Зміна експресії генів у гліальних пухлинах головного мозку людини

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Зміна експресії генів у гліальних пухлинах головного мозку людини

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Сучасна картина молекулярних основ пухлин головного мозку людини відображає комплексну взаємодію між численними генетичними подіями, включаючи хромосомні аномалії, активацію протоонкогенів, інактивацію генів-супресорів пухлин, аберантну експресію факторів росту і їхніх рецепторів.

Протоонкогени - це гени, які присутні у нормальних еукаріотичних організмах, чиї екзони гомологічні онкогенам гостротрансформуючих ретровірусів для яких було показано індукування неопластичних трансформацій (Garret and Sell, 1995). Протоонкогени кодують велику різноманітність білків, які беруть участь у рості і поділі клітин і відносяться до однієї з наступних категорій: 1 - рецептори факторів росту (наприклад, c-erbB-1, c-erbB-2); 2 - цитоплазматичні протеїн кінази залучені до перетворення сигналу (наприклад, src, raf); 3 - GTP-зв'язувальні білки (наприклад, N-ras, gsp); 4 - регулятори транскрипції, які утворюють найбільшу групу (наприклад, erbA-1, erbA-2, fos, jun, myb, c/L/N-myc). Ідентифіковано більше сотні онкогенів, що виникли з клітинних протоонкогенів у результаті точкових мутацій, генних ампліфікацій і хромосомних транслокацій (Shapiro, 2001; Rempel, 2001), і цей список постійно поповнюється.

У той час як онкогени підсилюють ріст, дозволяючи клітині ігнорувати сигнали пригнічення росту, продукти генiв-супресорiв пухлин мають зворотній ефект. Ідентифіковано близько десятка генів-супресорів пухлин і припускають існування більшої їхньої кількості (Nozaki et al., 1999; Rutka et al., 2000). Онкогени і гени-супресори функціонують як антагоністи: одні - підсилюють, інші - пригнічують клітинну проліферацію. Існує, однак, і деяка асиметрія. В той же час було показано, що генетичні детермінанти раку є мутантними генами-супресорами пухлин. Результат мутацій у цьому випадку - інактивація гена-супресора пухлин, що призводить до втрати його функцій. Два найкраще охарактеризовані гени-супресори пухлин - ген ретинобластоми Rb (Marshall, 1991) і ген, що кодує білок р53 (Nigro et al., 1989; Hollstein and Sidransky, 1991).

Гліальні пухлини складають більше 50% усіх новоутворень головного мозку людини. Цю групу пухлин поєднує загальне походження з астроцитарної глії, а також низка специфічних особливостей: наявність гліально-фібрилярного компоненту, характер росту, часті рецидиви, рідкі виникнення метастазів навіть при дуже значній агресивності.

Найрозповсюдженою гліальною пухлиною людини є мультиформна гліобластома з приблизною частотою захворювання 3 на 100 000 чоловік у рік. Астроцитоми низького ступеня злоякісності майже завжди прогресують до більш злоякісного фенотипу і набувають гістопатологічних і клінічних характеристик мультиформної гліобластоми. Гліобластома може також виникати de novo, тобто без будь-яких клінічних чи гістологічних передумов.

Припущення, що при утворенні майже всіх злоякісних пухлин виникають не поодинокі зміни, а зміни в багатьох, чи хоча б у двох генах, одержало численні експериментальні підтвердження. Для різних форм раку (в тому числі і для астроцитарних пухлин головного мозку) виявлено набори генів, які залучені до процесу ініціації та прогресії пухлин. Крім того, різними науковими групами були отримані цитогенетичні та молекулярно-генетичні докази інактивації в пухлинах головного мозку потенційних генів-супресорів пухлин, що знаходяться на хромосомах 1 р, 9p, 10 р і 10q, 11 р, 13q, 19q, 22q (Rosenberg et al., 1996; Maier et al., 1998; Ino et al., 1999; Simons et al., 1999; Smith et al., 1999; Farrell and Clayton, 1999; Bello et al., 2000). Однак більша частина цих генів дотепер не ідентифікована і це зумовлює необхідність проведення подальших досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводяться у відділі біосинтезу нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (зав. відділу - доктор біол. наук, професор, чл.-кор. НАН України В.М. Кавсан) за бюджетною темою №2.2.4.12 - «Вивчення регуляції вираження генів у вищих еукаріот», а також спеціальних проектів: з Інститутом нейрохірургії імені акад. А.П. Ромоданова АМН України (Київ) - «Дослідження генетичних змін у гліомах різного ступеня злоякісності та зіставлення із клінічними та імунологічними проявами захворювання»; з Центром ембріональних тканин «ЭмЦелл» (Київ) - «Отримання зразків ембріональних тканин людини для проведення генно-інженерних робіт»; з Центром ресурсів і баз даних Німецького проекту «Геном людини» (Resource Zentrum/Primary Data Base, German Human Genom Project; RZPD) (Берлін) - «Determination of genetic alterations associated with initiation or progression of human brain astrocytic tumors» («Дослідження генетичних змін, які пов'язані з ініціюванням та прогресією астроцитарних пухлин головного мозку людини»).

