Дослідження пейсмекерної активності нейронів молюска та впливу на неї тритерпенових глікозидів

Размещено на http://www.allbest.ru/

ТАВРІЙСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. В. І. ВЕРНАДСЬКОГО

УДК 612.822 : 547.918

ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕЙСМЕКЕРНОЇ АКТИВНОСТІ НЕЙРОНІВ МОЛЮСКА

ТА ВПЛИВУ НА НЕЇ ТРИТЕРПЕНОВИХ ГЛІКОЗИДІВ

03.00.13 - фізіологія людини та тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КОСТЮЧЕНКО Оксана Валентинівна

Сімферополь - 2002

Дісертацією є рукопис

Робота виконана в Таврійському національному університеті ім. В. І. Вернадського Міністерства освіти України

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор Коренюк Іван Іванович, Таврійський національний університет ім. В. І. Вернадського, професор кафедри фізіології людини та тварин і біофізики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Шаповал Людмила Миколаївна, Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, провідний науковий співробітник

доктор біологічних наук, професор Русяєв Валентин Федорович, Кримський державний медичний університет ім. С. І. Георгієвського, завідувач кафедри біофізики

Провідна установа кафедра нормальної фізіології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького Міністерства охорони здоровўя України

Захист відбудеться " 20 " червня 2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 52.051.04 в Таврійському національному університеті ім. В. І. Вернадського за адресою: вул. Ялтинська, 4, 95007, м. Сімферополь.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Таврійського національного університету ім. В. І. Вернадського за адресою: вул. Ялтинська, 4, 95007, м. Сімферополь.

Автореферат розісланий " 17 " травня .

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради К 52.051.04 В. С. Мартинюк

АНОТАЦІЇ

Костюченко О.В. Дослідження пейсмекерної активності нейронів молюска та впливу на неї тритерпенових глікозидів. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини та тварин. - Таврійський національний університет ім. В.І. Вернадського, Сімферополь, 2002. Дисертацію присвячено вивченню механізмів генерації пейсмекерної активності нейронів слимака, а також впливу на неї тритерпенових глікозидів. Показано, що ізольовані нейрони ППа2 та ППа7 мають ендогенну ритмічну активність, а пейсмекероподібна активність нейрону ППа1 має екзогенне походження. Пейсмекерна активність ініціюється в дендритному дереві нервової клітини, а потім електротонічно поширюється до соми, де й відбувається генерація повномірних потенціалів дії. Найбільш вірогідно, що іони кальцію та Jh-струм не беруть безпосередньої участі в генерації пейсмекерної активності в досліджених ідентифікованих нервових клітинах виноградного слимака. Знайдено новий тип протон-керованого струму, який відрізняється від описаних раніше струмів кислотно-чутливих іонних каналів, присутніх у нейронах ссавців. Досліджено вплив тритерпенових глікозидів на пейсмекерну активність нейронів слимака. Монодесмозидні глікозиди в концентраціях 2·10-3 - 10-4 М, додані в зовнішній розчин, викликають тривалу гіперполяризацію нейронів. Установлено, що ці сполуки підвищують амплітуду вихідного калієвого струму. Дія глікозидів є неспецифічною та розвивається протягом 1-2 хвилин. Висловлено припущення, що вплив тритерпенових глікозидів у високих концентраціях пов'язаний із виникненням неселективних пор у мембранах нейронів.

Ключові слова: нейрони молюсків, пейсмекерна активність, аксодендритне дерево, протон-керований струм, тритерпенові глікозиди.

Костюченко О.В. Исследование ритмоводящей активности нейронов моллюска и влияния на нее тритерпеновых гликозидов. -Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского, Симферополь, 2002.

Диссертация посвящена изучению механизмов ритмоводящей активности в нейронах виноградной улитки, а также влиянию на нее тритерпеновых гликозидов. Показано, что изолированные нейроны ППа2 и ППа7 обладают эндогенной ритмической активностью, а пейсмекероподобная активность нейрона ППа1 имеет экзогенное происхождение. Ритмоводящая активность инициируется в дендритном дереве нервной клетки, затем электротонически распространяется до сомы, где и происходит генерация полномерных потенциалов действия. По всей видимости, ионы кальция и Jh-ток не принимают непосредственного участия в генерации пейсмекерной активности в исследованных идентифицированных нервных клетках виноградной улитки. Обнаружен новый тип протонуправляемого тока, отличный от описанных ранее токов кислотно-чувствительных ионных каналов, наблюдаемых в нейронах млекопитающих.

Исследовано влияние тритерпеновых гликозидов на пейсмекерную активность нейронов моллюска. Монодесмозидные гликозиды в концентрациях 2·10-3 - 10-4 М, введенные в наружный раствор, вызывают устойчивую гиперполяризацию нейронов. Установлено, что данные вещества увеличивают амплитуду выходящего калиевого тока. Действие гликозидов является неспецифическим и развивается в течение 1 - 2 минут. Высказано предположение, что влияние тритерпеновых гликозидов в высоких концентрациях связано с образованием неселективных пор в мембранах нейронов.

Ключевые слова: нейроны моллюсков, пейсмекерная активность, аксодендритное дерево, протонуправляемый ток, тритерпеновые гликозиды.

Kostyuchenko O.V. Investigation of the pacemaker activity of molluscan neurons and influence of triterpene saponins on it. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by specialty 03.00.13 - physiology of man and animals. - National Taurida V. I. Vernadsky University, Simferopol, 2002.

