Алельний поліморфізм мінісателітних та мікросателітних локусів в популяціях з різних регіонів України

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут молекулярної біології і генетики

УДК 577. 21 + 575.857+ 343.98.06

Алельний поліморфізм мінісателітних та мікросателітних локусів в популяціях з різних регіонів України

03.00.26 - молекулярна генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Кравченко Сергій Афанасійович

Київ 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий керівник

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Лівшиць Людмила Аврамівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, в.о. завідувача відділу геноміки людини.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Соломко Олександр Петрович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, завідувач відділу біохімічної генетики;

доктор сільськогосподарських наук, професор Глазко Валерій Іванович, Інститут агроекології і біотехнології УААН, м.иїв, завідувач відділу молекулярно-генетичних досліджень

Провідна установа:

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра загальної та молекулярної генетики, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 18.06.2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 17.05.2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Підпала О.В.

алельний поліморфізм гетерогенність локус

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення індивідуальної мінливості є принциповою сферою інтересів генетиків. У 80-х роках минулого сторіччя, впровадження нових технологій дозволило вивчати не тільки продукт генів - білки, але й проводити дослідження із вивчення мінливості на рівні ДНК - матеріального субстрату спадковості. В 1991 році комітет міжнародного проекту “Геном людини” HUGO запропонував програму із вивчення генетичного різноманіття популяцій людини, метою якого є систематичне дослідження біологічної історії та генетичної диференціації існуючих популяцій та створення і збереження для майбутніх досліджень банку зразків ДНК індивідів, які складають сучасне різноманіття людського геному, оскільки, генетична різниця між існуючими популяціями дуже швидко зникає внаслідок урбанізації та міграції. В рамках міжнародної програми "Human Genetic Diversity", започаткованої в 1992 р. Каваллі-Сфорца (Cavali-Sforza, 1992), в лабораторіях світу були започатковані дослідження різноманіття поліморфних послідовностей ДНК геному людини в популяціях та етнічних групах світу. В нашій лабораторії було розпочато створення банку зразків лейкоцитарної ДНК донорів з різних регіонів України та аналіз алельного поліморфізму ПДРФ-локусів геному цих регіонів (Лівшиць, 1991).

Відкриття гіперваріабельних локусів ДНК є одним із найважливіших наукових досягнень 80-х років в галузі генетики людини через величезну значимість застосування їх для генетичного картування, сегрегаційного аналізу в родинах із спадковими захворюваннями, вивчення молекулярної еволюції, ідентифікації особистості. Проте, найбільш широко досліджуються ці локуси в популяційній генетиці, оскільки, аналіз варіювання певних алельних варіантів, генотипів та гаплотипів цих локусів з різних хромосом людини дозволяє проаналізувати генетичну спорідненість або віддаленість популяцій та етнічних груп, і в цьому контексті, ретроспективно дослідити еволюцію народонаселення. На сьогодні в геномі людини відкрито декілька тисяч гіперваріабельних локусів, які, спираючись на попередні популяційні дослідження їх алельного поліморфізму, широко використовуються як генетичні маркери в практиці судово-медичної експертизи.

Населення сучасної України є багатонаціональним і відзначається складністю процесів свого формування. Історію популяції України, як і інших європейських народів, можна порівняти з генним потоком через століття, до якого час від часу вливалися окремі “струмки”. Оскільки Україна до останнього часу залишалася білою плямою на геногеографічній карті Європи, проведені в нашій лабораторії дослідження природи, походження та шляхів розповсюдження в популяції України мажорних мутацій генів спадкових захворювань (Livshits et al., 1996) стали початком створення генетичної карти України. Аналіз алельного поліморфізму в гіперваріабальних регіонах геному людини, якому присвячена дана робота, є новим важливим етапом цих досліджень у вивченні генетичної структури, диференціації та біологічної історії регіональних популяцій України.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота відповідає основному планові науково-дослідних робіт відділу генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, зокрема бюджетній темі: "Популяційно-генетичні дослідження мутацій в групах високого ризику тяжких спадкових патологій в Україні" (№ держ. реєстрації 0196U005251, 1996-2000 рр.).

Робота також виконувалась в рамках отриманих на конкурсних засадах вітчизняних та міжнародних проектів: "Поліморфізм ДНК деяких локусів геному людини" (програма "Фонд фундаментальних досліджень" ДКНТ України, шифр 5.3/9, 1994-1995рр.); "Створення тест-систем для ДНК-дiагностики спадкових хвороб, поширених на Українi" (шифр 01.01.01/056-92, 1992-1995рр.) та (DGA/DSP/STTC) гранту Інституту Захисту та ядерної безпеки та Національного інституту раку за програмою EUROGEM (Франція).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є аналіз алельного поліморфізму в гіперваріабельних мінісателітних (VNTR) та мікросателітних (STR) послідовностях ДНК геному людини серед населення регіональних популяцій України та дослідження генетичної гетерогенності цих популяцій.

Для досягнення мети були поставлені основні завдання дослідження:

1.Створити банк зразків лейкоцитарної ДНК донорів з популяцій різних регіонів України.

2. Провести аналіз алельного поліморфізму аутосомальних VNTR-локусів: APOВ, PYNZ22, IGHJ, PMСT118 та STR-локусів: 2AE9.1, Rep4, VWF-8, VWA, TH01, D21S11; а також STR-локусів HPRT (Х-хромосома) та DYS19, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393 (Y-хромосома) в регіональних популяціях України.

3. На основі власних та літературних даних провести порівняльний аналіз частоти та спектра алелів та гаплотипів досліджуваних локусів у регіональних популяціях України та інших країн світу.

4. Визначити параметри інформативності досліджених локусів та запропонувати панель поліморфних маркерів для проведення ДНК-аналізу в судово-медичній експертизі.

