Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут молекулярної біології і генетики

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.03 - молекулярна біологія

Вивчення методом сайт-направленого мутагенезу елементів впізнавання тирозинової тРНК тирозил-тРНК синтетазою з вищих еукаріотів

Київ - 2002

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК здійснювали у трис-боратному буфері в 15-20% процентному поліакриламідному гелі при напруженості електричного поля 20 В/см, а також в трис-ацетатному буфері в 1-2% агарозному гелі при напруженості електричного поля 5 В/см. Елюцію фрагментів ДНК з гелю здійснювали протягом 18 годин при кімнатній температурі буфером: 50 mМ трис-HCl, pН- 7.0; 300 mМ NaCl; 10 mМ ЕДТА. Клонування штучного гена в плазміду pUC119 проводили згідно стандартних методик (Маниатис и др., 1984) з використанням ферментів та буферних розчинів виробництва “Amersham Pharmacia Biotech” (Велика Британія) та “Fermentas” (Литва).

Сайт-направлений мутагенез першої пари акцепторного стебла тРНК^Tyr виконували методом ПЛР із використанням олігонуклеотидних праймерів, що були синтезовані фірмою “Genosys” (США).

Нуклеотидні заміни в ділянках штучного гена, які відповідають антикодону і варіабельній петлі тРНК^Tyr, проводили методом олігонуклеотидних гетеродуплексів (Kunkel, 1989).

Сайт-направлений мутагенез залишків лізин-146 і лізин-147 тирозил-тРНК синтетази з печінки бика здійснювали з використанням методу "мегапраймера" (Barik, 1997).

Для визначення нуклеотодної послідовності ДНК за методом Сенгера (Sanger et al., 1977) використовували б[³⁵S]dATP (Amersham Pharmacia Biotech) і набір "T7 Seguenase v.2.0. DNA seguencing Kit" (USB, США).

Для бактеріальної експресії тирозил-тРНК синтетази дикого типу і мутантних варіантів ферменту були використані клітини E.coli штаму BL-21(DE3). Культивування клітин, індукцію, а також очищення експресованих білків афінною хроматографією на глутатіон-сефарозі (Amersham Pharmacia Biotech, Велика Британія) чи Ni-NTA агарозі (Qiagen, Німеччина) проводили згідно інструкцій виробників. Визначення концентрації білків проводили за (Bradford, 1976).

“Run-off” транскрипцію штучних генів TРНК ^Tyr іn vitro здійснювали, як описано Семпсоном і Уленбеком (Sampson, Uhlenbeck, 1988). Реакційна суміш містила: 40 мМ трис-HCl, рН 7,5; 50 мМ NaCl; 8 мМ MgCl₂; 2 мМ спермідин; 30 мМ DTT; 1 мМ кожного з чотирьох рибонуклеозидтрифосфатів; 10000 од./мл Т7 РНК-полімерази; 0,2 мг/мл лінеаризованої плазміди. Реакційну суміш інкубували протягом 2 - 16 годин при 37^оС. Очищували транскрипти препаративним електрофорезом у 15%-ному поліакриламідному гелі, з 8М сечовиною. Зони гелю, що містили повнорозмірні транскрипти, локалізували в ультрафіолетовому світлі на пластині "Silufol", вирізали та проводили елюцію транскриптів 5 - 8 об'ємами буферу: 10 мМ трис-HCl, pН 7,0; 300 мМ NaCl; 1 мМ ЕДТА протягом 16 - 24 годин при 37?С. Елюат екстрагували рівним об'ємом хлороформу і транскрипти з водної фази осаджували етанолом.

