Комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну: роль в регуляції системи крові

В коагуляційній ланці гемостазу при гострому гама-опроміненні в сублетальній дозі ми відмічали подовженням часу рекальцифікації на 41,3% (р<0,01), тромбінового часу на 24,2% (р<0,01). Виявлене збільшення тромбінового часу вказувало на наявність порушень кінцевої фази зсідання крові і може бути пов'язано з підвищенням антитромбінової активності плазми у 1,5 рази (р<0,01).

Важливим показником радіопротекторного ефекту пептидного комплексу гемоглобіну стала здатність тварин виживати після опромінення жорсткими гама-променями в сублетальній дозі. Смертність в дослідній групі тварин складала 12%, тоді як в контрольній групі тварин загинуло 25% тварин.

Кістковий мозок тварин, які отримували пептидний комплекс гемоглобіну, після гострого сублетального опромінення виявляв деякі ознаки відновлення мієлоїдного ряду. Морфологічно зростала клітинність кісткового мозку з осередками клітин гранулоцитарного ряду, при цьому в клітинах кісткового мозку знижувалася ступінь фрагментації ДНК і відсоток клітин з маркерами апоптозу. Можливо, ендонуклеазна активність, яка каталізує початкову стадію деградації ДНК, інгібувалася дією пептидних фрагментів гемоглобіну. Підвищення експресії всl-2 на 83,0 % (р<0,05) в клітинах кісткового мозку після введення тваринам пептидних фрагментів гемоглобіну збільшувало резистентність клітин до багатьох ініціаторів апоптозу, що може мати терапевтичну дію. Так, ряд гемопоетичних ростових факторів в теперішній час використовуються в клінічній практиці після застосування променевої терапії для збільшення кількості клітин крові і запобігання розвитку анемії (Казначеев К.С.,1999). Відомо, що розвиток апластичної анемії може бути пов'язаний з дією іонізуючого опромінення. При цьому встановлено, що іонізуючє опромінення є потенціальним апоптогеном, а всl-2, блокуючи деградацію ДНК, запобігає посиленню апоптозу (Hsu B.et al., 1994).

Застосування комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну у опромінених тварин в сублетальній дозі зменшувало кількість клітин з маркером протеіна р53 у 2,3 рази (р<0,05). Можливо, пептидний комплекс впливає на активність протеаз в ядрі і протеоліз ядерних білків. Суттєве зниження кількості апоптозних клітин покращувало гемопоетичні показники і надавало можливість зберігати нормальну тривалість життя клітинам.

Таким чином, пептидний комплекс гемоглобіну можна віднести до препаратів, які збільшують кількість клітин гранулоцитарного ряду не тільки за рахунок проліферації, а й за рахунок блоку апоптозу.

В мієлограмі тварин, які отримували комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну, зростала у 2,2 рази (р<0,05) кількість мієлоцитів, у 1,6 рази (р<0,05) моноцитів та знижувалась кількість паличкоядерних та сегментоядерних нейтрофілів на 37,5% (р<0,05) і 50,0% (р<0,05) відповідно. Тобто посилювалися процеси проліферації мієлоїдних клітин та відмічалася затримка дозрівання метамієлоцитарного ряду у паличкоядерні і сегментоядерні форми. Також, введення комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну опроміненим тваринам посилювало фагоцитарні властивості нейтрофілів у 1,6 рази (р<0,01) та нормалізувало їх здатність відновлювати нітросиній тетразолій. У периферичній крові в порівнянні з контролем у 8,0 разів (р<0,01) зростала кількість сегментоядерних нейтрофілів та у 1,3 рази (р<0,01) вміст лімфоцитів. Таким чином, пептидні фрагменти гемоглобіну впливали на спеціалізацію та вихід клітин гранулоцитарного ряду з депо кісткового мозку, прискорювали процеси проліферації.

В еритроїдному ряді червоного кісткового мозку під впливом комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну знизився відсоток базофільних нормобластів у 3,3 рази (р<0,05) та підвищився відсоток поліхроматофільних нормобластів у 1,9 рази (р<0,05). Тобто затримка еритропоезу проходила на рівні базофільних нормобластів з посиленим дозріванням поліхроматофільних нормобластів. У періферійній крові при постійній кількості еритроцитів збільшувався в порівнянні з нормою та контролем кольоровий показник еритроцитів. При введенні препарату в кровотоці відмічалась наявність більш стійких до дії солянокислого і перекисного гемолітика молодих форм еритроцитів. Встановлені кореляції між часом руйнування найбільш стійких еритроцитів при дії соляної кислоти та фагоцитарної активності нейтрофільних лейкоцитів (r=0,93; p<0,05) вказували на відповідну роль процесів перекисного окислення ліпідів при променевому пошкоджені організму.