Об`єктом дослідження були поліморфні ДНК-локуси геному людини, а предметом - частота і спектр алельних варіантів, генотипів та гаплотипів досліджуваних локусів. У роботі використовували методи: виділення та очищення ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, різні види гель-електрофорезу та статистична обробка даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було створено банк зразків лейкоцитарної ДНК донорів з популяцій різних регіонів України - Київської, Львівської, Полтавської та Луганської областей та популяції кримських татар.

Вперше були отримані дані про частоту і спектр алельних варіантів та генотипів у аутосомальних VNTR- та STR-локусів та локусу HPRT Х-хромосоми в регіональних популяціях України. Отримано дані про розподіл алельних варіантів та гаплотипів Y-STR-локусів у регіональних популяціях України, Білорусі та Росії.

За результатами аналізу Y-STR-гаплотипів було сформовано мережу гаплотипів та виявлено два мажорних гаплотипи 13/11/10/25/16 і 13/11/11/24/16, які, найбільш імовірно, є “прабатьківськими” в популяціях східних слов'ян. Встановлено, що популяція кримських татар є генетично гетерогенною, про що свідчить високий показник індексу різноманіття гаплотипів - Dhp=0,973.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані спектра та частоти алельних варіантів, генотипів та гаплотипів досліджуваних міні- та мікросателітних локусів дозволили встановити основні характеристики алельного поліморфізму цих локусів серед населення України. Встановлено, що аналіз алельного поліморфізму STR-локусів Y-хромосоми є більш інформативним для дослідження генетичної диференціації популяцій (навіть “близькоспоріднених”) порівняно з аналізом ДНК-локусів аутосом.

Отримані показники генетичних відстаней, які розраховано на основі розподілу алельних частот 5-ти STR-локусів Y-хромосоми між популяціями східних слов'ян з України, Білорусії, Росії та іншими популяціями світу продемонстрували близькість всіх східнослов'янських популяцій і їхню генетичну віддаленість від інших популяцій Європи та Азії.

Визначені параметри інформативності проаналізованих мінісателітних та мікросателітних локусів дозволили вибрати панель ДНК-маркерів, перспективних для проведення точної ідентифікації особистості та аналізу біологічного батьківства в судово-медичній експертизі в України.

Результати роботи використовують при читанні курсу лекцій "Генетика людини" студентам біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Весь обсяг експериментальної частини дисертації, пошук та обробку літературних даних виконано автором особисто. Аналіз та обговорення результатів проводилися спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на вітчизняних та міжнародних з'їздах та конференціях: II-му з'їзді медичних генетиків України (Львів, 1995), 8-му з'їзді з генетики людини (Німеччина,1996), на X міжнародній конференції “Human Genetics” (Відень, Aвстрія, 2001) та конференції “Conference for students, PhD students and young scientists” (Київ, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 14 друкованих праць, зокрема, 10 статей у вітчизняних та міжнародних фахових виданнях та тези 4 доповідей на вітчизняних та міжнародних конференціях та з'їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, отриманих результатів власних досліджень та їх обговорення, підсумку, висновків та переліку використаних джерел. Текст дисертації проілюстровано 50 таблицями та 21 рисунком. Перелік використаних джерел містить 173 найменувань. Дисертаційну роботу викладено на 158 сторінках машинописного тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи. Матеріалом для проведення дослідження були зразки крові донорів з різних регіонів України - міст Києва, Львова, Кременчука, Алчевсьва та популяції кримських татар, зразки ДНК з популяцій міст Пінська (Білорусь) та Новгорода (Росія), люб'язно надані для дослідження проф. С.А.Лімборською (м. Москва, Росія), а також анонімні зразки крові осіб, які проходили судово-медичну експертизу з питань спірного батьківства в ГБ судово-медичної експертизи МОЗ України. В роботі використовували загальноприйняті методи: виділення та очищення ДНК, (Маниатис, 1988), полімеразна ланцюгова реакція (Saiki et al., 1983) та різні типи гель-електрофорезу. Власні модифікації методів, а також послідовності олігонуклеотидних праймерів наведені в дисертації. Статистичну обробку даних проводили за загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Лі, 1980) з використанням пакету програм “GENEPOP” (Raymond, 1995),"SYSTAT" та PHILIP (Felsenstein, 1993).

Результати дослідження та їх обговорення

Аналіз алельного поліморфізму аутосомальних мінісателітних та мікросателітних локусів та локусу HPRT. Нами проведено аналіз алельного поліморфізму в чотирьох мінісателітних (VNTR) локусах: APOВ, PYNZ22, IGHJ, PMСT118 та в семи мікросателітних (STR) локусах: 2AE9.1, Rep4-cf, VWF-8, VWA, TH01, D21S11 та локусі HPRT у вибірках із популяцій різних регіонів України - міст Києва (196 осіб), Львова (146 осіб), Кременчука (132 особи) та Алчевська (181 особа). Загальну характеристику локусів наведено в таблиці 1.

Узагальнені результати аналізу спектра та частоти алельних варіантів досліджуваних локусів серед населення України наведено на рисунках 3 та 4. Найбільш поліморфним виявився локус PMСT118, в якому було виявлено 15 алельних варіантів, найменш поліморфним - Rep4-cf - всього 2 алельних варіанти. Отримані нами дані про розподіл генотипів перевіряли на відповідність рівновазі Харді-Вайнберга з використанням критерію ч2. Розподіл фактичних частот генотипiв, як у кожнiй окремій аналiзованiй популяцiї, так і в Україні в цілому, відповідав теоретично очікуваному за всіма досліджуваними локусами.

