Мембранні та клітинні механіми дії імуноактивних речовин на електрогенез та скорочення гладеньких м'язів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 577.353.(043)

МЕМБРАННІ ТА КЛІТИННІ МЕХАНІМИ ДІЇ

ІМУНОАКТИВНИХ РЕЧОВИН

НА ЕЛЕКТРОГЕНЕЗ ТА СКОРОЧЕННЯ

ГЛАДЕНЬКИХ М'ЯЗІВ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Давидовська Тамара Леонідівна

КИЇВ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор, академік НАН України Шуба Михайло Федорович, професор кафедри біофізики Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук. професор Матишевська Ольга Павлівна професор кафедри біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка

доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України Веселовський Микола Сергійович заступник директора Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України

доктор медичних наук, професор, член-кор. АПН України Шевчук Віктор Григорович завідувач кафедри нормальної фізіології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця

Провідна установа - Львівський національний університет імені Івана Франка, м. Львів

Захист відбудеться "24" грудня 2003 року о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, проспект акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215)

Поштова адреса: 01033, м. Київ - 33, вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, м. Київ - 33, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий "24" листопада 2003 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Актуальною проблемою фізіології, фармакології та біофізики гладеньких м'язів (ГМ) є з'ясування механізмів скорочення-розслаблення, що визначають функціональну активність вісцеральних органів. Беручи до уваги те, що стінка кишечнику пронизана не тільки судинами та нейронами вегетативної нервової системи (ВНС), але й розгалуженою лімфатичною тканиною, що огортає м'язовий шар, проникаючи в нього і формуючи полігональну сітку зі складними функціональними зв'язками [Aminova, 2000], стає очевидним, що запуск або регуляцію реакцій ГМ нейромедіаторами ВНС не можна уявити в повній мірі, не враховуючи також можливого модулюючого контролю механізмів збудження та гальмування біологічно активними речовинами, що продукуються лейкоцитами у відповідь на дію антигенів різного походження, у тому числі - бактеріального. До таких відноситься [Lawrence, 1949; Burger et al., 1983; Голєва з співавт., 1996; Любченко, 1999] унікальна за своїми імуно-біологічними властивостями низькомолекулярна субстанція олігорибонуклеопептидної природи, яка отримала назву фактор переносу (ФП) (Transfer factor) до антигенів золотистого стафілокока, механізми участі якої у регуляції скорочення-розслаблення ГМ шлунково-кишкового тракту (ШКТ) залишаються невідомими.

Не дослідженою, але вкрай актуальною є проблема модуляції регуляторних механізмів скорочення-розслаблення гладеньких м'язів ШКТ не тільки фактором переносу, що індукується Staphylococcus aureus, але і його субстанціями та токсинами, які також з'являються у місці контакту цих бактерій з ГМ [Смирнов з співавт., 1988; Franklin, Lowy, 1998; Позднеев, 2001]. Це важливо, оскільки вони є з високою летальністю небезпечними для життя людини патогенами, що викликають ентероколіти, холецистити, перитоніти та інш., а причиною їх прискореного останнім часом поширення та зумовлених ними інфекцій є, з одного боку, поява нових стійких до антибіотиків форм, а з іншого - що їх основним джерелом є безпосередньо носії стафілокока (здебільшого медичний персонал, хворі з різними запальними інфекційними процесами та зниженою імуно-біологічною реактивністю) [Franklin, Lowy, 1998]. Актуальними видаються також дослідження змін скорочувальної функції таких потенційних резервуарів патогенного стафілокока як матка та кровоносні судини, наслідком враження яких є відповідно: постабортивний сепсис та зміни гемодинаміки судин [Позднеев, 2001].

