Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

Заїка Олег Леонідович

УДК 577.352 : 576.382

Кальцієва сигналізація в хромафінних клітинах щура при дії факторів, що стимулюють секрецію

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Наукові керівники:

академік НАН України, доктор біологічних наук Костюк Платон Григорович

директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

зав. відділом Загальної фізіології нервової системи (ЗФНС)

кандидат біологічних наук Лук`янець Олена Олександрівна

старший науковий співробітник відділу ЗФНС Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти:

Чл.-кор. НАН України, доктор біологічних наук Костерін Сергій Олексійович

зав. відділом Біохімії м`язів Інституту біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України, м. Київ.

Доктор біологічних наук Жолос Олександр Вікторович

провідний науковий співробітник відділу нервово-м`язевої фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, м. Київ.

провідна установа: Київський Національний Університет ім. Тараса Шевченка, біологічний факультет.

Захист відбудеться “__2__”___грудня____ 2003 р. о “_14____” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

Автореферат розісланий “___1_____”__листопада___ 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук__________________ Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом з`явилося багато інформації про фактори, що опосередковують процеси входження іонів кальцію та вивільнення катехоламінів із хромафінних клітин. З одного боку іони кальцію, що увійшли до клітини через численні кальцієві канали, будуть створювати певну внутрішньоклітинну концентрацію, яка і буде впливати на процес вивільнення везикул. З іншого боку, в цих клітинах існує декілька видів внутрішньоклітинних кальцієвих депо, що здатні запасати і вивільняти іони кальцію; який відіграє дуже важливу роль в регуляції секреції катехоламінів в хромафінних клітинах. Ці внутрішньоклітинні депо включають в себе мітохондрії, хромафінні гранули, ендоплазматичний ретикулум та, можливо, кальціосоми. Однак, дотепер все ще мало відомо про процеси мобілізації іонів кальцію із цих депо. По своєму походженню секреторні клітини мозкової речовини наднирників аналогічні постгангліонарним нейронам симпатичної нервової системи і тому можуть використовуватись як експериментальні моделі для дослідження синаптичної передачі. Катехоламінові гормони -- норадреналін та адреналін, які синтезуються в хромафінних клітинах мозкового шару наднирників відіграють суттєву роль в нормальному функціонуванні організму, забезпечуючи адаптацію до різних типів стресів. Так, наприклад, якщо людина схвильована чи злякана, завдяки адреналіну її витривалість різко збільшується. Тому регуляція секреторної активності в хромафінних клітинах є необхідним критерієм для повноцінного функціонування як самих клітин, так і організму в цілому. Однак, дотепер залишається мало дослідженим зв`язок кальцієвих каналів і ацетилхолінових рецепторів з процесом екзоцитозу в хромафінних клітинах, роль іонів кальцію в процесі вивільнення катехоламінів, можливі відмінності в механізмах запуску секреції при різних типах клітинної стимуляції. З іншого боку самі хромафінні клітини поділяють на типи в залежності від певних функціональних ознак. Так дослідження мозкової речовини наднирника ссавців, на основі гістологічних, морфологічних та топографічних критеріїв виявило незаперечну присутність в медулі наднирника двох типів хромафінних клітин, що містять адреналін та норадреналін, але ступінь відмінності цих двох типів до кінця не з`ясована. Також, на даний момент закономірність розподілу хромафінних клітин, що містять норадреналін та адреналін в медульній частині наднирника залишається неясною і не має достатньо обгрунтованої інформації про різницю їх взаємодії з кровоносними судинами. Така невизначеність всіх аспектів регуляторних механізмів, які відповідають за процеси вивільнення катехоламінів в хромафінних клітинах спонукає до проведення подальших експериментальних досліджень в даній області. Зважаючи на все вище сказане, можна вважати, що дослідження змін кальцієвої сигналізації в хромафінних клітинах при дії факторів, що стимулюють секрецію представляють великий науковий інтерес і практичне значення.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової програми відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій різних мозкових структур”.

Мета дослідження. Мета даної роботи полягала в дослідженні зміни внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації при дії на хромафінну клітину факторів, що стимулюють секрецію.

Завдання дослідження.

Провести дослідження внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів при деполяризації хромафінної клітини, а також при дії агоністами ацетилхолінових рецепторів (мускарином та нікотином).

Провести детальний аналіз кальцієвих транзієнтів, отриманих при стимуляції хромафінної клітини ацетилхоліном (АХ) та дослідити роль типів ацетилхолінових рецепторів в їх формуванні.

Провести дослідження ролі ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій в формуванні кальцієвого сигналу при стимуляції цих клітин ацетилхоліном.

Провести безпосереднє вимірювання вивільнених хромафінною клітиною катехоламінів за допомогою електрохімічного методу.