Пептидний комплекс гемоглобіну зменшував рівень накопичення ТБК-активних продуктів в процесі 1,5 годинної інкубації еритроцитів в умовах залізо-аскорбатного буфера у 1,5 рази (р<0,05), можливо, за рахунок зниження кисеньутворюючої функції нейтрофілів. За фізіологічних умов відмічена значна позитивна кореляція активності нейтрофілів і накопичення ацилгідроперекисей в мембранах еритроцитів (Мищенко В.П. и соавт., 1990). Тобто введення комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну гальмувало розвиток вільнорадикальних реакцій в крові опромінених тварин, нормалізувало коагуляційний потенціал крові. Виявлено кореляцію між рівнем СОД еритроцитів та тромбіновим часом (r=0,89; p<0,05), рівнем накопичення МДА за час інкубації еритроцитів та вмістом антитромбіну-ІІІ у плазмі (r=0,85; p<0,05). В коагуляційній ланці гемостазу ми відмічали скорочення часу рекальціфікації у 1,2 рази (р<0,05), тромбінового часу у 1,6 рази (р<0,01) з деяким зниженням вмісту антитромбіну ІІІ. Виходячи з того, що процес зсідання крові являє собою складний багатокомпонентний захисний механізм, в якому приймають участь клітинні та гуморальні фактори (Бышевский А.Ш., 1993), зміни, які ми спостерігали, можливо, пов'язані з активацією процесів фагоцитозу. Відомо, що в період активного фагоцитозу, моноцити продукують фактор прокоагулянтної активності значно сильніший, ніж у інтактних клітин (Jaffe E.A.et al., 1985). Продукція моноцитів у кістковому мозку під впливом комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну зростала на 65,7% (р<0,05). В свою чергу, ці клітини здатні виробляти вітамін-К-залежні фактори, активатор фактору Х (Кузник Б.И. и соавт., 2001), що також сприяє посиленню процесів зсідання крові.`

Таким чином, комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну відновлював адекватність реакцій системи гемостазу при дії іонізуючого опромінення. Звертають увагу дані про вплив іншого поліпептидного фактора, вилученого з кісткового мозку - гемаліну (Морозов В.Г. и соавт., 1998): як і у випадку пептидного комплексу гемоглобіну, він прискорював процеси зсідання крові і стимулював фібриноліз.

Наступним кроком наших досліджень стало вивчення дії природного пептидного комплексу гемоглобіну за умов гемодепресії, яка була викликана введенням цитостатичного препарату вінбластину.

На 7-му добу після одноразового введення вінбластину в нашому досліді загинуло 70% тварин, причому відмічені чисельні спайки та перфорації стінок кишечника, некротичний стан шкіри та слизових оболонок ротової порожнини, гіпоплазія кісткового мозку.

В умовах гемодепресії після введення вінбластину нами виявлена активація загибелі клітин кісткового мозку шляхом апоптозу за рахунок посилення експресії ядерного білка р53 та зменшення експресії білка bcl-2 (таблиця) що, можливо, призводить до блоку в точці рестрикції при проходженні клітиною G1-фази, тому клітина не вступає в S-фазу клітинного циклу і підлягає самознищенню (Булкина З.П.,1991).

Поділ клітин у контрольних тварин був найбільш порушений в ряді еритробластів та мієлобластів. Нами виявлено зменшення числа мієлобластів на 73,0% (р<0,01), мієлоцитів на 76,0% (р<0,05), метамієлоцитів на 73,4% (р<0,05), паличкоядерних нейтрофілів на 90,0% (р<0,05), еозинофілів на 61,2%(р<0,05), пронормобластів та поліхроматофільних нормабластів у 2,1 рази (р<0,05) та 3,4 рази (р<0,05), відповідно. Таким чином, гальмування мітозу йшло на стадії промієлоцитів з послідуючим порушенням дозрівання метамієлоцитів, паличкоядерних нейтрофілів, тобто спеціалізації та диференціювання, можливо, гальмувався вихід деяких клітин з мозку у кров, де посилювалося дозрівання паличкоядерних у сегментоядерні нейтрофіли. Збіднення червоного кісткового мозку мієлоідними елементами призвело до зменшення у периферичній крові кількості паличкоядерних нейтрофілів у 2,6 рази (р<0,05), моноцитів у 1,6 рази (р<0,05 ), Т-лімфоцитів і О-клітин у 1,3 рази (р<0,01) та 1,6 рази (р<0,01) відповідно. Зменшення кількості нейтрофілів супроводжувалось зниженням рівня фагоцитозу. В сироватці крові знижувався рівень Ig G у 2,0 рази (р<0,05). Зменшення кількості поліхроматофільних нормабластів вказувало на порушення еритропоезу, що у периферичній крові виражалось у модіфікації структурно-функціональних особливостей еритроцитів та їх мембран: зменшення вмісту гемоглобіну в 1,3 рази (р<0,1), подовженні ШОЕ у 2,7 рази (р<0,01), зниженні стійкості до кислотного гемолізу. що, можливо, зумовлено зростанням кількості старих еритроцитів і одночасно пригніченням еритропоезу.