Перед аміноацилюванням транскрипти прогрівали при 80^оС у буфері: 30 мМ НЕРЕS-KOH, pН 7,6; 5 мМ MgCl₂ протягом 2 хвилин, і повільно (впродовж 30 хвилин) охолоджували до кімнатної температури. Реакцію аміноацилювання проводили в буферному розчині, який містив 30мМ HEPES-KOH, pН 7,4; 2,5 мМ MgCl₂; 20 мМ KCl; 2 мМ DTT; 2мМ АТР; 30 мкМ [¹⁴C] тирозину (13320 МБк/ммоль), 0,05 - 3 мкМ тРНК^Tyr-транскрипту (або 10 - 300 мкМ сумарної тРНК із дріжджів) і 0,03 - 2,5 мкМ тирозил-тРНК синтетази. Реакцію зупиняли, додаючи 10 об'ємів охолодженої 7%-ної трихлороцтової кислоти, фільтрували через скловолокнисті фільтри GF-C і вимірювали радіоактивність у сцинтиляційному лічильнику "RACK - BETA" (LKB, Швеція). Кінетичні константи реакції аміноацилювання визначали методом Лайнуівера і Берка або методом прямих лінійних графіків (Eisenthal, Cornish-Bowden, 1974).

Результати дослідження та їх обговорення

Конструювання та клонування штучного гена тРНК^Tyr бика

Для конструювання штучного гена тРНК^Tyr бика використано шість синтетичних олігодезоксирибонуклеотидів (рис.1). Олігонуклеотиди Y1, Y3, Y5 являють собою (+)ланцюг штучного гена і складають повну послідовність тРНК^Tyr бика. Олігонуклеотид Y1, крім того, містить послідовність промотору Т7 РНК-полімерази. Вище промотору розташовано липкий кінець сайта рестрикції EcoRI, що спрощує клонування штучного гена в плазміду. Оскільки початок структурної частини штучного гена тРНК^Tyr бика: 5'-ССТТCGA… є несприятливим для транскрипції Т7 РНК-полімеразою (Milligan et al., 1987), на 5'-кінець структурної частини було введено додатковий гуанозин - G(-1).

Олігонуклеотиди Y2, Y4, Y6 являють собою (-)ланцюг штучного гена тРНК^Tyr бика з липким кінцем сайта рестрикції BamHI на 3'-кінці. Акцепторний ССА-кінець тРНК, перекриваючись із сайтом BamHI, утворює сайт рестрикції BstNI. Лінеаризація плазмиди рестриктазою BstNI призводить до утворення двоспіральної ДНК-матриці, що закінчується тимідином, комплементарним 3?-кінцевому аденозину тРНК^Tyr.

Шість олігонуклеотидів попарно комплементарні таким чином, що гібридизація олігонуклеотидів Y1+Y2, Y3+Y4, Y5+Y6 призводить до утворення частково двоспіральних фрагментів ДНК з односпіральними кінцями, причому односпіральні кінці дуплексівY1+Y2 і Y5+Y6 комплементарні односпіральним кінцям дуплексу Y3+Y4. Лігування цих трьох дуплексів дозволило одержати двоспіральний фрагмент ДНК довжиною у 104 пари основ, що включає повну послідовність тРНК^Tyr бика, з 5'-кінця якої знаходиться промотор Т7 РНК-полімерази. Даний фрагмент ДНК було клоновано у плазміду pUC119 між сайтами рестрикції EcoRI і BamHI. Відповідність нуклеотидної послідовності вставки в отриманій плазміді pBY1.3 очікуваній нуклеотидній послідовності штучного гена тРНК^Tyr бика було підтверджено секвенуванням плазміди.

Сайт-направлений мутагенез штучного гена тРНК^Tyr

Нуклеотидну послідовність тРНК^Tyr-транскрипту дикого типу і варіанти досліджених у роботі мутацій наведено на рис. 2. Для введення нуклеотидних замін у позиції 1 і 72 штучного гена тРНК^Tyr бика методом ПЛР як матрицю використовували плазміду pBY 1.3, що несе штучний ген тРНК^Tyr дикого типу. Для заміни цитозину на гуанозин у позиції 1 тРНК^Tyr використовували 5ґ-мутантний праймер: 5ґ-Gaattctaatacgactcactatagcttcgatagc-3ґ, комплементарний (-) ланцюгу штучного гена дикого типу в ділянці Т7 промотору і 5ґ- частини акцепторного стебла тРНК^Tyr, за винятком позицій -1 і +1.