Провести експерименти по ідентифікації норадреналін та адреналін- секретуючих клітин наднирників щура за допомогою цитохімічного методу.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі досліджено роль різних факторів, що стимулюють секрецію, в процесі генерації внутрішньоклітинного кальцієвого сигналу. Вперше показано існування двох різних популяцій клітинних відповідей при стимуляції хромафінної клітини ацетилхоліном (охарактеризовані, як клітини І та ІІ типу), що може свідчити про функціональну гетерогенність цих клітин. Охарактеризовано й показано подібність кінетичних параметрів індукованих ацетилхоліном внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів в клітинах І типу до транзієнтів, ініційованих нікотином, а в клітинах ІІ типу до транзієнтів, ініційованих мускарином. Ці дані можуть свідчити про переважну експресію нікотинових рецепторів в І типі та мускаринових в ІІ типі хромафінних клітин, що було підтверджене при використанні специфічних блокаторів нікотинових та мускаринових рецепторів тубокурарину та атропіну. Виявлено, що в клітинах ІІ типу в процесі генерації кальцієвих транзієнтів при стимуляції ацетилхоліном приймають участь внутрішньоклітинні джерела іонів кальцію. Показано, що мітохондрії в гостроізольованих хромафінних клітинах здатні акумулювати дуже високі рівні концентрації кальцію і підтверджено їх значну роль в процесі усунення іонів кальцію з цитоплазми хромафінної клітини щура. На основі отриманих даних припускається, що існує функціональний поділ хромафінних клітин: одна популяція з яких має в основному іонотропні нікотинові рецептори (І тип), тоді як інша - метаботропні мускаринові рецептори (ІІ тип) і вперше за допомогою цитохімічного методу показано, що такий функціональний поділ відповідає типу катехоламінів, які містять клітини (клітини І типу містять адреналін, тоді, як клітини ІІ типу-норадреналін). Показано, що в хромафінних клітинах щура існують суттєві відмінності в формуванні внутрішньоклітинного кальцієвого транзієнту у відповідь на стимуляцію клітини різними факторами, що індукують секрецію. Це в свою чергу може істотно впливати на процеси вивільнення катехоламінів. Отримані експериментальні дані суттєво доповнюють сучасні уявлення відносно змін кальцієвої сигналізації в хромафінних клітинах при дії факторів, що стимулюють секрецію і дають змогу пояснити закономірності внутрішньоклітинної регуляції цього процесу.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Отримані в даній роботі результати мають як теоретичне, так і практичне значення. Ці дані дають підстави говорити про різну функціональну роль виявлених нами двох типів хромафінних клітин щура. Як відомо, регуляція збуджуючого впливу ендогенних катехоламінів відбувається за допомогою адреноблокаторів. Але навіть завдяки найбільш активним - та - адреноблокаторам неможливо добитися повного виключення симпато-адреналової системи. Також, незважаючи на побічні ефекти, різні адреноблокатори застосовуються в практичній медицині в якості ефективних лікарських засобів. Завдяки отриманим результатам, які показують існування функціонального поділу хромафінних клітин одна популяція з яких містить адреналін і в них переважає експресія нікотинових рецепторів тоді як інша містить норадреналін і переважає експресія мускаринових рецепторів, з`являються нові можливості вирішення даної проблеми. Результати роботи, отримані при використанні блокаторів рецепторів та функцій певних внутрішньоклітинних органел, дають нам нові знання для розуміння функціонування хромафінних клітин при певних патологіях. Розуміння механізмів формування різних кальцієвих сигналів та регуляції концентрації внутрішньоклітинного кальцію, а також взаємний вплив в цих процесах мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму, значно збагачує наші знання в області кальцієвого гомеостазу хромафінних клітин.

Особистий внесок здобувача. Робота по вивченню внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів в ізольованих хромафінних клітинах щура при стимуляції клітини агоністами рецепторів, по дослідженню ролі типів АХ-рецепторів в формуванні індукованих внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів, по дослідженню ролі внутрішньоклітинних кальцієвих депо - мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму в формуванні кальцієвої відповіді, по електрофізіологічним дослідженням реєстрації процесу секреції, та по цитохімічним дослідженням вмісту катехоламінів була виконана особисто автором. Обробка та статистичний аналіз отриманих даних були виконані особисто автором. Здобувач приймав активну участь у розробці концепції роботи, обговоренні й редагуванні результатів та формуванні висновків.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи докладались на І конференції Українського товариства нейронаук (Київ, 24-26 листопада 1998р.), на міжнародній школі-семінарі ”Мембрани та сигнали” (Київ, 3-8 вересня 2000р.), на конференції “Bogomoletz-Nencki Meeting” (Сулейов, Польща, 7-8 травня 2001р.), на ІІ конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 30 травня-4 червня 2001р.), на міжнародній конференції „ Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System” (Київ, 16-17 червня 2002р.) та на “Second Bogomoletz-Nencki Symposium. Intracellular signalling in excitable cells” (Київ, 1-3 вересня 2002р.).

Публікації. По результатам роботи опубліковано 4 статті та тези 6 доповідей в наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 205 найменувань. Робота викладена на 158 сторінках та ілюстрована 55 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність дослідження зміни внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації при дії на хромафінну клітину факторів, що стимулюють секрецію, сформульована мета та задачі дослідження, наведені відомості про наукову новизну, практичну цінність та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ1 “Огляд літературних даних” присвячений висвітленню відомих аспектів впливу зміни внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію на процеси вивільнення катехоламінів, впливу внутрішньоклітинних Са2+-буферів на секрецію в хромафінних клітинах, охарактеризовані типи потенціал-керованих Са2+-каналів та внутрішньоклітинних кальцієвих депо в хромафінних клітинах, показана їх роль в процесі генерації кальцієвих сигналів, детально ознайомлено з роллю ацетилхолінових рецепторів в формуванні внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів та функціональним поділом хромафінних клітин.

Для досягнення поставленої мети у розділі 2 “Матеріали та методи дослідження” описано використання наступних методичних підходів:

Виділення гостроізольованих хромафінних клітин щура;

Реєстрація кальцієвих транзієнтів за допомогою флуоресцентного методу та процесу секреції за допомогою електрохімічного методу;

Виявлення за допомогою цитохімічного методу норадреналін та адреналін- секретуючих клітин мозкової речовини наднирника щура.

Статистична обробка отриманих результатів з використанням стандартних методів аналізу.

Об`єкт дослідження. Загальна характеристика хромафінних клітин наднирника. По своєму походженню секреторні клітини мозкової речовини наднирників аналогічні постгангліонарним нейронам симпатичної нервової системи; не дивно тому, що і функціонують вони аналогічно. Вегетативна (автономна) нервова система включає в себе парасимпатичну систему з холінергетичнми пре- і постганглінарними нервами симпатичну нервову систему з холінергічними прегангліонарними і адренергічними постгангліонарними нервами і мозковий шар наднирників. Останній по суті справи є продовженням симпатичної нервової системи оскільки прегангліонарні волокна черевного нерву закінчуються на хромафінних клітинах мозкового шару наднирників продукуючих катехоламіни -норадреналін адреналін. Значить мозковий шар наднирників представляє собою спеціалізований ганглій без продовження у вигляді аксонів. Хромафінні клітини цього шару синтезують запасають і секретують продукти дія яких здійснюється на віддалі від місця їх синтезу. Таким чином мозковий шар здійснює функцію і ендокринного органу - чудовий приклад взаємодії нервової і ендокринної системи. Головний продукт мозкового шару наднирників - адреналін. На долю цієї сполуки припадає близько 80% усіх катехоламінів мозкового шару.

