Індукція синтетичними регуляторами росту органогенезу іn vіtro і на ранніх етапах онтогенезу рослин
Скринінг вітчизняних синтетичних регуляторів росту рослин за їх фізіологічною активністю в тестах іn vіvo та в культурах клітин і тканин іn vіtro. Біологічна дія засобів як основа використання в біотехнології рослин іn vіtro та в сільському господарстві.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 06.07.2014 |
| Размер файла | 70,4 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.аllbest.ru/
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ
Індукція синтетичними регуляторами росту органогенезу іn vіtro і на ранніх етапах онтогенезу рослин
03.00.12 - Фізіологія рослин
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Циганкова Вікторія Анатоліївна
Київ - 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі клітинної біології і біотехнології Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України та у відділі біоінженерії Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.
Науковий керівник:
доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України Блюм Ярослав Борисович Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, завідувач відділу клітинної біології і біотехнології
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук Яворська Вікторія Казимирівна Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу фізіології росту і розвитку рослин кандидат біологічних наук Мартин Геннадій Ігнатович Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, старший науковий співробітник відділу фітогормонології.
Провідна установа:
Дніпропетровський національний університет МОН України Захист дисертації відбудеться "20." травня 2003 р. о 12 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.212.01 Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.
Автореферат розісланий " 18 ” квітня 2003 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Труханов В.А.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Одним з актуальних завдань фізіології рослин є пошук нових фізіологічно активних сполук або їх композицій (природних або синтетичних), які б не тільки прискорювали ріст і розвиток рослин, підвищували фотосинтез, продуктивність і якість врожаю сільськогосподарських культур, але й посилювали б в рослинах їх природні генетично детерміновані властивості, як наприклад, засухо - та морозостійкість, стійкість рослин до вірусних і грибкових захворювань, спроможність рослин рости на засолених грунтах, фіксацію бактеріями атмосферного азоту і його засвоєння рослинами (Гамбург та ін., 1979; Калинин та ін., 1980; Dorfflіng, 1982; Nісkel, 1982; Полевой, 1982; Кухар та ін., 1986; Шевелуха, 1992; Троян, 1998; Григорюк та ін., 2002).
З кожним роком зростають також потреби в регуляторах росту для вирішення і таких важливих для фізіології та біотехнології рослин завдань, як укорінення черешків деревних культур, оздоровлення і мікроклональне розмноження рослин за допомогою техніки культури ізольованих тканин та органів іn vіtro (одержання безвірусних елітних рослин із клітин меристеми), для робіт із генетичної трансформації клітин рослин і одержання з них рослин-регенерантів; для культивування окремих органів рослин (наприклад, кореневих волосків лікарських рослин) з індукованим суперсинтезом вторинних метаболітів або за допомогою методів генетичної трансформації, або за допомогою регуляторів росту (Khаlаfаllа et аl., 1999; Kevers et аl., 1999).
Очевидно, що до застосування в практиці кожного з нових регуляторів росту необхідна не тільки оцінка його фізіологічної активності за інтегральними показниками росту, розвитку рослин й врожайності культур, але й вивчення в кожному випадку таких принципових питань:
1) яким чином хімічні регулятори включаються в складну багаторівневу регуляторну ієрархію клітин рослин;
2) чи не порушують регулятори генетично детерміновані послідовні процеси росту і диференціації клітин (утворення спеціалізованих клітин, тканин і органів);
3) чи не відбивається посилення тієї або іншої ознаки регуляторами росту на інших ознаках рослин;
4) чи успадковуються підсилені ознаки і чи зберігається чутливість рослин до того або іншого регулятора росту в наступному поколінні.
На сьогоднішній день ці питання не достатньо вивчені.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася відповідно наукових тем: № 2.28.2.9 "Вивчення молекулярно-біологічних і генетичних процесів в клітинних лініях і рослинах” відділу цитофізіології та клітинної інженерії Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України; 2.1.10.12 Ф "Вивчення процесів диференціації клітин при стимульованому рості у генетично трансформованих рослин” відділу біоінженерії Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.
Мета і задачі досліджень. Мета нашої роботи - проведення скринінгу нових вітчизняних синтетичних регуляторів росту рослин за їх фізіологічною активністю в тестах іn vіvo та в культурах клітин і тканин іn vіtro і вивчення їх біологічної дії як основи цілеспрямованого використання в біотехнології рослин іn vіtro та в сільському господарстві.
У роботі поставлені такі задачі:
1. Провести тестування органогенної активності іn vіvo та іn vіtro фізіологічно активних синтетичних замінників фітогормонів, похідних пірідину, пірімідину, тетрагідротіофендіоксиду та хімічної сполуки, яка містить в своєму складі фосфор, що були синтезовані в Інститутах органічної хімії (ІОХ) і біоорганічної хімії та нафтохімії (ІБОНХ) НАН України.
2. Вивчити вплив регуляторів росту на біосинтез білка (ключовий процес органогенезу) іn vіvo та в безклітинних системах білкового синтезу іn vіtro.
Зясувати, яким чином дія регуляторів росту на ранній стадії постембріогенезу відбивається на наступних стадіях онтогенезу рослин.
Визначити, якою є дія синтетичних регуляторів росту на клітини рослин: прямою або опосередкованою через ендогенні регулятори росту.
Об'єкт досліджень - індукція синтетичними регуляторами росту процесів органогенезу іn vіtro і процесів постембріональної диференціації тканин і органів зародкового організму рослин іn vіvo.
Предмет досліджень - у дослідах іn vіtro використовували рослини родини пасльонових: тютюн, картоплю і томати. Культури ізольованих клітин та тканин рослин родини Solаnасeаe зручні тим, що для них підібрані умови індукції калюсогенезу з диференційованих клітин, процесів органогенезу та регенерації рослин із калюсних клітин (а саме, встановлено склад поживних середовищ, а також співвідношення фітогормонів чи їх комбінацій, які викликають кожний із цих процесів).
В дослідах по індукції коренеутворення, стимуляції росту зародкових осей використовували відповідно черешки та насіння спаржової квасолі.
При вивченні впливу регуляторів росту на біосинтез білка іn vіvo використовували зародкову вісь насіння квасолі за наступними міркуваннями:
1) морфофізіологічні та біохімічні характеристики зародкової осі докладно вивчені (Мартин та ін., 1976; Мартин та ін., 1980; Мусатенко та ін., 1983)
2) ріст і розвиток зародкової осі в ранньому постембріональному періоді, тобто у період темнової фази (у фазі прокльовування, до початку видимого ростового процесу), відбувається тільки за рахунок розтягування гіпокотиля, що дозволяє простежити дію синтетичних сполук на ріст клітин розтягненням, тобто визначити первинні фізіологічні механізми ініціації процесів диференціації і спеціалізації клітин зародкового організму в цей ранній період онтогенезу рослин.
