Пристосованiсть i частота кросинговеру у мутантiв Drosophila melanogaster залежно вiд вiку та штучних перебудов генотипу

Размещено на http://www.allbest.ru/

СЕЛЕКЦІЙНО-ГЕНЕТИЧНИЙ ІНСТИТУТ - НАЦІОНАЛЬНИЙ ЦЕНТР

НАСІННЄЗНАВСТВА ТА СОРТОВИВЧЕННЯ

УДК: 575.3:577.222:595.773.4

ПРИСТОСОВАНІСТЬ І ЧАСТОТА КРОСИНГОВЕРУ У МУТАНТІВ DROSOPHILA MELANOGASTER ЗАЛЕЖНО ВІД ВІКУ ТА ШТУЧНИХ ПЕРЕБУДОВ ГЕНОТИПУ

03.00.15 - генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

НАССЕР МОХ'Д ЮСЕФ АЛ-ШИБЛI

Одеса 2003



Дисертацiєю є рукопис.

Робота виконана в Одеському нацiональному унiверситетi iм. I. I. Мечникова

Науковий керiвник: Тоцький Владлен Миколайович, доктор бiологiчних наук, професор, Одеський нацiональний унiверситет iм. I. I. Мечникова, завiдувач кафедри генетики i молекулярної біології.

Офіційні опоненти: Сиволап Юрій Михайлович, доктор бiологiчних наук, професор, академiк УААН, директор Пiвденного бiотехнологiчного центру в рослинництвi УААН i МОН України.

Герасименко Воладимир Пилиповч, кандидат бiологiчних наук, доцент, завiдуiвач кафедри селекції, генетики та захисту рослин Одеського державного аграрного унiверситету Мiнагрополiтики України.

Провiдна установа: Харкiвський нацiональний унiверситет i м. В. Н. Каразiна МОН України.

Захист вiдбудеться “23” сiчня 2004 р.о 10:00 годинi на засiданнi спецiалiзоваої вченої ради Д 41.363.01 Селекцiйно-генетичного iнституту - нацiонального центру насiннєзнавства та сортовивчення УААН, 65036, м. Одеса, Овiдiопольська дорога, 3.

З дисертацiєю можна ознайомитись у бiблiотецi Селекцiйно-генетичного iнституту - Нацiонального центру насiннєзнавства та сортовивчення УААН за адресою: 65036, м. Одеса, Овiдiопольська дорога, 3.

Автореферат розiсланий “11 ” грудня 2003 р.

Вчений секретар

спецiалiзованої вченої ради Сiчкар В. I.



Нассер Мох`д Юсеф Ал-Шиблi. Пристосованiсть i частота кросинговеру у мутантiв Drosophila melanogaster залежно вiд вiку та штучних перебудов генотипу. - Рукопис. генотип мутантний кросинговер муха

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук, 03.00.15 - генетика. Селекцiйно-генетичний iнститут - Нацiональний центр насiннєзнавства та сортовивчення УААН, 2003 р.

Отримано данi про стан компонентiв пристосованостi у рiзних мутантних лiнiй Drosophila melanogaster, про частоту кросинговеру на дiлянцi b - cn - vg i експресивнiсть локуса Adh залежно вiд вiку мух, умов їх утримання i штучно здiйснених перебудов генотипу. Показано, що вiковi змiни компонентiв пристосованостi у дослiджуваних носiїв мутантних генiв бiльш значнi, нiж у мух дикого типу C - S. Встановлено, що насичення генотипу мутанта b cn vg генами мух C - S або замiщення його хромосоми 1 на гомологiчну хромосому мух C - S супроводжується пiдвищенням частоти кросинговеру на дiлянцi b - cn - vg. При цьому частота кросинговеру за штучних змiн генотипу зростає головним чином на дiлянцi b - cn, але не змiнюється на дiлянцi cn - vg. Отримано докази наявностi в генотипi мух лiнiї C - S генiв, здатних полiпшувати показники компонентiв пристосованостi у мутантiв b cn vg. Встановлена певна подiбнiсть у спрямованостi змiн окремих дослiджуваних показникiв (плодючостi, активностi АДГ, кросинговеру) у мутантiв b cn vg за їх старiння та штучних перебудов генотипу.

Ключовi слова: дрозофiла, генотип, компоненти пристосованостi, вiк, кросинговер, ген-ензимна система АДГ, мутацiї.



Нассер Мох'д Юсеф Ал-Шибли. Приспособленность и частота кроссинговера у мутантов Drosоphila melanogaster в зависимости от возраста и искусственных перестроек генотипа. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, 03.00.15 - генетика. Селекционно-генетический институт - Национальный центр семеноводства и сортоизучения УААН, 2003 г.

Изучено состояние компонентов приспособленности у разных мутантных линий Drosоphila melanogaster и у мух дикого типа C - S, исследована экспрессивность локуса Adh и частота кроссинговера на участке b - cn - vg в зависимости от возраста мух, условий их содержания и осуществленных перестроек генотипа. Показано, что участки b - cn и cn - vg, равноценные по размерам на генетической карте хромосомы 2 дрозофилы, обладают разной рекомбинационной активностью в условиях опытов. Прицентромерный участок b - cn характеризуется пониженной частотой кроссинговера по сравнению с участком cn - vg. Установлено, что приспособленность, определяемая по плодовитости, продолжительности жизни и устойчивости к экстремальным факторам, варьирует у исследованных линий мух в зависимости от генотипа и возраста особей. Обнаружено, что тройные мутанты b cn vg уступают мухам дикого типа по всем исследованным показателям приспособленности и выявляют при этом более высокую активность АДГ в течение онтогенеза. Возрастные изменения компонентов приспособленности у исследованных носителей мутантных генов более значительны, чем у мух дикого типа C - S.