Виділення гостроізольованих хромафінних клітин щура. В експериментах, використовувались дорослі (56 місяців) самки білих щурів лінії Вістар масою 180-230 грамів, що утримувались на стандартній лабораторній дієті у віварії Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Для отримання свіжоізольованих клітин використовувалась стандартна процедура ферментативної ізоляції. Виділені наднирники інкубувались спочатку на протязі 30 хвилин при 37С в стандартному розчині DPBS (9.6гр/літр), що містив фермент колагеназу тип ІА (Sigma, США) в концентрації 0.5мг/мл та потім на протязі 40 хвилин при концентрації 0.3мг/мл. Для усування залишків та запобігання подальшої дії ферменту зрізи інкубувались в насиченому розчині білка альбуміну 1мг/мл (Sigma, США) на протязі 10 хвилин при 37С. Окремі хромафінні клітини отримувались за допомогою м`якого, повільного піпетування з використанням піпеток різного діаметру не менше 15 хвилин.

Вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію в хромафінних клітинах. Для проведення експериментів використовувався стандартний флуоресцентний метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію ([Ca2+]i) з використанням кальцій-чутливого барвника fura-2 АМ. Свіжоізольовані хромафінні клітини інкубували протягом 30 хв. при температурі 37°С в зовнішньоклітинному розчині, що містив 1 мкм fura-2 АМ. Після цього клітини відмивали зовнішньоклітинним розчином і залишали в темряві при кімнатній температурі на 30-40 хвилин для завершальної деестерифікації fura-2 АМ. Для реєстрації кальцієвих транзієнтів, викликаних дією на клітину певного агента, використовувався підсилювач ЕРС-9 (НЕКА, Ламбрехт, Німеччина). Керування процесами вимірювання, а також запису даних відбувалось за допомогою комп`ютерної програми “Pulse”та „X-chart” (НЕКА, Ламбрехт, Німеччина). Збудження флуоресцентного зонду здійснювалось на довжинах хвилі 360 та 380нм.. Сигнали з фотопомножувача подавали на вхід LPS-150 (Till Photonics, Японія), який в реальному масштабі часу розраховував відношення флуоресцентних сигналів на двох довжинах R = F1/F2.

Електрохімічийі метод реєстрації процесу вивільнення катехоламінів. Для реєстрації вивільнення катехоламінів в хромафінних клітинах використовувався електрохімічний метод детектування, що оснований на окисленні або відновленні специфічних сполук. В якості вимірюючого електроду використовувався електрод з карбоновим волокном, оскільки він мав властивості, які найбільше відповідають поставленим задачам. Реєстрація окремих секреторних відповідей відбувалась в конфігурації “Амперометрія “, при прикладанні на електрод постійного потенціалу +600мВ.

Методика ідентифікації норадреналін та адреналін- секретуючих клітин мозкової речовини наднирників лабораторних тварин. Для ідентифікації типу катехоламінів, який секретує хромафінна клітина, використовувався світловий цитохімічний метод диференційованого визначення катехоламінів мозкової речовини наднирника лабораторних тварин. В основі методу лежить принцип фіксації хромафінних клітин наднирника в 5% глютаровому альдегіді, на фосфатному буфері з рН 7,2. Ізольовані хромафінні клітини переносять в біхроматний розчин Мюллера і потім забарвлюють лужним розчином толуїдинового синього. Норадреналін-секретуючі клітини, в даному випадку, забарвлюються в зелений колір, а адреналін-секретуючі клітини в синьо-фіолетові. Суть методу полягає в утворенні продукту конденсації норадреналіну з глютаровим альдегідом.

Електрофізіологічні вимірювання. При проведенні експериментів застосовувались наступні розчини: контрольний- NaCl 130, KCl 5, CaCl2 2, MgCl2 2, HEPES 10, C6H12O6 10; гіперкалієвий розчин- NaCl 85, KCl 50, CaCl2 2, MgCl2 2, HEPES 10, C6H12O6 10; безкальцієвий розчин- NaCl 133, KCl 5, MgCl2 2, HEPES 10, C6H12O6 10, рH 7,3. Для вивчення змін внутрішньоклітинного кальцію, процесу секреції, в ізольованих хромафінних клітинах щура в контрольний розчин додавались відповідні агенти: ацетилхолін в концентрації 1мМ, нікотин в концентрації 150мкМ та мускарин в концентрації 30мкМ. Для дослідження вкладу різних типів АХ рецепторів застосовувались відповідні блокатори тубокурарин в концентрації 50мкМ та атропін в концентрації 5мкМ. Для вивчення ролі внутрішньоклітинних кальцієвих депо використовувались: кофеїн в концентрації 30мМ, СССР в концентрації 10мкМ татапсігаргін в концентрації 20нМ. Всі отримані величини представлені як середнє значення ± стандартна помилка (SEM). Статистичні відмінності були оцінені за допомогою стандартних методів із рівнем достовірності р.

У третьому розділі “Результати досліджень” проведений детальний аналіз змін кальцієвої сигналізації в хромафінних клітинах щура при дії факторів, що стимулюють секрецію.

Властивості кальцієвих сигналів викликаних дією гіперкалієвого розчину, нікотину, мускарину, кофеїну та ацетилхоліну на хромафінну клітину щура. На початку нашої експериментальної роботи був проведений детальний аналіз змін кальцієвої сигналізації в хромафінних клітинах щура при дії факторів, що стимулюють секрецію. В якості агентів стимулюючих секрецію використовувались: гіперкалієвий розчин, нікотин, мускарин, кофеїн та ацетилхолін. Виявлено, що кінетичні характеристики кальцієвих сигналів, отриманих в результаті дії цих агентів мають певні відмінності. Проведений статистичний аналіз показав суттєві відмінності в амплітудах кальцієвих транзієнтів(F1/F2): Так при дії на клітину гіперкалієвого розчину - F1/F2=1,470,03 (n=175), 1мМ ацетилхоліну - F1/F2=0.910.02 (n=180), 150мкМ нікотину - F1/F2=0,570,14 (n=99) та 30мМ кофеїну - F1/F2=0,470,03 (n=72) та 30мкМ мускарину - F1/F2=0,540,12 (n=64). Ми бачимо, що у випадку дії на клітину нікотину та мускарину спостерігається досить суттєва варіація значень амплітуди кальцієвого сигналу. Пояснення цього явища буде зроблено при обговоренні результатів подальших експериментів. При аналізі кінетики спаду кальцієвого сигналу було виявлено, що криві спаду з достатньо високою імовірністю (р<0,0001) апроксимуються однією експонентою, але існують певні відмінності характеристичного часу спаду() при різному типі стимуляції клітини. Так при дії на клітину гіперкалієвого розчину - =7,0461,172 (n=115), 1мМ ацетилхоліну - =10,121,27 (n=92), 150мкМ нікотину - =5,540,85 (n=54) та 30мМ кофеїну - =5,490,87 (n=42) та 30мкМ мускарину - =11,021,13 (n=32) (рис. 1).