Згідно приросту МДА за час інкубації крові у прооксидантному залізо-аскорбінатному буферному розчині, антиоксидантний потенціал крові виявився зниженим, що вказує на ослаблення антиоксидантного захисту у самих еритроцитах. Встановлені кореляції між початковою концентрацією продуктів, які реагують з тіобарбітуровою кислотою та перекисною резистентністю еритроцитів (r=0,86; p<0,05), загальною тривалістю процесу гемолізу еритроцитів при дії соляної кислоти та накопиченням МДА за час інкубації еритроцитів (r=-0,95; p<0,05), часом наступу максимуму гемолізу еритроцитів та накопиченням МДА за час інкубації еритроцитів (r=-0,88; p<0,05). Зниження значень НСТ-тесту на 74,3% (р<0,05) відповідає послабленню функціональної активності нейтрофілів та ставить питання про джерела активних форм кисню. Активація субстратіндуцибельної СОД у 1,3 рази (р<0,05) вказує на посилення продукції супероксиду, а зниження активності каталази сприяє дії перекису водню - продукту СОД (Борисюк М.В. и соавт., 1998). Ці процеси перебігали на фоні зрушення коагуляційної ланки гемостазу до гіперкоагуляції, зі зниженням антитромбінового потенціалу плазми на фоні гіперфібриногенемії. Спостерігався кореляційний звўязок між концентрацією фібриногену та накопиченням МДА за час інкубації еритроцитів (r=0,91; p<0,05), зворотний взаємозвўязок між вмістом антитромбіну-111 та активністю каталази крові (r=-0,95; p<0,05).

Таким чином, вінбластин сприяє дисбалансу клітин-попередників у кістковому мозку, порушенню у крові клітинного складу та імунологічного статусу, опосередковано-посиленню пероксидації та ослабленню антиоксидантного захисту, розвитку гіперкоагуляції крові. Тобто, отруєння вінбластином по параметрах порушень клітинного складу кісткового мозку та крові, гемокоагуляції, антиоксидантного і імунологічного статусів, фагоцитозу можливо вважати моделлю комплексного пошкодження червоного кісткового мозку.

В останні роки значний прогрес при лікуванні хіміотерапевтичних мієлосупресій пов'язаний із застосуванням рекомбінантних гемопоетичних колонієстимуюючих факторів (КСФ) людини, особливо гранулоцитарного КСФ і гранулоцитарно-макрофагального КСФ (Cacciola E. et al., 1994). У цих пацієнтів використання гемопоетичних ростових факторів зменшувало тривалість нейтрофілоцитопенії.

Попередніми дослідами було показано, що комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну, як і вище названі цитокіни, здатен стимулювати процеси проліферації і диференціювання клітин-попередників мієлоідного та еритроїдного ростків, збільшувати кількість поліморфноядерних лейкоцитів у периферичній крові та посилювати реакцію респіраторного вибуху нейтрофілів.

Застосування комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну щурам, що отримували вінбластин, приводило до зниження летальності на 20% у порівнянні з контрольною групою. У дослідних тварин зберігалися вага та координація рухів, відмічалося незначне випадіння шерсті. Отже, візуальні симптоми отруєння вінбластином були виражені у меншому ступені. Комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну гальмував процеси апоптозу за рахунок зниження експресії ядерного протеїну р53 і збільшення експресії онкопротеїну всl-2, зменшував фрагментацію ДНК клітин кісткового мозку.

Зниження експресії онкопротеіну р53 сприяло проходженню клітиною S-фази та здійсненню процесів реплікації і репарації ДНК. Можливо, комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну інгібує активність ендонуклеаз в ядрі, які каталізують початкову стадію деградації ДНК. Ці дані дозволяють розглядати комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну, як препарат, який підвищує резистентність клітин до ініціаторів апоптозу та відновлює вміст клітин крові після хіміотерапії, зменшуючи побічні властивості цитостатиків.

У червоному кістковому мозку після введення комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну майже до норми знизився відсоток моноцитів (4,8±0,86% проти 26,4±2,64%; р<0,01), підвищився вміст паличкоядерних нейтрофілів у 3,0 рази (р<0,01), сегментоядерних нейтрофілів у 2,5 рази (р<0,01) (рис.4).

В еритроїдному ряду залишався зниженим відсоток пронормобластів, базофільних нормобластів, збільшився відсоток поліхроматофільних нормобластів (з 1,0±0,1% до 4,2±0,51%; р<0,05).

У периферичній крові, в порівнянні з контролем, нормалізувалась загальна кількість лейкоцитів, причому відсотки паличкоядерних нейтрофілів та моноцитів зросли відповідно у 5,6 рази (р<0,01) та у 2,0 рази (р<0,01), підвищився до норми фагоцитарний індекс.

Кількість еритроцитів у крові незначно збільшилась в порівнянні з контролем, вміст гемоглобіну підвищився відносно контролю. Таким чином, не дивлячись на гальмування мітозів попередників пронормобластів, різко зростала швидкість дозрівання поліхроматофільних нормобластів та ретикулоцитів, що майже нормалізувало кількість еритроцитів та гемоглобіну крові. Найбільш виражений нормалізуючий ефект виявився для показників кислотного гемолізу еритроцитів (кількість зруйнованих еритроцитів зменшилась до 10,6±1,21% проти 30,2±1,24%, р<0,01). Зростання високостійких молодих клітин в еритроїдному ряді може свідчити про наявність сильної стимуляції процесів диференціювання, прискореного виходу клітин з кісткового мозку.