The dissertation is devoted to investigation of pacemaker activity mechanisms in neurons of snail, and to investigation of the influence of plant triterpene saponins (TS) on this activity. It has been shown that isolated RPa2 and Rpa7 neurons display endogenous pacemaker activity. Superfusion of the ganglion with CdCl2 at concentration of 1mM, at which it blocks all voltage-gated Ca2+ channels, did not significantly affect pacemaker activity of these neurons. In contrast, isolation of bursting RPa1 neuron abolished its bursting activity, whereas subsequent application of oxytocin to the isolated neuron resulted in its transient reappearance. These data indicate exogenous nature of bursting activity in RPa1 neuron. Extracellular application of 1mM CdCl2 to the intact RPa1 neuron resulted in inhibition of its activity. However, CdCl2 applied simultaneously with oxytocin did not prevent its bursting activity. Cs+ (10mM), which inhibits Ih channels (activated by hyperpolarization, known to participate in pacemaker activity of neurons in some preparations), did not influence rhythmic activity of all neurons in study. Rhythmic activity of these neurons revealed spikes of smaller than somatic action potentials (APs), considered by us as dendritic APs. From our data one may conclude that rhythmic activity has its origin in dendritic tree. Then it electrotonically propagates to the neuronal soma resulting in generation of somatic APs.

A novel type of proton-gated current in ganglia of water mollusc Lymnaea stagnalis strikingly different from those provided by acid-sensitive ion channels types observed in mammalian neurons was discovered. It was found that extracellular pH drop from 8.1 to 5.3 elicited a rapidly activated transient inward current. The peak amplitude of the pH-response was proportional to the cell diameter. Replacing of extracellular Na+ by Tris ions did not affect the response. Manipulations with the extracellular Ca2+ concentration yielded rather complicated effects: at high Ca2+ concentrations (10mM), the current-voltage relationship was shifted to positive voltages, while the amplitudes somewhat decreased. Decreasing of the Ca2+ concentration from 2 to 0.5 mM resulted in a 10-20% potentiation. Probably, Ca2+ plays a dual role in regulating the conductance, combining the roles of a current carrier and a partial voltage-dependent channel blocker. Thus, it was shown that Ca2+ current is much less Na+-selective (if provided by the Na+ permeability at all) and it is highly voltage-dependent, being activated at positive voltages.

The effect of plant triterpene saponins on Helix pomatia neurons was investigated. It was found that monodesmosidic TS being perfused to the extracellular solution at concentrations 2Ч10-3 - 10-4 M induced persistent hyperpolarization of the neurons. By using the patch-clamp technique it was obtained that these substances increased the amplitude of the outward potassium current. At lower concentrations (10-5 - 10-7 M) TS either led to the transient reversible oppression of the impulse activity, or didn't change the background activity. The influence of TS is unspecific and develops during 1-2 min. It was supposed that the effect of TS at high concentrations was related to the appearance of nonselective holes in neuron membrane.

Key words: molluscan neurons, pacemaker activity, axodendritic tree, proton-gated сurrent, triterpene saponins.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Різні циклічні процеси є невід'ємною частиною існування живих організмів. Їхній часовий діапазон дуже широкий - від сезонних і добових поведінкових і гормональних ритмів до субсекундних інтервалів активності серця й мілісекундних подій, які реєструються в нервових клітинах. Прикладом можуть бути пейсмекерні нейрони в таламічних структурах ссавців, що управляють ритмами, які зв'язані зі сном (Steriade et al., 1988; Steriade, 1999), або які зумовлюють деякі форми епілептиформної активності (Steriade, 1999).

Однак, незважаючи на численні спроби зрозуміти механізм генерації пейсмекерної активності в нервових клітинах, цей феномен усе ще залишається не до кінця вивченим. Основні труднощі пов'язані з тим, що, по-перше, в клітині існують численні іонні канали, відбувається велика кількість цитоплазматичних процесів, у принципі здатних забезпечити осциляції мембранного потенціалу (МП). Важко визначити, які з цих чинників необхідні й достатні для забезпечення таких осциляцій, а які є просто супутніми. По-друге, зі спостережень, проведених останнім часом, створюється враження, що локуси пейсмекерної активності розташовані в дендритах (Segev et al., 1998; Yuste et al., 1996). Саме тут можливості використання методу фіксації потенціалу, що дає можливість одержувати досить адекватну характеристику електричних процесів, особливо зв'язаних із функціонуванням потенціал-керованих каналів, дуже обмежені (якщо взагалі цей метод можна застосувати в подібному аспекті).

Виявлення закономірностей виникнення й регуляції пейсмекерної активності в нервових клітинах є актуальним завданням, тому що воно може бути основою для практичних досліджень з тестування й вивчення механізмів дії різних фармакологічних препаратів.

Протягом багатьох років відома терапевтична дія біологічно активних компонентів вищих рослин - тритерпенових глікозидів (ТТГ). Для досліджених глікозидів роду Hederа була виявлена імуномодулююча активність (Krivoruchenko et al., 1997). Однак, поряд із лікувальним ефектом, ці речовини можуть виявляти і цитотоксичну дію (Hostettmann, 1995). Це означає, що при системному введенні ці хімічні речовини можуть впливати й на нервову систему, як найбільш реактивну систему організму. Тому існує необхідність більш поглибленого вивчення механізмів дії ТТГ на імпульсну активність нейронів.