З отриманих даних видно, що в хромафінних клітинах щура спостерігалися суттєві відмінності в формуванні внутрішньоклітинного кальцієвого транзієнту (відрізняється амплітуда та в деяких випадках характеристичний час спаду) у відповідь на стимуляцію клітини різними факторами, які індукують секрецію. Оскільки процес вивільнення катехоламінів в хромафінних клітинах є кальційзалежним відмінності в формуванні кальцієвих сигналів можуть впливати на процес секреції в цих клітинах. Такі висновки знайшли підтвердження в проведених нами експериментах, по безпосередньому вимірюванню вивільнених хромафінною клітиною нейромедіаторів. Реєстрація процесу секреції здійснювалась в конфігурації “Амперометрія” при потенціалі на електроді +600мВ. Для порівняння в якості агентів, що стимулюють секрецію використовувались гіперкалієвий розчин та ацетилхолін. Було проведено одночасне вимірювання кальцієвих транзієнтів та процесу секреції в хромафінних клітинах відповідно за допомогою флуоресцентного та електрохімічного методу. Короткочасна стимуляція (протягом 3 секунд) клітини АХ призводила до помітного процесу вивільнення, що тривав ще протягом 2025 секунд після припинення стимуляції. Деполяризація клітини розчином, що містив підвищену концентрацію KCl (50мМ) протягом 3 секунд теж ініціює значний процес вивільнення який триває на протязі 15-20 секунд після припинення стимуляції (рис. 2).

Як ми бачимо з отриманих даних стимуляція клітини різними факторами, що індукують секрецію, приводить до помітних змін в частоті вивільнення нейромедіатора (середня частота появи амперометричних піків, що відповідають квантовому процесу вивільнення окремої секреторної везикули, складала: 0,720,06с-1 (n=20) при стимуляції клітини розчином, що містив АХ в концентрації 1мМ; 0,260,06с-1 (n=15) при деполяризації клітини розчином, що містив 50мМ KCl). Також спостерігались певні відмінності в амплітудах секреторних піків (середня амплітуда амперометричних піків становила: 39,081,40пА при стимуляції клітини-АХ; та 21,180,75пА при стимуляції клітини гіперкалієвим розчином). Більш детально всі відмінності процесу секреції при різних типах стимуляції охарактеризував Починюк Олег Миколайович у своїй дисертаційній роботі „Зміна кінетики процесу квантового вивільнення медіаторів в хромафінних клітинах щура при різних типах стимуляції.”

Детальне дослідження властивостей кальцієвих сигналів викликаних дією ацетилхоліну на хромафінну клітину. Оскільки секреція катехоламінів із хромафінних клітин викликається саме за допомогою ацетилхоліну, що вивільняється із симпатичних прегангліонарних нервових волокон, переважна частина дисертаційної роботи була присвячена дослідженню кальцієвих транзієнтів отриманих при стимуляції клітини АХ. При детальному аналізі кальцієвих сигналів отриманих при дії на клітину ацетилхоліну було виявлено, що форма кальцієвого транзієнту має певні відмінності порівняно з отриманими кальцієвими сигналами при дії на хромафінну клітину щура гіперкалієвого розчину, нікотину, мускарину та кофеїну; при послідовній стимуляції хромафінних клітин АХ виявлено дві популяції клітинних відповідей (в клітинах І типу при послідовній стимуляції не відбувається значного зменшення амплітуди відповіді, а в клітинах ІІ типу при послідовній стимуляції спостерігається значне зменшення амплітуди кальцієвого сигналу, причому ця величина повертається до початкового значення після деполяризації клітини гіперкалієвим розчином (рис.3).

Статистична обробка отриманих даних показала, що нормована амплітуда кальцієвого транзієнту в клітинах І типу складала 100% при 1-шій стимуляції, 952% при 2-гій , 935% при 3-ій та 916% при 4-тій, а в клітинах ІІ типу 100% при 1-шій стимуляції, 596% при 2-гій , 355% при 3-ій та 186% (р< 0,001). Порівняння амплітуд кальцієвих сигналів, отриманих при першій стимуляції АХ в клітинах І та ІІ типу, не виявили суттєвих відмінностей (F1/F2=0,900,05 та F1/F2=0,940,03 відповідно). Виникає питання, чим обумовлюються такі різні клітинні відповіді при послідовних стимуляціях клітини АХ.

Дослідження ролі нікотинових та мускаринових AХ-рецепторів в формуванні кальцієвих сигналів, викликаних дією ацетилхоліну на хромафінну клітину. Наступна серія експериментів була присвячена дослідженню ролі різних типів АХ-рецепторів в формуванні кальцієвої відповіді викликаних дією на клітину АХ. Спочатку за допомогою агоністу нікотинових AХ-рецепторів - нікотину досліджувалась роль нікотинових рецепторів в формуванні кальцієвого транзієнту, опосередкованого дією на хромафінну клітину АХ. Нами були виявлені суттєві відмінності в амплітуді кальцієвого сигналу, викликаного дією 150мкМ нікотину в клітинах І та клітинах ІІ типу (рис. 4).

При порівнянні амплітуд кальцієвих сигналів, викликаних дією 150мкМ нікотину в клітинах І та ІІ типу, були виявлені суттєві відмінності (р<0.001). Так в клітинах І типу F1/F2=0,570,02 (n=32), а в клітинах ІІ типу F1/F2=0,210,02 (n=12). Наступним кроком роботи було дослідження за допомогою агоністу мускаринового типу AХ-рецепторів - мускарину ролі мускаринових рецепторів в формуванні кальцієвого транзієнту, опосередкованого дією на хромафінну клітину АХ (рис.5).