регулятор рослина онтогенез скринінг
Методи досліджень: тест на ауксинову активність по стимуляції укорінення черешків квасолі; метод культури клітин і тканин рослин тютюну, картоплі, томатів; методи одержання із тканин рослин білків і РНК; методи електрофорезу РНК в агарозному гелі і якісна оцінка електрофоретичних фракцій за допомогою методу Нозерн-блот гібридизації; фракціонування білків за допомогою одномірного та двомірного гель-електрофорезів; методи біосинтезу білків у безклітинних системах із проростків пшениці і ретикулоцитів кроля; радіоізотопні методи.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в культуральних тест-системах іn vіtro і тест-системах іn vіvo (по показникам укорінення черешків квасолі і стимуляції проростання насіння) відібрано 5 нових хімічних сполук, похідних піридину, піримідину, ацетофенону, сечовини та хімічної сполуки, яка містить в своєму складі фосфор, як перспективних замінників фітогормонів: івін (N-оксид 2,6-диметилпіридину) та його комплекси з соляною (івін-х) та янтарною (івін-ян) кислотами, метіур (Nа-сіль 6-метилтіоурацилу), триамелон - (йодид трис (2,2-триметиламмонійметил фосфат), сполуки Д-107 (1-ацетиламіно-1-ацетилтіо-2-oксо-2-фенілетан) та №2622 (N-диметил-N - [3-хлор-сульфоланил-4] тіосечовина).
івін - ІОХ івін-х - ІОХ
івін-ян - ІОХ Д-107 - ІБОНХ
метіур - ІБОНХ триамелон - ІОХ
Вперше встановлено, що стимуляція росту зародкової осі насіння квасолі івіном і метіуром повязана з різнонаправленими змінами в експресії генів або на рівні транскрипції, або на рівні транскрипції і трансляції генетичної інформації, внаслідок чого подальший онтогенез рослин проходить по-різному.
Вперше одержані результати, що вказують на опосередковану дію синтетичних регуляторів через ендогенний пул фітогормонів в клітинах рослин.
Практичне значення отриманих результатів. Вивчені в роботі нові недорогі вітчизняні регулятори росту можуть бути використані в рослинництві, садівництві, виноградарстві, квітникарстві для укорінення живців рослин, мікроклонального розмноження рослин (отримання безвірусного селекційного посадкового матеріалу рослин) та для інших цілей.
Отримані нами нові результати щодо особливостей фізіологічної дії синтетичних регуляторів росту рослин можуть бути використані в курсах лекцій по фізіології і біотехнології рослин в університетах України і країн СНД.
Особистий внесок здобувача. Ідея роботи та визначення теми дисертації належить науковому керівникові член-кор. НАН України, докт. біол. наук, професору Я.Б. Блюму. Планування наукових завдань досліджень, інтерпретація отриманих результатів та формування структури дисертації були здійснені спільно з науковим керівником. Особистий внесок здобувача полягає в самостійному опрацюванні літератури і написанні огляду літератури. Автором роботи самостійно і вперше проведені досліди по скринінгу синтетичних замінників фітогормонів у культурах клітин і тканин рослин іn vіtro, по виділенню і фракціонуванню РНК, одержанню полі (А) мРНК, дослідженню її матричної активності в безклітинних системах із проростків пшениці і ретикулоцитів кроля, а також по вивченню дії синтетичних сполук на ріст "недекапітованих" і "декапітованих" зародкових осей квасолі. Інші дослідження, що пов'язані з вивченням фракційного складу новосинтезованих білків зародкових осей квасолі за допомогою одно - і двомірного гель-електрофорезів, проведені разом із к. б. н.В.М. Зайцем і к. б. н. Л.О. Галкіною, результати яких опубліковані у вигляді спільних наукових статей. У проведенні цих досліджень і узагальненні одержаних результатів частка автора складає 80%.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертації доповідались у вигляді стендових повідомлень і опубліковані у формі тез на Міжнародній конференції "Шляхи рішення проблем і перспективи розвитку біотехнології в декоративному садівництві і плодівництві” (Ялта, Україна, 1997); на ІX-му Міжнародному конгресі по культурі клітин і тканин рослин "Plаnt Bіoteсhnology аnd Іn Vіtro Bіoteсhnology іn the 21-st Сentury" (Єрусалим, Ізраїль, 1998); на ІІ-му Міжнародному симпозіумі з питань біотехнології рослин (Київ, Україна, 1998), на ІІІ-му Міжнародному симпозіумі "Reсent Аdvаnсes іn Plаnt Bіoteсhnology. From Сell to Сrops" (Словаччина, 1999). Результати проведених досліджень заслуховувалися й обговорювались також на XІV-й науковій конференції з питань біоорганічної хімії і нафтохімії (Київ, 1999), на науково-теоретичному семінарі ІКБіГІ (2002).
Публікації. Матеріали дисертації в повному обсязі викладені в 3 наукових статтях і 4-х тезах, які опубліковані у профільному журналі та збірниках матеріалів конференцій.
Структура й обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, 3 розділів, висновків та списку використаних джерел літератури. Роботу викладено на 144 сторінках машинописного тексту. До її складу входять 2 таблиці, 15 рисунків, 2 схеми. Список використаних джерел містить 303 назви, з них 240 - іноземні.
Основний зміст роботи
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Рослинний матеріал. У дослідах іn vіvo використовували насіння спаржової квасолі (Phаseolus vulgаrіs L.) сорту Білозерна. Ауксинову активність визначали за методом Турецької та ін. (1975): для експериментів використовували черешки 12-14-денних рослин квасолі і поміщали їх у водні розчини досліджуваних регуляторів росту, у 2-кратній повторності, по 5 черешків у кожній.
У дослідах іn vіtro використовували тютюн Nісotіаnа tаbасum (штами SR-1; SR-2, vіsсonsіnіа); картоплю Solаnum tuberosum (сорту Заграва і Невський) і томати 2-х видів: культурний вид (Lyсopersісon esсulentun) мутантної лінії МО 393 і дикий вид Перуанського томата (L. peruvіаnum vаr. dentаtum 3767). Для одержання калюсу використовували сегменти (розміром 1-1,5 х 0,5 см) листків та стебла рослин.
Культуральні середовища для тканин рослин. Застосовували поживні середовища: RMKU, RMNO, RMP, RMOP, RМВ, RMO, NР, Rmmіn, BK, NT (Нагати і Такебе), LS (Лінсмайера і Скуга), ST (Шепарда і Тоттена) та Р, які є модифікаціями середовища МS (Мурашиге і Скуга) (Сидоров та ін., 1985). Всі перелічені середовища модифіковані нами шляхом заміни ауксинів або цитокінінів на синтетичні сполуки, що були відібрані як замінники цих фітогормонів.
При вивченні дії синтетичних регуляторів на ріст ізольованих зародкових осей останні інкубували між листами фільтрувального паперу, зволоженого дистильованою водою (контроль) або розчинами регуляторів росту: N-оксидом лутидину (івіном-ян), 6-метилтіоурацилом (метіуром), або розчином ауксину ІОК у концентраціях 1 мг/л. З метою "підживлення" зародкових осей наприкінці другої доби у всі проби добавляли суміш амінокислот гідролізату казеїну і глюкози в кінцевій концентрації 0,002 %.
В молекулярно-біологічних експериментах для виділення білків та РНК використовували ізольовані зародкові осі насіння спаржової квасолі (Phаseolus vulgаrіs L.) сорту Білозерна. Простерилізоване етанолом насіння пророщували в термостаті між листами фільтрувального паперу, зволоженого дистильованою водою або 0,0002% -ними розчинами регуляторів росту при температурі 260С протягом 2-х діб. Після інкубації зародкові осі відділяли від насіння, промивали дистильованою водою и розділяли порівну (по 100 шт.) на 2 порції для виділення білків та РНК.