Для введення мутацій у позицію 72 використовували набір 3ґ-мутантних праймерів: 5ґ-ggatcctggt(g,a,t)cttccagccg-3ґ, комплементарних (+)-ланцюгу штучного гена дикого типу в 3'-кінцевій ділянці за винятком заміни цитозину в позиції праймера, що відповідає позиції 72 у гені дикого типу, на гуанозин, аденозин чи тимідин.

Разом з мутантними праймерами в ПЛР використовувалися також універсальні

для плазмід серії pUC M13 прямий і M13 зворотній праймери. M13 зворотній праймер гібридизується з плазмідою в ділянці полілінкера вище початку штучного гена, а М13 прямий праймер - в ділянці полілінкера нижче 3'-кінця штучного гена.

При використанні 5'-мутантного праймера в парі з М13 прямим праймером отримано варіант штучного гена з першою парою акцепторного стебла тРНК^Tyr G1:G72. При використанні 5'-мутантного праймера в парі з кожним із 3'-мутантних праймерів були отримані варіанти штучного гена з першою парою акцепторного стебла: G1:C72, G1:A72 та G1:U72. Нарешті, при використанні 3'-мутантних праймерів у парі з М13 зворотнім праймером отримано варіанти штучного гена з першою парою акцепторного стебла C1:C72, C1:A72 та C1:U72. Оскільки цитозин у першій позиції штучного гена несприятливий для транскрипції Т7 РНК-полімеразою, останні три варіанти мутантних генів (як і ген дикого типу) містили додатковий 5ґ-кінцевий гуанозин.

Для нуклеотидних замін за методом олігонуклеотидних гетеродуплексів у позиціях штучного гена, що відповідають антикодоновому триплету тРНК^Tyr бика використовували мутантний праймер: 5'-CTAAGGATCТGGAGTCCTCCGCTC-3', комплементарний ділянці антикодонової петлі (позиції 22-45 тРНК^Tyr) за винятком позицій 34 і 35 антикодону. В 11-у і 12-у позиції праймера, що відповідають 34-й і 35-й позиціям антикодону, замість цитозину і аденозину було введено два гуанозини, що призвело до заміни в тРНК тирозинового антикодону GUA на триптофановий антикодон CCA (рис. 2). Для заміни в тРНК^Tyr бика короткої варіабельної петлі (характерної для еукаріотичних тирозинових тРНК) на довгу (характерну для прокаріотичних тирозинових тРНК) використовували синтетичний мутантний праймер: 5'-CGAACCAGCGACGTCTАTGACCTAAGGATCTACA-3',

комплементарний послідовності штучного гена в ділянці 3?-частини антикодонового стебла, варіабельної петлі та 5?-частини Т-петлі. У цьому праймері між позиціями, комплементарними G44 та G45 тРНК^Tyr бика, вставлено послідовність

5?-GTCTАTGAC-3', що комплементарна послідовності додаткової петлі тРНК^Tyr E. сoli (рис. 2).

Комбінація двох описаних вище методів (ПЛР-мутагенезу і методу олігонуклеотидних гетеродуплексів) дозволила одержати варіант штучного гена тРНК^Tyr з подвійною мутацією: заміною тирозинового антикодону на триптофановий і заміною першої пари C1:G72 на G1:C72. При цьому плазміду, що несе штучний ген тРНК^Tyr із триптофановим антикодоном використовували як матрицю для введення заміни в першу пару акцепторного стебла методом ПЛР.

Таким чином, поряд із штучним гена дикого типу, було створено ряд мутантних варіантів гена тРНК^Tyr печінки бика. Транскрипція штучних генів in vitro Т7 РНК-полімеразою дозволила отримати як тРНК^Tyr- транскрипт дикого типу, так і тРНК^Tyr- транскрипти з нуклеотидними замінами в першій парі акцепторного стебла, антикодоновому триплеті та варіабельній петлі у препаративних кількостях, достатніх для вивчення їх акцепторних властивостей в реакції аміноацилювання.