Нами також були виявлені суттєві відмінності в амплітуді кальцієвого сигналу, викликаного дією 30мкМ мускарину на клітини І та ІІ типу. При порівнянні амплітуд кальцієвих сигналів, викликаних дією мускарину в клітинах І та ІІ типу виявили суттєві відмінності (р<0.001). Так в клітинах І типу F1/F2=0,720,05 (n=27), а в клітинах ІІ типу F1/F2=0,240,04 (n=18). Ці дані можуть свідчити про переважну експресію нікотинових рецепторів в І типі та мускаринових в ІІ типі хромафінних клітин, що і було підтверджено в експериментах з використанням специфічних блокаторів нікотинових та мускаринових рецепторів тубокурарину та атропіну відповідно. Спочатку були проведені дослідження кальцієвих транзієнтів, ініційованих дією на клітину АХ в присутності блокатору нАХ-рецепторів 50мкМ тубокурарину (рис.6).

Потім було проведено дослідження поведінки кальцієвих транзієнтів, викликаних дією на клітини АХ в присутності 5мкМ атропіну, блокатору мАХ-рецепторів (рис.7).

Нами також були показані суттєві відмінності дії цього блокатора на такі кальцієві сигнали в клітинах І та ІІ типу. При проведенні аналізу отриманих даних, було виявлено, що в присутності блокатору нікотинового типу рецепторів-тубокурарину амплітуда кальцієвого транзієнту, викликаного дією на клітину АХ, зменшилась на 806% в клітинах І типу та на 123% в клітинах ІІ типу, а при використанні блокатору мускаринового типу рецепторів-атропіну на 235% та 724% відповідно. Отже, на основі отриманих даних ми можемо стверджувати, що існує як мінімум дві популяції хромафінних клітин, які відрізняються кінетичними характеристиками кальцієвих транзієнтів при їх стимуляції 1мМ АХ. Проводячи паралелі літературними та даними, що ми отримали, ці відмінності можна пояснити функціональною гетерогенністю хромафінних клітин: одна популяція з яких має в основному іонотропні (нікотинові) рецептори, тоді як інша - метаботропні (мускаринові), що пов`язані з вивільненням кальцію з внутрішньоклітинних депо. Тому наступна серія наших експериментів була присвячена дослідженню ролі внутрішньоклітинних депо в формуванні кальцієвих сигналів, опосередкованих дією на хромафінну клітину АХ.

Дослідження ролі ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій в формуванні кальцієвих сигналів, викликаних дією ацетилхоліну на хромафінну клітину. Фармакологічним препаратом, який широко застосовується для вивчення функцій ендоплазматичного ретикулуму, являється кофеїн. Нами було показано, що в клітинах І типу не відбувається значних змін в амплітуді кальцієвого транзієнту викликаного дією на клітину 30мМ кофеїну після її послідовної стимуляції АХ. Амплітуда кальцієвого транзієнту до і після послідовної стимуляції ацетилхоліном становила F1/F2=0,450,04 та F1/F2=0,430,07 (n=22) відповідно. Але в клітинах ІІ типу при даному протоколі спостерігались значні зміни кінетики кальцієвого транзієнту викликаного дією 30мМ кофеїну (рис.8).

Спостерігаються суттєві відмінності амплітуди кальцієвого транзієнту, викликаного дією кофеїну, до і після послідовної стимуляції АХ (F1/F2=0,460,04 та F1/F2=0,130,05 (n=18) відповідно). Це може свідчити про участь депо ендоплазматичного ретикулуму в формування кальцієвого сигналу, опосередкованого дією АХ в клітинах ІІ типу. Відомо, що тапсігаргін-чутливі кальцієві АТФази відіграють головну роль в акумуляції іонів кальцію як в ІР3-чутливих, так і в кофеїн чутливих кальцієвих депо в хромафінних клітинах. Тому наступні наші досліди були направлені на вивчення поведінки кальцієвих сигналів клітин І та ІІ типу, викликаних дією АХ в присутності тапсігаргіну. В клітинах І типу було виявлено незначні зміни кінетики кальцієвого сигналу, опосередкованого дією на клітину АХ, в присутності 20нM тапсігаргіну порівняно з контрольним значенням. В клітинах ІІ типу спостерігалося значне затухання амплітуди кальцієвого транзієнту при тривалій аплікації 20нM тапсигаргіну (рис. 9)

Нами було відмічено значне пригнічення амплітуди АХ-активованого Ca2+-сигналу в клітинах ІІ типу в присутності 20 нМ тапсигаргіну. Ці дані свідчать, що ендоплазматичний ретикулум приймає участь у формуванні кальцієвого транзієнту, викликаного дією АХ в клітинах ІІ типу. Для підтвердження визначної ролі внутрішньоклітинних Ca2+-депо в формуванні кальцієвого транзієнту в клітинах ІІ типу були проведені експерименти із застосуванням безкальцієвого розчину. В клітинах І типу на фоні безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину відбувається досить значне пригнічення АХ-індукованого кальцієвого транзієнту. Спостерігаються відмінності амплітуди кальцієвого транзієнту в клітинах І типу при стимуляції клітини АХ в контролі та в безкальцієвому розчині. Так F1/F2=0,910,06 в контролі та F1/F2=0,190,09 (n=25) в безкальцієвому розчині. В клітинах ІІ типу ми спостерігали подібну поведінку кальцієвого транзієнту при послідовній стимуляції клітини АХ в контрольному та безкальцієвому розчині. Але при цьому спостерігалось порівняно з клітинами І типу зменшення амплітуди кальцієвого сигналу. Амплітуда кальцієвого транзієнту в клітинах ІІ типу при стимуляції клітини АХ в контролі та в безкальцієвому розчині становила F1/F2=0,920,07 та F1/F2=0,390,07(n=25) відповідно (рис.10).

Відомо, що активація мускаринових рецепторів в хромафінних клітинах ініціює велику кількість клітинних відповідей, найбільш важливими з яких є вивільнення іонів кальцію із депо ендоплазматичного ретикулуму. Тому проведені експерименти по вивченню ролі ендоплазматичного ретикулуму в формуванні кальцієвого транзієнту в клітинах І та ІІ типу ще раз підтверджують наше припущення про функціональну гетерогенність хромафінних клітин.

Як зазначалось вище, до складу внутрішньоклітинних кальцієвих депо, що здатні запасати іони кальцію входять мітохондрії. Наступним кроком було дослідження ролі мітохондрій у кальцієвому метаболізмі в цих двох типах клітин. Для визначення впливу мітохондрій на кальцієву сигналізацію використовувався розузгоджувач протонного градієнту на мембрані мітохондрій - СССР. Отримані дані свідчать про те, що мітохондрії відіграють однакову роль в поглинанні внутрішньоклітинного кальцію в клітинах І та ІІ типу. Статистичний аналіз не виявив суттєвих відмінностей в амплітудах кальцієвих транзієнтів отриманих при аплікації розчину, що містив 10мкМ СССР в клітинах І - F1/F2=0.980.12 (n=16) та ІІ типів - F1/F2=1.070.14 (n=15) (рис.11).