Дослідження проводилися згідно з планами науково-дослідної роботи кафедри фізіології людини та тварин і біофізики Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського за програмою: "Механізми та функціональне значення ритмічної активності нейронів" (№ держ. реєстрації 0100U001369 (1999 - 2001)) та кафедри органічної хімії за програмами: "Вивчення будови й біологічних властивостей вуглеводів, вуглеводовмісних сполук та біополімерів" (№ держ. реєстрації 0197U001964 (1996 - 2000)) та "Отримання нових біологічно активних сполук на основі мурамоїлдипептиду та природних тритерпеноїдів" (№ держ. реєстрації 0197U000423 (1997 - 1999)).

Мета й задачі дослідження. Метою роботи було вивчення механізмів генерації та модуляції пейсмекерної активності в ідентифікованих нервових клітинах виноградного слимака, визначення ролі в них Ca2+-струму й струму (Jh-струм), активованого при гіперполяризації; вивчення рН-відповідей на нейронах молюска; дослідження особливостей біологічного впливу рослинних тритерпенових глікозидів на електричну активність нейронів і механізмів їхньої дії на нейрональну мембрану.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

1. Використовуючи метод внутрішньоклітинного відведення біопотенціалів, з'ясувати природу та іонні механізми пейсмекерної активності ізольованих ідентифікованих нейронів; визначити роль іонів кальцію й Jh-струму в її генерації.

2. За допомогою методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” дослідити рН-відповіді на нейронах молюска.

3. Одержати інформацію щодо біологічного впливу ТТГ на пейсмекерну активність.

4. Використовуючи метод фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина”, дослідити вплив монодесмозидних ТТГ на потенціал-керовані калієві струми.

Наукова новизна одержаних результатів.

Досліджено природу пейсмекерної активності ідентифікованих нейронів ППа1, ППа2, ППа7 і В7 виноградного слимака. Доведено, що генератор повільно-хвильового ритму, який індуціює пачкову активність у нейронах ППа1 та В7 із періодом більше 100 секунд, розташований у вісцеральному ганглії.

Визначено, що Ca2+ та Jh-струм не беруть безпосередньої участі в генерації пейсмекерної активності досліджених нейронів.

Показано, що локус генерації пейсмекерної активності розташований у дендритному дереві.

Уперше описаний новий тип кислотно-чуттєвих іонних каналів у нейронах молюска. Визначено природу й властивості вхідного струму.

Досліджено вплив моно- та бісдесмозидних ТТГ на електричну активність нейронів виноградного слимака. Показано, що гіперполяризуюча дія ТТГ залежить від їхньої хімічної структури й корелює з гемолітичною активністю.

Виявлено, що цитотоксична дія монодесмозидних ТТГ у високих концентраціях пов'язана з підвищеним виходом К+ із клітин.

Теоретичне та практичне значення роботи. Одержані результати мають теоретичну цінність, тому що вони є внеском у розвиток уявлень про виникнення й механізми регуляції ритмічної активності в нервових клітинах. Практичне значення результатів роботи полягає в тому, що були досліджені особливості впливу рослинних ТТГ на нейрони, а також визначені їхні порогові концентрації, що повинно бути враховане в клінічній медицині при розробці лікарських препаратів на їх основі.

Особистий внесок здобувача. Автором були виконані всі електрофізіологічні експерименти. У розробці концепцій досліджень активну участь брали співавтори друкованих робіт. Вивчення рН-відповідей на нейронах молюска проводилося спільно з аспіранткою Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця (м. Київ) О. Островською.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені на I республіканській конференції молодих вчених Криму (Сімферополь, 2000), на 2-й міжнародній конференції "Актуальные проблемы современного естествознания" (Калуга, 2000), International workshop "Membranes and signaling" (Київ, 2000), 4th International symposium on the chemistry of natural compounds SCNC-2001 (Isparta, Turkey), 11th European carbohydrate symposium (Lisboa, Portugal, 2001) і обговорювалися на наукових конференціях професорсько-викладацького складу Таврійського національного університету ім. В. І. Вернадського (Сімферополь, 1999, 2000).

Публікації. Результати роботи відображено в 5 наукових статтях і 5 тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 174 найменувань. Робота викладена на 110 сторінках, ілюстрована 18 рисунками та містить 1 таблицю.

Методика досліджень

Об'єкт досліджень. Експерименти були проведені на нейронах дорзальної поверхні підглоткового комплексу гангліїв молюсків Helix pomatia, Helix lucorum taurica Kryn та Lymnaea stagnalis.

Дослідження механізмів генерації пейсмекерної активності проводилося на ізольованих нейронах Helix pomatia ППа1, ППа2, ППа7 та В7. Техніка ізоляції була такою. Спочатку для точної ідентифікації нейронів реєстрували їх фонову електричну активність, а потім витягали мікроелектрод і перерізали конективу між правим парієтальним ганглієм (ППаГ), де розташовані клітини, і вісцеральним ганглієм (ВГ), куди спрямовані їхні головні відростки. Потім знову вводили мікроелектрод у клітину і, безперервно реєструючи електричну активність, за допомогою мікроманіпулятора витягали клітину з ганглія із залишком аксодендритного дерева, розташованого в ППаГ.

Для дослідження іонних струмів ізольовані нейрони Helix lucorum та Lymnaea stagnalis отримували за допомогою ферментативної обробки навкологлоткового ганглія у 0.35 % розчині пронази Е (Sigma, США). Час інкубації складав 45 хвилин при температурі 370С. Ізольовані нейрони виділялися при багаторазовому перепусканні потрібних ділянок ганглія через скляні піпетки (діаметр кінчика 0.5 - 1 мм).