У крові кількість Т-лімфоцитів підвищувалась у 1,4 рази (р<0,05), кількість О-клітин зростала відносно контролю у 2,9 рази, (р<0,01). Тобто є затримка лімфоцитів у червоному кістковому мозку, нерівномірне дозрівання лімфоцитів у периферичних імунних органах. Нами були виявлені зміни клітинного імунітету: нормалізувалися відсотки В-лімфоцитів, теофілінчутливих клітин. Зміни гуморального імунітету були виражені у збільшенні вмісту IgA у 2,8 рази (р<0,01) та IgG у 3,4 рази (р<0,01) проти контролю.

Отже, затримка лейкопоезу зберігалася на рівні поділу попередників промієлоцитів, посилилося дозрівання метамієлоцитарного ряду, накопичувалися у мозку сегментоядерні форми, але спеціалізація у еозинофіли гальмувалася. Вихід паличкоядерних та сегментоядерних форм нейтрофілів у кров різко збільшився. У червоному мозку починається відновлення продукції моноцитів, що відображається у лейкограмі. Внаслідок цього відновлювалась до норми фагоцитарна активність.

Під дією комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну у сироватці крові нормалізувався вміст дієнових кон'югатів, тобто, можливо, збільшилася їх продукція або знизилося їх поглинання клітинними мембранами. Концентрація МДА до інкубації та активність СОД залишилися в межі отруєння, але концентрації МДА після інкубації та її приріст за час інкубації значно знизилися у напрямку норми (26,48±2,19 мкмоль/л проти 50,82±3,51 мкмоль/л), що вказує на збільшення антиоксидантного потенціалу. Концентрація церулоплазміну і активність каталази збільшувались в 1,7 рази (р<0,01) та 1,5 рази (р<0,05), що свідчить про нормалізацію функції печінки та елімінацію перекису водню. Внаслідок цього нормалізувався рівень спонтанного гемолізу еритроцитів перекисної природи (8,34±1,7% проти 16,23±0,56%, р<0,01). Встановлені кореляції між тривалістю процесу гемолізу еритроцитів та активністю каталази еритроцитів (r=0,95; p<0,05), часом руйнування найбільш стійких еритроцитів до дії соляної кислоти і перекисною резистентністю еритроцитів (r=-0,94; p<0,05). Таким чином, комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну, підвищував стійкість мембран та антиоксидантний потенціал еритроцитів.

Зміни показників гемокоагуляції виразилися у нормалізації часу рекальціфікації (99,0±13,08 с проти 16,23±0,56 с, р<0,01), протромбінового часу, вмісту фібриногену та суттєвому збільшенню відсотку антитромбіну ІІІ. Це вказує на нормалізацію гемокоагуляції, що може бути пов'язано зі стабілізацією антиоксидантного статусу крові (Козинец Г.И. и соавт., 1998). Відмічено зворотній кореляційний звўязок між часом рекальціфікації та рівнем накопичення МДА еритроцитами (r=-0,98; p<0,05).

Отже, можна вважати, що комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну впливає на вихід клітин крові з депо червоного кісткового мозку, на диференціювання та спеціалізацію клітин. На наш погляд, існує взаємодія пептидних комплексів гемоглобіну з мембранними рецепторами клітин, їх вплив на активність внутрішньоклітинних посередників з відповідними протеінкіназами, сигнали яких переносяться до ядра і змінюють експресію ядерних білків. Всі перелічені процеси приводять до вторинної зміни активності генома і синтезу іншого клану білків. Мабуть, під впливом комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну посилюється детоксикація вінбластину у печінці. Опосередковано комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну нормалізує вміст церулоплазміну, атерогенні ліпопротеїди, антиоксидантний статус та процеси гемокоагуляції. Ці зміни можуть бути пов'язані з дією на рецептори мембран клітин-попередників у гемопоєзі, що сприяє елімінації пошкоджених вінбластином клітин.

Узагальнюючи матеріали нашого дослідження, вважаємо можливим констатувати, що комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну має широкий спектр біологічної дії на систему крові (рис.5). Він здатен дістантно діяти на клітини кісткового мозку, посилюючи проліферацію і диференцировку клітин-попередників еритроїдного ряду та проліферацію клітин гранулоцитарного ряду, що споріднює їх з гемопоетичними колонієстимуюючими факторами. Комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну можна віднести до медіаторної ланки біорегуляції системи крові, яка здійснює перенос специфічної інформації необхідної для нормального функціонування, розвитку і взаємодії клітинних популяцій шляхом зміни експресії ядерних белків (зокрема, р53). КПФГ притаманна нормалізуюча дія на систему вільнорадикального окислення, білки гострої фази запалення, неспецифічну резистентність і систему гемостазу, що супроводжується відновленням імунологічної регуляції фізіологічних функцій. Подальше вивчення фізіологічної ролі пептидних фрагментів гемоглобіну разом із вирішенням найважливіших теоретичних проблем біологічної регуляції дозволить накреслити нові підходи до лікування різних захворювань системи крові.