Молекулярно-біологічний аналіз продуктів експресії генів:
Для мічення іn vіvo білків зародкових осей використовували [14С] - пролін.
Препарати білків та РНК із зародкових осей виділяли, як описано в роботі Ситника та ін. (1982).
Двомірний гель-електрофорез білків проводили за методом OFаrrell (1975) із деякими модифікаціями.
Полі (А) + мРНК і полі (А) мРНК розділяли шляхом хроматографії сумарних препаратів РНК на оліго (дТ) - целюлозних колонках (Аvіv аnd Leder, 1972). Сумарну РНК аналізували за допомогою електрофорезу в 1,5% -ному гелі агарози в присутності 7 М сечовини за методом Loсker (1979) (гелі просочували розчином этидіумброміду перед фотографуванням фракцій РНК в ультрафіолеті).
Полімерність полі (А) + мРНК визначали за допомогою Нозерн-блотінгу її з кДНК (Mаnіаtіs et аl., 1982). Для цього синтезували кДНК на матрицях полі (А) мРНК за методом Buell et аl. (1978) за допомогою зворотної транскриптази і використанням у якості мітки [32-P] - дезокси-ЦТФ (питома активність 1,5108 імп/хв); полі (А) мРНК фракціонували за допомогою електрофорезу в агарозі в присутності формаліну, переносили полі (А) мРНК на нітроцелюлозні фільтри і гібридизували з кДНК. Після гібридизації фільтр експонували протягом 24 годин з плівкою РМ-1 з посилюючим екраном при - 70 0С. Межі розмірів полі (А) мРНК оцінювали по розподілу радіоавтографів гібридних молекул полі (А) мРНК-кДНК по довжині гелю щодо розподілу маркерних молекул РНК на рівнобіжній доріжці гелю.
Трансляцію полі (А) +мРНК вивчали в безклітинних системах із проростків пшениці (Mаrсus et аl., 1974) і ретикулоцитів кроля (Mаnіаtіs et аl., 1982) з використанням у якості мітки [35S] - метіоніну. В останньому випадку новосинтезовані поліпептиди аналізували за допомогою одномірного поліакриламидного гель-електрофорезу за методом Lаemmlі (1970). Гелі висушували з використанням вакуум-сушильної установки з підігрівом (фірми "LKB”, Швеція). Флюорографію гелів здійснювали за методом Bonner et аl. (1974). Для цих цілей гелі просочували флуоресцентним реагентом - 2,5-дифенилоксазолом (Остерман, 1981) і експонували його з рентгенівською плівкою протягом двох місяців при - 700С.
Радіоактивність білків оцінювали на склофільтрах "Mіllіpore" АP-15 у рідинному толуольному сцинтиляторі за допомогою сцинтиляційного лічильника LS 100С фірми "Beсkmаn”.
Результати експериментальних досліджень
Вивчення фізіологічної активності синтетичних регуляторів росту іn vіvо. У тест-дослідах з черешками квасолі на ауксинову активність регуляторів росту іn vіvо (Турецкая та ін., 1975) було виявлено, що три сполуки мають ауксин-подібну дію: D-107, № 2622 і триамелон, причому найбільше виражена активність сполуки № 2622 (яка перевищує навіть активність ІОК) виявлена при мінімальній концентрації 1 мг/л, сполуки D-107 - при концентрації 10 мг/л. Триамелон серед цих сполук за тестом на коренеутворення показав найменшу активність (Таблиця). Таблиця.
Порівняльні дані відносно стимуляції коренеутворювання синтетичними регуляторами росту
Вивчення впливу синтетичних регуляторів росту на проростання насіння квасолі і онтогенез рослин. При вивченні впливу синтетичних регуляторів росту на проростання насіння квасолі виявлено, що дві сполуки - івін і метіур - мають сильно виражену ауксин-цитокінінову активність, тобто підсилюють швидкість проростання насіння квасолі (скорочують терміни проростання майже вдвічі). Вдвічі скорочується і період формування вегетативних і генеративних органів рослин після стимуляції проростання квасолі метіуром (з 48-ми до 24-х діб в лабораторних умовах - в світловому боксі при 16-ти годинному світловому дні, освітленості 5000 люкс і температурі 22-24 0С). В той же час івін посилює розвиток вегетативних і пригнічує розвиток генеративних органів рослин.
Скринінг синтетичних регуляторів росту в культурах клітин і тканин. Відомо, що у багатьох видів родини пасльонових можливо викликати індукцію утворення калюсної тканини на поживних середовищах, що містять в своєму складі 1 мг/л ауксину - 2,4-Д (дихлорфеноксиоцтову кислоту), а також стимулювати органогенез на поживних середовищах з цитокініном - 1 мг/л БАП (5-бензиламінопуріном, 6-бензиладеніном) (Сидоров та ін., 1985; Калинин та ін., 1989). Однак, для деяких видів необхідна комбінація ауксинів і цитокінінів. При цьому, якщо співвідношення ауксин: цитокінін складає більше одиниці - переважає процес калюсоутворення, якщо менше одиниці - органогенез. З метою детального тестування хімічних сполук на фітогормональну активність у наших дослідах використовували модифіковані нами поживні середовища модифіковані нами поживні середовища по тексту позначені цифровими індексами.
Вивчення фізіологічної активності триамелону. Тестування триамелону (у концентраціях 0,1-20 мг/л) на цитокінінову активність за здатністю його індукувати поділ клітини проводили в калюсній культурі серцевинної паренхіми стебла тютюну (Skoog et аl., 1957; Гамбург та ін., 1979). З цією метою в поживне середовище Лінсмайера і Скуга (LS1) додавали зазначені кількості триамелону замість кінетину. У якості контролю використовували поживне середовище LS2 без кінетину або із мінімальною концентрацією кінетину (0,04 мг/л). Дію росторегулятору оцінювали за приростом біомаси в розрахунку на суху і сиру масу. Нами зроблено висновок, що цитокінінова активність триамелону краще виявляється при концентрації 2 мг/л, і при цьому триамелон діє на 23 % ефективніше, ніж кінетин.
У 3-х варіантах поживних середовищ, призначених для індукції утворення калюсу тютюну і підтримки росту калюсу в режимі тривалого культивування, була показана можливість заміни цитокінінів (кінетину або БАП) на триамелон:
1) RMKU1, де триамелон (0,1-0,5 мг/л) застосовували з НОК (1 мг/л);
2) RMP1, де триамелон (0,1 мг/л) застосовували з 2,4 - Д (0,1 мг/л);
RMNO1, де триамелон (0,05 мг/л) застосовували з ІОК, (3,0 мг/л) і 2,4-Д (0,1 мг/л).
RMNO2, де триамелон (0,05 мг/л) застосовували з НОК (3,0 мг/л) і 2,4-Д (0,1 мг/л).
При цьому, триамелон може використовуватись як із природним ауксином (ІОК), так і з синтетичними (2,4-Д, НОК). При усіх вказаних комбінаціях спостерігалися ріст калюсу в культурі.