Самі мітохондрії можливо не відіграють суттєвої ролі в формуванні кальцієвого транзієнту при стимуляції хромафінної клітини щура АХ, але підтверджена їх значна роль (при детальному аналізі кінетики спаду кальцієвого сигналу було виявлено, що ці спади транзієнтів з достатньо високою імовірністю (р<0,0001) апроксимуються однією експонентою) в процесі виведення іонів кальцію з цитоплазми.

Ідентифікація норадреналін та адреналін- секретуючих хромафінних клітин наднирників щура. Наступний етап роботи був присвячений питанню чим обумовлена функціональна гетерогенність виявлених нами двох типів хромафінних клітин. Проводячи паралелі з результатами отриманими на основі гістологічних, морфологічних топографічних та тинкторіальних критеріїв, які виявили незаперечну присутність в медулі наднирника двох типів хромафінних клітин, що містять адреналін та норадреналін робиться припущення, що охарактеризовані нами І та ІІ тип клітин відрізняються вмістом катехоламінів. Для підтвердження даного припущення були проведені експерименти з використанням світлового цитохімічного методу диференційованого визначення вмісту катехоламінів мозкової речовини наднирника лабораторних тварин. Спочатку за допомогою флуоресцентного методу виявлялися клітини І та ІІ типу. Потім за допомогою цитохімічного методу було показано, що клітини І типу містять адреналін (вони забарвлювались в синьо-фіолетовий колір), а клітини ІІ типу містять норадреналін ( вони забарвлювались в зелений колір).