Електрофізіологічні вимірювання. Для реєстрації електричної активності в нейрони вводили по одному мікроелектроду, що були зв'язані з вхідними передпосилювачами. Скляні мікроелектроди заповнювалися 2.5 М розчином KCl і мали опір 10-30 МОм. Електричну активність нейронів реєстрували на швидкодіючому чорнильному самописці Н 338-6П та осцилографі CI-69. Для стимуляції нейронів струмом у клітину одночасно вводили два мікроелектроди: один - для реєстрації МП, другий - для поляризації мембрани нейрона. У цьому випадку стимуляцію нейрона струмом проводили через навантажувальний опір 100 МОм за допомогою ізолюючого пристрою стимулятора ЕСУ-2. Під час роботи другий мікроелектрод був зв'язаний із виходом підсилювача фіксації потенціалу.

Для реєстрації струмів використовувався метод фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” (Hamill et al., 1981). Стандартний зовнішній розчин для наземних слимаків містив (у мМ): NaCl 100, KCl 4, CaCl2 10, MgCl2 4, TRIS-base 10; рН 7.45, а для водяних молюсків - (у мМ): NaCl 44, KCl 1.7 або 0, CaCl2 2, MgCl2 4, HEPES - NaOH 10, pH 5.3 - 8.1. Скляні мікропіпетки виготовлялися з легкоплавких капілярів діаметром 1.8 мм і мали опір 2 - 3 МОм. Для реєстрації натрієвих струмів піпетки заповнювалися розчином (у мМ): Cs 40, TRIS-base 12; pН 6.8; для реєстрції калієвих струмів - КCl 100, MgCl2 5, EGTA 5, HEPES-NaOH 10; рН 7.4. Зміну позаклітинних розчинів здійснювали шляхом додавання речовини в реєстраційну камеру, та (якщо визначено) методом “фіксації концентрації” (Krishtal et al., 1983), який давав можливість швидко змінити позаклітинний розчин за 20 - 50 мс. Усі електрофізіологічні експерименти проводилися при кімнатній температурі (19 - 240С).

Результати досліджень

Пейсмекерна активність нейронів ППа2 та ППа 7. У ході досліджень було ізольовано 17 нейронів ППа2 та 22 - ППа7. Після повної ізоляції соми із залишком аксодендритного дерева ці нейрони тривалий час продовжували генерувати спонтанну ритмічну активність, параметри якої були близькі до тих, які спостерігалися в інтактному ганглії. Через 40 - 80 хвилин після ізоляції спонтанна електрична активність нейронів ППа2 та ППа7, як правило, припинялася, причому штучна деполяризація клітин у цей час призводила до генерації нормальних за амплітудою і формою потенціалів дії (ПД). Візуальне спостереження за клітинами в мікроскоп свідчило, що припинення пейсмекерної активності корелювало з ретракцією залишку аксодендритного дерева в сому; приблизно через 60 - 80 хвилин цей процес практично закінчувався. Аналіз записів активності ізольованих нейронів ППа2 і ППа7 показав, що іноді на місці очікуваної генерації соматичних ПД виникали лише так звані дендритні ПД. Це спостереження дає можливість зробити висновок, що пейсмекерна активність нейрона ініціюється у віддаленій від соми зоні, а потім електротонічно поширюється й досягає низькопорогової зони мембрани клітини - початкового сегмента аксона, де вже й відбувається генерація повномірних соматичних ПД. Дендритні ПД за формою дуже близькі до соматичних, але відрізняються від них в основному лише значно меншою амплітудою.

Для того, щоб оцінити участь вхідного кальцієвого струму в процесі генерації активності нейронами ППа2 і ППа7, ми вивчали вплив аплікації 1 мМ CdCl2 в експериментальну камеру. Перфузія експериментальної камери розчином, що містить Cd2+, привела до зменшення амплітуди ПД (вірогідно за рахунок усунення їхніх кальцієвих компонентів), і збільшенню частоти генерації розрядів. Останнє обумовлено тим, що іони Са, проникаючи під час генерації ПД у клітину, викликають активацію кальційактивованої калієвої провідності (Meech, 1974), а це повинно до деякої міри збільшувати тривалість міжімпульсних інтервалів. Однак, пейсмекерний характер активності, на відміну від параметрів окремих ПД і частоти їхнього проходження, був стійкий до зовнішнього додатка 1 мМ CdCl2.

Модуляція електричної активності в нейроні ППа1. Для одержання прямих доказів екзогенного походження пачкової активності в нейроні ППа1, після перерізання конективи між ППаГ і ВГ, він був ізольований. Уже початкова стадія ізоляції - перерізка конективи - в усіх випадках (досліджено 24 препарати) усувала фонову активність нейрона ППа1. При цьому МП нейрона встановлювався на рівні -65 - -68 мВ. Такий же стан нейрон ППа1 зберігав і після повної його ізоляції з ганглія. Короткочасна аплікація через мікропіпетку розчину оксітоцину (10 мкМ) на ізольований нейрон ППа1 призводила до тимчасового розвитку типової пачкової активності. Через 30 - 40 хвилин, по мірі ретракції збереженої частини аксодендритного дерева в сому, здатність нейрона генерувати пачкову активність зменшувалася, і після цього аплікація оксітоцину викликала лише деполяризацію клітини і генерацію ПД, не організованих у пачки. Як і в нейронах ППа2 і ППа7, в окремих пачкових нейронах ППа1 можна було спостерігати дендритні ПД на гребені осциляцій МП; лише деякі з них викликали генерацію повноцінних соматичних ПД (див. рис. 1 В).