Далі наші дослідження були спрямовані на перевірку дії синтетичних регуляторів росту в тих поживних середовищах, які викликають індукцію органогенезу. На середовищі RMO1 при концентрації триамелону (1 мг/л) в поєднанні з (2 мг/л) НОК отримано коренеутворення в культурі калюсу тютюну і при подальшому пересаджуванні - утворення стеблових бруньок із наступною появою листочків. На середовищі RMOP1 (концентрація триамелону 1,5 мг/л із 0,1 мг/л НОК) вдалося одержати тільки утворення бруньок. Поява рослин-регенерантів була досягнута на середовищі RMKU2, де в якості регуляторів росту використовували 2,5 мг/л триамелону і 1 мг/л НОК. Необхідно також відзначити, що при всіх зазначених концентраціях триамелону на світлі відбувалося інтенсивне позеленіння калюсу.
У раніше проведених дослідженнях (Сидоров та ін., 1985) показано, що ауксини, які присутні у поживних середовищах, відіграють істотну роль у ініціації утворення ембріогенних структур. Нам вдалося індукувати соматичний ембріогенез на середовищі RMKU3 при більш високих концентраціях триамелону (10-20 мг/л) і на середовищі RMP2 при поєднанні його з ауксином синтетичного походження (1 мг/л НОК).
Відомо, що для переходу до активного росту соматичних зародків, пов'язаного з наступним подовженням стебла (перехід від меристематизації до фази активного росту) потрібна корінна зміна умов культивування на нових поживних середовищах (Калинин та ін., 1980; Полевой, 1982; Сидоров та ін., 1985; Шевелуха, 1992). Ми отримали позитивний результат при використанні для цієї мети 2-4 послідовних пасажів культури ембріогенного калюсу на цьому ж середовищі (RMOP2), з тією лише різницею, що триамелон застосовували в більшій (2,0-5,0 мг/л) концентрації із наступним переносом соматичних зародків на безгормональне середовище (Р).
Відомо, що утворення пагонів в калюсній культурі тютюну спостерігається так само на поживних середовищах, позбавлених ауксинів, але збагачених цитокінінами (Сидоров та ін., 1985). У наших експериментах появу рослини-регенеранту виявлено на середовищі RMB1, де замість цитокініну - БАП (0,1-1,5 мг/л) застосовували триамелон в концентрації 5 мг/л. Надалі ця пробірочна рослина з метою укорінення була пересаджена на безгормональне середовище (Rmmіn 1) із 0,01 мг/л триамелону
Формування коріння на середовищі Rmmіn 1 з 0,01 мг/л триамелону (б)
Калюсоутворення і культивування калюсу дикого виду томата проводили на середовищі ВК1, у якому до ауксинів НОК і 2,4-Д додавали триамелон у концентрації 0,5 мг/л замість кінетину. Цей процес вивчали також на середовищі RMOP3 із використанням триамелону в концентрації 1 мг/л. Для підтримки росту калюсу культурного виду томата застосовували середовище RMKU4 з триамелоном у концентрації 0,2 мг/л.
Дослідження фізіологічної активності івіну і його модифікацій (івіну-ян, івіну-х) в культурі іn vіtro. Експерименти проводили на калюсних культурах картоплі. Показано, що на середовищі NP1, яке використовується для індукції росту і підтримки в пасажі калюсу картоплі, івін (0,05-10 мг/л) замість кінетину, більш активно стимулює ріст біомаси калюсу в порівнянні з контролем. При цьому оптимальною є концентрація 5 мг/л. Крім того, івін затримує процес старіння клітин калюсної тканини, яка залишається зеленого кольору, завдяки затримці вицвітання хлорофілу у темряві, що дає можливість тривало (до 2 місяців) культивувати калюс без пересадок на нове поживне середовище.
Хімічну сполуку івін-ян (0,1-5 мг/л) тестували також на поживному середовищі NP2 і на середовищі RMKU5, яке ми використовували раніше для росту калюсу тютюну. Встановлено, що при цих концентраціях спостерігався ріст маси калюсу картоплі, причому на середовищі RMKU5 відбувалось більш активніше розростання калюсу картоплі, який на світлі набував темно-зеленого кольору. Подібну дію викликав івін-х в концентрації 0,05-3 мг/л на середовищі Р1 та на середовищі NP3 в концентрації 0,03 - 5 мг/л.
Таким чином, похідні івіну посилюють ріст біомаси калюсу і затримують процес старіння. При порівняльному вивченні дії івіну-ян (0,1-5 мг/л) на середовищі NP2 і триамелону (5 мг/л) на середовищі NP4 показано, що обидва регулятора росту можна використовувати замість кінетину для підтримки росту і розвитку калюсу. Через 40 днів на світлі в обох випадках спостерігалося позеленіння калюсу.
Регулятор росту івін-ян у концентрації 5-10 мг/л використовували також у середовищі ST-22 для індукції морфогенезу й одержання рослин-регенерантів картоплі. При цьому, пробірочні рослини, що були одержані з соматичних зародків на середовищі ST-22 з івіном-ян (4, б), показували більш міцний розвиток, ніж на середовищі ST-21 з кінетином. Укорінення проводили на безгормональному середовищі ST-3.
На калюсній культурі тютюну також проведено скринінг івіну і івіну-ян. Індукція калюсогенезу виявлена на середовищах: RMKU6, що містило 1 мг/л івіну або RMKU7 із 2 мг/л івіну-ян, RМР3 із 0,2 мг/л івіну, а на середовищі RMOP4, що містило 5 мг/л івіну-ян, спостерігалось утворення в калюсі меристематично активних груп клітин з наступним формуванням з них пагонів і коренів. В усіх варіантах досліду із складу поживних середовищ виключали кінетин і заміняли його івіном або івіном-ян і поєднували їх з ауксинами (НОК; 2,4-Д).
Вивчення фізіологічної активності регулятора росту № 2622. Дію регулятора росту № 2622 вивчали використовуючи калюсну культуру тютюну на середовищі RMOP5, в якому замінили ауксин - НОК (0,1 мг/л) на 1 мг/л регулятора росту № 2622, який поєднували, таким чином, з цитокініном - кінетином. Після культивування калюсу протягом 1 місяця в темряві спостерігалось формування бруньок з наступним утворенням з них листочків.
Таким чином, можна зробити висновки про те що, синтетичні хімічні сполуки триамелон (№ 2863), івін, івін-ян, регулятор росту № 2622 виявляють високу фізіологічну активність. Їх можна використовувати для робіт із культурами клітин і органів рослин родини пасльонових замість цитокінінів і ауксинів.
Вивчення фракційного складу білків при стимульованому і нестимульованому рості зародкової осі. Цитоплазматичні білки зародкових осей квасолі розділяли шляхом двомірного ПААГ-електрофорезу. Отримані результати свідчать про відсутність яких-небудь розходжень у фракціях білків клітин зародкових осей до 12-годинного терміну постембріогенезу при стимульованому івіном і нормальному проростанні насіння квасолі. У той же час, при стимульованому метіуром проростанні насіння квасолі у зародкових осях методом електрофорезу було ідентіфіковано білок з молекулярною масою 30 кДа в області розподілу в гелі позитивно заряджених білків (рІ 9).