ВИСНОВКИ

В дисертації наведені теоретичні узагальнення і нове вирішення сучасної наукової проблеми в галузі фізіології по розкриттю ролі пептидних фрагментів гемоглобіну в регуляції системи крові. Результати дослідження впливу комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на гематологічні показники, стан кісткового мозку, перекисне окислення ліпідів, гемостаз, імунітет та апоптоз гемопоетичних клітин важливі для фундаментальної фізіології і можуть бути використані як підґрунтя для створення нових лікарських засобів.

1.Комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну має власну фізіологічну активність, яка спрямована на регуляцію гематологічних показників, стану кісткового мозку, перекисне окислення ліпідів, гемостаз, імунітет та апоптоз гемопоетичних клітин в умовах експериментальної патології, що підтверджує існування пептидної регуляції біологічно активними фрагментами гемоглобіну системи крові.

2. Комплекс пептидних фрагментів отримували за власною методикою шляхом ферментативного гідролізу гемоглобіну. Екстракцію гідролізату проводили за допомогою органічних кислот в присутності катіонів двохвалентних металів, з очисткою шляхом гельфільтрації для вилучення пептидів з молекулярною масою менше 10 кД. Пептидний комплекс давав позитивну біуретову реакцію з максимумом спектра поглинання 200-210 нм. За даними іонообмінної хроматографії мав шість основних фракцій, час утримання: 3, 12,18, 27, 35, 39 хвилин.

3. Комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну при внесенні у кров, отриману від здорових донорів, проявляв широкий спектр біологічної активності: стабілізував мембрану еритроцитів при дії солянокислого гемолітика, посилював фібринолітичну активність плазми, знижував ступінь експресії манозовміщуючих мембранних структур (МВМС) лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів.

4. Комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну має рецепторний тип дії, про що свідчило збільшення швидкості проведення імпульсів зорової модальності по специфічних аферентних системах підкоркових та коркових відділів зорового аналізатора, зниження експресії МВМС лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів після його введення здоровим тваринам.

5. Найбільша фізіологічна активність відмічається при застосуванні дози 1 мг/кг. У тварин відмічалось підвищення вмісту гемоглобіну, посилення розвитку еритробластних елементів, стимуляція процесів проліферації клітин гранулоцитарного ряду, підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів.

6. Комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну в умовах експериментальної патології системи крові притаманна корегуюча дія на гематологічні показники периферичної крові і кісткового мозку, перекисне окислення ліпідів, гемостаз та неспецифічну резистентність організму.

7. При гемолітичній анемії, викликаній введенням сірчанокислого фенілгідразину комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну відновлює вміст глюкозо-6-фосфатдегідрогенази еритроцитів, нормалізує морфологічну картину крові та фагоцитарний індекс нейтрофілів, знижує значення НСТ-тесту нейтрофілів та гальмує розвиток гіперкоагуляції.

8. За умов хронічної свинцевої інтоксикації комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну прискорює розвиток компенсаційно-пристосувальних реакцій в периферичній крові та кістковому мозку, а саме: нормалізує кількість сидероцитів та активність супероксиддисмутази еритроцитів, фагоцитарну і кисеньактивуючу функцію нейтрофілів, збільшує швидкість оновлення еритроїдних елементів кісткового мозку.

9. При променевому пошкодженні комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну виявляє радіопротекторний ефект: прискорює процеси проліферації та вихід клітин гранулоцитарного ряду з депо кісткового мозку, посилює дозрівання поліхроматофільних нормобластів, зменшує рівень процесів пероксидації, відновлює фагоцитарну функцію нейтрофілів та показники гемостазу.

10. За умов гемодепресіі, яка була викликана введенням цитостатичного препарату вінбластину, комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну зменшує побічні ефекти цитостатика, запобігає мієлосупресії стимулюючи грануло- і лімфопоез, зменшує нейтрофілопенію в периферичній крові, стимулює клітинний та гуморальний імунітет, відновлює до норми фагоцитарну активність нейтрофілів. Під впливом пептидних фрагментів гемоглобіну нормалізується стан прооксидантно-антиоксидантної системи і системи гемокоагуляції.

11. Комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну можна віднести до медіаторної ланки біорегуляції системи крові, яка здійснює перенос специфічної інформації змінюючи активність внутрішньоклітинних білків bcl-2 та експресію ядерних білків р53. В умовах експериментальної патології системи крові (хронічної свинцевої інтоксикації, іонізуючому опроміненні організму, депресії кровотворення, яка була викликана введенням вінбластину) комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну гальмує процеси апоптозу за рахунок зниження експресії протеіну р53 і збільшення експресії онкопротеїну bcl-2, зменшує фрагментацію ДНК клітин кісткового мозку.

12. Подальше вивчення дії комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну, як потенційних лікарських речовин, дозволить накреслити нові підходи до лікування різних захворювань системи крові

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Враховуючи проведені дослідження, доцільно рекомендувати комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну для проведення доклінічних іспитів, як потенційних лікарських речовин.