Контрастные по показателям приспособленности и экспрессивности локуса Adh линии C - S и b cn vg использованы в качестве исходных для получения синтезированных генотипов b cn vg (C - S) и b cn vg (1 C - S). Отличающиеся высокой приспособленностью мухи дикого типа служили донорами, а низко приспособленные тройные мутанты - реципиентами генов и Х-хромосом соответственно при насыщающих скрещиваниях и замещениях хромосом.

Установлено, что искусственное объединение в генотипе хромосом и генов разного происхождения существенно влияет на адаптивный потенциал особей. Оказалось, что перестройки генотипа у мух b cn vg как путем его насыщения генами дикого типа, так и замещением хромосомы 1, приводит к повышению частоты кроссинговера между генами b и cn. Частота кроссинговера на участке cn - vg при этом остается неизменной. Повышение рекомбинационной активности у тройных мутантов с модифицированными генотипами сочетается с увеличением их приспособленности, определяемой по большинству показателей, за исключением плодовитости. Так, например, при насыщении генотипа мутантов b cn vg генами мух дикого типа удлиняются сроки их жизни, а замещение хромосомы 1 на соответствующую “дикую” хромосому приводит к увеличению теплоустойчивости особей. В обоих случаях возрастает также устойчивость к голоданию до уровня этого показателя у мух дикого типа. Выявлено определенное сходство в направленности изменений отдельных изученных показателей (плодовитости, частоты кроссинговера и активности АДГ), наблюдаемых у мутантов b cn vg при их старении и искусственных изменениях генотипа.

Ключевые слова: дрозофила, генотип, компоненты приспособленности, возраст, кроссинговер, ген-энзимная система АДГ, мутации.



Nasser Moh`d Usef Al-Shibly. Fitness and crossing over frequency of the mutants Drosophila melanogaster in dependance upon age and artificial reorganizations of a genotype. - Manuscript.

Athesis on competition for the scientific degree of the candidate of biological sciences, 03.00.15 - Genetic. Plant breeding & genetics institute - National center of seed and cuitivar investigation, UААS, 2003.

It was determined that saturation of the mutant genotype b cn vg by the genes of flies C - S or the displacement of its chromosome 1 on a homologous chromosome of flies C - S leads to increasing of frequency of a crossing over on the field b - cn - vg. Thus the frequency of the crossing over at the artificial changes of the genotype increases on the field b - cn, but does not change on the field cn - vg.

It is shown that the age changes of the fitness components for the investigated bearers of mutant genes are more significant than for flies of wild type C - S. The proofs of availability in the genotype of flies of the line C - S genes which are capable to improve the parameters of fitness components for the mutants b cn vg are obtained. The state of fitness components for different mutant lines D. melanogaster, frequency of the crossing over on the field b - cn - vg and expressivity of the locus Adh depending upon age of flies, conditions of their keeping and carried out modification of the genotype are studied. The definite resemblance in the trend of changes of the separate studied parameters (fertility, frequency of a crossing over and activity of Adh), observed for the mutants b cn vg is determined at their aging and artificial change of their genotype.

Keywords: Drosophila, the genotype, fitness components, age, crossing over, the gene-enzyme system Adh, mutations.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Широке застосування в генетиці індукованого мутагенезу та аутбридингу, впровадження генноінженерних та інших біотехнологічних методів збуджує інтерес до проблеми вивчення адаптивних здатностей генетично модифікованих генотипів. Не менш важливим є дослідження змін пристосованості генотипів за процесу старіння, яке також супроводжується зміною генного балансу із-за накопичення в генотипі мутаційних та інших змін. В усіх випадках, коли гени взаємодіють у зміненому генетичному середовищі, це може істотно впливати на реалізацію генетичної інформації, включаючи становлення таких складових пристосованості як плодючість, життєздатність, тривалість життя та ін. Слід зазначити, що вивчення функцій окремих генів у зміненому генофоні сприяє поглибленню і конкретизації відомих теорій і гіпотез про коадаптовані гени [Айала, Кайгер, 1988; Жученко, 1980], компенсаційні [Струнников, 1987] та адаптаційні [Тоцкий и др., 2002] комплекси генів тощо. Всі ці теорії і гіпотези, важливість яких для генетики і селекції не викликає сумніву, потребують молекулярно-генетичного і генетико-біохімічного трактування. На жаль, інформації про те, як впливають на зазначені блоки і комплекси генів природні і штучні перебудови генотипів, дуже мало.

Сказане свідчить про те, що вивчення експресивності окремих структурних генів, частоти кросинговеру і фенологічних показників пристосованості у генетично модифікованих генотипів в залежності від віку особин є актуальною проблемою генетики, яка має важливе загальнобіологічне значення

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі генетики і молекулярної біології Одеського національного університету і є складовою частиною наукових досліджень по темі № 698 (№ державної реєстрації 0197008973) “Вікові особливості життєздатності і мейотичної рекомбінації у дрозофіли в залежності від генотипу, штучного заміщення хромосом і умов утримання”.

Мета і задачі досліджень. Метою даної роботи було вивчення змін частоти кросинговеру, функціональної активності локуса Adh і стану основних компонентів пристосованості у лінійних мух D. melanogaster в залежності від віку та експериментально створених перебудов генотипу.

Відповідно до поставленої мети ставили такі задачі:

З'ясувати стан основних компонентів пристосованості (плодючості, виживання в екстремальних умовах, тривалості життя) у мух дикого типу C - S і мутантних ліній b, cn, vg, cn vg, b cn, b cn vg.

Провести порівняльну оцінку показників пристосованості у мух досліджуваних ліній, з'ясувати вплив маркерних мутацій на пристосованість і виявити генотипи з контрастними показниками пристосованості.