Раніше було показано (Koval et al., 1994), що якщо спостерігалася спонтанна модуляція електричної активності нейрона ППа1, то синхронна модуляція електричної активності мала місце й у нейрона В7. Таким чином, неідентифікований інтернейрон, що викликає генерацію пачкової активності в нейроні ППа1, також має аналогічний вхід і на нейрон В7. Тому, для розвўязання питання про локалізацію неідентифікованого пептидергічного інтернейрона (генератора), що викликає повільно-хвильові осциляції в нейроні ППа1, була вивчена фонова імпульсна активність 32 нейронів В7 в інтактному ганглії і після перерізання правої та лівої парієто-вісцеральної конектив. Нейрон В7 генерував пачкову активність із періодом більше 100 секунд. Тут чітко простежується робота генератора. Після перерізання правої парієто-вісцеральної конективи імпульсна активність нейрона не припинялася. Вона також зберігалася й у цілком ізольованому В. Повна ізоляція нейрона В7 з ганглія (10 препаратів), завжди призводила до усунення електричної активності. Таким чином, цей результат доводить, що генератор локалізований у ВГ.

Щоб оцінити внесок кальцієвого струму в генерацію пачкової активності нейроном ППа1, було досліджено вплив аплікації Cd2+. Як і повинно було очікувати, з урахуванням екзогенного походження пачкової активності в нейроні ППа1, вплив 1мМ CdCl2 призводив до зникнення подібної активності, яке відбувалося на фоні зниження амплітуди ПД за рахунок усунення кальцієвого компонента цих потенціалів. Пригнічення пачкової активності та зменшення амплітуди ПД були цілком оборотними й усувалися після відмивання кадмійвмістимого розчину стандартним розчином Рінгера. Щоб з'ясувати, чи є основною причиною зникнення пачкової активності інгібування кальцій-залежного вивільнення з терміналі пресинаптичного нейрона нейропептида, який індуціює пачкову активність, чи ж кальцієвий струм у нейроні ППа1 також бере безпосередню участь у генерації подібної форми активності, ми тестували ефект аплікації 1 мМ CdCl2 на фоні перфузії експериментальної камери розчином із нейропептидом, що викликає в нейроні ППа1 появу пачок ПД. Виявилося, що в цьому випадку, як і раніше, амплітуда ПД зменшується, але інгібування пачкової активності не спостерігається.

Вплив іонів цезію на пейсмекерну активність. Показано (Clapham, 1998; Luthi et al., 1998), що в деяких випадках деполяризація мембрани в пейсмекерних нейронах, яка відповідає за генерацію спонтанної активності, пов'язана з наявністю вхідного трансмембранного Jh-струму, активованого при гіперполяризації. Цей струм інгібується іонами цезію в концентрації до 1 мМ (Bal et al., 1997). Для відповіді на питання про участь Jh-струму в генерації пейсмекерної активності в досліджених нами ідентифікованих нейронах виноградного слимака (8 нейронів - ППа1, 5 - ППа2, 7 - ППа7), був вивчений вплив хлористого цезію на пейсмекерну активність. У наших експериментах додаток навіть 10 мМ Cs+ (а в окремих експериментах - і 20 мМ) не викликав достовірного пригнічення пейсмекерної активності ( що характеризується частотою генерації ПД). Залишається припускати, що цей струм не бере участі в генерації пейсмекерної активності досліджених нейронів.

РН-відповіді в нервових клітинах молюска. Більшість сенсорних нейронів ссавців здатно відповідати на швидкі зміни рН як у кислу, так і в лужну сторону (Krishtal et al., 1981; Waldmann et al., 1998). Швидкий зсув рН у кислу сторону супроводжується у таких клітинах виникненням натрієвого вхідного струму. Після досягнення максимального значення, активований протонами струм зменшується за експонентним законом із постійною часу, що слабко залежить від рН і від потенціалу на мембрані. Феноменологічно цей процес аналогічний явищу десенситизації постсинаптичних мембран до дії медіаторів (Krishtal et al., 1981). Його наявністю і викликана необхідність швидких змін рН для активації відповідного механізму. Тому аплікація позаклітинних розчинів проводилася за допомогою методу "фіксації концентрації". Було досліджено 98 ізольованих нейронів водяного молюска Lymnaea stagnalis. Швидкий зсув рН зовнішнього розчину від 8.1 до 5.3 призводив до розвитку швидко активованого вхідного струму, що демонстрував часткову десенситизацію протягом 100 - 200 мс (рис. 5). Виявлений протон-керований струм (рН-відповідь) сильно залежав від підтримуваного потенціалу на мембрані. При МП від -90 до -30 мВ спостерігалися незначні рН-відповіді із середньою амплітудою струму ~70 пА (див. рис. 5, вставка). Для позитивних значень підтримуваного потенціалу виявлялася залежність амплітуди струму від напруги на мембрані. Зі збільшенням потенціалу збільшувалася амплітуда вхідного струму.