2. Запропонований спосіб отримання комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну може бути використаний для створення нових лікарських препаратів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Запорожець Т.М. Вплив пептидних фрагментів гемоглобіну на стан показників імунітету та експресію манозовміщуючих мембранних структур лейкоцитів// Проблеми екології та медицини. -1997.- Т.1, №1-2.-С.38-40.

2. Запорожець Т.М., Боброва Н.О., Кайдашев І.П. Зміни експресії манозо- вміщуючих мембранних структур лейкоцитів під впливом пептидного комплексу гемоглобіну у здорових тварин та за умов гемолітичної анемії //Проблеми екології та медицини. -1999.- Т.3, №1-2.-С.132-134.

3. Запорожець Т.М. Вплив пептидних фрагментів гемоглобіну на морфофункціональні показники периферійної крові за умов фенілгідразинової анемії //Вісник проблем біології і медицини.-1999.-№13.-С.128-132.

4. Запорожець Т.М., Міщенко В.П., Цебржинський О.І., Рябенко В.В., Ткаченко О.В. Ефекти вінбластину на систему крові, опосередковані станом кісткового мозку //Одеський медичний журнал.- 2000.-№5.-Т.61.-С.31-34.

5. Запорожець Т.М., Міщенко В.П., Саник О.В. Характеристика біологічної активності пептидних фрагментів гемоглобіну //Фізіологічний журнал.-2001.-Т.47.-№3.-С.42-46.

6. Запорожець Т.М. Вплив пептидних фрагментів гемоглобіну на показники периферійної крові і кісткового мозку за умов свинцевої інтоксикації// Вісник проблем біології та медицини.- 2001.-№ 3.- С.8-12.

7. Запорожець Т.М., Ерошенко Г.А.Імуногістохімічне дослідження апоптозу клітин кісткового мозку при хронічному отруєнні свинцем //Буковинський медичний вісник.-2001.-Т.5.-№1-2.-С.61-63.

8. Запорожець Т.М.Корекція процесів пероксидації в крові комплексом пептидних фрагментів гемоглобіну в умовах дії іонізуючого випромінювання// Медицина сьогодні і завтра.-2001.-№ 2.-С.25-27.

9. Запорожець Т.М. Корекція процесів апоптозу в кістковому мозку комплексом пептидних фрагментів гемоглобіну при хронічному отруєнні свинцем //Вісник морфології.-2001.-№1.-С.76-77.

10. Запорожець Т.М. Модифікація постпроменевої реакції системи крові комплексом пептидних фрагментів гемоглобіну//Наукові записки НаУКМА. Спец.вип.-2001.-Т.19, ч.2.-С.385-387.

11. Запорожець Т.М Вплив комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на перебіг гемолітичної анемії// Наукові записки НаУКМА. Біологія та екологія.-2001.-Т.19.-С.97-101.

12. Запорожець Т.М. Ефекти комплексу пептидних фрагментів гемоглобину та можливі механізми впливу на процеси перекисного окислення ліпідів та гемостаз// Проблемы достижения и перспективы развития медико-биологических наук.-2001.-ч.3.-С.44-46.

13. Запорожець Т.М. Регуляция пептидными фрагментами гемоглобина свободнорадикальных и иммунологических реакций в условиях депрессии кроветворения// Таврический медико-биологический вестник.-2001.-№1-2.-С.31-34.

14. Запорожець Т.М. Вплив пептидних фрагментів гемоглобіну на деякі показники крові та гемостаз in vitro// Медицина сьогодні і завтра.-2002.-№1.-С.32-34.

15. Запорожець Т.М., Ткаченко О.В. Вплив пептидних фрагментів гемоглобіну на апоптоз гемопоетичних клітин кісткового мозку при променевому пошкодженні// Одеський медичний журнал.-2002.-№1.-С.4-6.

16. Запорожець Т.М. Дослідження біологічної активності комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну in vivo// Вісник проблем біології та медицини.-2002.-№3.-С.22-26.

17. Запорожець Т.М. Вплив комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на гематологічні показники при мієлодепресії // Наукові записки НаУКМА. Біологія та екологія.-2002.- Т.20.-С.86-89.

18. Запорожець Т.М., Цебржинський О.І. Вплив пептидних фрагментів гемоглобіну на пероксидацію в крові при свинцевій інтоксикації// Современные проблемы токсикологии.-2002.-№ 1.- С.72-74.

19. Запорожець Т.М. Вплив пептидних фрагментів гемоглобіну на апоптоз гемопоетичних клітин кісткового мозку при мієлодепресії// Вісник Київського Державного університету. “Проблеми регуляції фізіологічних функцій”.-2002.-Вип.8.-С.40-43.

20. Запорожець Т.М. Дослідження радіопротекторної дії комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну на гемопоетичні клітини кісткового мозку// Актуальні проблеми сучасної медицини. Вісник Української медичної стоматологічної академії.-2002.-№1.-С.18-20.

21. Пат.48685 Україна, МКИ А61К38/00. Спосіб отримання комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну/ Запорожець Т.М., Кайдашев І.П.- Опубл.15.08.2002.-Бюл.№8.