В питаннях динаміки генетичного складу важливим параметром є гетерозиготність. При вивченні різних типів добору, дрейфу генів, процесів міграції, панміксії та інбридингу оцінка відповідних факторів популяційної динаміки часто пов'язана з рівнем гетерозиготності в популяціях. За всіма локусами нами було розраховано показники фактичної гетерозиготності, які варіювали від 36,4% (Rep4-cf) до 84,9% (D21S11). Для встановлення відхилень мiж фактичною та теоретичною гетерозиготністю в дослiджуваних популяцiях, було застосовано тест із визначення дефіциту чи надлишку гетерозигот (Rousset and Raymond, 1995). Рiзниця мiж фактичною гетерозиготністю та теоретичною в дослiджуваних популяцiях виявилася невірогідною для всіх локусів, за винятком локусу Rep4-cf. Проведений детальний аналіз параметрів гетерозиготностi полiморфного локусу Rep4-cf, а саме, показників відхилення фактичної гетерозиготності від теоретичної в усіх чотирьох популяціях і в Україні в цілому, наочно вказував на наявність надлишку гетерозигот в усіх аналізованих популяціях. Відхилення фактичної гетерозиготності від теоретичної в окремих регіональних популяціях не були статистично вірогідними, проте в рандемізованій вибірці населення України зафіксовано статистично вірогідний надлишок гетерозигот (Р=0.026). Слід зауважити, що локус Rep4-cf знаходиться в 6-му інтроні гена трансмембранного регуляторного білка муковісцидозу (ТРБМ). В попередніх дослідженнях (Кравченко и др., 1993) було показано наявність тісного (100%-го) зчеплення між алелем "06" і делецією F508 в гені ТРБМ, яка призводить до тяжкого спадкового захворювання - муковісцидозу. Імовірно, виявлені нами відхилення в розподілі генотипів можна пояснити наявністю добору проти гомозигот з генотипом “0606”, або на користь гетерозигот з генотипом “0607”, основним механізмом якого є селективна перевага гетерозигот з делецією F508, з якою тісно зчеплений відповідний алельний варіант "06" локусу Rep4-cf. Оскільки цей локус, скоріше за все, не є селективно нейтральним, ми вважали за доцільне не використовувати його як маркер при популяційних дослідженнях. Слід зазначити, що показники гетерозиготності за кожним окремим локусом не завжди адекватно віддзеркалюють всю сукупність динамічних процесів, які можуть відбуватися в популяціях. Тому, нами було проведено оцінку середньої гетерозиготності за всіма локусами. Нами не було виявлено вірогідних відмінностей мiж середніми показниками фактичної та теоретичної гетерозиготності усіх дослiджуваних популяцiях та по Україні в цілому. Так, показники відхилення (D) не перевищували і 2%, що може свідчити про випадковий характер виявлених нами незначних відхилень за деякими локусами. Найвищі показники середньої гетерозиготності були в київській популяції (Hо = 0.760), найнижчі - у львівській (Hо = 0,733). Це дає підставу для припущення про відносно більшу гетерогенність міського населення Києва порівняно з більш однорідною популяцією зі Львова. Проте ця різниця не виявилася статистично вірогідною (tst=1,40; Р>0.05).

При порівнянні популяцій спираються на аналіз їх генетичної структури - сукупності алельних частот локусів і частот генотипів. Одночасний аналіз багатьох маркерів сприяє об'єктивності результатів дослідження спорідненості або віддаленості популяцій в генетичному розумінні. При порівняльному аналізі популяцій перевіряли “нульову” гіпотезу, згідно якої міжпопуляційна диференціація відсутня. Для цього проводили тест вірогідності відхилення від “нульової” гіпотези за критерієм Фішера (Fisher exact test) (Raymond and Rousset, 1995). Отримані результати наведено в таблиці.

За результатами аналізу 9-ти аутосомальних міні- та мікросателітних локусів та локусу HPRT нами не було виявлено статистично вірогідних відмінностей (Р=0.705) між усіма популяціями, тобто підтверджувалася нульова гіпотеза про відсутність генетичної диференціації між регіональними популяціями України.

При порівняльному аналізі популяцій можлива ситуація, коли в різних популяціях алелі одного локусу мають подібний спектр і частоту, в той час, як генні концентрації іншого локусу відрізняються між собою. У таких випадках розраховують інтегральний показник, який характеризує “віддаленість” чи “подібність” популяції за всіма дослідженими маркерам - генетичну відстань. Так, для дослідження генетичної спорідненості регіональних популяцій нами були проведені розрахунки показників генетичних відстаней за Неєм (Nei, 1987), які наведено в таблиці 3. На основі показників генетичних відстаней було побудовано дендрограму генетичної подібності, яка наочно демонструє відносну “близькість” та “віддаленість” досліджуваних регіональних популяцій (рис.5).

Найбільш генетично “близькими” виявилися популяції Києва та Кременчука. Це віддзеркалює отримані нами результати про відсутність статистично вірогідних відмінностей в розподілі алельних варіантів кожного окремого досліджуваного локусу. Найбільш "віддаленими" між собою виявилися популяції Львова і Алчевська та Львова і Кременчука. Таку відносну “віддаленість” окремих популяцій можна пояснити за рахунок виявленої нами різниці в розподілі частот алельних варіантів деяких локусів, а саме APOB, IGHJ, PMCT118 та WVA між цими популяціями. В цілому, за результатами аналізу алельного поліморфізму аутосомальних локусів та локусу HPRT, не виявлено вірогідних відмінностей розподілу частот алельних варіантів, тому популяцію України, представлену вибірками міст Києва, Львова, Кременчука та Алчевська, можна вважати генетично гомогенною.

Подібні результати досліджень аутосомальних локусів були отримані й для інших популяцій світу. Було показано, що міжіндивідуальна мінливість у межах однієї популяції може досягати 85%, в той час, як міжпопуляційна мінливість складає лише 15% (Cavali-Sforza, 1998). Слід зазначити, що на відміну від аутосом, Y-хромосоми можуть характеризуватися високою міжпопуляційною варіабельністю, оскільки ефективний розмір популяції для Y-хромосом у чотири рази менший за цей показник для аутосом. Отже, дрейф генів може мати набагато більший вплив на варіабельність Y-хромосом порівняно з аутосомами. Тому, ми спрямували свої подальші дослідження на вивчення алельного поліморфізму мікросателітних локусів Y-хромосоми.