Вивчення акцепторних властивостей транскрипту тРНК^Tyr дикого типу і мутантних транскриптів тРНК^Tyr у реакції аміноацилювання рекомбінантною тирозил-тРНК синтетазою з печінки бика

Кінетичні параметри реакції аміноацилювання транскрипту TРНК ^Tyr дикого типу тирозил-TРНК синтетазою з печінки бика. Клонована нами раніше (Леванец и др., 1996,1997) тирозил-тРНК синтетаза з печінки бика є димером б_2-типу і, окрім типового для аміноацил-тРНК синтетаз першого класу каталітичного модуля, містить на С-кінці поліпептидного ланцюга додатковий домен, який відсутній у відповідних ферментів прокаріотів та нижчих еукаріотів. Аналіз амінокислотної послідовності С-кінцевого домену (Леванец и др.,1997) показав наявність гомології з некаталітичними доменами метионіл-тРНК синтетази і в-субодиниці фенілаланіл-тРНК синтетази, а також із С-кінцевою ділянкою білка Arc1p із дріжджів, функція якого (Simos et al., 1996) полягає в неспецифічному зв'язуванні тРНК і спрямуванні їх в активні центри асоційованих з ним аміноацил-тРНК синтетаз.

З метою з'ясування ролі С-кінцевого домену тирозил-TРНК синтетази печінки бика в реакції аміноацилювання повнорозмірний фермент (ТирРС) та фермент, позбавлений С-кінцевого домену (ТирРС_ДC) були клоновані в плазміду pET23d (Novagen, США). Рекомбінантний повнорозмірний фермент з урахуванням нуклеотидної послідовності вектора має амінокислотну послідовність Met1-Ile527Arg(His)₆ і розраховану молекулярну масу 60 кДа, фермент з делецією С-кінцевого домена має амінокислотну послідовність Met1-Ser338AspLysLeuAlaAlaLeuGlu(His)₆ і розраховану молекулярну масу 39,9 кДа (рис.3 А). Експресовані в бактеріальній системі ферменти були афінно очищені хроматографією на Ni-NTA агарозі (рис. 3 Б). Як видно із наведених результатів, електрофоретична рухливість отриманих білків відповідає розрахованим молекулярним масам.

Визначення оптимальних для ферментативної активності ТирРС і ТирРС_ДС концентрацій одно- та двовалентних йонів показало, що обидва ферменти демонструють однакову залежність початкової швидкості реакції аміноацилювання тРНК^Tyr-транскрипту дикого типу від концентрації йонів Mg²⁺ у реакційній суміші (рис.4А). Найбільша початкова швидкість аміноацилювання досягається при 2 - 2,5 мМ MgCl₂ як для ТирРС, так і для ТирРС_ДC.

У той же час оптимальні концентрації йонів К⁺ для двох ферментів різні (рис.4Б). Для ТирРС_ДC вона складає 15 мМ, у той час як повнорозмірний фермент виявляє максимальну активність при 60 мМ КCl. Така різниця в оптимальних концентраціях K⁺ може свідчити про участь С-кінцевого домену в йонних взаємодіях із тРНК.

Для того, щоб перевірити, чи не порушує видалення С-кінцевого домену специфічність ферменту, ми порівняли активність повнорозмірної тирозил-тРНК синтетази і тирозил-тРНК синтетази з делецією С-кінцевого домену в реакції вичерпного аміноацилювання сумарної тРНК із дріжджів.

Наведені на рис.5 криві залежності в часі реакції утворення тирозил-тРНК, що каталізує ТирРС і ТирРСДС при концентраціях ферментів, які не лімітують швидкість реакції, показують, що ТирРСДС здатна аміноацилювати тирозином таку ж кількість тРНК з пулу сумарної тРНК, що і ТирРС. Це свідчить про збереження ТирРСДС специфічності до тирозинової тРНК.

Дослідження активності обох ферментів за методами стаціонарної кінетики дали можливість розрахувати основні кінетичні параметри реакції аміноацилювання природної тРНК з дріжджів та транскрипту дикого типу ТРНК^Tyr бика, а саме: каталітичну константу k_cat, константу Міхаеліса К_М і каталітичну ефективність k_cat/К_М. Отримані результати наведені в таблиці 1.