Для того, щоб визначити, якими іонами переноситься індукований протонами струм, Na+ у позаклітинному розчині заміняли на еквімолярну кількість іонів триса. Однак, ні заміна Na+ на іони триса, ні повне усунення К+ із зовнішнього розчину не впливало на розвиток рН-відповідей. Ми припустили, що цей струм переноситься Са2+. Із підвищенням концентрації кальцію від 2 до 10 мМ (при відсутності Na+ і К+) у зовнішньому розчині вольт-амперна характеристика зсувалася в зону позитивних значень напруги, у той час, як амплітуда рН-відповідей трохи знижувалася. При зменшенні концентрації Са2+ від 2 до 0.5 мМ у натрійвмісному розчині тільки 8 клітин із 43 досліджених продемонстрували реакцію, специфічну до підвищення концентрації протонів у розчині.

Виходячи з отриманих результатів можна припустити, що іони Са відіграють подвійну роль у регуляції рН-відповідей. Із одного боку, вони проводять струм, а з іншого боку - здатні частково блокувати протонактивовані канали.

Дія тритерпенових глікозидів на нейрональну мембрану. Аплікація ТТГ була проведена на 63 нейронах ППа1, 57 - ППа2, 74 - ППа7, 31 - В7, 40 неідентифікованих нейронах у ППаГ та 31 нейроні у ВГ. Перфузія в експериментальну камеру бісдесмозидних глікозидів (11 сполук) у концентраціях 10-3 - 10-2 М не впливала на електричну активність досліджених нейронів. Монодесмозидні глікозиди (11 сполук) у високих концентраціях (2?10-3 - 10-3 та, у деяких випадках, 10-4 М) призводили до стійкої гіперполяризації мембрани нейронів, або викликали незворотні зміни в характері імпульсної активності після відмивання. Ймовірно, розвиток тривалої гіперполяризації обумовлений підвищеною калієвою провідністю. Для перевірки цього припущення було досліджено вплив ТТГ на сумарний калієвий струм (СКС).

Протонактивований вхідний струм. Стрілками біля кожної реєстрації струму відзначений потенціал на мембрані (мВ); східчаста зміна рН показана над записами струму. Вставка: рН-відповідь при підтримуваному мембранному потенціалі -50 мВ.

Заміна стандартного розчину Рінгера на розчин Рінгера, що містить монодесмозидний глікозид у концентрації 10-5 М, призводила до збільшення амплітуди СКС, викликаючи також зміну його форми. Середнє арифметичне значення амплітуди струму для контролю складало 1.85 ± 0.03 нА, а для струму, викликаного ТТГ 3.38 ± 0.18 нА. Після 5 - 7 хвилин від початку дії глікозиду, клітина припиняла демонструвати вихідний К+-струм, внаслідок її загибелі.

У наступній серії експериментів ми додавали в розчин Рінгера тетраетиламоній (ТЕА) 15 мМ, щоб з'ясувати дію ТТГ на кальцій-залежний калієвий струм. Із рис. 6 Б видно, що позаклітинне прикладання до нейрону зовнішнього розчину з ТЕА зменшувало середнє значення амплітуди струму, порівняно з контролем, приблизно на 1.4 нА. Але аплікація глікозиду з ТЕА знімала здатність ТЕА блокувати калієвий струм затриманого випрямлення. Амплітуда струму підвищувалася на 1.2 ± 0.05 нА. При відмиванні ефект глікозиду був необоротним. Більш нижчі концентрації глікозиду (10-7-10-6 М) не впливали на СКС.

Походження (ендогенне чи екзогенне) пейсмекерної активності нейронів. Як випливає з результатів проведених експериментів, активність нейронів ППа2 та ППа7 має ендогенне походження. Повна ізоляція цих клітин і тривалий додаток CdCl2 як до інтактних, так і до цілком ізольованих клітин, не приводили до помітної трансформації власної активності клітин, а тим більше до її зникнення. Через 40 - 60 хвилин після ізоляції активність цих клітин припинялася, причому це корелювало з ретракцією аксодендритного дерева сомою нейрона. Видається ймовірним, що саме драматична зміна електричних властивостей дендритів (де, як ми думаємо, знаходиться локус генерації пейсмекерної активності) відповідальна за блокування зазначеної активності. Локалізація пейсмекерного локусу на дистальних дендритах також була показана для NMDA-індукованої пачкової активності в дофамінергічних клітинах чорної субстанції (Seutin et al., 1994). Треба зазначити, що останні математичні моделі пейсмекерної активності клітини уже враховують ці експериментальні знахідки (Li et al., 1996).

Зовсім інша картина спостерігалася як при аплікації Cd2+ на нейрон ППа1, що генерує пачкову активність, так і при повній ізоляції цієї клітини. Виявилося, що навіть перерізання конективи між ППаГ і ВГ цілком усувало типову пачкову активність цього нейрона. Тим більше він не генерував подібної активності після ізоляції клітини чи додавання в зовнішній розчин Cd2+. Однак у всіх зазначених випадках зникла активність могла бути викликана зовнішнім додатком нейропептида. Отриманий результат дає можливість затверджувати, що активність нейрона ППа1 є пейсмекероподібною і залежить від впливу екзогенної біологічно активної речовини, яка секретується пептидергічним інтернейроном, розташованим у ВГ.