Значний науковий інтерес має питання щодо участі в механізмах збудження та гальмування ГМ шлунково-кишкового тракту простагландинів групи Е - макрофагального походження провідних факторів імуногенезу, що утворюються у відповідь на дію антигенів, в т.ч. золотистого стафілокока. Ці речовини здатні, підсилюючи синтез інтерлейкіну 1- важливого чинника запуску практично всіх імунних реакцій, включати імунокомпетентні клітини лімфоїдного походження у процес імуногенезу [Громыхина, 1992; Громыхина, Козлов, 1996; Чопяк, 1997]. У роботі була приділена також увага дослідженню модуляції зазначених вище механізмів такими імуноактивними речовинами як брадикінін (БК) та рослинного походження похідними поліфенолів - флавоноїдами. Останні широко використовуються в антибактеріальній терапії захворювань, зумовлених інфікуванням організму метицилін - стійкими бактеріями золотистого стафілокока [Максютіна, 1998; Alcaraz et al., 2000; Saponara, 2002].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукових програм кафедри біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка: “Вивчення клітинних та молекулярних механізмів активації скорочення-розслаблення гладеньких м'язів”, (1983-1990), номер держреєстрації (N/p) 0186U0061341; “Клітинні та молекулярні механізми електрогенезу і скорочення м'язів” (1991-1993), N/p 0294U000057; “Регуляція та механіка скорочення гладеньких м'язів” (1994-1996), N/p 0297U000688; “Мембранні та молекулярні механізми регуляції скорочення м'язової клітини” (1997-2000), N/p 0197U003200; “Дослідження структурно-функціонального стану та розробка методів оцінки та корекції м'язової та серцево-судинної системи людини в нормі та патології” (2000-2001), N/p 0100U003944; “Дослідження та моделювання молекулярних і клітинних процесів у збудливих біологічних системах” (2001- 2005), N/p 0101U001967; “Механізми модулюючої дії субстанцій стафілокока на електричні та механічні властивості м'язової клітини” (1993-1994), N/p 0196U007737 та наукова тема “Вивчення клітинних та молекулярних механізмів дії активних субстанцій (білка А та пептидоглікану) стафілокока на гладенькі м'язи” (1998-1999), N/p 0198U007728 виконані на замовлення Державного комітету з питань науки і технологій України .

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було дослідити мембранні та клітинні механізми дії імуноактивних речовин на електричну та скорочувальну активність гладеньких м'язів шлунково-кишкового тракту, міометрія, а також на базальний та викликаний тонус стінки кровоносних судин. У відповідності з метою досліджувались такі конкретні питання:

1. Дослідити механізми напруження скінованих кільцевих гладеньких м'язів сліпої кишки.

2. Дослідити механізми дії фактора переносу імунної реактивності до корпускулярних антигенів золотистого стафілокока на спонтанну електричну та скорочувальну активність, а також на збуджувальну (ацетилхолін (АХ)) та гальмівну (аденозин-5'-трифосфат (АТФ)), оксид азоту, норадреналін (НА)) дію нейромедіаторів на ГМ.

3. Дослідити модулюючу дію пептидоглікану (ПГ), очищеного білка А (БА) золотистого стафілокока та стандартного стафілококового токсину на спонтанну, викликану гіперкалієвою деполяризацією і дією нейромедіаторів скорочувальну активність гладеньких м'язів.

4. Дослідити дію ПГ та БА золотистого стафілокока на базальний тонус ізольованих смужок судин еластичного (грудний відділ та дуга аорти, легенева артерія) та м'язового (мезентеріальна та хвостова артерії), а також на збуджувальну дію АХ, НА і серотоніну на ці смужки.

5. Дослідити методом “patch-clamp” дію БА золотистого стафілокока на потенціалкерований кальцієвій струм мембрани гладеньком'язових клітин (ГМК) taenia coli та на електричні параметри штучних бімолекулярних ліпідних мембран (БЛМ).

6. Дослідити дію пептидоглікану та БА золотистого стафілокока на АТФ-азну активність актоміозину та міозину ГМ шлунково-кишкового тракту.

7. Дослідити дію простагландинів (ПРГ) групи Е, брадикініну та флавоноїдів на спонтанну електричну активність, іонну провідність плазматичної мембрани, а також на синаптичну передачу збудження та гальмування в ГМ.

8. З'ясувати здатність простагландинів змінювати електричні параметри штучних БЛМ.

Об'єкт досліджень - ізольовані гладеньком'язові смужки (ГМС) і поодинокі ізольовані ГМК шлунково-кишкового тракта та препарати з судин морських свинок і щурів, а також штучні лецитин-холестеринові БЛМ.

Предмет досліджень - модуляція імуноактивними субстанціями процесів збудження, гальмування і скорочення-розслаблення ГМ шлунково-кишкового тракту, а також неактоміозинового компонента в механізмі напруження стінки кровоносних судин.