Отримати потрійних мутантів b cn vg із штучно модифікованими генотипами, а саме мух b cn vg (C - S) і b cn vg (1 C - S), шляхом насичення генотипу b cn vg генами мух C - S, а також заміщенням хромосоми 1 мутанта на відповідну хромосому мух дикого типу C - S.

З'ясувати частоту кросинговеру на ділянці b - cn - vg у потрійних мутантів b cn vg, а також у штучно модифікованих генотипів - b cn vg (C - S) і b cn vg (1 C - S).

Визначити функціональний стан ген-ензимної системи АДГ у мух з різним рівнем пристосованості, а саме у лінійних мух C - S, b cn vg, а також у штучно створених генотипів b cn vg (C - S) і b cn vg (1 C - S)

З'ясувати частоту кросинговеру, функцію локуса Adh та стан компонентів пристосованості у досліджуваних мух залежно від віку.

Провести аналіз отриманих даних і дати заключення про вплив мутацій, віку і здійснених штучних перебудов генотипу на окремі фенологічні компоненти пристосованості, функціональний стан локуса Adh і на рекомбінаційну активність хромосом.

Об'єкт дослідження - пристосованість мутантних ліній D. melanogaster за старіння і штучних перебудов генотипів.

Предмет дослідження - ефекти мутацій, а також штучно створених і пов'язаних із старінням змін генотипу на компоненти пристосованості, експресію локуса Adh і частоту кросинговеру у мутантів D. melanogaster.

Методи дослідження. Застосовано традиційні і добре апробовані в генетиці методи визначення основних компонентів пристосованості D. melanogaster, а саме: плодючості, виживаності в екстремальних умовах (гіпертермія, голодування), тривалості життя та ін. Крім зазначених фізіологічних компонентів пристосованості, використовували також генетичний (визначення частоти кросинговеру) і генетико-біохімічний (визначення функціонального стану ген-ензимної системи АДГ) показники адаптивності. Частоту кросинговеру, активність і термостабільність АДГ визначали загальноприйнятими методами і, керуючись даними літератури, використовували ці показники для оцінки життєздатності і загальної пристосованості D. melanogaster. Достовірність отриманих даних оцінювали за критерієм Стьюдента (Р<0,05).

Наукова новизна одержаних результатів. Порівняльна оцінка стану компонентів пристосованості у вищенаведених мутантів D. melanogaster за їх старіння, а також за насичуючих схрещувань і заміщення хромосоми 1 проведена вперше. При цьому встановлено ряд нових фактів і закономірностей, які доповнюють і поглиблюють існуючі у генетиці уявлення і концепції. Серед них:

вперше встановлено, що насичення генотипу мутанта b cn vg генами мух C - S або заміщення його хромосоми 1 на гомологічну хромосому мух C - S супроводжується підвищенням частоти кросинговеру на ділянці b - cn - vg. При цьому частота кросинговеру після штучних змін генотипу зростає на ділянці b - cn, але не змінюється на ділянці cn - vg;

вперше показано, що зміни компонентів пристосованості, пов'язані з віком, у досліджуваних носіїв мутантних генів більш значні, ніж у мух дикого типу C - S;

отримано докази наявності в генотипі мух лінії C - S генів, здатних поліпшувати показники компонентів пристосованості у мутантів b cn vg;

отримано нові дані про стан компонентів пристосованості у різних мутантних ліній D. melanogaster, про частоту кросинговеру на ділянці b - cn - vg і експресивність локуса Adh залежно від віку мух, умов їх утримання і штучно здійснених перебудов генотипу;

встановлена певна подібність у спрямованості змін окремих досліджуваних показників (плодючості, активності АДГ, кросинговеру) у мутантів b cn vg за їх старіння та штучних перебудов генотипу.

Практичне значення одержаних результатів. Матеріали роботи, що свідчать про вплив природних і штучних перебудов генотипів на компоненти пристосованості досліджуваних комах, мають практичне значення у зв'язку з широким впровадженням у генетику і селекцію методів клітинної і генетичної інженерії. Встановлені автором факти, згідно з якими в умовах насичуючих схрещувань і штучного заміщення хромосом може зростати частота кросинговеру і змінюватися функціонування структурних генів, слід враховувати за проведення аутбридингу і генноінженерних маніпуляцій. Ці ж матеріали, а також дані про вікові зміни пристосованості, можуть бути використані генетиками для подальшої розробки теорій старіння, адаптації, кросинговеру і мутагенезу.

Ряд положень і матеріалів дисертації використовуються в навчальному процесі кафедри генетики та молекулярної біології Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно провів інформаційний пошук та проаналізував літературу по темі дисертації. Особисто виконав експериментальну частину роботи, статистично обробив цифровий матеріал, написав текст дисертації. Налагодження методів і проведення дослідів здійснював разом з канд. біол. наук доц. Н. Д. Хаустовою. Визначення концепцій і задач, обговорення та інтерпретацію результатів здійснював з допомогою наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, викладені в дисертації, були представлені на 56-й і 57-й наукових конференціях професорсько-викладацького складу і наукових співробітників ОНУ (Одеса, 2001, 2002); Міжнародній конференції студентів і молодих вчених по молекулярній біології і генетиці (Київ, 2001); на 7-му з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М. І. Вавілова (Крим, 2002); на 4-му і 5-му Міжнародних симпозіумах по біологічних механізмах старіння (Харків, 2000; 2002).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 8 робіт: 4 журнальних статті у фахових виданнях і 4 публікації у матеріалах наукової конференції, двох симпозіумів і з'їзду генетиків України.