З таблиці 1 видно, що каталітична ефективність реакції аміноацилювання як природньої тРНК^Tyr, так і транскрипту тРНК^Tyr дикого типу тирозил-тРНК синтетазою, позбавленою С-кінцевого домену, нижча порівняно з ефективністю реакції, що каталізує повнорозмірний фермент. Незалежно від субстрату, ТирРС_ДC демонструє триразове зниження k_cat порівняно з ТирРС. У той же час, делеція С-кінцевого домена по-різному впливає на K_M для природньої тРНК і для тРНК - транскрипту.

Якщо K_M для природньої тРНК практично однакова при аміноацилюванні обома ферментами, то K_M для тРНК-транскрипту при аміноацилюванні ТирРС_ДC майже на порядок більша, ніж у випадку, коли реакцію каталізує ТирРС. Відповідно і загальна різниця в каталітичній ефективності аміноацилювання тирозил-тРНК синтетазою з делецією С-кінцевого домену порівняно з повнорозмірним ферментом у випадку, коли субстратом є тРНК^Tyr-транскрипт, виявляється більш значною (у 18 разів), ніж коли субстратом є природна тРНК (у 4 рази).

Наведені результати вказують на те, що додатковий С-кінцевий домен тирозил-тРНК синтетази бика підвищує каталітичну ефективність ферменту. З огляду на той факт, що С-кінцевий домен має РНК-зв'язувальні властивості (Курочкин и др., 1991) можна припустити, що його роль полягає в збільшенні міцності зв'язування тРНК-транскрипту з ферментом. Менш виражений ефект С-домену в аміноацилюванні природньої тРНК порівняно з тРНК^Tyr-транскриптом, можливо, пояснюється тим, що природна тРНК^Tyr на відміну від транскрипту містить модифіковані нуклеотиди, які можуть вносити свій вклад у посилення зв'язування (як за рахунок безпосередніх контактів так і опосередковано, через підтримання нативної конформації тРНК), тим самим певною мірою компенсуючи відсутність С-кінцевого домену в ТирРС_ДC.

Вивчення впливу сайт-направлених мутацій в транскриптах TРНК^Tyr на їхні акцепторні властивості. З метою з'ясування ролі окремих нуклеотидів тирозинової тРНК печінки бика як детермінант відповідності, було вивчено вплив сайт-направлених нуклеотидних замін на кінетичні параметри реакції аміноацилювання мутантних транскриптів порівняно з транскриптом дикого типу.

У таблиці 2 підсумовано результати визначення кінетичних параметрів реакції аміноацилювання транскриптів тРНК^Tyr повнорозмірною рекомбінантною тирозил-тРНК синтетазою печінки бика.

Наведені в таблиці 2 дані свідчать про те, що коротка варіабельна петля тРНК^Tyr не є істотним елементом відповідності для еукаріотичної тирозил-тРНК синтетази, оскільки заміна короткої варіабельної петлі, характерної для еукаріотичних тРНК^Tyr, на довгу, характерну для прокаріотичних тРНК^Tyr, не призводить до помітного зменшення ефективності аміноацилювання такого транскрипту. Це узгоджується з даними для дріжджової й архебактеріальної тРНК^Tyr (Fechter et al., 2000, 2001), отриманими в експериментах із трансплантації набору елементів відповідності тРНК^Tyr у гетерологічні тРНК.

Нуклеотиди першої пари акцепторного стебла - важливий елемент відповідності транскрипту тРНК^Tyr. Заміна першої пари C1:G72 (характерної для еукаріотичних тРНК^Tyr) на G1:C72 (яка є типовою для прокаріотичних тРНК^Tyr) повністю блокує аміноацилювання мутантного транскрипту еукаріотичним ферментом. Це також збігається з відомими даними, отриманими для тРНК^Tyr E. coli, архебактерій, дріжджів та мініспіралей еукаріотичної тРНК^Tyr.