Дослідження поліморфізму мікросателітних локусів Y-хромосоми в регіональних популяціях України та в інших популяціях світу. Було проведено аналіз алельного поліморфізму та гаплотипів Y-STR-послідовностей, які являють собою варіюючу кількість GATA-повторів (локуси - DYS19, DYS390, DYS391 та DYS393) та АТТ-повторів (локус DYS392) з нерекомбінуючої (псевдоаутосомальної) ділянки Y-хромосоми серед індивідів чоловічої статі з регiональних популяцiй України (міст Києва (90 осіб), Львова (63 особи), Кременчука (67 осіб), Алчевська (65 осіб) і популяції кримських татар (76 осіб)) та з Білорусі (м. Пінськ, 38 осіб) і Росії (м. Новгород, 50 осіб). Усі проаналізовані локуси виявилися поліморфними, кількість виявлених алелів у різних локусах варіювала від 3 (DYS393) до 8 (DYS392). За всіма локусами спостерігали унімодальний розподіл алельних варіантів, за винятком локусу DYS392, для якого розподіл алелів був бімодальним. Були розраховані показники індексу алельного різноманіття (Dg) - параметр, еквівалентний показнику гетерозиготності для Y-хромосом. В наших дослідженнях найбільший індекс алельного різноманіття було виявлено для локусу DYS19 в популяції з Алчевська - Dg=0,76; найменше значення даного показника встановлено для локусу DYS392 у популяції з Києва (Dg=0,24). Індекси алельного різноманіття в усіх досліджуваних популяціях слов'янського походження були подібними, як за окремими локусами, так і в середньому в популяціях. Про високий ступінь гетерогенності популяції кримських татар свідчило найбільше середнє значення цього показника (Dg =0,60). Відносно низький індекс для локусу DYS392, обумовлений наявністю мажорного алеля “11”, частота якого в усіх досліджуваних популяціях, за винятком кримських татар, перевищувала 80%, в той час, як в європейських популяціях частота даного алеля варіювала від 18% до 61%. Цікаво зазначити, що для локусу DYS391 в популяції кримських татар частота мажорного алеля “10” сягала 70%, в той час, як в усіх інших досліджуваних нами популяціях, а також в популяціях європейських країн, було виявлено два мажорних алелі - “10” і “11”, з частотою розповсюдження близько 50% (De Kniff et al., 1997). Розподіл частот алельних варіантів для локусів DYS390 і DYS19 в досліджуваних популяціях характеризувався зміщенням у бік підвищення частот алелів з більшим числом тандемних повторів. Така ж тенденція була характерною для деяких азіатських популяцій. У наших дослідженнях для локусу DYS390 було виявлено найбільш розповсюджені алелі “24” і “25”, тоді як у європейських популяціях найбільш частими є алелі “22”, “23” і “24”. В усіх досліджуваних популяціях локус DYS19 характеризувався наявністю мажорного алеля “16”, з частотою близько 40%. Подібний розподіл алелів цього локусу спостерігається в популяціях Словаччини і Польщі (Pawlowski et al., 1999), де алель “16” також був мажорним, в той час, як в західноєвропейських популяціях частота його не перевищувала 25%.

За результатами порівняльного аналізу розподілу частот алельних варіантів усіх Y-STR-локусів, статистично вірогідні міжпопуляційні вiдмiнності були виявлені між усіма популяціями слов'янського походження та популяцією кримських татар (Р<0,001), а також між популяціями Києва і Пінська (Р=0,004) та Києва і Алчевська (Р=0,003). Проте, визначений нами показник імовірності алельної диференціації між усіма популяціями слов'янського походження з України (Р=0,103), вказує на відсутність статистично вірогідної підрозділеності цих регіональних популяцій за розподілом частот алельних варіантів 5-ти Y-STR-локусів.

Використовуючи дані розподілу алельних частот п'яти досліджених STR локусів, були розраховані генетичні відстані за Неєм між досліджуваними популяціями і деякими популяціями Європи та Азії (De Kniff et al., 1997; (Perez-Lezuan et al., 1999). На їх основі було побудовано дендрограму генетичної подібності даних популяцій (рис. 6).

Звертає на себе увагу кластеризація розміщення популяцій на філогенетичному дереві, яка демонструє близькість східнослов'янських популяцій і їхню віддаленість від популяцій Західної і Центральної Європи. Усі слов'янські популяції знаходяться на одній “гілці”, до якої входять і популяції з Середньої Азії. Популяція кримських татар розміщується на одній “гілці” з популяціями турків та болгар. Усі інші популяції Центральної та Західної Європи утворюють свою окрему “гілку”. Подібну закономірність нами було встановлено також при дослідженні диалельних локусів Y-хромосоми (Rosser et al., 2000).

Особливу роль у вивченні поліморфних локусів Y-хромосоми відіграє аналіз гаплотипів, оскільки саме вони визначають популяційну специфічність. Нами було проведено аналіз гаплотипів п'яти поліморфних Y-STR локусів у досліджуваних популяціях. Серед 449 обстежених індивідів було виявлено 143 різних гаплотипи. Розподіл та частоту найбільш розповсюджених гаплотипів наведено в таблиці 3. Найбільш частим серед населення слов'янського походження з України виявився гаплотип №1 з алельними варіантами 13/11/11/24/16 (12,6%). Цей же гаплотип був мажорним в популяції Пінська (13,2%). Найбільш частим у популяції з Новгорода виявився гаплотип №3 13/11/10/25/16 - 22%. В популяції кримських татар не вдалося визначити мажорний гаплотип, оскільки одразу 9 різних гаплотипів зустрічалися майже з однаковою низькою частотою - 3,9%-5,2%.