22. Запорожець Т.М. Регуляторные пептиды в регуляции физиологических функций //Матеріали науково-практич.конф.”Актуальні питання теоретичної та клінічної медицини на сучасному рівні”.-Полтава,1996.-С.145-146.

23.Запорожець Т.М., Міщенко В.П. Про можливі універсальні принципи дії та будови поліпептидних біорегуляторів //Матеріали ХV зўїзду Українського фізіологічного товариства.- Донецьк,1998.-С.292.

24.Запорожець Т.М., Саник О.В., Міщенко С.В. Вплив пептидних регуляторів на зорові викликані потенціали в експерименті// Матеріали конференції молодих вчених “Фізіологія і патологія перекисного окислення, гемостазу та імуногенезу”.-Полтава,1999.-С.15.

25. Запорожець Т.Н. Пептидные фрагменты гемоглобина, их влияние на некоторые показатели системы крови// Материалы международной научно-практической конференции “Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины”.-Минск,2000.-С.363.

26. Запорожець Т.М. Біологічно-активний комплекс гемоглобіну та його вплив на систему крові// Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції “Вчені України - вітчизняній фармації”.- Харків, 2000.- С.253-254.

27. Запорожець Т.М., Ткаченко О.В. Універсальні механізми дії пептидних біорегуляторів на стан периферійної крові і кісткового мозку // Матеріали наукової конференції “Історія та сучасні досягнення фізіології в Україні”.- Київ, 2001.-С.111.

28. Запорожец Т.Н., Мищенко В.П., Цебржинский О.И. К механизмам токсичности анемических факторов//Матеріали доповідей 1-зўїзду токсикологів України.-Київ,2001.-С.95.

29. Запорожець Т.М. Корекція процесів гемостазу пептидними фрагментами гемоглобіну в умовах експериментальної патології //Материалы 2-й Международной конф. ”Микроциркуляция и ее возрастные изменения”.-Київ,22-24 травня 2002.-С.119-121.

30. Запорожець Т.М., Ткаченко О.В. Загальність дії пептидного комплексу гемоглобіну на апоптоз гемопоетичних клітин кісткового мозку при патологічних станах у тварин//Матеріали ХV1зўїзду Укр.фізіол.тов-ва. Вінниця,28-30 травня 2002 /Фізіол.ж-л.-2002.-Т.48,№ 2.-С.162.

31. Запорожець Т.М., Саник О.В., Насонова Т.І. Регуляція кровотворення та фізіологічної загибелі клітин пептидними фрагментами гемоглобіну// Тези доп. Всеукраїн. наук. конф., присвяченої 160-річчю каф. фізіології людини і тварин Київського нац. ун-ту ім.Тараса Шевченка. -Київ, 3-4 жовтня 2002р.-С.46.

гемоглобін фрагмент пептидний

 АНОТАЦІЇ

Запорожець Т.М. Комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну: роль в регуляції системи крові.

Дисертація (рукопис) на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 14.03.13 - нормальна фізіологія. - Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2002.

Пептидний комплекс, отриманий шляхом ферментативного гідролізу гемоглобіну з наступною екстракцією органічною кислотою в присутності двохвалентних катіонів має власну фізіологічну активність, яка спрямована на підтримку метаболічних та регенераторних процесів у системі крові.

Комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну можна віднести до медіаторної ланки біорегуляції системи крові, яка здійснює перенос специфічної інформації після взаємодії з мембранними рецепторами, змінюючи активність внутрішньоклітинних білків (зокрема bcl-2) з протеінкіназами, сигнали від яких змінюють експресію ядерних білків (зокрема р53). Виявлена здатність комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну посилювати розвиток еритробластних елементів та стимулювати процеси проліферації клітин гранулоцитарного ряду за фізіологічних умов і при розвитку експериментальних патологій. Комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну в умовах експериментальної патології системи крові (гемолітичної анемії, викликаній введенням сірчанокислого фенілгідразину, порушенні синтезу порфіринів та гему в умовах хронічної свинцевої інтоксикації, гіпопластичноїї анемії, викликаній променевим пошкодженням організму, депресії кровотворення,, викликаній введенням цитостатика) притаманна нормалізуюча дія на систему вільнорадикального окислення, білки гострої фази запалення, неспецифічну резистентність, що супроводжується відновленням фагоцитарних властивостей нейтрофілів, нормалізацією функцій системи гемостазу та імунітету. Перспективне подальше вивчення комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну, як потенційних лікарських речовин, що разом із вирішенням найважливіших теоретичних проблем біологічної регуляції дозволить накреслити нові підходи до лікування різних захворювань системи крові.

Ключові слова: комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну, система крові, біорегуляція, експериментальна патологія крові.

Запорожец Т.Н. Комплекс пептидных фрагментов гемоглобина: роль в регуляции системы крови.

Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 14.03.13- нормальная физиология; Институт физиологии иім. А.А.Богомольца НАН Украини, Киев, 2002.

Пептидный комплекс полученный, путем ферментативного гидролиза гемоглобина имеет собственную биологическую активность, которая направлена на поддержание метаболических и регенераторных процессов в системе крови.