Структура та об'єм дисертації. Дисертація складається із вступу, 4 розділів: огляду літератури, загальної методики і основних методів, результатів досліджень і їх обговорення, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, рекомендацій по практичному використанню результатів, списку літератури. Текст викладено на 123 сторінках комп'ютерного тексту, він містить 3 рисунки і 14 таблиць. Список літератури включає 258 найменувань, з них 140 - на іноземних мовах.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури і вибір напрямів досліджень

Наведено дані літератури щодо генетичних аспектів пристосованості, основних компонентів цієї властивості та її залежності від генного балансу, викладено існуючу інформацію про генетичну рекомбінацію як джерело комбінаційної мінливості і як показник адаптивної здатності генотипів. Один із підрозділів присвячено ген-ензимній системі алкогольдегідрогенази (АДГ) і ролі локуса Adh у філогенетичній та онтогенетичній адаптації дрозофіли. На підставі викладених даних обгрунтовано вибір теми дисертаційної роботи, основні напрями досліджень та основні показники пристосованості, що враховувалися у дослідах.

Загальна методика і основні методи

У розділі викладено інформацію про матеріали (лінії D. melanogaster), використані у дослідженнях, загальну методику виконання експериментальної частини роботи і описано конкретні методи, що були застосовані у роботі.

Досліди провадили на лініях D. melanogaster, гомозиготних по хромосомі 2, де локалізовані ген Adh і маркерні мутації b, cn і vg. Досліджували одинарних (b, cn, vg), подвійних (b cn, cn vg) і потрійних (b cn vg) мутантів, а також мух дикого типу (C - S), попередньо інбредованих протягом 20 поколінь.

Здійснювали перебудову генотипу потрійного мутанта b cn vg у двох напрямах: 1) насичували цей генотип генами лінії C - S за допомогою насичуючих схрещувань і 2) заміщували хромосому 1 мутанта на відповідну хромосому мух лінії C - S за схемою L. S. Luckinbill et all [1988]. Cинтезованих мух з модифікованими генотипами позначали відповідно як b cn vg (C - S) і b cn vg (1 C - S).

Пристосованість вихідних мутантів та мух з модифікованими генотипами оцінювали, визначаючи основні компоненти цієї ознаки: реальну плодючість, тривалість життя, здатність виживати в екстремальних умовах, а також рівень рекомбінаційної активності на ділянці b - cn - vg та функціональний стан ген-ензимної системи АДГ. Визначення всіх цих показників провадили загальноприйнятими та добре апробованими методами.

Реальну плодючість оцінювали по кількості нащадків (імаго) однієї пари мух, що утримувалася в пробірці (20 мл) протягом трьох діб [Хаустова, 1995]. Для визначення здатності мух виживати в умовах гіпертермії їх прогрівали 15 хв при 41 °С (L_t50 для мух дикого типу), після чого через добу вираховували відношення (відсоток) живих мух до загального числа прогрітих [Некрасова, Шахбазов, 1981]. Виживання досліджуваних дрозофіл в умовах голоду визначали, утримуючи мух різного віку у пробірках без корму і підраховуючи через кожні 3 години живих комах. Результати виражали кількістю годин, необхідних для загибелі 50% мух. Тривалість життя комах за утримання їх на стандартному середовищі і з доданням до середовища етанолу (10%) визначали в днях, на які випадала загибель 50% мух [Dorado, Barbancho, 1984].

Частоту кросинговеру визначали по кількості рекомбінантних нащадків F_а аналізуючого схрещування тригетерозигот по маркерних генах b, cn і vg і виражали у відсотках [Лобашов, 1969].

Активість АДГ в екстрактах тканин дрозофіли визначали спектрофотометрично [McKechnie, Yeer, 1984], а термостабільність ферменту - за методом Chambers, Wilks, Gibson [1984].

Отримані результати статистично обробляли за алгоритмами, наведеними у А. Н. Плохінського [1980], і оцінювали за критерієм Ст'юдента.

Результати досліджень та їх обговорення

Маркерні мутації і компоненти пристосованості досліджуваних мух різного віку. Внаслідок проведених експериментів з'ясувалося, що досліджувані лінії мух за станом окремих компонентів пристосованості (плодючості, теплостійкості, тривалості життя тощо) можна поділити на добре пристосованих і погано пристосованих. Найкраще пристосованими виявилися мухи дикого типу C - S. Їх плодючість, виживання в умовах гіпертермії, а також тривалість життя за стандартних умов утримання були досить високими і в подальших дослідженнях використовувалися як контроль. Близькими до мух C - S за показниками пристосованості виявилися молоді мутанти cn. Плодючість самиць cn у молодому віці (2 - 5 днів) складала 90,5% контрольного рівня (C - S), однак у більш зрілому віці (6 - 9 днів) зазначені мутанти були значно менш плодючими (57% у порівнянні з самицями C - S того ж віку). Ще менш плодючими виявилися мутанти b і vg. Плодючість молодих (2 - 5 днів) самиць цих ліній складала відповідно 71% і 57%, а у віці 6 - 9 днів - 54,6% і 31,3% від рівня плодючості мух C - S у зазначені вікові періоди (табл. 1).

У молодих (2 - 5 днів) самиць подвійних мутантів b cn рівень плодючості був таким же низьким, як і у мух vg того ж віку, однак зменшення плодючості з віком у мух b cn було менш значним (майже у 1,5 рази). Таким чином, незважаючи на те, що сумісне знаходження в генотипі мутацій b і cn виявляє більш істотний негативний вплив на плодючість мух, ніж одинарні мутації b і cn, негативний ефект старіння на плодючість самиць подвійних мутантів b cn менш виразний, ніж на плодючість одинарних мутантів b, cn і vg.

У мутантів, що містять мутацію vg, рівень плодючості був найнижчим. Це відноситься до мутантів vg, b vg і b cn vg, у яких, крім низького рівня плодючості, спостерігався більш виразний негативний вплив старіння на зазначений компонент пристосованості. В протилежність цьому, у подвійного мутанта cn vg негативний плейотропний ефект мутацій на показники пристосованості виявився менш значним. Плодючість мух cn vg була в 1,3 рази вищою, ніж одинарних мутантів vg, і менш інтенсивно падала в залежності від віку мух. Цю більш високу пристосованість мутанта cn vg у порівнянні з мутантом vg можна пояснити безпосереднім супресорним впливом гена cn на ген vg, однак механізми такого впливу залишаються не з'ясованими.