Нами були розраховані індекси різноманіття гаплотипів у досліджуваних популяціях. Найменше значення цього показника було виявлено у популяції з Новгорода Dhp=0,918. Найбільші значення цього показника було виявлено саме в популяції кримських татар - Dhp=0,973, оскільки серед 76 індивідів було виявлено 49 різних гаплотипів. Результати аналізу різноманіття гаплотипів у цій популяції, так само, як і результати аналізу алельної варіабельності, свідчать про те, що популяція кримських татар є найбільш гетерогенною серед усіх досліджуваних.

Показник імовірності диференціації популяцій слов'янського походження з України за частотами гаплотипів (Р=0,171) дає підставу вважати популяцію України генетично гомогенною. За результатами попарного порівняльного аналізу не було виявлено вірогідної різниці в розподілі частот гаплотипів між чотирма популяціями слов'янського походження з України та популяцією з Пінська. Важливо зазначити, що між популяцією Новгорода та усіма іншими популяціями слов'янського походження виявлені вірогідні відмінності в розподілі частот гаплотипів. Імовірно, ця диференціація обумовлена наявністю у популяції з Новгорода мажорного гаплотипа №3 (22%), в той час, як частота мажорного для популяцій з України та Білорусі гаплотипу №1, в популяції з Росії сягала лише 4% (табл.3). При порівняльному аналізі розподілу частот гаплотипів виявлено вірогідну різницю між популяцією кримських татар та усіма популяціями слов'янського походження.

Встановлено, що нові гаплотипи утворюються в основному внаслідок мутацій (делецій чи інсерцій), які змінюють послідовність Y-STR-локусів на один повтор. Тому, “сусідні” гаплотипи Y-хромосоми пов'язані між собою цими "однокроковими" мутаційними подіями. На основі даних про частоту та спектр гаплотипів, було побудовано мережу найрозповсюдженіших гаплотипів у досліджуваних популяціях за методом Морала (Morral et al., 1994). Імовірно, у популяції з України “прабатьківським” гаплотипом виявився мажорний гаплотип №1- 13/11/11/24/16, навколо якого нам вдалося сформувати спільну мережу гаплотипів (рис.7, А). У популяції з Росії “прабатьківським” виявився гаплотип №3 - 13/11/10/25/16 (рис.7, Б). Цікаво зазначити, що в популяції з Білорусі гаплотипи №1 та №3 є найбільш частими. До того ж, формування мережі навколо гаплотипу №3 у популяції з Білорусії мало схожу конфігурацію з "мережею" в популяції з Росії (рис.7, В, сірий овал), а мережа навколо гаплотипу №1 мала конфігурацію подібну до виявленої в популяції слов'ян з України (рис.7, В, сірий трикутник).

Важливо зазначити, що в досліджуваних нами популяціях були виявлені гаплотипи, що істотно відрізнялися від “прабатьківських” і не мали сполучних ланок у "мережі" гаплотипів, хоча мали досить високу частоту розповсюдження в популяціях. У популяції з України гаплотип №11 - 14/14/11/23/15 (4,7%) відокремлювали від “прабатьківського” №1 6 мутаційних подій. У популяції з Росії гаплотип №16 - 13/13/11/24/14 (4%) відокремлювали від “прабатьківського” №3 5 мутаційних подій. Можна припустити, що ці гаплотипи є “мігрантними”, а досить висока їх частота обумовлена "ефектом засновника". Отримані результати дають можливість зробити припущення, що саме гаплотипи 13/11/10/25/16 і 13/11/11/24/16 є “прабатьківськими” і основними "джерелами" для інших гаплотипів у популяціях східних слов'ян. Цікаво зазначити, що група найбільш частих для східнослов'янських популяцій гаплотипів №1-№10, дуже рідко зустрічалася в популяціях Західної Європи, проте достатньо представлена в популяціях з Угорщини та Болгарії, а частота мажорного для популяції з Новгорода гаплотипу №3 13/11/10/25/16 у вибірці з популяції Казахстану сягає 57%. Зважаючи на виявлений нами високий ступінь гетерогенності популяції кримських татар (Dhp=0,973), не можливо було побудувати єдину мережу гаплотипів. Проте нам вдалося прослідкувати взаємозв'язок декількох відносно частих гаплотипів 13/11/10/25/16??13/11/10/24/15 (найчастіші в популяціях східних слов'ян та Казахстану) та 12/11/10/23/14?12/11/10/23/15 (найбільш представлені в популяції курдів з Іраку).

Підсумовуючи, слід зауважити, що результати аналізу алельного поліморфізму та гаплотипів Y-STR-локусів, віддзеркалюють специфіку популяційних процесів, а саме дрейфу генів та міграцій, пов'язаних з генофондом чоловічої статі. Наприклад, більший вплив дрейфу генів на розподіл алелів Y-зчеплених локусів призводить до більшої частки міжпопуляційної варіабельності. Крім того, значні історичні міграції, переважно населення чоловічої статі (воєнні походи, колонізація), можуть знаходити своє відображення на “Y-хромосомному дереві”, на відміну від даних, отриманих на основі аналізу аутосомальних чи мітохондріальних ДНК-маркерах.

Дослідження мутацій в міні- та мікросателітних локусах. В родинах, які проходили судово-медичну експертизу із встановлення біологічного батьківства та материнства в при генотипуванні нами було проведено аналіз успадкування алельних варіантів від батьків дітьми. За всіма мінісателітними локусами було проаналізовано 1106 мейозів, за мікросателітними - 1668 мейозів. В жодному мінісателітному локусі не було виявлено успадкованих мутацій. Під час аналізу мікросателітних локусів нами було виявлено три мутації. У локусі D21S11 нами було виявлено одну мутацію материнського походження - динуклеотидну делецію (перетворення алеля “10” в “9”). У локусі WVA виявлено дві мутації батьківського походження - тетрануклеотидні інсерції (перетворення алелів “19” в “20” (рис.8) та “18” в “19”).