Комплекс пептидных фрагментов гемоглобина можно отнести к медиаторному звену системи биорегуляции крови, которая осуществляет перенос специфической информации после взаемодействия с мембранними рецепторами, изменяя активность внутриклеточных белков (в частности, bcl-2) с протеинкиназами, сигналы от которых изменяют експрессию ядерных белков (в частности, р53). Виявлена способность комплекса пептидных фрагментов гемоглобина ускорять развитие эритробластных клеток и стимулировать процессы пролиферации клеток гранулоцитарного ряда в физиологических условиях и при развитии экспериментальной патологии. Комплекс пептидных фрагментов гемоглобина в условиях экспериментальной патологии системы крови (гемолитическая анемия, вызванная введением фенилгидразина, нарушение синтеза порфиринов и гема в условиях хронической интоксикации солями свинца, гипопластическая анемия, вызванная гамма-излучением, депрессия кроветворения, вызванная введеним цитостатика) способен оказывать нормализующее действие на систему свободнорадикального окисления, белки острой фазы воспаления, неспецифическую резистентность организма, что сопровождается восстановлением фагоцитарных функций нейтрофилов, нормализацией функций системы гемостаза и иммунитета. Перспективным является дальнейшее изучение комплекса пептидных фрагментов гемоглобина, как потениального лекарственного препарата, которое вместе с решением теоретических проблем биологической регуляции позволит наметить новые подходы к лечению заболеваний системы крови.

Ключевые слова: комплекс пептидных фрагментов гемоглобина, система крови, биорегуляция, экспериментальная патология крови.

Zaporozhetz T.N. The haemoglobin peptide fragments complex: its role in a blood system regulation

A thesis (manuscript) on the competition of academic degree of Biological Sciences Doctor by speciality 03.00.13-the Normal Physiology; A.A.Bogomoletz Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2002.

The peptide complex, received by fermentative haemoglobin hydrolysis, has its own biological activity which is aimed to the metabolic and regenerative processes maintaining in a blood system.

In the work the chromatographic, haematological, biochemical, coagulological, immunological and histological methods are used. Immunohistochemical investigation of antigens bcl-2 and p53 were performed with the monoclonal antibodies using. The DNA fragmentation was accomplished by means of agarose-gel electrophoresis. The experiments were performed on the models of acute phenylhidrasine anaemia, chronic lead-poisoning (saturnism), acute haematopoesis hypoplasia, caused by the vinblastine application, acute extracorporal г-irradiation.

The performed investigation results showed that the haemoglobin peptide fragments complex in vitro is capable to activate the fibrinolysis, to bloke the thrombine transformation, to decrease the mannosecontaining membrane lymphocytes and rod neutrophils structures expression degree.

While injecting to the health animals the peptide complex increased the velocity of conducting the visual modality impulses in the specific afferent systems of subcortical and cortical visual analysers regions, stimulated the erythroblastic elements development, the proliferation processes in the bone-marrow granulocytic line, increased the haemoglobin concentration in erythrocytes, and the neutrophils phagocytic activity.

In the condition of the chemical oxidant phenylhidrasine action the haemoglobin peptide fragments complex implication restored the glucose-6-dehydrogenase level and the reticulocytes number in a blood, normalized the nitroblue (NBT) test and neutrophil phagocytic activity, decreased the mannosecontaining membrane lymphocytes and rod neutrophils structures expression and inhibited the hypercoagulation development.

At the chronic saturnism the haemoglobin peptide fragments complex intramuscular injection restored the morphological blood and bone-marrow picture, while enhancing the erythropoiesis and decreasing the apoptotic cells number and bone-marrow cells DNA-fragmentation.

The haemoglobin peptide fragments complex affected radioprotectively the blood system after the extracorporal г-irradiation in a sublethal dose. The animals mortality in experimental group decreased in 13%, in bone marrow there were a myeloid cells restoring, the DNA fragmentation reducing and the cell number with protein hall-marker p53 reducing in 2.3 times. The peptide complex decreased in a blood the malone dialdehyde accumulation level in 1,5 times, increased the young erythrocytes number in a circulation, normalized the coagulative blood potential.

In the haemodepression condition, caused by the vinblastine application, the haemoglobin peptide fragments complex decreased the animal lethality in 20%, inhibited the oncoprotein p53 expression and DNA degradation in a bone-marrow cells, increased in it the rod and segment-nuclear neutrophils containing. In a peripheral blood the peptide complex normalized the leucocytes number, neutrophils phagocytic index, T-lymphocytes, B-lymphocytes, theophyllin-perceptible cells, Ig A and Ig G containing.

Thus, the haemoglobin peptide fragments influence the blood cells exit from the bone marrow, the cell differentiation and specialization. To our point of view, the haemoglobin peptide fragments interact with the cell membrane receptors, changing the intracellular messengers and corresponding proteinkinases activity, modulate the nuclear proteins expression. All processes mentioned above lead to the genome activity change and secondary new proteins synthesis. The further studying of the haemoglobin peptide fragments physical role side by side with the most important theoretical problems of biological regulation solving will allow to substantiate the new ways of different blood system diseases treatment.

Key words: haemoglobin peptide fragments complex, blood system, bioregulation, experimental blood pathology.

Размещено на Allbest.ru