Виразна негативна дія мутації vg на пристосованість мух виявлялася не тільки стосовно плодючості, - мухи, що мали цю мутацію, були більш чутливими до гіпертермії, виявляли скорочені строки життя за нормальних умов утримання і на середовищі з етанолом. Вплив інших маркерних мутацій (b, cn) на зазначені показники пристосованості або не виявлявся, або був менш виразним.

Слід зазначити, що із збільшенням віку досліджуваних мутантів міжлінійні відмінності окремих показників пристосованості зростають. Так, наприклад, відсоток мух, що вижили в умовах гіпертермії, за дослідження імаго однодобового віку для всіх мутантних ліній був майже однаковим (коливався в межах 60 - 65%), а у мух 5-ти і 15-денного віку виявлялися статистично достовірні міжлінійні відмінності. Відношення мух vg і b cn vg, що вижили за гіпертермії, до мух C - S, що залишилися живими за цих умов, складало для п'ятиденних мутантних мух відповідно 74,7% і 85%, а для тих же мух 15-денного віку - майже 35,4% і 24,1%. Таким чином, молоді мухи vg в перший день життя за рівнем теплостійкості мало відрізняються від мух дикого типу C - S, однак за старіння генотипів цей компонент пристосованості значно швидше знижується у мутантів, ніж у мух C - S. Сказане не відноситься до одинарних мутантів b і cn, виживання яких в умовах гіпертермії не відрізнялося від аналогічного показника мух C - S в усі вікові періоди.

Отже, вивчення плодючості і виживаності мух в умовах гіпертермії приводить до висновку, що мутація vg в будь-якому генотиповому оточенні виявляє більш виразний негативний вплив на пристосованість, ніж інші мутації, і що інтенсивність цього впливу істотно зростає в міру старіння мух. До такого ж висновку приводить аналіз виживаності мух C - S і b cn vg 1-, 5- і 15-денного віку за повного голодування. Істотних статевих відмінностей з боку показників виживаності мух при гіпертермії та тривалості їх життя у стандартних умовах утримання не спостерігалося. Лише в умовах повного голодування самиці виявилися більш життєздатними, ніж самці.

За стандартних умов утримання мух тривалість життя особин vg, cn vg і b cn vg була значно (приблизно в 2 рази) меншою у порівнянні з мухами C - S, а також з іншими мутантами - b, cn і b cn. Наявність 10% етанолу в живильному середовищі приводила до подовження тривалості життя мух усіх досліджуваних ліній, за винятком лінії vg.

Узагальнюючи дані, отримані за вивчення основних фенологічних складових пристосованості, слід підкреслити, що ці показники залежать не тільки від наявних у генотипах маркерних мутацій, але й від віку, статі і умов утримання досліджуваних мух. При цьому мутація vg виявляє найвиразніший негативний вплив на складові пристосованості мух як сама по собі, так і сумісно з іншими мутаціями у складі генотипу b cn vg та деяких інших.

Ген-ензимна система АДГ у лінійних мух з різним рівнем пристосованості. Враховуючи дані літератури про важливу роль локуса Adh в життєзабезпеченні та адаптивності дрозофіли, досліджували стан ген-ензимної системи АДГ у добре пристосованої лінії C - S і слабко пристосованої лінії b cn vg. Алельний контроль АДГ у мух визначали шляхом оцінки трьох загальноприйнятих критеріїв - активності АДГ, термостабільності цього ферменту і його електрофоретичної рухливості. Останній показник у досліджуваних мух був визначений раніше [Хаустова, Тоцький, 1990]. З'ясувалося, що мухи C - S є гомозиготами по Adh^S-алелю АДГ, а мухи, утримуючі ген vg, містять Adh^f-алель і, отже, F-алозим ферменту. F-алозим вважається більш активним і менш стійким до високої температури.

Наші дослідження показали, що личинки, лялечки та імаго високопристосованих мух C - S виявляють значно меншу активність АДГ, ніж відповідні вікові групи мух b cn vg, що узгоджується з даними про наявність різних алозимів АДГ у цих мух. В міру розвитку і старіння мух (від личинкового до 25-денного імагінального віку) активність АДГ значно зростає як у мух C - S, так і у мух b cn vg. Щодо термостабільності ферменту, то цей показник за старіння мух не змінювався і був практично однаковим як у мух C - S, так і у потрійних мутантів, що, можливо, пов'язано з посттрансляцiйною модифікацією АДГ у мутантних мух.

Порівняльна оцінка вікової динаміки активності АДГ у мух C - S і b cn vg з динамікою раніше вивчених компонентів їх пристосованості показала, що висока активність АДГ у старіючих і старих мух спостерігається на фоні погіршення фенологічних показників пристосованості. Таким чином, висока активність АДГ, як і висока теплостійкість ферменту, не є обов'язковою умовою високої пристосованості особин. Можливо, що нормальний розвиток мух і необхідний рівень їх пристосованості забезпечується певним оптимальним функціонуванням ген-ензимної системи АДГ, збалансованим з усіма іншими ферментативними процесами клітин. Зміни генотипу, що призводять до порушення цього ензимного гомеостазу, викликають зменшення пристосованості і інші небажані наслідки.