Мета і завдання дослідження. Метою даного дослідження було виявлення і характеристика генів, що змінюють свою експресію в гліальних пухлинах головного мозку людини, приділивши особливу увагу мультиформній гліобластомі, як найбільш злоякісній пухлині головного мозку людини.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1) ідентифікувати гени, що змінюють свою експресію в гліальних пухлинах головного мозку людини за допомогою диференційної гібридизації кДНК-бібліотеки головного мозку ембріона людини і кДНК-бібліотеки головного мозку немовляти з пробами тотальних кДНК головного мозку і мультиформної гліобластоми;

2) підтвердити диференційну гібридизацію клонів, для яких були знайдені зміни в інтенсивності гібридизаційного сигналу за допомогою повторної гібридизації індивідуальних клонів кДНК із тими ж пробами тотальних кДНК;

3) визначити нуклеотидну послідовність кДНК і провести комп'ютерний пошук гомології в сучасних базах даних нуклеотидних і амінокислотних послідовностей для ідентифікації генів, що змінюють експресію в гліальних пухлинах головного мозку людини;

4) охарактеризувати експресію ідентифікованих генів у клітинах головного мозку і гліальних пухлинах на рівні РНК.

Об'єкт дослідження - гліальні пухлини головного мозку людини.

Предмет дослідження - зміна експресії генів у гліальних пухлинах головного мозку людини.

Методи дослідження - для визначення генів, що змінюють експресію в гліальних пухлинах головного мозку людини використовували метод диференційної гібридизації «грид» кДНК-бібліотеки головного мозку новонародженого і кДНК-бібліотеки головного мозку ембріона людини з пробами тотальних кДНК пухлин і головного мозку дорослої людини. Для характеристики експресії генів у клітинах зразків гліальних пухлин і нормального головного мозку використовували метод Нозерн-гібридизації та зворотної транскрипції - полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР). Для виявлення можливих змін у будові гена використовували метод Саузерн-гібридизації.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті диференційної гібридизації «грид» кДНК-бібліотеки головного мозку ембріона людини і кДНК-бібліотеки головного мозку немовляти з пробами тотальних кДНК анапластичної астроцитоми, гліобластоми, головного мозку дорослої людини і головного мозку ембріона було відібрано більше трьохсот клонів. Після вторинного скринінгу тими ж пробами кДНК диференційна гібридизація була підтверджена для 23 нуклеотидних послідовностей.

Визначення значно більшої кількості «позитивних» клонів при первинному скринінгу порівняно з повторною диференційною гібридизацією має місце в результаті поліморфізму експресії генів в індивідуальних зразках пухлин однакового ступеня злоякісності та в індивідуальних зразках нормального головного мозку.

Для 60 клонів визначено часткову чи повну нуклеотидну послідовність їхніх кДНК-вставок.

Диференційну експресію генів 12S і 16S рРНК, 28S рРНК, аполіпопротеїну Е, фактора, асоційованого з рецептором фактора некрозу пухлин TRAF-6, ДНК-зв?язувального білка В, фактора сплайсингу ссавців ZFM-1, куліну-1, регулятора процесів проліферації, деградації й апоптозу ID-4, а також TSC-22 було підтверджено гібридизацією індивідуальних клонів кДНК із пробами тотальних кДНК гліобластоми і головного мозку дорослої людини.

Вперше знайдено підвищення експресії генів, що кодують ДНК-зв?язувальний білок В, ID-4 і ZFM-1 у пухлинах головного мозку людини. Нуклеотидна послідовність для зв'язування CSD білків, до яких відносять ДНК-зв?язувальний білок В, знаходиться в промоторах генів цитокінів. ID-4 - регулятор процесів проліферації, деградації й апоптозу, підвищення його експресії призводить до змін у клітинному циклі. ZFM-1 - фактор сплайсингу ссавців, підвищення його експресії призводить до порушень процесів транскрипції і синтезу білків.

У деяких зразках гліальних пухлин виявлено зниження рівня експресії гена куліну-1. Кулін-1 є негативним регулятором клітинного циклу і є необхідний для переходу з фази G1 у фазу G0, та, можливо, бере участь у запрограмованій смерті клітин і, таким чином, причетний до пухлинного процесу.

Отримані нами результати про істотно знижений вміст мРНК TSC-22 у пухлинах головного мозку, разом із іншими факторами, свідчать про потенційну супресорну роль цього гена в пухлинному процесі.

Показано значне підвищення експресії гена HC gp-39 в анапластичних астроцитомах та мультиформній гліобластомі. У жодному зразку головного мозку дорослої людини чи астроцитоми II ступеня злоякісності сигнал не виявлено, що свідчить про роль гена HC gp-39 у процесі проліферації при переході до більш злоякісного фенотипу (гліобластоми).

Практичне значення одержаних результатів. Виявлене нами підвищення рівня продукції гетеродисперсних РНК із Alu-повторами й акумуляція поліаденільованих мітохондріальних і цитоплазматичних рРНК у мультиформній гліобластомі порівняно з анапластичною астроцитомою, головним мозком дорослої людини і головним мозком ембріона, а також іншими ембріональними тканинами, свідчить про аномалії синтезу чи деградації РНК у пухлинних клітинах.

Виявлений поліморфізм експресії генів у різних зразках пухлин одного і того ж ступеня злоякісності дозволяє говорити про гетерогенність у шляхах виникнення і прогресії гліальних пухлин.

У зв'язку з тим, що наші результати з великою ймовірністю вказують на потенційну супресорну роль гена TSC-22, генно-інженерні конструкції з геном TSC-22 можуть бути випробувані при генній терапії.