У локусі 2АЕ.9 нами було зафіксовано делецію батьківського алеля розміром 107 п.н. з утворенням нового алеля розміром 103 п.н, який і був успадкований дитиною. Таким чином, рівень мутацій материнського походження в локусі D21S11 становить 5,3х10-3 1/190), а рівень мутацій батьківського походження в локусах WVA та 2АЕ.9 - 1х10-2 (2/198) та 8,8х10-3 (1/114) відповідно. В усіх трьох випадках біологічне батьківство (материнство) було підтверджено (P>99,95%). Слід зазначити, що показники мутаційного рівня мають відносний характер, оскільки проаналізовану нами кількість мейозів не можна вважати достатньо репрезентативною при оцінці досить рідкісних мутаційних подій. Кумулятивні показники мутаційного рівня, що розраховані нами для усіх досліджуваних мікросателітних локусів, сягають 1,2х10-3 (1/834) та 3,6х10-3 (3/834) для мутацій материнського та батьківського походження відповідно. Загальну тенденцію переважання “батьківських” мутацій над материнськими було встановлено нами в попередніх дослідженнях і для теломерних мінісателітних локусів групи СЕВ - співвідношення “батьківських” і “материнських” мутацій в яких становить 51:13 (Livshits et al., 2001). Причиною переважання мутацій батьківського походження, імовірно, є той факт, що під час дозрівання сперматозоїди зазнають на порядок більше циклів реплікації, ніж яйцеклітина. Слід зазначити, що всі три мутації, виявлені нами, мали, так званий, “однокроковий” характер. Ці дані узгоджуються із запропонованою моделлю SSM (single step mutation), яка пояснює утворення нових алелів (Ohta and Kimura, 1973).

Виявлений нами високий показник різноманіття гаплотипів Y-STR-локусів (Dhp=0,953) надає можливість додатково збільшити показники імовірності виключення при проведенні ідентифікації осіб чоловічої статі. На підставі визначених кумулятивних показників інформативності (рМ = 1,2х10-8 та W=0,9991) та показника різноманіття Y-STR-гаплотипів (Dhp) нами було запропоновано панель ДНК-маркерів для проведення судово-медичної експертизи в Україні, що включає наступні локуси: APOВ, PYNZ22, IGHJ, PMСT118, VWA, TH01, D21S11, DYS19, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393. З використанням цієї панелі маркерів нами було проведено генотипоскопію осіб під час судово-медичної експертизи із встановлення біологічного батьківства. В проаналізованих нами 280 випадках, висновок про підтвердження батьківства з вірогідністю понад 99,90% було зроблено в 215 випадках (77%). У 65 випадках (23%) біологічне батьківство було виключено на підставі того, що в дитини, не менш ніж за трьома локусами, не було виявлено алелів, ідентифікованих у відповідача. Таким чином, досліджена нами панель ДНК-маркерів є високоінформативною і надає можливість проводити ідентифікацію особистості методом генотипоскопії в Україні.

ВИСНОВКИ

Вирішення поставлених у даній роботі завдань дозволило встановити основні характеристики алельного поліморфізму гіперваріабельних локусів серед населення регіональних популяцій України, визначити місце слов'янських популяцій на геногеографічній карті Європи та запропонувати інформативну панель ДНК-маркерів для судово-медичної експертизи в Україні.

1. Вперше було створено банк лейкоцитарної ДНК індивідів з різних регіонів України, що налічує 731 зразок.

2. Вперше отримано дані про спектр та частоту генотипів та алельних варіантів аутосомальних VNTR-локусів (APOВ, PYNZ22, IGHJ, PMСT118) та STR-локусів (2AE9.1, Rep4, VWF-8, VWA, TH01, D21S11), локусу HPRT Х-хромосоми та алельних варіантів і гаплотипів Y-STR-локусів (DYS19, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393) серед населення різних регіонів України.

3. Не виявлено статистично вірогідної диференціації за розподілом частот алельних варіантів аутосомальних VNTR- та STR-локусів (Р=0.705) та Y-STR-гаплотипів (Р=0.171) серед населення міст Києва, Львова, Кременчука та Алчевська, що дає підставу вважати популяцію України, представлену цими регіональними вибірками, відносно генетично гомогенною.

4. За результатами аналізу гаплотипів 5-ти STR-локусів Y-хромосоми в популяціях слов'янського походження України, Росії та Білорусі було виявлено два мажорних гаплотипи 13/11/11/24/16 і 13/11/10/25/16, які найбільш імовірно є “прабатьківськими” в популяціях східних слов'ян.

5. Виявлена статистично вірогідна різниця за розподілом частот гаплотипів між популяціями України і Росії (Р=0.022) та Білорусі і Росії (Р=0.024) свідчить про високу інформативність використання Y-STR-локусів для порівняння “близькоспоріднених” популяцій.

6. Показники генетичних відстаней, які розраховані на основі розподілу алельних частот Y-STR-локусів, між популяціями слов'янського походження з України, Росії, Білорусі, популяцією кримських татар та популяціями інших країн світу продемонстрували генетичну “близькість” слов'янських популяцій та їхню відносну “віддаленість” від популяції кримських татар інших популяцій Європи та Азії.

7. Встановлено, що в досліджуваних аутосомальних мікросателітних локусах рівень успадкованих мутацій (делеції / інсерції) материнського та батьківського походження становить 1,2х10-3 та 3,6х10-3 відповідно.