Незважаючи на відсутність прямої залежності між активністю АДГ і компонентами пристосованості мух, важлива роль ген-ензимної системи АДГ в процесах онтогенетичної і філогенетичної адаптації не викликає сумнівів [Benassi, Venille, 1995 ]. Той факт, що ті чи інші алелі виявляють селективну перевагу за конкретних умов існування [Савченко і співавтори, 1985; Хаустова, 1995], свідчить на користь входження цих алелей у адаптаційні і компенсаційні комплекси, а також в коадаптовані блоки генів, постульовані для пояснення механізмів філогенетичної адаптації і гетерозису.

Частота кросинговеру на ділянці b - cn - vg залежно від віку мух. Сьогодні вважається досить обгрунтованою думка про те, що вдосконалення адаптивних здатностей вищих організмів у філогенезі забезпечує переважно рекомбіногенез, оскільки саме він сприяє створенню нових комплексів та блоків коадаптованих генів, а відтак - нових генотипів. Отже, є підстави вважати, що рівень рекомбінаційної активності хромосом може слугувати показником не тільки мінливості генотипів, але й рівня їх пристосованості.

Виходячи із цих міркувань, ми досліджували частоту кросинговеру на ділянці b - сn - vg у мутантів b cn vg різного віку . Мірою частоти кросоверів слугувало відношення кількості одинарних і подвійних рекомбінантів до усіх нащадків аналізуючого схрещування. Окремо враховували частоту кросинговерів на ділянці b - cn і cn - vg. З'ясувалося, що максимальна рекомбінаційна активність властива мухам молодого (1-3-денного) віку. У наступні терміни життя мух (4 - 6, 7 - 9, 10 - 12 днів) частота кросинговеру виявляється більш низькою і приблизно відповідає значенням наявних у літературі генетичних карт. Однак у старих (23-26-денних) мух спостерігалось істотне збільшення частоти кросинговеру. Є підстави вважати, що висока рекомбінаційна активність молодих (1-3-денних) мух свідчить про високий потенціал комбінаційної мінливості їх нащадків і, отже, про кращу виживаність їх у мінливих умовах середовища. В протилежність цьому, висока частота кросинговеру у старих мух може віддзеркалювати певну нестабільність геному і знижений рівень пристосованості старих особин.

Аналіз частоти кросинговеру в кожній досліджуваній ділянці хромосоми 2 показав нерівномірний розподіл кросоверів на ділянках b - cn і cn - vg, особливо у старих мух (табл. 5). Менша частота кросоверів на ділянці b - cn, можливо, пояснюється прицентромерною локалізацією цієї ділянки, оскільки залежність рекомбінаційних процесів від структурних особливостей різних ділянок хромосом добре відома. Разом з тим, ступінь зростання рекомбінаційної активності у старих (23-26-денних) мух на ділянках b - cn і cn - vg у порівнянні з тими ж ділянками хромосоми 2 мух 7-9-денного віку є майже однаковим (приблизно у 1,5 рази).

Рекомбінаційна активність, ген-ензимна система АДГ і пристосованість мутанта b cn vg за структурних змін генотипу. Про вірогідні зміни генного балансу за суміщення генів контрастних по пристосованості генотипів судили по рівню рекомбінаційної активності, функціонального стану локуса Adh і по фенологічних показниках пристосованості у синтезованих потрійних мутантів b cn vg (C - S) і b cn vg (1 C - S).

З'ясувалося, що частота кросинговеру у мух із штучно модифікованими генотипами достовірно збільшується у порівнянні з вихідними мухами b cn vg. Так, у 4-6-денних мух b cn vg (C - S) частота кросинговеру зростала на 38%, а у мух b cn vg (1 C - S) такого ж віку - приблизно на 20 % у порівнянні з мухами b cn vg. Ступінь зростання рекомбінаційної активності у мух з генотипом, насиченим генами С - S, був неоднаковим у мух різного віку (рис. 1). У молодих мух (1-й - 3-й дні життя імаго) частота кросинговеру була високою, але практично однаковою як у вихідного мутанта b cn vg, так і у мух b cn vg (C - S). У мух середнього віку (4 - 6, 7 - 9, 10 - 12 днів життя) виявлявся більш низький рівень рекомбінаційної активності, однак у мух b cn vg (C - S) він був значно вищим, ніж у мутанта b cn vg. У старих мух (23 - 26 діб життя) частота кросинговеру знову зростала і була достовірно вищою, ніж у 7-9-денних мух. Ступінь зростання рекомбінаційної активності у старих мух b cn vg (C - S) був достовірно вищим, ніж у мух b cn vg такого ж віку.

Характер розщеплення нащадків у тригібридних аналізуючих схрещуваннях свідчить про те, що підвищення частоти генетичної рекомбінації на ділянці b - cn - vg у мух з модифікованими генотипами пов'язано в першу чергу із збільшенням частоти перехресть між генами b і cn. У 4-6-денних самиць b cn vg (C - S) частота кросоверів на ділянці b - cn зростала в 1,81 раза, а у такого ж віку самиць b cn vg (1 C - S) - в 1,55 раза у порівнянні з вихідними мутантами b cn vg. На ділянці cn - vg інтенсивність хроматидних обмінів у мутантів з модифікованими генотипами і у вихідних мутантів була практично однаковою.

Збільшення інтенсивності кросинговеру у старих мух і у мух з модифікованими генотипами можна розглядати як показник певної нестабільності цих генотипів із-за зміненого генетичного балансу, що дуже вірогідно за введення в генотип чужорідного генетичного матеріалу. Цілком можливо, що за цих умов полегшуються і стають більш частими розриви хроматид, особливо в місцях скупчення гетерохроматину.

Цікаво співставити частоту рекомбінацій у досліджуваних мух з активністю їх АДГ і станом компонентів пристосованості. Хоч мухи C - S і b cn vg відрізнються алельним складом локуса Adh, з'ясувалося, що заміщення Х-хромосоми і насичення генотипу мух b cn vg генами C - S практично не призводить до змін активності і термостабільності АДГ у мутантів. Відсутність істотних відмінностей в активності і термостабільності АДГ за можливої зміни алельного контролю цього ферменту в умовах насичуючих схрещувань можна пояснити посттранстляційними модифікаціями алозимів, про наявність котрих свідчать роботи інших авторів [Боднар, 1989; Тоцький і співавт., 1998].