Обговорення результатів. Як відомо, секреція катехоламінів із хромафінних клітин викликається переважно за допомогою ацетилхоліну, що вивільняється із симпатичних прегангліонарних нервових волокон. Хромафінні клітини мають нікотинові та мускаринові ацетилхолінові рецептори. Активація кожного з них може викликати процес вивільнення катехоламінів. Існує досить суттєва різниця впливу цих типів АХ рецепторів на процес вивільнення катехоламінів в хромафінних клітинах. Імуноцитохімічні дослідження підтверджують існування двох різних популяцій хромафінних клітин: ті, що містять адреналін та що містять норадреналін. Очевидна наявність відмінностей в результатах досліджень по визначенню ефективності ініціації процесу екзоцитозу в хромафінних клітинах для різних типів каналів та ацетилхолінових рецепторів у різних піддослідних тварин, та існування суттєвої різниці в формуванні кальцієвих транзієнтів, викликаних дією агентів, що стимулюють секрецію, дала нам підстави провести детальний аналіз змін кальцієвої сигналізації в хромафінних клітинах щура при дії факторів, що стимулюють секрецію. В якості агентів стимулюючих секрецію використовувались: гіперкалієвий розчин, нікотин, мускарин, кофеїн та ацетилхолін. Виявлено, що кінетичні характеристики кальцієвих сигналів, отриманих в результаті дії цих агентів мають певні відмінності. Проведений статистичний аналіз показав суттєві відмінності в амплітудах та характеристичному часі спаду цих кальцієвих транзієнтів (рис.1). Оскільки процес вивільнення катехоламінів в хромафінних клітинах є кальційзалежним, відмінності в формуванні кальцієвих сигналів при дії різних агентів, що стимулюють секрецію може істотно впливати на цей процес, що і було показано в проведених експериментах по безпосередньому вимірюванню вивільнених хромафінною клітиною нейромедіаторів за допомогою електрохімічного методу (рис.2). Стимуляція клітини різними факторами, що індукують секрецію, приводить до помітних змін в частоті вивільнення нейромедіатора. Також є певні відмінності в кінетичних характеристиках (амплітудах) окремих секреторних подій. При детальному аналізі кальцієвих сигналів викликаних дією на клітину АХ було виявлено дві популяції клітинних відповідей (в клітинах І типу при послідовній стимуляції клітини АХ не відбувається значного зменшення амплітуди відповіді, а в клітинах ІІ типу при послідовній стимуляції спостерігається значне зменшення амплітуди кальцієвого сигналу, причому ця величина повертається до початкового значення після деполяризації клітини гіперкалієвим розчином) (рис.3). Насамперед було показано, що зменшення амплітуди кальцієвого транзієнту в клітинах ІІ типу може бути опосередковане спустошенням внутрішньоклітинних депо, а не внаслідок дисенситизації АХ рецепторів. Оскільки відомо, що саме активація АХ рецепторів мускаринового типу викликає вивільнення кальцію з внутрішньоклітинних депо, на відміну від активації АХ рецепторів нікотинового типу, ми робимо припущення про функціональну гетерогенність виявлених двох типів клітин. Для підтвердження даного припущення були зроблені наступні кроки. Спочатку, проводився порівняльний аналіз внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів, отриманих в клітинах І та ІІ типу при їх стимуляції нікотином (агоністом нікотинових АХ рецепторів) і мускарином (агоністом мускаринових АХ рецепторів) (рис.4-5). Показано, що амплітуди кальцієвих сигналів, отриманих при стимуляції нікотином значно більші в клітинах І, а при стимуляції мускарином в клітинах ІІ типу. Також спостерігалось подібне зменшення амплітуди кальцієвих транзієнтів викликаних послідовною дією АХ на клітини ІІ типу та ініційованих дією на хромафінні клітини мускарину. Це дає підстави говорити про переважну експресію нікотинових рецепторів в І типі та мускаринових рецепторів в ІІ типі хромафінних клітин. Потім, проводився порівняльний аналіз внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів, викликаних дією на клітину АХ з використанням специфічних блокаторів нікотинового та мускаринового типу АХ рецепторів тубокурарину та атропіну (рис.6-7). Виявлено, що в клітинах І типу присутність тубокурарину призводила до досить значного зменшення амплітуди кальцієвого транзієнту, опосередкованого дією АХ, а в випадку використання атропіну ми спостерігали порівняно невелике зменшення амплітуди. В клітинах ІІ типу все відбувалось навпаки - присутність атропіну призводила до значного зменшення амплітуди кальцієвого сигналу, викликаного дією на клітину АХ і не спостерігалось значних змін при використанні тубокурарину. Оскільки показано, що в хромафінних клітинах щура викликані нікотином вхідні струми пов`язані з зростанням внутрішньоклітинної концентрації кальцію в основному завдяки входу іонів кальцію через нікотинові рецептори, а короткотривала стимуляція мускаринових рецепторів призводить до мобілізації іонів кальцію з депо ендоплазматичного ретикулуму, були проведені дослідження ролі внутрішньоклітинних кальцієвих депо в формуванні кальцієвих сигналів, викликаних дією на хромафінну клітину АХ. Фармакологічним препаратом, який широко застосовується для вивчення функцій ендоплазматичного ретикулуму, являється кофеїн. Нами було показано, що в клітинах І типу не відбувається значних змін в амплітуді кальцієвого транзієнту, отриманого при дії на клітину 30мМ кофеїну після послідовної стимуляції АХ, тоді як в клітинах ІІ типу суттєво зменшувалась амплітуда такого кальцієвого транзієнту (рис.8). Відомо, що в ізольованих хромафінних клітинах і ІР3 і кофеїн ініціюють вивільнення іонів кальцію та наступний АТФ-залежний процес акумуляції іонів кальцію в ці депо. Ця акумуляція усувається дією тапсігаргіну. Таким чином, тапсігаргін-чутливі кальцієві АТФази відіграють головну роль в акумуляції іонів кальцію як в ІР3-чутливих, так і в кофеїн-чутливих кальцієвих депо в хромафінних клітинах. В проведених нами дослідженнях були виявлені суттєві відмінності в формуванні кальцієвих сигналів в клітинах І та ІІ типу при використанні тапсігаргіну (рис.9). В клітинах І типу спостерігалося незначні зміни кінетики індукованого АХ кальцієвого транзієнту в присутності тапсигаргіну. Це може свідчити про певну роль внутрішньоклітинних кальцієвих депо в процесі виведення вільних іонів кальцію з цитоплазми в цих клітинах. На противагу в клітинах ІІ типу спостерігалося значне затухання амплітуди кальцієвого транзієнту, опосередкованого дією на хромафінну клітину АХ, при тривалій аплікації тапсигаргіну. Припущення про домінантну роль кальцієвих депо в формуванні кальцієвого сигналу в клітинах ІІ типу також знайшло підтвердження в проведених експериментах з використанням безкальцієвого розчину (рис.10). В клітинах І типу на фоні безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину відбувається досить значне пригнічення АХ-індукованого кальцієвого транзієнту. В клітинах же ІІ типу ми спостерігали досить незначне, порівняно з клітинами І типу, зменшення амплітуди АХ-індукованого кальцієвого транзієнту. Ці дані добре корелюють з літературними даними, де показано, що в хромафінних клітинах морської свинки мускарин, нікотин і KCl призводять до швидкого зростання внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Однак в безкальцієвому розчині лише мускарин призводить до швидкоплинного зростання внутрішньоклітинної концентрації кальцію, що частково ігібується попередніми аплікаціями кофеїну або інкубуванням клітини в присутності ріанодину та кофеїну. Внутрішньоклітинна аплікація ІР3 призводить до транзієнтного зростання внутрішньоклітинної концентрації кальцію і інгібує наступну клітинну відповідь на мускарин, але не впливає на клітинні відповіді на нікотин та KCl. Стимуляція мускаринових рецепторів призводить не тільки до входження іонів кальцію ззовні, але також до мобілізації іонів кальцію із ІР3-чутливих депо. Сумуючи отримані дані можна говорити про справедливість нашого припущення відносно функціональної гетерогенності хромафінних клітин: одна популяція з яких має в основному іонотропні (нікотинові) рецептори (клітини І типу) , тоді як інша - метаботропні (мускаринові) рецептори (клітини ІІ типу). Однак постає питання: чим обумовлено зменшення амплітуди кальцієвого сигналу при дії на клітину ІІ типу кофеїну після послідовної стимуляції АХ (рис.8б), адже стимуляція мускаринових рецепторів призводить до мобілізації іонів кальцію саме із ІР3-чутливих депо. Останнім часом існує дуже багато експериментальних фактів, що свідчать про взаємний вплив ІР3- та кофеїн-чутливих депо ендоплазматичного ретикулуму. Так, показано, що в хромафінних клітинах кофеїн-чутливі та ІР3-чутливі депо ендоплазматичного ретикулуму просторово перекриваються між собою, при чому розмір першого типу депо більший ніж розмір другого. В інших роблять припущення, що в хромафінних клітинах щура в загальному депо ендоплазматичного ретикулуму присутні як ІР3, так і ріанодинові-рецептори, і менша ефективність індукування процесу секреції за допомогою кофеїну може бути викликана внаслідок швидкого зменшення активності ріанодинових каналів. Більш того виявлено, що в хромафінних клітинах морської свинки ІР3-чутливі депо можна функціонально розділити на дві субпопуляції: чутливі та нечутливі до кофеїну, що частково ігібується попередніми аплікаціями кофеїну або інкубуванням клітини в присутності ріанодіну та кофеїну. Наступна експериментальна робота була присвячена дослідженню ролі мітохондрій в формуванні кальцієвих сигналів, викликаних дією ацетилхоліну на хромафінну клітину. Проведені експерименти виявили, що самі мітохондрії можливо не відіграють домінантної ролі в формуванні кальцієвого транзієнту при стимуляції ацетилхолінових рецепторів хромафінної клітини щура, але підтвердили їх значну роль (при детальному аналізі кінетики спаду кальцієвого сигналу було виявлено, що спад з достатньо високою імовірністю (р<0,0001) апроксимуються однією експонентою) в процесі виведення іонів кальцію з цитоплазми хромафінної клітини щура (рис.11). Ці результати добре узгоджуються з недавно отриманими даними в яких показано, що мітохондрії в хромафінних клітинах здатні акумулювати дуже високі рівні концентрації кальцію (порядку декількох мМ) протягом стимуляції, і така здатність запасати кальцій може помітно регулювати процес вивільнення катехоламінів.