Ген HC gp-39 може, очевидно, бути молекулярним маркером при дослідженні злоякісної прогресії астроцитарних гліом чи ідентифікації гліобластом серед інших пухлин головного мозку людини.

Подальший молекулярно-генетичний аналіз генів, для яких у цій роботі показано зміну експресії в пухлинах головного мозку, дозволить визначити місце і їхню причетність до численних генетичних подій, що призводять до виникнення і прогресії пухлин головного мозку людини. Глибше розуміння цих процесів має практичне значення для вдосконалення діагностики і прогностичної оцінки, для визначення біологічних мішеней при розробці хіміотерапевтичних препаратів.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені в дисертації, отримані здобувачем, в основному, самостійно. Аналіз і обговорення результатів проводили разом з науковим керівником д.б.н., професором, член-кор. НАН України В.М. Кавсаном. Експериментальні роботи з гібридизаційного аналізу кДНК-бібліотек і визначення нуклеотидної послідовності були проведені у співробітництві з к.б.н. В.В. Дмитренком та к.б.н. О.М. Гаріфуліним. Здобувач висловлює щиру подяку співробітникам Інституту нейрохірургії імені акад. А.П. Ромоданова АМН України за біопсії нормальних і пухлинних тканин головного мозку людини; доктору Г. Цехетнеру (G. Zehetner) і співробітникам RZPD за бактерійні клони; доктору Г. Лераху (H. Lerach) за фільтри з клонами кДНК-бібліотек головного мозку людини.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на XV-му і XVI-му міжнародних симпозіумах Європейської Асоціації Досліджень Раку (EACR) (Стокгольм, Швеція, 1998 та Халькідікі-Хелас, Греція, 2000); 10-й конференції Європейського Товариства Досліджень Раку (ECCO) (Відень, Австрія, 1999); на II-му з'їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000), конференції студентів, аспірантів і молодих спеціалістів (Київ, 2001), а також на наукових семінарах відділу біосинтезу нуклеїнових кислот і відділу молекулярної онкогенетики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Публікації. За темою дисертації опубліковано дев'ять друкованих праць, з них чотири статті у співавторстві, а також тези п'яти доповідей на міжнародних наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертацію викладено на 125 сторінках. Вона містить вступ, огляд літератури, експериментальні дослідження, результати досліджень і їх обговорення, висновки. Дисертацію проілюстровано 21 рисунком і 5 таблицями. Список цитованої літератури охоплює 256 найменувань.

Основний зміст

ген гліальний пухлина клон

Матеріали та методи дослідження. Виділення РНК із тканин людини. Ембріональні (вік ембріонів 6-12 тижнів) органи людини (печінка, нирки, легені, серце, головний мозок, м'язи) були отримані в Центрі ембріональних тканин «ЭмЦелл». Зразки пухлин для виділення РНК і ДНК (відразу після видалення перенесені в рідкий азот) були отримані в Інституті нейрохірургії імені акад. А.П. Ромоданова АМН України. Зразки тканин транспортували в рідкому азоті, зберігали в низькотемпературному холодильнику при -70?С.

Тотальну РНК виділяли із заморожених тканин гуанідинізотіоціанатним методом (Chomchinsky et al., 1987). Середній вихід РНК у наших експериментах складав від 0,5 мг до 3,5 мг на 1 г тканини залежно від типу тканини.

Синтез проби кДНК для диференційної гібридизації. Синтез кДНК проводили, як описано (Sambrook et al., 1989), в розчині наступного складу: 50 мМ трис-HCl рН 8,3; 10 мМ MgCl_2, 10 мМ дитіотриетол; 140 мМ KCl; 10 мкг тотальної РНК; 1 мкг оліго (dT)₁₅; 0,5 мМ dATP, dGTP, dTTT, 0,025 мМ dCTP; 50 мCi [б-³²Р] dCTP; 300 од. зворотної транскриптази M-MLV. Суміш інкубували 1 год при 37єС. Для гідролізу РНК у складі гібриду РНК:ДНК реакційну суміш обробляли 50 мМ NaOH 1 год при 65єС.

Диференційна гібридизація бібліотек кДНК. Гібридизували клони кДНК бібліотек головного мозку ембріона людини на «гридах» у приладі Autoblot (Bellco-Glass, США) у розчині: 5х SSC, 5х Denhardt, 50% деіонізований формамід, 100 мкг/мл денатурованої ДНК сперми лосося, [б-³²Р] dCTP мічена проба кДНК (10⁸ імп/хв. мкг), протягом 10-16 год при 42С. Фільтри відмивали спочатку при кімнатній температурі в 2х SSC і 0,1% SDS з поступовим зменшенням концентрації NaCl до 0,03 М і підвищенням температури до 65С.

Виділення плазмідної ДНК. Для аналітичного (1-5 мл LB) і препаративного (0,2-1,0 л LB) виділення плазмідної ДНК з E.coli (штам XL1blue) використовували метод лужного лізису (Birnboim and Doly, 1979) чи метод кип'ятіння (Holmes and Quigley, 1981), або набори фірми Qiagen (Німеччина).