Для досягнення поставленої мети були застосовані такі методи досліджень:

1. Модифікований метод одинарного сахарозного містка, що дозволяє одночасно досліджувати електричну та скорочувальну активності мультиклітинних ізольованих препаратів; 2. Тензометричний метод дослідження механічної напруги ізольованих тонких гладеньком'язових смужок; 3. “Рatch-clаmp” метод дослідження трансмембранних іонних струмів ізольованих поодиноких гладеньком'язових клітин (ГМК); 4. Метод визначення АТФ-азної активності актоміозину та міозину ГМ; 5. Метод дослідження електричних властивостей штучних БЛМ.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що унікальна за своїми імуно-біологічними властивостями низькомолекулярна субстанція діалізату лейкоцитів - фактор переносу імунної реактивності до корпускулярних антигенів золотистого стафілокока штаму Cowan 1 (2352) є також ефективним неімунної дії чинником модуляції регуляторних механізмів збудження та гальмування ГМ травного тракту. Концептуально сформульовано принципи, за якими здійснюється ця трансформація. В основі посилення фактором переносу ацетилхолінового збудження ГМ лежить збільшення рецепторкерованого надходження до ГМК через Са²⁺ канали L-типу. Одночасно ФП пригнічує вивільнення Са²⁺ з ріанодин- та ІР₃-чутливого депо саркоплазматичного ретикулума (СР).

ФП також трансформує пригнічувальний вплив NО на АХ збудження в гладеньких м'язах в активуючий. Одначе пригнічувальна дія оксиду азоту на ці ГМ виявилась нечутливою до дії ФП. Нечутливими до дії цієї субстанції в ГМ є також гальмівні ефекти, викликані активацією б- і в-адренорецепторів. Нарешті, ФП трансформує гальмівну дію екзогенного АТФ у збуджувальну (замість гіперполяризації ПМ ГМК виникає їх деполяризація), а також блокує АТФ-зумовлений компонент гальмівних синаптичних потенціалів (ГСП).

Вперше проведено дослідження модулюючої дії провідних факторів патогенності золотистого стафілокока: пептидоглікану (штам St. aureus 2887), очищеного білка А (штам Cowan 1 (2352)), стандартного стафілококового токсину (штам Wood 46) з Lh 0,18 на скорочення-розслаблення вісцеральних ГМ та запропонована концепція механізмів їх дії. Пептидоглікан та білок А пригнічують збуджувальну дію ацетилхоліну на ГМ міометрія і сліпої кишки (БА) за принципом неконкурентного інгібування, в основі якого лежить активація Са²⁺ залежних К⁺ каналів великої провідності плазматичної мембрани ГМК. Центральною ланкою в ланцюгу цих подій є підвищення [] за рахунок підсилення надходження їх до ГМК через потенціалкеровані Са²⁺ канали (ПККК) L-типу, а в ГМК t. coli - також за рахунок вивільнення Са²⁺ з ІР₃-чутливого депо. В ГМК міометрія механізми вивільнення іонів Са²⁺ з ІР₃-чутливого депо СР нечутливі до дії БА та ПГ. БА та ПГ не здатні формувати специфічні канальні структури за типом відомих моделей іонних каналів. БА модифікує БЛМ, вірогідно, за принципом “дефектного” механізму. Здатність ПГ збільшувати збуджувальну дію ацетилхоліну в ГМ кишечника пов'язана з активацією ним провідності плазматичної мембрани до Са²⁺, що надходять у міоплазму через ПККК L-типу, а також механізмів вивільнення Са²⁺ з ІР₃- і ріанодинчутливого депо СР.

Вперше методом “patch-clаmp” показана потенціююча дія білка А на кальцієвий струм мембрани ГМК t. coli.

Вперше доведено, що білок А на відміну від пептидоглікану в концентраціях 10^-3 мг/мл та вище підсилює Са²⁺, Mg²⁺- АТФ-азну активність актоміозину ГМ.

Встановлено, що стандартний стафілококовий токсин в залежності від ступеня його розведення збільшує або зменшує І_Са L-типу Са²⁺ каналів, пригнічує вивільнення Са²⁺ з ріанодинчутливого депо СР, блокує проведення сигналу агоніста по електро- та фармакомеханічному шляхах від М₂ та М₃ холінорецепторів до скорочувального апарата (СА) ГМК.

Вперше показана провідна роль міжклітинного матриксу стінки аорти, що забезпечує її неактоміозинове механічне напруження у пригнічувальному ефекті пептидоглікану на базальний тонус цих судин. У той же час білок А та пептидоглікан не впливають на судинні ГМ м'язового, а перший - також на ГМ еластичного типу.

Вперше доведено, що простагландини групи Е, брадикінін та рослинного походження флавоноїди (кверцетин, рутин) є не тільки модуляторами імунної системи, але й синаптичної передачі неадренергічного нехолінергічного (НАНХ) синаптичного гальмування та холінергічного збудження ГМ шлунково-кишкового тракту.