8. Визначені параметри інформативності проаналізованих мінісателітних та мікросателітних локусів дозволили вибрати панель ДНК-маркерів перспективних для проведення точної ідентифікації особистості в популяції України методом генотипоскопії.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лившиц Л.А., Кравченко С. А., Гришко В. И., Гаврилюк Ю. И., Ковальчук О. К., Бужиевская Т. И., Баранов В. С. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ДНК-локусов хромосомы 7 человека // Цитология и генетика. -1991. - Т. 25, № 4. - C.41-47.

2. Кравченко С.А., Лившиц Л.А. Анализ мутаций в 7, 10, 11-м экзонах и полиморфизма четырех нуклеотидных повторов 3'-конца 6-го интрона гена ТРБМ в семьях с высоким риском муковисцидоза из Украины // Цитология и генетика. - 1993. - Т. 27, № 4. - С. 72-77.

3. Livshits L.A., Kravchenko S.A. Cystic fibrosis in Ukraine: age, origin and tracing of the ?F508 mutation // Gene geography. - 1996. - Vol. 10. - P. 219-227.

4. Друзь А.Ф., Кравченко С.А., Лівшиць Л.А., Хоменок Т.О., Шупік Ю.П. Сучасні можливості експертизи спірного батьківства, материнства та заміни дітей (метод генотипоскопії) // Український судово-медичний вісник. - 1996. - Т. 1. - C. 42-44.

5. Кравченко С.А., Малярчук С.Г., Лившиц Л.А. Популяционно-генетическое исследование аллельного полиморфизма гипервариабельной области гена алолипопротеина В у населения разных регионов Украины // Цитология и генетика. - 1996. - Т. 30, № 5. - C. 35-41.

6. Лівшиць Л.А., Кравченко С.А., Гришко В.І., Малярчук С.Г., Екшиян О.Ю., Нечипоренко М.В., Пампуха В.М., Бичкова Г.М., Бариляк І.Р., Михайлець Л.П., Сопко Н.І., Скибан Г.В., Антипкін Ю.Г., Лук'янова О.М., Бужієвська Т.І., Мацука Г.Х. ДНК-діагностика найбільш поширених в Україні спадкових захворювань моногенної природи (10-річний досвід проведення ДНК-діагностики в Україні) // Перинатологія та педіатрія. - 2000. - № 1. - C. 3-7.

7. Rosser Z., Zerjal T., Hurles M., Adojaan M., Alavantic В., Amorim A., Amos W., Armenteros M., Arroyo E., Barbujani G., Beckman G., Beckman L., Bertranpetit J., Bosch E., Bradley D.G., Brede G., Cooper G., Corte-Real HB., de Knijff P., Decorte R., Dubrova YE., Evgrafov O., Gilissen A., Glisic S., Golge M., Hill EW., Jeziorowska A., Kalaydjieva L., Kayser M., Kivisild T., Kravchenko S.A., Krumina A., Kucinskas V., Lavinha J., Livshits L.A., Malaspina P., Maria S., McElreavey K., Meitinger T.A., Mikelsaar A.V., Mitchell RJ., Nafa K., Nicholson J., Norby S., Pandya A., Parik J., Patsalis P.C., Pereira L., Peterlin B., Pielberg G., Prata MJ., Previdere C., Roewer L., Rootsi S., Rubinsztein D.C., Saillard J., Santos FR., Stefanescu G., Sykes BC., Tolun A., Villems R., Tyler-Smith C., Jobling M.A. Y-Chromosomal Diversity in Europe Is Clinal and Influenced Primarily by Geography, Rather than by Language // Amer.J. Hum. Gen. - 2000. - Vol. 67, № 6. - P. 1526-1543.

8. Livshits L.A., Malyarchuk S.G., Lukyanova E.M., Antipkin Y.G., Arabskaya L.P., Kravchenko S.A., Matsuka G.H., Petit E., Giraudeau F., Gourmelon P., Vergnaud G., Le Guen B. Children of Chernobyl Cleanup Workers do not Show Elevated Rates of Mutations in Minisatellite Alleles // Radiat Res. - 2001. - Vol.155, № 1. - P. 74-80.

9. Кравченко С.А., Пампуха В.Н., Экшиян А.Ю., Нечипоренко М.В., Лившиц Л.А. Аллельный полиморфизм микро- и минисателитных локусов среди населения региональных популяций Украины // Цитология и генетика. - 2001. - T. 35, № 5. - C.30-37.

10. Кравченко С.А., Сломинский П.А., Бец Л.А., Степанова А.В., Микулич А.И., Лимборская С.А., Лившиц Л.А. Полиморфизм STR локусов Y-хромосомы у восточных славян в трех популяциях из Белоруссии, России и Украины // Генетика. - 2002. - Т. 38, № 1. - С. 97-104.

11. Кравченко С.А., Лівшиць Л.А., Гришко В.І., Малярчук С.Г., Екшиян О.Ю., Мусієнко С.І. Поліморфізм ДНК деяких локусів у популяціях України // Тези II-го з'їзду мед. генетиків України. - Львів. - 1995. - C. 85.

12. Kravchenko S.A., Livshits L.A. Cystis fibrosis in Ukraine: origin, age, and spreading of the mutation del F508 // Abstract. Jahrestagung der Gesellschaft fur humangenetic, Gottingen (Germany) - 1996. - P. 102.

13. Kravchenko S., Livshits L. Analysis of human Y-microsatellite haplotypes in Ukraine // European Jornal of Human Genetics. - 2001. - Vol. 9, Supplement 1. - P. 291.

14. Kravchenko S., Livshits L. Y-microsatellite haplotypes analysis in Ukraine // Conference for students, PhD students and young scientists. Abstracts book. Kyiv (Ukraine) - 2001- P. 149.