Визначення нуклеотидної послідовності ДНК. нуклеотидну послідовність визначали за Сенгером відповідно до протоколу фірми Amersham Pharmacia Biotech (Велика Британія). Пошук гомологічних послідовностей у GenBank та інших базах даних нуклеотидних і амінокислотних послідовностей проводили за допомогою програми Blast (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Електрофорез РНК у денатуруючому агарозному гелі, перенос РНК на нейлонові фільтри. РНК фракціонували в горизонтальному 1% агарозному гелі в присутності 2,2 М формальдегіду в боратному буферному розчині протягом 3-4 год при силі струму 50-60 мА і переносили на нейлонові фільтри Hybond N (Amersham Pharmacia Biotech) за допомогою паперових рушників, змочених 20x SSC, як описано (Sambrook et al., 1989) протягом ночі. РНК фіксували УФ-опромінюванням за допомогою приладу Spectrolinker (Spectronics Corporation, США, 1200 мJ/см²).

Гібридизаційний аналіз РНК (Нозерн-гібридизація). Проби для Нозерн-гібридизації синтезували за допомогою набору Rediprime (Amersham Pharmacia Biotech). Гібридизацію РНК проводили у приладі Autoblot (BellcoGlass, США) за умов, як описано (Sambrook et al., 1989).

Для радіоавтографії фільтрів використовували рентгенівську плівку Kodak. Інтенсивність сигналів гібридизації вимірювали денситометрично за допомогою програми ScionImage 1.61 (NIH, США). Діаграми будували в програмі Excel (Microsoft, США).

Виділення і гібридизаційний аналіз геномної ДНК (за Саузерном). Виділення геномної ДНК із тканин, рестрикційний аналіз отриманої ДНК, перенос на нейлонові фільтри Hybond N проводили, як описано (Sambrook et al., 1989). Введення мітки у пробу і гібридизацію з використанням набору фірми Boehringer Mannheim (Німеччина) здійснювали відповідно до протоколу для гібридизації з флуоресцентною міткою DIG (дігоксигінін), а також з [б-³²Р] dCTP міченою ДНК згідно протоколу фірми Amersham Pharmacia Biotech.

ЗТ-ПЛР. ЗТ-ПЛР проводили з використанням набору фірми Roche (Німеччина); для реакцій ПЛР були підібрані специфічні праймери до гена TSC-22: Forward: tcaggagctgtgtgcc; Reverse: ggtttctgcatatcacct.

Умови реакції: 94?С - 30 сек, 55?С - 1 хв, 72?С - 1 хв, 30 циклів.

5?/3?-RACE. Продукти 5?- і 3?-RACE до гена HC gp-39 отримували з допомогою набору Roche (Німеччина) згідно інструкції фірми.

Результати досліджень та їх обговорення. Скринінг упорядкованих кДНК-бібліотек головного мозку ембріона людини і головного мозку новонародженої людини гібридизацією з тотальними кДНК пробами. У результаті диференційної гібридизації «грид» кДНК-бібліотеки головного мозку ембріона людини і бібліотеки головного мозку новонародженої людини з тотальними пробами кДНК анапластичної астроцитоми, гліобластоми, нормального головного мозку дорослої людини й ембріонального головного мозку людини було відібрано близько чотирьохсот клонів, що показали зміни в силі гібридизаційного сигналу (рис. 1).

Ці клони були отримані з Центру ресурсів і баз даних Німецького проекту «Геном людини» (Resource Zentrum/Primary Data Base, German Human Genom Project; RZPD, Берлін). Проведена нами диференційна гібридизація підтвердила результати первинного скринінгу для 23 клонів кДНК (табл. 1).

Клони, диференційну експресію яких було підтверджено скринінгом плазмідних ДНК

Експресію відповідних генів вивчали за допомогою Нозерн-гібридизації РНК із нормальних тканин і хірургічних зразків гліальних пухлин головного мозку людини.

Аналіз експресії генів цитоплазматичної 28S рРНК і мітохондріальних 12S рРНК і 16S рРНК. У результаті дот-гібридизації плазмідної ДНК із пробами тотальних кДНК анапластичної астроцитоми, гліобластоми, головного мозку дорослої людини, головного мозку ембріона були відібрані клони ICRFp507G1815, ICRFp507М243 і COLUp553I0714, що мали більш інтенсивний сигнал із пробою кДНК гліобластоми порівняно з кДНК головного мозку дорослої людини (рис. 2).

Аналіз нуклеотидної послідовності показав, що кДНК цих клонів мають гомологію з мітохондріальними 12S рРНК (COLUp553I0714) і 16S рРНК (ICRFp507М243) і цитоплазматичною 28S рРНК (ICRFp507G1815). Вставка з клону ICRFp507М243 має розмір 1,6 т. п.н. Секвенована ділянка є гомологічною аналогічній ділянці гена мітохондріальної 16S рРНК людини. В той же час кДНК ICRFp507М243 має на 3'-кінці додаткові три нуклеотиди, що у мітохондріальній ДНК належать гену тРНК лейцину, а за ними в кДНК розташована гомополімерна послідовність, комплементарна 16 залишкам дезоксиаденозину. Наступний аналіз виявив ще одну кДНК (клон ICRFp507H2345), 3'-кінець якої був такий же, як і в кДНК із клону ICRFp507М243, але містив послідовність, комплементарну 18 залишкам дезоксиаденозину. Поліаденільовані кДНК мітохондріальних 12S рРНК і 16S рРНК були виявлені й в інших клонах (COLUp553I0714, COLUp553P2336, COLUp553J2484). Таким чином, поліаденільовані мітохондріальні рРНК не є артефактом. Аналізом баз даних ESTs були також знайдені клони з інших бібліотек кДНК, із вставками гомологічними мітохондріальним рРНК, що мають на 3?-кінцях послідовності полі(А).