Роль вхідного кальцієвого струму в пейсмекерній активності. Багато моделей генерації пейсмекерної активності припускають провідну участь іонів кальція в цьому процесі. Вважається, що вхідний під час генерації ПД потік Са2+ у цитоплазму клітини може активувати [Са2+]in-активовану калієву провідність (Meech, 1974) чи ж інгібувати [Са2+]in-інгібовану стаціонарну кальцієву провідність (Kramer et al., 1985) і, таким чином, викликати фазу гіперполяризації. В інших випадках передбачається, що стаціонарний кальцієвий струм через низькопорогові кальцієві Т-канали створює постійну електрорушійну силу, що викликає деполяризацію мембрани, і, відповідно, пейсмекерну активність (Akasu et al., 1993).

В експериментах, виконаних на ідентифікованих нейронах виноградного слимака, ми не знайшли безпосередньої участі Са2+ у пейсмекерній активності. Іони Cd у концентрації, достатньої для повного припинення потоку Са2+ у клітину під час генерації ПД, у визначених умовах не приводили до помітного припинення пейсмекерної активності. Хоча Cd2+ сам по собі інгібував пейсмекероподібну пачкову активність у нейроні ППа1, аплікація цього блокатора на фоні попереднього додавання в експериментальну камеру нейропептида, одержаного з мозку молюсків і ініціюючого повільні хвилі МП, не викликала інгібування електричної активності клітини. У даному випадку амплітуда ПД нейрона зменшувалася, чого й треба було очікувати, оскільки Cd2+ пригнічує потенціал-керований кальцієвий струм. Таким чином, очевидно, що інгібування пачкової активності, яке ми спостерігали, пов'язано з пригніченням кальцій-залежного вивільнення з пресинаптичних терміналей пептидергічного інтернейрону нейропептиду, що ініціює пачкову активність.

У дослідженнях, проведених на дофамінергічних нейронах чорної субстанції, що генерують пачкову активність в інтактному мозку ссавців (а при аплікації NMDA - і в переживаючих зрізах), також не знайшли участі Са2+ у генерації пейсмекероподібної активності (Johnson et al., 1992). Цікавий результат був отриманий на нейронах аплізії. Зовнішній додаток 40 мМ кофеїну викликав появу осциляцій МП і генерацію типової пачкової активності в культивованих нейронах аплізії, які спочатку не мали пейсмекерної активності в інтактному ганглії, та в умовах культивування. При цьому додаток Cd2+ з одночасним заміщенням Са2+ у зовнішньому розчині на Mg2+ не призводив до інгібування пейсмекероподібної активності, викликаної кофеїном, хоча і значно впливав на параметри ПД (Комендантов и др., 2000).

Залежність змін електричної активності нейронів від хімічної структури тритерпенових глікозидів. При вивченні біологічної дії глікозидів на нейрони було встановлено, що, незалежно від числа вуглеводних залишків у вуглеводному ланцюзі, пов'язаного ацилглікозидним зв'язком з агліконом (від 1 до 3 моносахаридних залишків у досліджуваній серії), бісдесмозидні глікозиди в концентраціях 10-3 - 10-2 М не впливали на фонову активність досліджених нейронів. Навпаки, аплікація монодесмозидних глікозидів у концентрації 10-3 М створювала виражену гіперполяризуючу дію на електричну активність як ідентифікованих, так і неідентифікованих нейронів. Очевидно, наявність вільної карбоксильної групи в С-17 в агліконах досліджуваних глікозидів і обумовлює вплив монодесмозидних глікозидів на електричну активність нейронів. Це корелює з відомим фактом про відсутність гемолітичної активності у бісдесмозидних глікозидів і наявності її у глікозидів із вільною карбоксильною групою у С-17 (Hostettmann, 1995).

Порівняння дії глікозидів олеанолової кислоти й хедерагенину показало, що залежність від природи аглікона має другорядний характер, тоді як природа і число моносахаридних залишків у ланцюзі у С-3 атома аглікона впливають на характер дії ТТГ. Не виключено, що ефект досліджуваних монодесмозидних ТТГ на мембрану нервових клітин аналогічний їх гемолітичній дії на структуру еритроцитів. Тому цікаво було зіставити отримані дані про гіперполяризуючий вплив глікозидів із даними щодо їх гемолітичної активності. Кореляційний аналіз показав наявність сильної позитивної кореляції між пороговими концентраціями для гіперполяризуючого ефекту монодесмозидних ТТГ і їхніми концентраціями, що викликають 50 % гемоліз еритроцитів (коефіцієнт кореляції 0.85).

Особливості впливу монодесмозидних глікозидів на проникність клітинної мембрани. Отримані нами експериментальні дані дають можливість зробити висновок, що монодесмозидні ТТГ мають гіперполяризуючу дію на мембрану нейронів, що залежить від структури вуглеводного ланцюга й природи моносахаридних залишків, що, мабуть, обумовлюється ступенем їхнього зв'язування з компонентами ліпідного шару клітинної мембрани. Це призводить до утворення неселективних пор у нейрональній мембрані та витоку К+ з клітини. Ці результати корелюють із даними, одержаними при дослідженні впливу голотурину А2 на модельні мембрани, що містять стерини (Корепанова и др., 1980). Як випливає з результатів проведених експериментів, монодесмозидні ТТГ у концентраціях 2·10-3 - 10-4 М володіють цілком вираженою цитотоксичною дією. Дана властивість глікозидів повинна враховуватися при розробці лікарських препаратів на їхній основі.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою методу внутрішньоклітинного відведення біопотенціалів показано, що пейсмекероподібна пачкова активність нейрона ППа1 має не ендо-, а екзосоматичне походження, тобто вона зв'язана з дією біологічно активних речовин, які секретуються іншими пептидергічними нейронами. Генератор повільно-хвильового ритму, який індуціює пачкову активність у нейронах ППа1 та В7 з періодом більше 100 секунд, розташований у вісцеральному ганглії. Пейсмекерна активність ідентифікованих нейронів ППа2 та ППа7 має ендогенний характер.