Підводячи підсумок проведеної нами роботи можемо відмітити, що в хромафінних клітинах щура, які ми поділили на два типи переважають клітини І типу (приблизно 70%), в яких існує переважна експресія нікотинових рецепторів. Але слід відмітити, що в деяких випадках спостерігалось групування цих типів клітин. Так як для отримання свіжоізольованих хромафінних клітин ми використовували невелику область медулярної частини наднирника іноді отримували переважно клітини ІІ типу. Це може свідчити про різне розташування хромафінних клітин І та ІІ типу в медулярній частині наднирника щура і можливо різну їх функціональну роль. Також слід відмітити, що між клітинами І та ІІ типу не спостерігалось певних візуальних відмінностей. Різниця в розподілі типів АХ рецепторів може свідчити про функціональні відмінності цих клітин в роботі наднирника щура. Постає питання чим саме обумовлена функціональна гетерогенність виявлених нами двох типів хромафінних клітин. Відомо, що по відношенню до наднирників щура, на даний період часу, належність двох типів клітин, що містять адреналін та норадреналін є загальноприйнятою. В наднирниках дорослих мишей та щурів кількість клітин, що містять адреналін перевищує кількість тих, що містять норадреналін і при розрахунку на хромафінну тканину складає 62-84% та 16-38% відповідно. Ці результати добре узгоджуються з отриманим нами співвідношенням між клітинами І та ІІ типу. Проведені нами експерименти з використанням світлового цитохімічного методу виявили, що клітини І типу містять адреналін (вони забарвлювались в синій колір), а клітини ІІ типу містять норадреналін ( вони забарвлювались в зелений колір) (рис.12). Отримані результати дають змогу стверджувати, що ідентифіковані нами два типи хромафінних клітин відрізняються вмістом катехоламінів. Так хромафінні клітини І типу, що мають переважну експресію нікотинових рецепторів містять адреналін, а клітини ІІ типу, що мають переважну експресію мускаринових рецепторів містять норадреналін.

ВИСНОВКИ

За допомогою флуоресцентного методу з використанням зонду fura-2 нами було показано, що існують відмінності в формуванні кальцієвих сигналів, викликаних дією на хромафінну клітину щура факторів, що стимулюють секрецію. Показано, що ці відмінності можуть істотно впливати на процес вивільнення катехоламінів в хромафінних клітинах.

Ідентифіковано дві різних популяції клітинних Ca2+ відповідей викликаних дією ацетилхоліну, що може свідчити про функціональну гетерогенність хромафінних клітин.

Охарактеризовано й показано подібність кінетичних характеристик викликаних ацетилхоліном внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів в клітинах І типу до транзієнтів, ініційованих нікотином, що свідчить про переважну експресію нікотинових рецепторів в даному типі клітин.

Виявлено подібність кінетичних характеристик викликаних ацетилхоліном внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів в клітинах ІІ типу до транзієнтів, ініційованих мускарином, що свідчить про переважну експресію мускаринових рецепторів в даному типі клітин.

Показано суттєві відмінності дії специфічних блокаторів АХ рецепторів - тубокурарину та атропіну на кальцієві сигнали при стимуляції АХ в клітинах І та ІІ типу. Отримані дані дають підстави стверджувати, що в ідентифікованих нами двох типах хромафінних клітин існує функціональний поділ: одна популяція з яких має в основному іонотропні (нікотинові) рецептори, тоді як інша - метаботропні (мускаринові).

Виявлено, що в клітинах ІІ типу в процесі генерації кальцієвих транзієнтів при стимуляції ацетилхоліном приймають участь внутрішньоклітинні джерела іонів кальцію.

Виявлено, що мітохондрії в гостроізольованих хромафінних клітинах здатні акумулювати дуже високі рівні концентрації кальцію.

Показано, що в хромафінних клітинах щура І та ІІ типу відмінності в формуванні кальцієвих сигналів, викликаних дією ацетилхоліну, пов`язані з різним розподілом типів АХ рецепторів в цих клітинах і свідчить про їх різну функціональну роль. Виявлено, що хромафінні клітини ідентифіковані нами, як клітини І типу, що мають переважну експресію нікотинових рецепторів містять адреналін, а клітини ІІ типу, що мають переважну експресію мускаринових рецепторів містять норадреналін.

Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації

1. Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Lukyanetz E.A. Comparative characteristics of secretory responses of chromaffin cells and pheochromocytoma cells (PC12) during their activation by acetylcholine. Нейрофізіологія 2000, т. 32, №3, ст. 215-217.

2. Заика О.Л., Починюк О.Н., Лукьянец Е.А. Электрохимические исследования индуцируемой секреции катехоламинов из одиночних везикул хромафинных клеток крысы. Український біохімічний журнал 2001, т.73, №4, ст. 69-72

3. Pochynyuk O.M., Zaika O.L., Lukyanetz E.A. The role of mitochondria in generation of acetylcholine-induced calcium transients in rat chromaffin cells. Нейрофізіологія 2002, т.34, № 2/3, ст. 217-219.

4. Kostyuk P.G., Pochynyuk O.M., Zaika O.L. and Lukyanetz E.A. Roles of nicotinic and muscarinic receptors in calcium signaling and transmitter release. Нейрофізіологія 2003, т.35, №3/4, ст. 229-235.

Тези доповідей.

1. Lukyanetz E.A., Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Kostyuk P.G. Two classes of vesicles participate in induced exocytosis from isolated rat chromaffin cells. J. Physiol. 2001, 231P, 162P.

2. Pochynyuk O.M., Zaika O.L., Lukyanetz E.A. Amperometrical studies of secretory responses of rat chromaffin cells induced by acetylcholine receptor agonists. Arch.Сlin.Exp.Medicine. 2001, 10(2), p.206.

3. Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Lukyanetz E.A. Altering of kinetics of neurotransmitter release measured by amperometry during different types of stimulation in rat chromaffin cells. Sulejow, 2001, P23.

4. Lukyanetz E.A., Pochynyuk O.M., Zaika O.L. Amperometric evidence about participation of several types of vesicles in exocytosis from chromaffin cells. J. Physiology (Paris), 2002 96, p.147-148.

5. Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Lukyanetz E.A. Investigation of calcium transients induced by acetylcholine in isolated chromaffin cells of rat. Fiziol Zh. 2002, 48(2), p.5-6.

6. Zaika O.L., Pochynyuk O., Lukyanetz E. Comparative studies of calcium transients induced by acetylcholine in rat chromaffin cells. Neurophysiology 2002, 34, No 2/3, p. 270-272.

Анотації

Заїка О.Л. Кальцієва сигналізація в хромафінних клітинах щура при дії факторів, що стимулюють секрецію. - Рукопис.