Оскільки активність і термостабільність АДГ у дорослих мух b cn vg, а також у мух з модифікованими генотипами, як показали досліди, мало відрізняються, можна вважати, що функціональний стан ген-ензимної системи АДГ в умовах наших дослідів безпосередньо не віддзеркалює рівня пристосованості генотипів. Чітка інформація про пристосованість досліджуваних мух була отримана за вивчення інших показників пристосованості - плодючості, тривалості життя особин за різних умов утримання, їх виживаності в умовах гіпертермії тощо.

Наведені дані узгоджуються з матеріалами літератури про залежність тривалості життя дрозофіли від алельного стану гена Adh. Насичення генотипу мух b cn vg генами лінії C - S супроводжується збільшенням тривалості їх життя до рівня цього показника у мух дикого типу. При цьому мухам b cn vg (C - S), як і мухам C - S, властивий S-алозим АДГ. Можна вважати, що заміна за насичуючих схрещувань Adh^F-алеля мутанта b cn vg на алель Adh^S, властивий мухам C - S, дуже важлива для нормалізації тривалості життя мутантів b cn vg. В протилежність цьому, заміна хромосоми 1 мутанта на хромосому 1 дикого типу не подовжує життя мутантних мух, бо заміщення хромосоми 1 не могло призводити до зміни алельного контролю АДГ.

Позитивний вплив генетичних елементів дикого генотипу на виживаність потрійних мутантів у умовах повного голоду. У мух b cn vg (C - S) і b cn vg (1 C - S) цей показник не відрізнявся від такого ж показника мух дикого типу і був достовірно вищим, ніж у вихідного мутанта b cn vg.

Щодо теплостійкості мух, то поліпшення цього показника виявлялося тільки за заміщення хромосоми 1; теплостійкість мух b cn vg (C - S) залишалася такою ж, як і у мутантів b cn vg.

Найменш мінливим в умовах дослідів виявився найважливіший показник пристосованості - плодючість особин. Мутанти із заміщеною хромосомою, як і мутанти з генотипом, насиченим генами дикого типу, були мало плодючими, як і лінійні мутанти b сn vg. Якщо припустити, що головною причиною низької плодючості потрійних мутантів є плейотропний вплив маркерних мутацій, то стає зрозумілою відсутність істотного ефекту на цей показник введення в генотип мутантів інших генів дикого типу.

В цілому матеріали табл. 7 свідчать про те, що структурні перебудови генотипу мутантів b cn vg шляхом введення в нього чужорідного генетичного матеріалу не призводять до погіршення показників пристосованості. Можна припустити, що, незважаючи на недостатню коадаптованість генів мух лінії С - S і генів мутанта b cn vg, їх суміщення в одному генотипі може виявляти позитивний вплив на окремі складові пристосованості мутантних особин завдяки високому адаптивному потенціалу генів дикого типу.

Результати роботи свідчать, що структурні і функціональні зміни генотипів, які відбуваються в онтогенезі та філогенезі, - такі як старіння, мутагенез, гібридизація, впровадження в генотип стороннього генетичного матеріалу, - можуть істотно впливати на генний баланс і пристосованість організмів. Отримана нова інформація про плейотропну взаємодію мутантних генів b, cn і vg за становлення компонентів пристосованості у мух різного віку, що несуть ці мутації у різних поєднаннях. Вперше на прикладі подвійних і потрійних мутантів дрозофіли досліджена взаємодія генів b, cn і vg, а також генів локуса АДГ у визначенні рівня пристосованості цих генотипів. Встановлено, що сумісне знаходження мутацій у генотипі призводить як до підсилення, так і до ослаблення їх сумарного несприятливого впливу на окремі складові пристосованості. Сумарний ефект маркерних мутацій залежить від віку мух, структурних особливостей генотипу та інших причин.

Досліди на потрійних мутантах b cn vg показали, що старіння мух і штучне втручання в їх генотип (насичуючі схрещування, заміщення хромосоми 1) можуть підвищувати активність АДГ i частоту рекомбiнацiй на дiлянцi b - cn - vg хромосоми 2. Разом із тим чітка взаємозалежність між окремими компонентами пристосованості, частотою кросинговеру і функцією ген-ензимної системи АДГ в наших дослідах виявлялася не завжди. Впливи мутацій, старіння і штучних модифікацій генотипу на окремі складові пристосованості в конкретних умовах досліду були різними по силі і неоднозначними по спрямованості змін досліджуваних показників.

Варто уваги, що старіння і структурні модифікації генотипів (наявність маркерних мутацій, насичуючі схрещування, заміщення хромосом) часто призводять до однотипних змін окремих компонентів пристосованості, активності АДГ і рекомбінаційного процесу. В цих окремих випадках фенологічні показники пристосованості, як правило, погіршуються, а активність АДГ і частота кросинговеру зростають. Цей результат узгоджується з існуючими теоріями старіння, які пов'язують цей процес з накопиченням у клітині мутацій, інтенсивним перекисним окисненням макромолекул, зниженням репаративних процесів, маргінотомією хромосом і т.п. Не виключено, що в основі зменшення пристосованості генотипів, виникаючого за процесів старіння, мутування і штучних модифікацій їх структури, лежать досить схожі механізми. Однак повного паралелізму в змінах показників, досліджуваних у старих мух і у мух з модифікованими генотипами, не спостерігається. Деякі компоненти пристосованості (плодючість, тривалість життя в умовах голодування, виживаність за гіпертермії) у мутантів b cn vg після насичення їх генотипу генами мух C - S або заміщення хромосоми 1 на хромосому дикого типу не змінювались або навіть поліпшувалися до рівня показників лінії C - S, в той час як старіння завжди супроводжувалося погіршенням цих компонентів пристосованості. Таким чином, генетичний матеріал мух C - S, внесений в генотип мутанта b cn vg, виявляв позитивний вплив на деякі показники пристосованості мутанта, в той час як старіння особин, особливо тих, що несуть маркерні мутації, неухильно супроводжується зниженням всіх складових пристосованості.