Однак, як випливає з таблиці 2, відносний внесок кожного з нуклеотидів першої пари у відповідність транскрипту в реакції аміноацилювання значно різниться. Основний внесок дає нуклеотид у позиції 72. Якщо в цій позиції знаходиться гуанін, транскрипт є активним субстратом для тирозил-тРНК синтетази бика незалежно від того, цитозин чи гуанін знаходиться в позиції 1.

З іншого боку, якщо в позиції 72 знаходиться цитозин, транскрипт цілком втрачає акцепторну активність, незалежно від нуклеотиду в позиції 1.

Заміна гуаніну-72 на урацил знижує акцепторну активність транскрипту більшою мірою, ніж заміна його на аденін, що видно з порівняння каталітичної ефективності реакції аміноацилювання транскриптів з першими парами акцепторного стебла C1:A72 і C1:U72, а також G1:A72 і G1:U72. При цьому внесок нуклеотиду в позиції 1 залишається помітно меншим, порівняно із внеском нуклеотиду в позиції 72. Наприклад, заміна G72 на U72 призводить до 69-кратного зниження каталітичної ефективності реакції аміноацилювання, а різниця у каталітичній єфективності реакції аміноацилювання транскриптів з першими парами C1:U72 та G1:U72 менш, ніж двократна.

Результати визначення основних кінетичних параметрів реакції аміноацилювання мутантних тРНК^Tyr-транскриптів рекомбінантною тирозил-тРНК синтетазою, позбавленою додаткового С-кінцевого домену, наведено в таблиці 3.

З таблиці 3 видно, що на якісному рівні розподіл і відносна сила елементів відповідності транскриптів тРНК^Tyr для ТирРС_ДС у цілому збігаються з такими для ТирРС.

У той же час, ТирРС_ДС порівняно з повнорозмірним ферментом виявляє більш високу “чутливість” до нуклеотидних замін у транскриптах. Наприклад, транскрипт із першою парою G1:U72 аміноацилюється повнорозмірною ТирРС у 69 разів менш ефективно, ніж транскрипт дикого типу, у той час як при аміноацилюванні того ж транскрипту ТирРС_ДС спостерігається 380-кратне зниження каталітичної ефективності реакції.

При цьому для ТирРС_ДС порівняно з ТирРС стає більш помітним зниження спорідненості мутантних транскриптів до ферменту, про що свідчить збільшення внеску К_М в сумарну втрату каталітичної ефективності реакції аміноацилювання. Це спостереження узгоджується з відзначеною вище здатністю додаткового С-кінцевого домену рекомбінантної тирозил-тРНК синтетази бика підвищувати каталітичну ефективність реакції аміноацилювання тРНК^Tyr-транскрипту дикого типу саме за рахунок зменшення К_М.

Внесок нуклеотидів у позиціях 34 і 35 антикодону в відповідність тРНК^Tyr-транскрипту при аміноацилюванні ТирРС_ДС досить суттєвий, про що свідчить 190-кратне зниження каталітичної ефективності реакції аміноацилювання мутантного в цих позиціях транскрипту порівняно із транскриптом дикого типу. Ці дані вказують також на те, що антикодоновий триплет тРНК^Tyr впізнається в межах каталітичного 39 кДа модуля ТирРС. Однак, ефект заміни тирозинового антикодону на триптофановий все ж менший, ніж ефект від заміни гуаніну в позиції 72 акцепторного стебла на цитозин або урацил.

Акцепторна активність мутантних транскриптів корелює з їхньою здатністю конкурентно інгібувати аміноацилювання транскрипту дикого типу (рис. 6). Із наведених даних видно, що транскрипт із подвійною заміною: “прокаріотичною” першою парою і триптофановим антикодоном є слабким інгібітором аміноацилювання транскрипту дикого типу. Це вказує на те, що перша пара акцепторного стебла і антикодон - два головні елементи відповідності тРНК^Tyr- транскрипту, що забезпечують його специфічне впізнавання і зв'язування з ферментом. Порівняння впливу транскрипту з “нормальною” першою парою але мутантним антикодоном і транскрипту з “нормальним” антикодоном, але мутантною першою парою на початкову швидкість реакції аміноацилювання свідчить про те, що здатність конкурувати з транскриптом дикого типу за зв'язування з ферментом пов'язана більшою мірою з першою парою акцепторного стебла і меншою мірою з антикодоном.