2. На даному етапі дослідження можна виключити безпосередню участь Са2+ в електричних процесах, що визначають генерацію пейсмекерної активності в нейроні, обмеживши їхню пряму участь у секреції біологічно активних речовин із пресинаптичних терміналей інших клітин, якщо має місце екзогенний характер пейсмекерної активності. Активований при гіперполяризації вхідний Jh-струм не бере участі в генерації пейсмекерної активності нейронів.

3. Локус генерації пейсмекерної активності нервової клітини, що демонструє ендогенну чи пейсмекероподібну активність, мономодальну ритмічну чи пачкову, розташований у віддаленій від соми зоні - найбільш вірогідно, в дендритному дереві. Відстань уздовж волокна від місця генерації імпульсів до соми складає приблизно 1.2 мм.

4. За допомогою методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” виявлено новий тип протон-керованого струму, відмінний від описаних раніше струмів кислотно-чуттєвих іонних каналів, що спостерігаються в нейронах ссавців. Показано, що цей струм є Са2+-селективним струмом і сильно залежить від потенціалу на мембрані, якщо він активований при позитивних значеннях напруги.

5. Вплив на нервові клітини тритерпенових глікозидів, для яких була встановлена імуномодулююча активність, показав, що незалежно від числа вуглеводних залишків у вуглеводному ланцюзі, зв'язаних ацилглікозидним зв'язком із агліконом, бісдесмозидні глікозиди в концентраціях 10-3 - 10-2 М не впливали на фонову активність нейронів. Навпаки, монодесмозидні глікозиди (10-3 - 10-4 М) здійснювали гіперполяризуючу дію на електричну активність як ідентифікованих, так і неідентифікованих нейронів. При цьому чітко спостерігалася кореляція між ступенем впливу на фонову електричну активність нейронів і гемолітичною активністю глікозидів (коефіцієнт кореляції 0.85). Зона виникнення потенціалів виявилася менш чуттєвою до дії тритерпенових глікозидів, ніж сама соматична мембрана.

6. Методом фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” встановлено, що розвиток тривалої гіперполяризації у нейронів при дії монодесмозидних глікозидів у концентраціях 10-3 - 10-4 М обумовлений підвищеним виходом К+ із клітин.

7. Результати наших експериментів дають можливість припустити, що монодесмозидні ТТГ здатні зв'язуватися з компонентами ліпідного шару нейрональної мембрани, що призводить до утворення в ній неселективних пор і витоку К+ із клітин. Цитотоксична властивість, що була виявлена у монодесмозидних глікозидів, повинна враховуватися при розробці лікарських препаратів на їхній основі.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кононенко Н.И., Костюченко О.В. Механизмы генерации ритмоводящей активности в идентифицированных нейронах виноградной улитки //Нейрофизиология. -2001. -Т.33, №1. -С.46-54.

2. Ostrovskaya O.I., Kostyuchenko O.V., Krishtal O.A. A component of the transmembrane current in molluscan neurons is gated by both protons and voltage //Нейрофизиология. -2000. -Т.32, №3. -С.171-172.

3. Костюченко О.В., Гришковець В.І., Коренюк І.І. Особливості дії рослинних глікозидів на нейрони слимака //Фізіологічний журнал. -2001. -Т.47, №4. -С.42-48.

4. Костюченко О.В., Гришковец В.И., Соболев Е.А., Коренюк И.И. Влияние структурных факторов тритерпеновых гликозидов на изменение электрической активности нейронов моллюска //Химия природных соединений. -2001. №1. -С.39-42.

5. Костюченко О.В., Коренюк И.И. Эндогенная пейсмекерная активность изолированных нейронов моллюска //Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. -2000. -Т.13(52). -С.37-41.

6. Костюченко О.В. Роль входящего кальциевого тока и Н-тока в генерации ритмоводящей активности нейронов виноградной улитки //Актуальные вопросы современной биологии. Материалы I республиканской конференции молодых ученых Крыма. Симферополь, 18 мая. -2000. -С. 61-63.

7. Костюченко О.В., Хусаинов Д.Р., Гамма Т.В. Влияние тритерпеновых гликозидов на электрическую активность идентифицированных нейронов моллюска //Материалы I республиканской конференции молодых ученых Крыма. Симферополь, 18 мая. -2000. -С.63-64.

8. Kostyuchenko O.V., Korenyuk I.I. Pacemaker properties of isolated Helix pomatia neurons //Advances in modern natural sciences. 2nd International Conference Kaluga, Russia, June 6-9. -2000. Abstracts. -P. 238-239.

9. V.I. Grishkovets, E.A. Sobolev, O.V. Kostyuchenko. Neuron hyperpolarisation action of plant triterpene glycosides //4th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds SCNC-2001, Isparta, Turkey, June 6-8. -2001. Abstracts. -P.52.

10. V.I. Grishkovets, E.A. Sobolev, O.V. Kostyuchenko. Hyperpolarisation action of triterpene glycosides //11th European Carbohydrate Symposium, Lisboa, Portugal, September 2-7. -2001. Abstracts. -P.404.

Размещено на Allbest.ru