Той факт, що мутації, старіння і штучні втручання в структуру генотипів часто можуть однотипно впливати на окремі показники пристосованості, а також на функцію структурних генів і рекомбінаційний процес, слід враховувати за створення нових генотипів шляхом аутбридингу, генноінженерними методами, а також за розробки генетичних теорій розвитку і старіння.



ВИСНОВКИ

Пристосованість мух ліній C - S, b, cn, vg, b cn, cn vg i b cn vg , яку визначали за плодючістю, тривалістю життя, стійкістю до екстремальних чинників та іншими показниками, варіює в залежності від лінії, віку і (меншою мірою) від статі особин. Серед досліджуваних мух максимальна пристосованість властива мухам C - S; найнижчий рівень пристосованості виявлено у мух vg i b cn vg.

В міру старіння мух пристосованість їх падає, особливо інтенсивно за наявності в генотипі мутантних генів. Максимальну негативну дію на пристосованість старих мух виявляє маркерний ген vg.

У молодому віці подвійні (b cn, cn vg ) і потрійні (b cn vg ) мутанти значеннями окремих компонентів пристосованості не поступаються одинарним мутантам b, cn i vg. У мутантів cn vg i b cn vg плодючість і виживаність в умовах гіпертермії виявилися більш високими, ніж у одинарного мутанта vg. Ці факти свідчать про супресорну дію гена cn на окремі прояви плейотропності генів vg i b.

Насичення генотипу мух b cn vg генами лінії C - S або заміщення хромосоми 1 потрійного мутанта на аналогічну хромосому мух C - S дещо поліпшує окремі показники пристосованості, однак не виявляє істотного впливу на плодючість мух.

Частота кросинговеру на ділянці b - cn - vg істотно зростає за старіння мух, а також за штучних модифікацій генотипів. Частота кросоверів на ділянці b - cn при цьому зростає більш істотно, ніж на ділянці cn - vg.

У старих мух C - S i b cn vg , а також у мух із штучно модифікованими генотипами спостерігається більш висока активність АДГ, ніж у молодих мух лінії C - S. Чітка залежність між функціональним станом ген-ензимної системи АДГ та іншими показниками пристосованості у досліджуваних мух виявляється не завжди.

Маркерні мутації, штучні модифікації генотипів і процес старіння мух часто призводять до однаково спрямованих зрушень показників пристосованості, експресії локуса Adh і рекомбінаційної активності, що може бути наслідком однотипних порушень генного балансу.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

Науковi статтi

1. Алшибли Нассер Мухамед, Хаустова Н.Д., Тоцкий В.Н. Частота рекомбинаций на участке b - cn - vg хромосомы 2 Drosophila melanogaster в зависимости от генотипа и возраста мух // Вiсник Одеського нацiонального унiверситету. - 2001. - T. 6. - Вип.1. - C. 45 - 50.

2. Алшибли Насер Мухамед, Хаустова Н.Д., Тоцкий В.Н. Приспособленность линий Drosophila melanogaster, мутантных по генам b, cn и vg // Вiсник Одеського нацiонального унiверситету. - 2002. - T. 7. - Вип.1. - C. 63 - 68.

3. Тоцкий В.Н., Хаустова Н.Д., Алшибли Н.М., Сечняк А.Л. Генетико-биохимические механизмы онтогенетической и филогенетической адаптации // Цитология и генетика. - 2002. - Т. 36. - № 3. - С. 69 - 75.

4. Хаустова Н.Д., Алшибли Насер, Тоцкий В.Н., Блажнова Е.В. Частота рекомбинаций как показатель генного баланса и приспособленности дрозофилы // Вiсник Одеського нацiонального унiверситету. - 2003. - T. 8. - Вип. 1. - C. 86 - 92.

Тези доповiдей на наукових конференцiях i симпозiумах

5. Хаустова Н.Д., Тоцкий В.Н., Нассер Мохамед Аль-Шибли. Возрастные особенности приспособленности и кроссинговера у мутантов дрозофилы с замещенным генотипом // 1V Междунар. симпоз. Биологические механизмы старения (Харьков, 24 - 27 мая 2000). Тез. докл. - Харьков, 2000. - С. 52.

6. Alshibly N.M., Blaznova E.V. Recombination frequency and adaptation of b cn vg Drosophila melanogaster mutants at the change of their genotype // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics {September 20 - 22, 2001, Kyiv, Ukraine}. - 2001. - P. 1.

7. Хаустова Н.Д., Тоцкий В.Н., Алшибли Н.М., Блажнова Е.В., Стрельцова Н.А. Ген-энзимная система АДГ в онтогенезе Drosophila melanogaster // V Междунар. симпоз. Биологические механизмы старения (Харьков, 30 мая - 1 июня 2002). Тез. докл. - Харьков, 2002. - С. 60 - 61.

8. Алшибли Н.М., Хаустова Н.Д., Сулакова М.П., Ясинская Н.П., Гнядая Е.В., Растихина Л.А. Возрастные особенности приспособленности дрозофилы // V Междунар. симпоз. Биологические механизмы старения (Харьков, 30 мая - 1 июня 2002). Тез. докл. - Харьков, 2002. - С. 69 - 70.

Размещено на Allbest.ru

...