Роль амінокислотних залишку Lys147 тирозил-тРНК синтетази бика в реакціх аміноацилювання

1. У дисертаційній роботі досліджено роль окремих структурних елементів тирозинової тРНК та тирозил-тРНК синтетази печінки бика в реакції аміноацілювання. Сконструйовано та клоновано штучний ген тирозинової тРНК печінки бика. Із застосуванням сайт-направленого мутагенезу отримано гени тРНК^Tyr бика з нуклеотидними замінами в першій парі акцепторного стебла, в антикодоновому триплеті та ділянці варіабельної петлі.

Методами стаціонарної кінетики проведено дослідження впливу нуклеотидних замін на кінетичні параметри реакції аміноацилювання мутантних тРНК^Tyr-транскриптів рекомбінантною тирозил-тРНК синтетазою печінки бика.

2. Показано, що основною структурною детермінантою відповідності тРНК^Tyr-транскрипту в ділянці першої пари акцепторного стебла є нуклеотид в позиції 72, в той час як роль нуклеотиду в позиції 1 є значно меншою.

3. Визначено, що нуклеотиди 34 і 35 антикодону є важливими детермінантами відповідності тРНК^Tyr-транскрипту. Отримані результати свідчать про те, що в реакції аміноацилювання еукаріотичною тирозил-тРНК синтетазою антикодоновий триплет тРНК^Tyr-транскрипту впізнається в межах 39 кДа каталітичного модуля ферменту.

4. Продемонстровано, що довжина варіабельної петлі тРНК^Tyr-транскрипту несуттєва для впізнавання еукаріотичною тирозил-тРНК синтетазою в реакції аміноацилювання.

5. Встановлено, що додатковий С-кінцевий домен тирозил-тРНК синтетази бика збільшує каталітичну ефективність реакції аміноацилювання тРНК^Tyr-транскрипту за рахунок підвищення спорідненості останнього до ферменту.

6. Показано, що амінокислотний залишок Lys147, який локалізований у сполучному пептиді нуклеотидзв'язувального домену є критичним для активності тирозил-тРНК синтетази бика в реакції аміноацилювання гомологічної тРНК^Tyr.

ЛІТЕРАТУРА

1. Найденов В.Г., Вудмаска М.И., Koрнелюк A.И., Maцукa Г.Х. Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т.16, №4. - С. 275-279.

2. Найденов В.Г., Вудмаска М.И., Мацука Г.Х. Кинетические параметры аминоацилирования тРНК^Tyr транскрипта тирозил-тРНК синтетазой из печени быка // Біополімери і клітина. - 2001. - Т.17, №6. - С. 534-539.

3. Найденов В.Г., Вудмаска М.И., Мацука Г.Х. Роль нуклеотидов в позициях 1 и 72 акцепторного стебля тРНК^Tyr в аминоацилировании тирозил-тРНК синтетазой печени быка // Біополімери і клітина. - 2002. - Т.18, №1. - C. 71-75.

4. Levanets O.V., Naidenov V.G.,Odynets K.A., Vudmaska M.I., Matsuka G.Kh., Wientjes F. J., Gassen H.G., Kornelyuk A.I. Cloning, seguensing and bacterial expression of bovine tyrosyl-tRNA synthetase // Abstracts of EMBO Workshop on Structure and Function of Aminoacyl synthetases. - Mittelwihr (France). - 1998. - Р.100.

5. Naidenov V.G., Vudmaska M.I., Matsuka G.Kh. The role of G72 for tRNA^Tyr identity //Abstracts of Asilomar Conference on Aminoacyl-tRNA synthetases in Biology, Medicine and Evolution. - Pacific Grove (USA). - 2002. - P.109.

Размещено на Allbest.ru