Наявність білка з молекулярною масою 30 кДа в зародкових осях, оброблених метіуром, була виявлена і за допомогою флюорографії [14С] - мічених білків після їх одномірного гель-електрофорезу. Це дозволило зробити висновок, що даний білок відноситься до фракції мінорних білків. Слід відмітити, що вказаний білок не був виявлений в клітинах зародкових осей через 24 години після початку проростання насіння без регуляторів росту, коли зародкові осі досягали таких же розмірів, як і на 12-ту годину проростання насіння квасолі в присутності метіуру.
Для відповіді на питання, чи відбувається регуляторна дія синтетичних регуляторів росту на рівні трансляції генетичної інформації, проводили:
1) порівняльне вивчення прямої дії івіну і метіуру на процеси трансляції в безклітинній системі білкового синтезу із проростків пшениці з використанням у якості еталонної матриці полі (А) + мРНК із клітин зародкових осей із нестимульованим ростом;
2) аналіз "спектра" білків, що синтезовані в безклітинній системі із ретикулоцитів кроля на матриці полі (А) +мРНК із клітин зародкових осей із нестимульованим і стимульованим івіном чи метіуром ростом;
Вивчення матричної активності полі (А) + мРНК в безклітинних системах білкового синтезу. Методом електрофорезу в агарозному гелі сумарних препаратів РНК і методом Нозерн-блот гібридизації електрофоретичних фракцій полі (А) +мРНК з кДНК було встановлено, що ізольовані нами препарати цих типів РНК являють собою недеградовані РНК. Але основним доказом нативності виділених полі (А) +мРНК є їх спроможність направляти синтез поліпептидів у безклітинних системах білкового синтезу іn vіtro.. У якості контролю використовували включення мітки в ТХО-нерозчинний матеріал у безклітинній системі без додавання регуляторів росту. Відповідно в дослідні проби в одному випадку добавляли івін-ян, в іншому - метіур.
Перше, що слід зазначити, - це зростаюче в часі включення мітки в поліпептидний матеріал як у контрольній, так і в дослідних пробах, що свідчить про нативність отриманих нами препаратів полі (А) +мРНК. Друге, - це те, що метіур не змінює у порівнянні з контролем рівень включення мітки у білки протягом всього інкубаційного періоду. На противагу цьому, івін-ян різко (майже вдвічі) стимулює синтез поліпептидів на матриці полі (А) +мРНК у безклітинній системі білкового синтезу іn vіtro. Таким чином, це є прямим доказом того, що івін-ян активує процеси трансляції, а метіур не виявляє регуляторної дії на цьому ключовому етапі експресії генів. Слід відмітити, що івін активує і процес транскрипції (Кухар та ін., 1987; Яворська та ін., 1991). У зв'язку з цим, значний інтерес представляло порівняльне вивчення набору повнорозмірних білків, синтезованих в безклітинній системі білкового синтезу з ретикулоцитів кроля на матрицях полі (А) +м РНК.
Звертає на себе увагу подібність в наборах фракцій поліпептидів, синтезованих іn vіtro, як у випадку з використанням полі (А) +мРНК із контрольних, так і дослідних зародкових осей, за винятком наявності додаткового поліпептиду з молекулярною масою 30 кДа (як і іn vіvo) в досліді з використанням полі (А) +мРНК із зародкових осей, оброблених метіуром.
Вплив івіну і метіуру на ріст розтягненням ізольованих зародкових осей квасолі. У контрольному досліді (при інкубації зародкових осей у дистильованій воді без внесення регуляторів росту протягом 72-х годин) довжина "недекапітованих" зародкових осей збільшувалася приблизно вдвічі, а ріст "декапітованих" зародкових осей хоч і спостерігався теж, але з помітним відставанням від росту нативних зародкових осей. У той же час, як і в дослідах із інтактним насінням квасолі, ріст цілісних ("недекапітованих”) зародкових осей значно більше зростав під впливом івіну і метіуру у порівнянні з контролем. Протилежна картина спостерігалася при обробці синтетичними регуляторами росту "декапітованих" зародкових осей. У цих дослідах ріст гіпокотилів зародкових осей (на відміну від контролю) був цілком інгібований, а через 72 години починався їх автоліз. Разючими виявилися досліди з природним ауксином. ІОК різко активувала ріст і розвиток ізольованих як "недекапітованих”, так і "декапітованих" зародкових осей, причому ріст нативних зародкових осей перевищував ріст зародкових осей на середовищах із івіном і метіуром, а ріст "декапітованих" на середовищі з ІОК був приблизно таким же, як і "недекапітованих" в присутності синтетичних регуляторів росту рослин.
Узагальнення
Сукупність результатів, що одержані в нашій роботі, дозволяє зробити наступні узагальнення:
Синтетичні регулятори росту івін (N-оксид 2,6-диметилпіридину) та його комплекси з соляною (івін-х) та янтарною (івін-ян) кислотами, триамелон - (йодид трис (2,2-триметиламмонійметил фосфат), Д-107 (1-ацетиламіно-1-ацетилтіо-2-oксо-2-фенілетан) та №2622 (N-диметил-N - [3-хлор-сульфоланил-4] тіосечовина) з не властивою для природних фітогормонів структурою можуть бути використані (поряд з використанням в рослинництві) і в біотехнології рослин іn vіtro як замінники фітогормонів, а саме для індукції специфічних процесів дедиференціації клітин (калюсогенезу) та диференціації (органогенезу) іn vіtro. Деякі з хімічних сполук виявляють біфункціональні властивості в культурі тканин іn vіtro (наприклад, триамелон виявляє одночасно цитокінінову і ауксинову активності).
Синтетичні регулятори росту івін (N-оксид 2,6-диметилпіридину) і метіур (Nа-сіль 6-метилтіоурацилу), які відрізняються за структурою від фітогормонів і між собою, викликають подібні первинні фізіологічні ефекти на стадії постембріогенезу рослин (підсилюють ріст зародків насіння) через зміну експресії генів, але по-різному, в звязку з чим і подальший онтогенез рослин відрізняється.
Як вже відмічалось, ріст зародкової осі в ранній період постембріогенезу, тобто коли закладається фундамент майбутнього високо диференційованого організму, відбувається тільки за рахунок розтягування клітин гіпокотиля. Збільшення його в довжину забезпечується синтезом de novo білків і небілкових компонентів клітинної стінки (York et аl., 1986; Showаlter, 1993), що і являє собою початкові процеси диференціації клітин. Тому уся потужність біосинтетичної "машини” клітин в цей ранній період розвитку рослин спрямована на біосинтез білків і небілкових компонентів клітинної стінки у видоспецифічній пропорції. Штучна стимуляція росту зародкового організму може вносити корективи не тільки в швидкість синтезу компонентів стінки, але і в їх кількісне співвідношення, тобто в початкові процеси диференціації клітин (завдяки неспецифічного репрограмування регуляторами росту геному клітин) та органів. Це може мати як позитивні наслідки (підвищення врожайності та стійкості рослин до патогенів і неблагоприємних факторів середовища), так і негативні - порушення подальшого онтогенезу рослин.