У той час, як при первинному скринінгу і дот-гібридизації плазмідної ДНК із пробами тотальних кДНК клони ICRFp507G1815, COLUp553Р2336, ICRFp507М243, ICRFp507Н2345, COLUp553P2336, COLUp553J2484 і COLUp553I0714 мали більш інтенсивний сигнал із кДНК гліобластоми порівняно з кДНК головного мозку дорослої людини, Нозерн-аналіз із використанням кДНК рибосомних РНК як гібридизаційних проб не показав диференційної гібридизації рРНК у пухлинах і нормальному головному мозку дорослої людини. Очевидно, зміни експресії рибосомних РНК мають місце тільки для поліаденільованих фракцій і не можуть бути виявлені за допомогою Нозерн-гібридизації (рис. 3).

Аналіз експресії генів, що містять послідовності Alu-повторів. Серед відібраних клонів, що показали підвищення експресії в гліальних пухлинах порівняно з експресією в нормальному головному мозку людини, кДНК п'яти клонів (ICRFp507F0552, ICRFp507M1080, ICRFp507M10100, ICRFp507C1134, ICRFp507F0246) містили Alu-повтори.

Використання кДНК, що містили Alu-повтори як проби для Нозерн-гібридизації, не виявило дискретних транскриптів ні в РНК нормального головного мозку, ні в РНК астроцитарних пухлин. Замість цього, були отримані гетерогенні гібридизаційні сигнали розміром від 0,3 до більш ніж 7,0 тисяч нуклеотидів. При цьому інтенсивність гібридизації з РНК мультиформної гліобластоми була набагато вищою порівняно з усіма іншими тканинами. При використанні унікальних послідовностей цих кДНК, які прилеглі до Alu-повторів, як гібридизаційних проб, змін в експресії відповідних генів виявлено не було.

Проведені нами подальші дослідження показали поліморфізм експресії генів, що містять Alu-повтори. Якщо в РНК деяких зразків мультиформної гліобластоми було показано підвищений вміст Alu-повторів, то в РНК інших зразків цього не було виявлено.

Акумуляція гетеродисперсних РНК, які містять Alu-повтори, свідчить про аномалії синтезу, деградації або процесингу РНК у ракових клітинах. Дерегуляція цих процесів може робити внесок у прогресію астроцитом в гліобластому.

Аналіз експресії гена ДНК-зв?язувального білка В. При первинному скринінгу кДНК бібліотек клон ICRFp507В2047 було відібрано як пухлиноспецифічний. кДНК клону ICRFp507В2047 має гомологію з геном ДНК-зв?язувального білка В (dbpB).

Хоча повторна гібридизація плазмідної ДНК ICRFp507В2047 не показала підвищення сигналу з пробами кДНК пухлин, Нозерн-гібридизація виявила сигнали різної інтенсивності з одним мажорним транскриптом розміром 1800 н., що відповідає даним літератури (Shen et al., 1998). На рис. 4 помітно підвищення вмісту мРНК ДНК-зв'язувального білка В у всіх чотирьох зразках гліобластоми, а також в одному з двох зразків анапластичної астроцитоми і у зразку астроцитоми II ступеня злоякісності. Підвищення експресії гена транскрипційного фактора dbpВ в анапластичній астроцитомі та гліобластомі може бути пов'язане з ангіогенезом, активацією і гіперплазією судинного ендотелію - процесів, які стимулюють розвиток астроцитарних пухлин. Було показано, що dbp В є транс-фактором тромбіну, який стимулює певні гени в ендотеліальних клітинах і активує ангіогенез у пухлинних клітинах (Ohga et al., 1998).

Аналіз експресії гена ApoE. Серед клонів, що показали підвищений гібридизаційний сигнал при первинному скринінгу кДНК бібліотеки головного мозку ембріона людини з пробою кДНК анапластичної астроцитоми порівняно з пробою кДНК головного мозку дорослої людини, було відібрано також клон ICRFp507I0511, кДНК вставка якого мала гомологію з мРНК аполіпопротеїну Е. Повторна гібридизація плазмідної ДНК із клону ICRFp507I0511 з пробами тотальних кДНК пухлин і нормального головного мозку людини не показала розходжень в інтенсивності сигналу, однак цей клон було відібрано для подальшої характеристики як ген, що експресується в клітинах глії і відіграє роль у регенерації нервових тканин.

Знижений вміст мРНК аполіпопротеїну Е спостерігався у двох із чотирьох зразків гліобластоми, у п'ятьох із семи зразків анапластичної астроцитоми, а також у зразку головного мозку ембріона людини. У той же час, підвищену експресію гена АроЕ виявлено в одному з чотирьох зразків гліобластоми, в одному із семи зразків анапластичної астроцитоми, в одному з двох зразків астроцитоми II ступеня злоякісності (рис. 5). Розмір транскрипту становить близько 1500 н., що відповідає даним літератури (Breslow et al., 1982).

Таким чином, незважаючи на результати, отримані нами після первинного скринінгу, а також дані інших авторів про підвищену експресію гена АроЕ в пухлинах і про можливу роль аполіпопротеїну Е в пухлинному процесі, нами не виявлено кореляції між ступенем злоякісності гліальних пухлин і експресією гена АроЕ.