АНОТАЦІЇ

Кравченко С.А. Алельний поліморфізм мінісателітних та мікросателітних локусів в популяціях з різних регіонів України. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.26 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено вивченню алельного поліморфізму гіперваріабельних локусів серед населення різних регіонів України. Було отримано дані про частоту і спектр алельних варіантів, генотипів та гаплотипів мінісателітних та мікросателітних локусів геному людини в досліджуваних популяціях. За результатами досліджень не виявлено генетичної диференціації серед населення міст Києва, Львова, Кременчука та Алчевська. Розраховано показники різноманіття алелів та гаплотипів мікросателітних локусів Y-хромосоми в популяціях слов'янського походження з України, Росії, Білорусі та популяції кримських татар. Встановлено, що популяція кримських татар є найбільш гетерогенною серед усіх досліджуваних. Для популяцій з України, Росії, Білорусі було сформовано мережу найрозповсюдженіших гаплотипів та виявлено два мажорних гаплотипи 13/11/11/24/16 і 13/11/10/25/16, які, найбільш імовірно, є “прабатьківськими” в популяціях східних слов'ян. Показники генетичних відстаней, розраховані на основі даних алельного поліморфізму локусів Y-хромосоми, демонструють близькість всіх східнослов'янських популяцій і їхню генетичну віддаленість від інших популяцій Європи та Азії. Запропоновано інформативну панель ДНК-поліморфних маркерів для проведення генотипоскопії в судово-медичній експертизі в Україні.

Ключові слова: Мінісателітний локус, мікросателітний локус, гаплотип, поліморфізм, популяція.

Кравченко С.А. Аллельный полиморфизм минисателлитных и микросателлитных локусов в популяциях разных регионов Украины. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.26 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН України, Киев, 2002.

В ходе выполнения данной работы был создан банк лейкоцитарной ДНК доноров из разных регионов Украины, который насчитывает 731 образец. Впервые получены данные о спектре и частоте аллелей и генотипов аутосомальных минисателлитных (APOВ, PYNZ22, IGHJ, PMСT118) и микросателлитных локусов (2AE9.1, Rep4-cf, VWF-8, VWA, TH01, D21S11), локуса HPRT Х-хромосомы, а также аллельных вариантов и гаплотипов Y-STR-локусов (DYS19, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393) среди населения славянского происхождения городов Киева, Львова Кременчуга и Алчевска. Эмпирическое распределение генотипов по всем локусам, как в каждой отдельной анализируемой популяции, так и в Украине в целом, соответствовало теоретически ожидаемому в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга. Различия между фактической гетерозиготностью и теоретической в исследуемых популяциях оказалась недостоверной для всех локусов, за исключением локуса Rep4-cf, где был зафиксирован статистически достоверный избыток гетерозигот (Р=0.026). Наибольшие показатели средней гетерозиготности были в киевской популяции (Hо=0.760), наиболее низкие - во львовской (Hо=0.733). Не было выявлено статистически достоверной дифференциации в распределении частот аллельных вариантов аутосомальных VNTR- и STR-локусов (Р=0.705) и Y-STR-гаплотипов (Р=0.171) среди населения городов Киева, Львова, Кременчуга и Алчевска, что дает основание считать популяцию Украины, представленную этими региональными выборками, относительно генетически гомогенной.

По результатам анализа гаплотипов 5-ти STR-локусов Y-хромосомы в популяциях славянского происхождения из Украины, Росси и Беларуси было выявлено два мажорных гаплотипи 13/11/11/24/16 и 13/11/10/25/16, которые наиболее вероятно являются “прародительскими” в популяциях восточных славян.

В популяции крымских татар не удалось определить мажорный гаплотип, поскольку сразу 9 разных гаплотипов встречались почти с одинаковой низкой частотой - 3,9%-5,2%. О высокой степени гетерогенности данной популяции свидетельствовало также наибольшие значения индекса разнообразия гаплотипов - Dhp=0,973. Выявленная нами статистически достоверная разность в распределении частот гаплотипов между популяциями Украины и России (Р=0.022) и Беларуси и России (Р=0.024) свидетельствует о высокой информативности использования Y-STR-локусов для сравнения “близкородственных” популяций. Показатели генетических расстояний, рассчитанные на основе распределения аллельных частот Y-STR-локусов, между популяциями славянского происхождения из Украины, России, Беларуси, популяцией крымских татар и популяциями других стран, продемонстрировали генетическую “близость” славянских популяций и их относительную “отдаленность” от других популяций Европы и Азии.

На основе рассчитанных параметров информативности проанализированных минисателлитных и микросателлитных локусов была предложена панель ДНК-маркеров перспективных для проведения точной идентификации личности в популяции Украины методом генотипоскопии.

Ключевые слова: Минисателлитный локус, микросателлитный локус, гаплотип, полиморфизм, популяция

Kravchenko S.A. Allelic polymorphisms of minisatellite and microsatellite loci among different populations from Ukraine. - Manuscript.

Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D) in Biology, speciality 03.00.26 - molecular genetics.- Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2002.

Dissertation is devoted to the study of аllelic polymorphisms in hypervariable loci among population from different regions of Ukraine. Allele, genotype and haplotype frequencies data in populations under investigations have been obtained. No genetic differences were observed among populations from Kiev, Lviv, Kremenchuk and Alchevsk. The allele and haplotype diversity values of Y-chromosome loci in Slavic origin populations from Ukraine, Russia and Belorussia as well as in Crimea tatars population have been calculated. It has been revealed that Crimea tatars population to be the most heterogeneous among all others under investigation. For Ukraine, Russia and Belorussia populations the network of most common haplotypes has been constructed. It has been shown that two haplotypes (13/11/11/24/16 and 13/11/10/25/16) are major and most probably are an ancestral haplotypes in Eastern Slavic populations. Calculated genetic distances based on Y-chromosome allelic polymorphisms data demonstrate that three Eastern Slavic populations are genetically close to one another and remote from European and Asian populations. Kit of informative DNA-markers has been proposed for forensic analysis in Ukraine.

Keywords: minisatellite locus, microsatellite locus, haplotype, polymorphisms, population.

Размещено на Allbest.ru