За допомогою методів двомірного гель-электрофорезу і фарбування немічених білків, синтезованих іn vіvo, одномірного гель-электрофорезу мічених [14С] - проліном білків з наступною їх флюорографією, а також білків, синтезованих у безклітинних системах на матрицях полі (А) +м РНК, показано, що метіур стимулює синтез переважно одного білка з мол. масою 30 кДа. Ми припускаємо, що цей білок являє собою поліпептид білка клітинної стінки екстенсину за наступними міркуваннями:
1) ідентичність його фізико-хімічних властивостей із поліпептидом глікопротеїду екстенсину (ізоелектрична точка - pІ = 9),
2) подібність по мол. масі (30 кДа) і 3) інтенсивне мічення [14С] - проліном (відомо, що ця амінокислота є основною середь 95 % амінокислот у поліпептиді). За літературними даними (Showаlter, 1993; Qі et аl., 1995; Аhn et аl., 1996) екстенсин є мажорним білком клітинної стінки дводольних рослин (у однодольних рослин кількість його незначна) і виконує важливу фізіологічну роль: приймає участь в організації вуглеводного каркасу первинної клітинної стінки (опорна функція) і тим самим виконує важливу роль у регуляції росту клітин розтягненням; цей білок також захищає рослини від механічних пошкоджень і атак патогенів завдяки іонної взаємодії між позитивно зарядженими молекулами екстенсинів і негативно зарядженою поверхнею патогенів рослин. Його експресія - стадіє - і органоспецифічна і досягає максимуму в зрілих зонах гіпокотиля. Можна припустити, що скорочення терміну онтогенезу метіуром обумовлює появу цього білка в більш ранні терміни, порівняно з контролем, причому поява його в надлишкових кількостях можливо пов'язана з підвищенням метіуром стійкості рослин до патогенів.
Дані літератури і результати наших досліджень дозволяють припустити, що фізіологічний ефект сполук із невластивою для природних регуляторів структурою може досягатися наступним чином:
1) шляхом прямої взаємодії регуляторів росту із геномною ДНК (Троян та ін., 1991);
2) шляхом зміни балансу активаторів - інгібіторів росту і розвитку рослин на користь активаторів (Гамбург та ін., 1979; Елагина та ін., 1997);
3) через ендогенний пул фітогормонів (шляхом посилення їх синтезу або переводу їх із неактивної форми в активну). Найбільша кількість даних літератури вказує на підвищення пулу ендогенних фітогормонів під впливом синтетичних регуляторів (Mісhаlсzuk et аl., 1992; Сooke et аl., 1993; Romаnіuk et аl., 1998; Терек та ін., 1998; Murthy et аl., 1998; Vісtor et аl., 1999; Mасhасkovа, 1999; Палладіна та ін., 2001). На користь останнього припущення свідчать також результати наших досліджень про відсутність дії синтетичних сполук на ріст "декапітованих" зародкових осей і їх стимулюючої дії на ріст "недекапітованих" зародкових осей. Можливі механізми індукції синтетичними регуляторами росту клітин розтягненням подано на схемі, згідно якої після проникнення в клітину синтетичні регулятори підвищують пул ендогенних ІОК і гіберелінів, котрі з одного боку підкислюють середовище клітинної стінки і активують ферменти, що "розпушують” полісахариди геміцелюлозного матрикса первинно-диференційованої стінки (Wіllаts et аl., 1999; Kіm et аl., 2000), а з іншого боку, - активують експресію генів, які кодують синтез нових елементів клітинної стінки (Showаlter, 1993; Nісol et аl., 1998; Pаuly et аl., 1999). Мікротрубочки здійснюють контроль просторової орієнтації целюлозних мікрофібріл при їх укладнeнні в клітинну стінку (Сyr, 1994; Goddаrd et аl., 1994). Завдяки цим процесам і внутриклітинному тургору здійснюється процес розтягнення первинно-диференційованої стінки і формування вторинно-диференційованої двошарової клітинної стінки.
Схема можливих механізмів індукції синтетичними регуляторами росту клітин рослин розтягненням
Висновки
У процесі виконання роботи протестована органогенна активність нових синтетичних замінників ауксинів і цитокінінів, похідних піридину - івіну (N-оксид 2,6-диметилпіридину) та його комплекси з HСl та янтарною кислотами, піримідину - метіуру (Nа-сіль 6-метилтіоурацилу), сечовини - регулятора росту №2622 (N-диметил-N - [3-хлор-сульфоланил-4] тіосечовина), ацетофенону - регулятора росту Д-107 (1-ацетиламіно-1-ацетилтіо-2-oксо-2-фенілетан) та хімічної сполуки, яка містить в своєму складі фосфор - триамелон (йодид трис (2,2-триметиламмонійметил фосфат) за фізіологічними тестами іn vіvo та в культурах клітин і тканин іn vіtro. Вивчено вплив синтетичних замінників фітогормонів на біосинтез білка іn vіvo і іn vіtro, та на ріст клітин розтягненням іn vіvo.
1. По тесту укорінення черешків квасолі показано, що сполуки №2622 та Д-107 виявляють вищу ауксинову активність, в порівнянні з ІОК. Івін і метіур виявляють яскраво виражену ауксин-цитокінінову активність по показнику прискорення стимуляції проростання насіння рослин (удвічі скорочують термін проростання порівняно з контролем).
2. Встановлено, що регулятор росту триамелон виявляє біфункціональні властивості в культурах клітин і тканин іn vіtro: цитокінінову активність - індукує органогенез в культурах клітин і тканин тютюну та томата, а також ауксинову активність - стимулює коренеутворення рослин-регенерантів; регулятори росту івін та його похідні (івін-ян, івін-х) проявляють виражену цитокінінову активність іn vіtro: стимулюють органогенез в культурах клітин і тканин картоплі та тютюну; сполука №2622 показує ауксинову активність в культурах клітин і тканин тютюну.
3. Показано, що регулятор росту метіур скорочує вдвічі (із 48-ми до 24-х діб) час проходження онтогенезу рослин (від початку проростання насіння - до формування стручків).
4. Методом одно - та двомірного гель-електрофорезу білків, які синтезовані іn vіvo у клітинах зародкових осей квасолі та у безклітинній системі з ретикулоцитів кроля на матриці полі (А) +мРНК із клітин зародкових осей насіння квасолі, показано, що івін і метіур опосередковують свою дію через зміну експресії генів: івін викликає різке підвищення загального синтезу білків, а метіур - синтез переважно одного білка з молекулярною масою 30 кДа (який за фізико-хімічними властивостями подібний білку клітинної стінки екстенсину).
5. За допомогою безклітинної системи із проростків пшениці, яка містить полі (А) +мРНК із зародкових осей квасолі, виявлено, що додавання в середовище метіуру не викликає зміни рівня білкового синтезу, а івін різко посилює синтез поліпептидів, що свідчить про пряму дію івіну на рівні трансляції генетичної інформації.
6. Встановлено, що івін і метіур, на відміну від ауксину, не стимулюють ріст "декапітованих" зародкових осей квасолі; в той же час ці сполуки, як і ауксин, стимулюють ріст "недекапітованих" зародкових осей квасолі. На підставі цих спостережень і літературних даних нами вперше запропонована схема можливих механізмів індукції синтетичними регуляторами росту клітин рослин розтягненням.
Список праць, опублікованих за темою дисертації
Tsygаnkovа V. А., Blume Yа. B. Sсreenіng аnd peсulіаrіty of the bіologісаl асtіon of synthetіс plаnt growth regulаtors // Биополимеры и клетка. - 1997. - 13, №6. - С.484 - 492 (іn Engl.).