Аналіз експресії гена куліну-1 (cullin-1). Клон ICRFp507L1033 із кДНК вставкою, що є гомологічною гену куліну-1, було відібрано у результаті первинного скринінгу кДНК бібліотеки головного мозку ембріона людини гібридизацією з пробою кДНК анапластичної астроцитоми і пробою кДНК головного мозку дорослої людини як потенційний ген-супресор пухлин.

Повторна гібридизація плазмідної кДНК ICRFp507L1033 показала зниження інтенсивності сигналу з кДНК пухлин. За допомогою Нозерн-гібридизації отримано дані про зниження експресії гена куліну-1 у пухлинах головного мозку людини, зокрема, відсутність експресії в одному з чотирьох зразків гліобластом, у двох із семи зразків анапластичної астроцитоми, у двох із трьох зразків астроцитоми II ступеня злоякісності. Найбільшу інтенсивність сигналів виявлено у зразках головного мозку дорослої людини, нирки і серця дорослої людини, а також зі зразком РНК головного мозку ембріона людини. Інтенсивність гібридизаційних сигналів з нормальними тканинами значно вища інтенсивності гібридизаційних сигналів з пухлинними зразками, тоді як для контрольних генів (в-актину і б-тубуліну) ця різниця не спостерігалась.

Кулін-1 входить до складу комплексу, що бере участь в убіквітинозалежній деградації білків, зниження його експресії призводить до порушень клітинного циклу, запускаючи клітину по неконтрольованому шляху поділу (Yu et al., 1998).

Аналіз експресії гена ZFM-1. Клон ICRFp507Р1833 було відібрано як пухлиноспецифічний. кДНК клону ICRFp507Р1833 має гомологію з геном, який кодує транскрипційний фактор ZFM-1 або фактор сплайсингу ссавців-1 (SF-1). Повторна гібридизація плазмідної ДНК ICRFp507Р1833 показала підвищення сигналу з пробами кДНК пухлин.

Підвищення експресії гена ZFM-1 виявлено в анапластичних астроцитомах порівняно з гліобластомами і головним мозком дорослої людини. Найбільш інтенсивні гібридизаційні сигнали спостерігалися з чотирма (із семи) зразками анапластичних астроцитом, а також зі зразком РНК головного мозку ембріона, нирки дорослої людини і з одним (з чотирьох) зразком головного мозку людини. В усіх чотирьох зразках гліобластом інтенсивність сигналів була значно нижчою. Розміри транскриптів - 2500-2700 і 3500 н., що відповідає даним літератури (Lloyd et al., 1997). В деяких зразках анапластичної астроцитоми та у зразку головного мозку ембріона спостерігається додатковій транскрипт розміром 8-10 т. п.н.

Підвищення експресії гена ZFM-1, що бере участь у негативній модуляції транскрипції інших транскрипційних факторів, асоційованих із РНК-полімеразою II, може викликати координовану зміну експресії генів, продукти яких асоційовані з різними сигнальними шляхами (Zhang et al., 1998).

Аналіз експресії гена ID-4. Ген ID-4 бере участь у процесах проліферації, диференціації й апоптозу (Pagliuca et al., 1995). Він належить до родини домінантно-негативних транскрипційних факторів (Id-1 - Id4), які містять у своєму складі активований helix-loop-helix домен, але не мають ДНК-зв?язувального домену. Id-4 було відібрано у результаті первинного скринінгу як ген, що підвищує експресію в пухлинах головного мозку людини. Однак повторна гібридизація плазмідної ДНК показала зниження експресії цього гена в пухлинах. Таке розходження в результатах гібридизації з «гридами» і плазмідною ДНК можна пояснити тим, що проби кДНК для первинного скринінгу кДНК бібліотеки і для гібридизації плазмідної ДНК синтезувалися на тотальній РНК, що була отримана з різних зразків анапластичної астроцитоми.

У результаті альтернативного сплайсингу та використання альтернативних сайтів поліаденілювання ген Id-4 продукує три типи молекул мРНК розміром 1,7; 2,0 i 3,7 т.н. (Rigolet et al., 2000). У всіх чотирьох зразках гліобластом експресію гена Id-4 виявлено на низькому рівні, а транскрипт розміром 3,7 т.н. відсутній взагалі. Низький рівень експресії показано і в головному мозку дорослої людини: у трьох з чотирьох зразків показано дуже низький рівень експресії транскрипту розміром 3,7 т.н., а в одному зразку - повну відсутність транскриптів розміром 1,7 і 2,0 т.н. У той же час збільшення експресії гена Id-4 виявлено в астроцитомах II ступеня злоякісності й в анапластичних астроцитомах.

Оскільки астроцитоми - це пухлини, які швидко ростуть, інфільтрують навколишні структури головного мозку, а гліобластоми характеризуються активацією росту судинного ендотелію і некрозами, то не дивно, що експресія Id-4 підвищена в активно проліферувальних клітинах глії, тобто в клітинах прогресуючих астроцитом. Ці результати корелюють з даними літератури про роль Id-4 у регуляції проліферації і клітинного росту (Norton, 2000).

Аналіз експресії гена TSC-22. Клон ICRFp507J1041 було відібрано за результатами первинного скринінгу як клон з меншою інтенсивністю гібридизаційного сигналу з пробами кДНК пухлин головного мозку людини. Вторинний скринінг плазмідних ДНК підтвердив дані цього аналізу.

Нуклеотидна послідовність кДНК ICRFp507J1041 ідентична опублікованій раніше нуклеотидній послідовності кДНК TSC-22 (Kestler et al., 1999), однак 3'-нетрансльований район кДНК ICRFp507J1041 коротший на 2 нуклеотиди порівняно з 3'-нетрансльованим районом кДНК TSC-22.

Нозерн-гібридизація тотальних РНК чотирьох зразків нормального головного мозку та 17 зразків різних пухлин головного мозку показала значне зниження експресії гена TSC-22 в більшості зразків мультиформної гліобластоми, анапластичної астроцитоми, астроцитоми II ступеня злоякісності, загалом, в дванадцяти індивідуальних пухлинах. У декількох пухлинах головного мозку експресія гена TSC-22 відсутня повністю (рис. 6). Розмір транскрипту становить близько 1,8 т.н., що відповідає даним літератури (Jay et al., 1996).

Ген TSC-22 людини було картовано на довгому плечі 13-ї хромосоми в районі q14 (Jay et al., 1996). Зараз дані по секвенуванню геному людини дозволяють більш точно розташувати його на ділянці 13q13.2. Приблизно в 50% астроцитом відбувається втрата довгого плеча 13-ї хромосоми (Henson et al., 1994; Huhn et al., 1999; Venkatraj et al., 1998; Harada et al., 1998). Втрата гетерозиготності в локусі гена ретинобластоми (Rb) на ділянці 13q14 виникає приблизно в 30% астроцитом високого ступеня злоякісності, однак не виявлена ні в одній з астроцитом низького ступеня. Ці результати показують, що локус гена Rb є однією з мішеней делецій на ділянці 13q14, однак, також дозволяють припустити можливість існування іншого гена-супресора на довгому плечі 13-ї хромосоми. TSC-22 є одним з кандидатів на роль цього додаткового гена-супресора.

Саузерн-гібридизація ДНК пухлин із фрагментом кДНК J1041 не показала втрату генетичного матеріалу в локусі гена TSC-22. Імовірно, зниження експресії цього гена відбувається внаслідок змін регуляторних елементів (мутацій, делецій чи інсерцій у промоторній ділянці, зміни експресії транскрипційних факторів).

Отримані нами результати про істотне зменшення вмісту мРНК TSC-22 у пухлинах головного мозку людини, показана іншими авторами відсутність експресії гена в пухлинах слинної залози (Ohta S. et al., 1997), негативна роль білка TSC-22 у регуляції проліферації клітин (Kester H. et al., 1999), все це разом свідчить про потенційну супресорну роль цього гена в пухлинному процесі.

Аналіз експресії гена HCgp-39. Ген НС gp-39 було відібрано як гліомоспецифічний за результатами комп'ютерного аналізу (SAGE) - бібліотек головного мозку людини і гліобластом, проведеному раніше у нашому відділі О.М. Гаріфуліним. На рис. 7 представлені результати Нозерн-гібридизації проби [б-³²Р] кДНК HC gp-39 з тотальною РНК.

Було проаналізовано 23 зразки гліальних пухлин головного мозку різного ступеня злоякісності та 11 зразків головного мозку дорослої людини. У більшості зразків розмір транскрипту становить близько 1900 н., що відповідає даним літератури (Rehli et al., 1997). Зростання експресії гена HC gp-39 виявлено винятково в астроцитомах високих ступенів злоякісності - анапластичних астроцитомах (III ступінь злоякісності) і мультиформних гліобластомах (IV ступінь злоякісності). мРНК HC gp-39 не детектувалась в астроцитомах II ступеня злоякісності й у зразках головного мозку дорослої людини, а також в інших типах пухлин головного мозку.

У трьох зразках мультиформної гліобластоми, а також у двох зразках анапластичної астроцитоми виявлено транскрипт розміром біля 3000 н., не описаний у літературі. Як і для гена ZFM-1, появу таких транскриптів можна пояснити виникненням нового альтернативно сплайсованого продукту цього гена чи утворенням, в наслідок перебудов, злитого (fusion) транскрипту в зразках анапластичних астроцитом.

Було проведено спробу клонувати більший транскрипт за допомогою техніки 3' - та 5'-RACE, однак нами не були отримані продукти кДНК, які б відповідали мРНК більшого розміру. Продукти 3?- і 5?-RACE основного розміру, що відповідають за розміром відомій кДНК (1,9 т.н.), були клоновані і частково секвеновані. вони виявилися гомологічними відомим кДНК. В Genbank є три кДНК цього гена - 1,76; 1,8 і 1,9 т.н., які відрізняються тільки довжиною 5? та 3'-кінців. RACE-метод не виявив продукту гена HC gp-39, який би альтернативно сплайсувався чи утворював «злитий» (fusion) транскрипт. Одним із пояснень існування сигналу, що відповідає розміру 3000 н. при Нозерн-гібридизації РНК гліобластоми з пробою кДНК gp-39, може бути гібридизація з гомологічною послідовністю, підвищення експресії якої корелює з експресією гена HC gp-39.

Таким чином, нами встановлено підвищення експресії гена HC gp-39 в анапластичних астроцитомах і мультиформній гліобластомі. У зразках головного мозку дорослої людини чи астроцитоми II ступеня злоякісності мРНК HC gp-39 не виявлено, що свідчить про роль гена HC gp-39 при переході до більш злоякісного фенотипу (гліобластоми). Ген HC gp-39 може бути використаним як молекулярний маркер при дослідженні злоякісної прогресії астроцитарних гліом чи ідентифікації гліобластом серед інших пухлин головного мозку людини.