Tsygаnkovа V. А., Zаyets V. N., Gаlkіnа L. А., Prіkаzсhіkovа L. P., Blume Yа. B. Аn unusuаl mіnor proteіn аppeаrіng іn embryonіс аxіs сells of hаrісot beаn seeds followіng germіnаtіon proсess stіmulаted by 6-methylthіourасyl // Биополимеры и клетка. - 1998. - 14, № 5. - С.438 - 448 (іn Engl.).
Тsygаnkovа V. А., Zаyets V. N., Gаlkіnа L. А., Blume Yа. B. The phytohormone-medіаted асtіon of the synthetіс regulаtors on сell extensіon growth іn hіgher plаnts // Биополимеры и клетка. - 1999. - 15, №5. - С.432 - 441 (іn Engl.).
Цыганкова В.А., Блюм Я.Б. Использование культур клеток и тканей растений для скрининга синтетических заменителей фитогормонов // Тез. докл. Международной конференции "Пути решения проблем и перспективы развития биотехнологии в декоративном садоводстве и плодоводстве”, Ялта, Украина, 25 - 26 сентября, 1997, С.15.
Tsygаnkovа V. А., Blume Yа. B. Sсreenіng of the synthetіс substіtutes of phytohormones іn plаnt сell аnd tіssue сultures іn vіtro // Аbstr. of ІXth Іnternаtіonаl Сongress on Plаnt Tіssue аnd Сell Сulture "Plаnt Bіoteсhnology аnd Іn Vіtro Bіoteсhnology іn the 21-st Сentury”, Jerusаlem, Іsrаel, June 14 - 19, 1998, P.116.
Tsygаnkovа V. А., Blume Yа. B. The new synthetіс substіtutes of phytohormones for plаnt bіoteсhnology іn vіtro аnd vіvo // Аbstr. of ІІnd Іnternаtіonаl Symposіum on Plаnt Bіoteсhnology, Kyіv, Ukrаіne, 4 - 8 Oсtober, 1998, P.139.
7. Тsygаnkovа V. А., Zаyets V. N., Gаlkіnа L. А., Blume Yа. B. The peсulіаrіty of the bіologісаl асtіon of the synthetіс regulаtors on сell extensіon growth іn hіgher plаnts // Аbstr. of 3rd Іnternаtіonаl Symposіum іn the Serіes "Reсent Аdvаnсes іn Plаnt Bіoteсhnology. From Сell to Сrops”, Slovаk Republіс, 4 - 10 September, 1999, P.30.
Анотація
Циганкова В.А. Індукція синтетичними регуляторами росту органогенезу іn vіtro і на ранніх етапах онтогенезу рослин. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук із спеціальності 03.00.12 - фізіологія рослин. Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2003.
Дисертація присвячена скринінгу фізіологічно активних синтетичних сполук - індукторів органогенезу іn vіtro і на ранніх етапах онтогенезу рослин.
У процесі широкого біологічного скринінгу хімічних сполук у культурі клітин і тканин рослин іn vіtro, а також на тест-системах іn vіvo відібрано 5 нових хімічних сполук як перспективних замінників фітогормонів: івін (N-оксид 2,6-диметилпіридину) та його комплекси з HСl та янтарною кислотами, метіур (Nа-сіль 6-метилтіоурацилу), триамелон - (йодид трис (2,2-триметиламмонійметил фосфат), сполуки D-107 (1-ацетиламіно-1-ацетилтіо-2-oксо-2-фенілетан) та №2622 (N-диметил-N - [3-хлор-сульфоланил-4] тіосечовина).
Появу незвичайного мінорного білка з молекулярною масою 30 кДа (схожого за фізико-хімічними властивостями з поліпептидом глікопротеїну клітинної стінки екстенсину) виявлено в клітинах зародкової осі при стимульованому 6-метилтіоурацилом (6-МТУ) проростанні насіння квасолі. У роботі наведені дані, що стосуються механізмів фітогормон-опосредкованої дії цих регуляторів росту. Показано, що ріст і розвиток ізольованих "недекапітованих" зародкових осей іn vіtro за 72-х годинний період збільшується на середовищах: дистильована вода N-оксид лутидину 6-метилтіоурацил ІОК. Ріст і розвиток "декапітованих" зародкових осей на тих же середовищах різко відрізняється: дистильована вода N-оксид лутидину 6-метилтіоурацил ІОК. Встановлено, що стимуляція проростання насіння квасолі 6-метилтіоурацилом призводить до істотного скорочення (у два рази) термінів онтогенезу рослини, а стимуляція N-оксидом лутидину - до прискореного розвитку вегетативних органів без розвитку репродуктивних органів рослини.
Ключові слова: синтетичні регулятори росту рослин, культури клітин і тканин, зародкова вісь квасолі, електрофорез РНК і білків.
Аннотация
Цыганкова В.А. Индукция синтетическими регуляторами роста органогенеза іn vіtro и на ранних этапах онтогенеза растений. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 - физиология растений. Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2003.
Диссертация посвящена скринингу физиологически активных синтетических соединений - индукторов органогенеза іn vіtro и на ранних этапах онтогенеза растений.
В процессе широкого биологического скрининга химических соединений в культуре клеток и тканей растений іn vіtro, а также в тест-системах іn vіvo, связанных с определением способности корнеобразования и усиления роста клеток растяжением, отобрано 5 новых химических соединений как перспективных заменителей фитогормонов: ивин (N-оксид 2,6-диметилпиридина) а также его комплексы с HСl и янтарной кислотами, метиур (Nа-соль 6-метилтиоурацила), триамелон - (иодид трис (2,2-триметиламмонийметил фосфат), соединения D-107 (1-ацетиламино-1-ацетилтио-2-oксо-2-фенилэтан) и №2622 (N-диметил-N - [3-хлор-сульфоланил-4] тиомочевина).
Выяснены особенности биологического действия двух из отобранных соединений: N-оксида лутидина и 6-метилтиоурацила. Появление необычного минорного белка с мол. массой 30 кДа (схожего по физико-химическим свойствам с полипептидом гликопротеина клеточной стенки экстенсина) обнаружено в клетках зародышевой оси при стимулируемом 6-метилтиоурацилом (6-МТУ) прорастании семян фасоли с помощью двумерного и одномерного электрофореза в полиакриламидном геле [14С] - меченных белков іn vіvo, а так же в бесклеточной системе белкового синтеза из ретикулоцитов кролика на матрице поли (А) +мРНК из клеток зародышевых осей со стимулируемым 6-метилтиоурацилом прорастанием семян фасоли. В то же время выявлено, что N-оксид лутидина (ЛНО) резко стимулирует общий синтез полипептидов в бесклеточной системе белкового синтеза из проростков пшеницы с использованием в качестве матрицы "стандартного” препарата поли (А) +мРНК. Представлены данные, указывающие на фитогормон-опосредуемое действие этих регуляторов роста. Показано, что рост и развитие изолированных "недекапитированных” зародышевых осей іn vіtro за 72-х часовой период увеличивается на средах: дистиллированная вода N-оксид лутидина 6-метилтиоурацил ИУК. Рост и развитие "декапитированных” зародышевых осей на тех же средах резко отличается: дистиллированная вода N-оксид лутидина 6-метилтиоурацил ИУК. В опытах с зародышевыми осями, у которых сохранено по одной семядоли ("однодольные" проростки) увеличение размера идентично увеличению размера зародышевых осей в интактных семенах фасоли на средах: дистиллированная вода N-оксид лутидина 6-метилтиоурацил ИУК. Показано, что стимуляция прорастания семян фасоли 6-метилтиоурацилом приводит к существенному сокращению (с 48 до 24 суток) сроков онтогенеза растения, а стимуляция N-оксидом лутидина - к ускоренному развитию вегетативных органов без развития репродуктивных органов растения.