Висновки

1. За допомогою методу диференційної гібридизації «грид» кДНК високої щільності ідентифіковано 23 нуклеотидні послідовності, експресія яких змінюється в гліальних пухлинах головного мозку людини.

2. Виявлено нагромадження поліаденільованих мітохондріальних і цитоплазматичних рРНК, а також гетеродисперсних РНК, що містять Alu-повтори, що свідчить про аномалії синтезу, деградації і процесингу РНК у пухлинних клітинах. Дерегуляція цих процесів може зумовлювати прогресію астроцитом у гліобластоми.

3. Встановлено підвищення експресії гена транскрипційного фактора dbpВ (ДНК-зв'язувального білка В) в астроцитарних пухлинах різного ступеня злоякісності. Участь dbpВ у стимуляції деяких генів у активованих ендотеліальних клітинах як транс-фактора тромбіну дозволяє припустити, що активація гена dbpВ пов'язана з гіперплазією судинного ендотелію в астроцитарних пухлинах.

4. Вперше виявлено активацію експресії генів ZFM1/SF1 та Id-4 в анапластичних астроцитомах. Ген ZFM1/SF1 кодує білок, який бере участь у негативній модуляції транскрипції факторів, асоційованих із РНК-полімеразою II, і може спричиняти координовану зміну експресії генів у різних ланках клітинних процесів. Ген Id-4 належить до родини регуляторів клітинної диференціації, проліферації і апоптозу, його активація, ймовірно, пов'язана з дедиференціацією трансформованих астроцитарних клітин.

5. Вперше досліджено експресію гена куліну-1 в гліальних пухлинах головного мозку людини на рівні мРНК. Встановлене зниження експресії гена куліну-1 у астроцитарних пухлинах різного ступеня злоякісності, можливо, пов'язане з порушеннями клітинного циклу.

6. Отримано дані про істотно знижений вміст мРНК TSC-22 у пухлинах головного мозку, що, поряд з описаними в літературі іншими даними, свідчить про потенційну супресорну роль цього гена в пухлинному процесі.

7. Показано підвищення експресії гена HC gp-39 в анапластичній астроцитомі та мультиформній гліобластомі. Ген HC gp-39 може бути молекулярним маркером при дослідженні злоякісної прогресії астроцитарних гліом чи ідентифікації гліобластом серед інших пухлин головного мозку людини.

8. Виявлений поліморфізм експресії генів у різних зразках пухлин одного і того ж ступеня злоякісності відображає гетерогенність шляхів виникнення і прогресії астроцитарних гліом.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Дмитренко В.В., Гарифулин О.М., Шостак Е.А., Смикодуб А.Н., Кавсан В.М. Характеристика различных типов мРНК, экспрессирующихся в головном мозге человека // Цитология и генетика. - 1996. - Т.30, №5. - С. 41-47.

2. Дмитренко В.В., Шостак К.О., Гаріфулін О.М., Зозуля Ю.П., Кавсан В.М. Зміни експресії генів у клітинах астроцитом головного мозку людини // Экспериментальная онкология. - 1998. - Т.20, №3-4. - С. 191-197.

3. Шостак К.О., Дмитренко В.В., Гарифулін О.М., Розуменко В.Д., Хоменко О.В., Зозуля Ю.П., Цехетнер Г., Кавсан В.М. Потенційна супресорна роль гена TSC-22 в пухлинах головного мозку людини // Біополімери і клітина. - 2001. - Т.17, №2. - С. 152-159.

4. Кавсан В.М., Дмитренко В.В., Шостак К.О., Марусик А.М., Зозуля Ю.П. Молекулярна генетика гліом // Генетика і селекція на межі тисячоліть. - К.: Логос, 2001. - Т.1. - С. 333-351.

5. Kavsan V.M., Dmitrenko V.V., Garifulin O.V., Shostak K. Identification of differentially expressed genes in gliomas // XV Meting European Association for Cancer Research. - Stockholm (Sweden). - 1998. - P.195.

6. Kavsan V., Dmitrenko V., Shostak K., Garifulin O., Homenko, Zozulya Yu. Increased expression of heterodisperse Alu-containing transcripts in glioblastoma multiforme // The 10th European Cancer Conference. - Vienna (Austria). - 1999. - P.119.

7. Дмитренко В.В., Марусик А.М., Шостак Е.А., Хоменко А.В., Розуменко В.Д., Зозуля Ю.П., Кавсан В.М. Изменения экспрессии генов в опухолях головного мозга человека // Онкология-2000, Тезисы II съезда онкологов стран СНГ. - Киев (Украина). - 2000, №187.

8. Kavsan V., Dmitrenko V., Shostak K., Garifulin O., Zehetner G., Homenko O., Gridina N., Zozulya Yu. Changes of gene expression associated with initiation or progression of human brain astrocytic tumours // XVI Meting European Association for Cancer Research. - Halkidiki-Hellas (Greece). - 2000. - P.63-64.

9. Shostak K.O., Garifulin O.M., Dmitrenko V.V., Kavsan V.M. Gene expression changes in human glial tumors // Conference for students, PhD students and young scientists. - Kyiv (Ukraine). - 2001. - P.167.

Размещено на Allbest.ru