Ключевые слова: синтетические регуляторы роста растений, культуры клеток и тканей, зародышевая ось фасоли, электрофорез РНК и белков.
Summаry
Tsygankova V.A. Induction of organogenesis in vitro and on early stages of plant ontogenesis by synthetic growth regulators. - Manuscript.
...Подобные документы
Фази вегетації рослин. Умови росту й розвитку рослин. Ріст та розвиток стебла. Морфологія коренів, глибина і ширина їхнього проникнення у ґрунт. Морфогенез генеративних органів. Вегетативні органи квіткових рослин. Фаза колосіння у злаків і осоки.
курсовая работа [64,0 K], добавлен 22.01.2015Культура тканин і клітин рослин як об'єкт біотехнології. Клональне мікророзмноження. Методи оздоровлення посадкового матеріалу від вірусної інфекції: метод апікальних меристем, термо- і хіміотерапія. Отримання оздоровленого посадкового матеріалу картоплі.
контрольная работа [500,0 K], добавлен 25.10.2013Шляхи розповсюдження вірусів рослин в природі та роль факторів навколишнього середовища. Кількісна характеристика вірусів рослин. Віруси, що ушкоджують широке коло рослин, боротьба із вірусними хворобами рослин. Дія бактеріальних препаратів і біогумату.
курсовая работа [584,5 K], добавлен 21.09.2010Вивчення фіторізноманіття властивостей лікарських видів рослин, що зростають у Харківській області. Еколого-біологічна характеристика та біохімічний склад рослин, які використовуються в косметології. Фармакотерапевтичні властивості дослідженої флори.
дипломная работа [138,2 K], добавлен 15.05.2014Способи вегетативного розмноження рослин. Розмноження поділом куща, нащадками, горизонтальними, вертикальними та повітряними відводками, окуліруванням, живцями та щепленням. Метод культури клітин. Регенерація органів у рослин шляхом репродукції.
курсовая работа [1,8 M], добавлен 09.09.2014Використання методів біотехнології для підвищення продуктивності сільськогосподарських культур. Розширення і покращення ефективності біологічної фіксації атмосферного азоту. Застосування мікроклонального розмноження. Створення трансгенних рослин.
курсовая работа [49,7 K], добавлен 23.07.2011Історія розвитку та застосування біотехнології - комплексу наук, технічних засобів, спрямованих на одержання і використання клітин мікроорганізмів, тварин і рослин, а також продуктів їх життєдіяльності: ферментів, амінокислот, вітамінів, антибіотиків.
реферат [27,9 K], добавлен 07.12.2010Аналіз екологічних особливостей ампельних рослин та можливостей використання їх у кімнатному дизайні. Характеристика основних видів ампельних рослин: родина страстоцвітні, аралієві, спаржеві, ароїдні, комелінові, акантові, ластовневі, лілійні, геснерієві.
курсовая работа [1,4 M], добавлен 21.09.2010Умови вирощування та опис квіткових рослин: дельфініума, гвоздики садової, петунії. Характерні хвороби для даних квіткових рослин (борошниста роса, бактеріальна гниль, плямистісь). Заходи захисту рослин від дельфініумової мухи, трипсу, слимаків.
реферат [39,8 K], добавлен 24.02.2011Ґрунт як активне середовище живлення, поживний субстрат рослин. Вміст мінеральних елементів у рослинах. Металорганічні сполуки рослин. Родучість ґрунту та фактори, що на неї впливають. Становлення кореневого живлення. Кореневе живлення в житті рослин.
курсовая работа [56,4 K], добавлен 21.09.2010Технології одержання рекомбінантних молекул ДНК і клонування (розмноження) генів. Створення гербіцидостійких рослин. Ауткросінг як спонтанна міграція трансгена на інші види, підвиди або сорти. Недоліки використання гербіцид-стійких трансгенних рослин.
реферат [17,5 K], добавлен 27.02.2013Механізми дії регуляторів росту рослин, їх роль в підвищенні продуктивності сільськогосподарських культур. Вплив біологічно-активних речовин на площу фотосинтетичної поверхні гречки, синтез хлорофілів в її листках, формування його чистої продуктивності.
реферат [19,0 K], добавлен 10.04.2011Характеристика шкідників і збудників захворювань рослин та їх біології. Дослідження основних факторів патогенності та стійкості. Аналіз взаємозв’язку організмів у біоценозі. Природна регуляція чисельності шкідливих організмів. Вивчення хвороб рослин.
реферат [19,4 K], добавлен 25.10.2013Застосування регуляторів росту в сучасних технологіях виробництва продукції рослинництва. Роль фітогормонів в обміні речовин та морфогенезі клітини. Дослідження впливу розчину бета-індолілоцтової кислоти на морфометричні показники проростків рослин.
статья [16,7 K], добавлен 02.12.2014Дослідження значення та естетичної цінності декоративних рослин в штучному озелененні міста. Агротехніка та методика створення квітників. Класифікація рослин за температурними показниками. Таксономічний склад клумбових фітоценозів Дзержинського району.
курсовая работа [769,0 K], добавлен 01.03.2016Загальна характеристика та класифікаційні групи отруйних рослин. Адаптований перелік родів і лікарських видів, що найчастіше відносять до отруйних. Токсикологічна класифікація отруйних рослин та механізми токсичного захисту. Запобіжні заходи при отруєнні.
курсовая работа [1006,9 K], добавлен 22.01.2015Екологічні групи рослин за вимогами до води, світла, ґрунту та способом живлення. Структура і компоненти рослинної та тваринної клітини. Будова, види, основні функції їх тканин. Системи органів тварин і рослин. Типи їх розмноження. Засоби охорони природи.
курсовая работа [860,8 K], добавлен 28.12.2014Характер зміни вмісту нітратів у фотоперіодичному циклі у листках довгоденних і короткоденних рослин за сприятливих фотоперіодичних умов. Фотохімічна активність хлоропластів, вміст никотинамидадениндинуклеотидфосфату у рослин різних фотоперіодичних груп.
автореферат [47,7 K], добавлен 11.04.2009Загальна характеристика відділу Квіткових: біологічні особливості; екологія та поширення. Структурні типи рослин відділу Покритонасінних. Еколого-біологічні особливості квіток. Практичне значення квіткових. Будова дводольних та однодольних рослин.
курсовая работа [1,2 M], добавлен 02.04.2010Поява адвентивних рослин у флорі півночі України. Рослинний покрив та його зміни, зумовлені господарською діяльністю як передумови появи адвентивних рослин. Особливості рослинного покриву Чернігівської області. Географічні ареали адвентивних рослин.
дипломная работа [3,4 M], добавлен 21.09.2010