Встановлено, що простагландини групи Е індукують флуктуації електричної провідності штучних БЛМ за канальним механізмом, а також модулюють граміцидин Д індуковану канальну провідність.

На скінованих сапоніном кільцевих ГМ сліпої кишки вперше визначені концентрації Са²⁺, в межах яких відбувається розвиток активного напруження СА. Доведено, що в обмеженні його рівня як “зверху”, так і “знизу” задіяні механізми транспорту Са²⁺ з внутрішньоклітинних депо цих катіонів. Показана роль Са²⁺-зв'язуючого білка кальмодуліну у розвитку механічного напруження скінованих ГМ, видалення якого практично унеможливлює його розвиток. Доведено, що цАМФ може не тільки знижувати чутливість СА до Са²⁺, але й активувати механізми накопичення цих катіонів ріанодинчутливим депо СР, а при певних концентраціях індукувати вивільнення цих катіонів з мітохондрій.

Наукова новизна досліджень щодо з'ясування механізмів неімунної дії імуноактивної субстанції - фактора переносу, індукованого корпускулярними антигенами золотистого стафілокока була відмічена дипломом ХІ Міжнародного конгресу “Transfer factor” у 1999 р. в м. Мехіко (Мексика).

Практичне значення одержаних результатів. Дана робота в основному носить експериментально-теоретичний характер. Отримані результати значно поглиблюють та розширюють уявлення про фізіолого-біофізичні механізми функціонування вісцеральних ГМ, дію на них активних субстанцій Staphylococcus aureus та стандартного стафілококового токсину, що крім загальнобіологічного значення може скласти основу імунокоректної терапії патологій вісцеральних ГМ, пов'язаних з інфікуванням цими бактеріями.

Встановлену модуляторну дію фактора переносу імунної реактивності до корпускулярних антигенів золотистого стафілокока трансформувати НАНХ гальмування у збудження, а також усувати гальмівну дію NO на холінергічне збудження в ГМ кишечника варто врахувати при розробці нормативних документів щодо впровадження в практику для імунізації та створення превентивного протистафілококового імунітету препаратів деяких субстанцій цього антигену.

Виявлений універсальний механізм дії досліджених бактеріальних субстанцій та фактора переносу - це активація ними потенціал-, та рецепторкерованого входу Са²⁺ в ГМК вісцеральних ГМ, а також встановлена властивість ПГ модулювати неактоміозинове механічне напруження судинних стінок може скласти основу для розробки фармакологічних препаратів селективної дії для попередження розвитку патологічних станів організму, зумовлених його інфікуванням бактеріями золотистого стафілокока.

Матеріали дисертації використовуються в навчальному процесі з нормати-вного курсу “Біофізика”, спецкурсів: “Електробіофізика”, “Біофізика сенсорних систем” для студентів кафедри біофізики та в навчальному процесі кафедри фізіології людини і тварин біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у спецкурсі: “Фізіологія травлення”.

Матеріали дисертації увійшли в навчальні посібники для студентів біологічних факультетів вищих навчальних закладів: “Біофізичні методи досліджень”, УМКВО, Київ, 1990; “Електробіофізика”, ФСЦ, Київ, 2002; “Загальний практикум з біофізики”, УМК ВО, Київ, 2002, співавтором яких є здобувач.

Особистий внесок здобувача. При виконані роботи здобувачем самостійно було проведено теоретичні пошуки та започатковано на кафедрі біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка в рамках наукових програм нові напрямки досліджень: “Біофізичні механізми неімунної дії на збудливі клітини речовин бактеріального та рослинного походження”, “Скіновані гладенькі м'язи. Регуляторні механізми напруження”. Автором здійснено монтаж експериментальних установок, розробку схем та проведення переважної більшості експериментів, поданих в даній роботі, їх статистичну обробку, аналіз, узагальнення, висновки, підготовку до друку наукових статей, розробку концепції дисертаційного дослідження. Отримані здобувачем результати експериментальних досліджень скорочення-розсла-блення ГМ, модифікованих імуноактивними речовинами, склали основу для розробки у співпраці з д.б.н., проф., чл.-кор. НАН України Костеріним С.О. (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України) феноменологічної моделі цих процесів. Деякі експерименти було проведено спільно з іншими дослідниками: з приблизно однаковим внеском: дослідження дії субстанції St. aureus на скорочення ГМ міометрія, стінки судин, іонні струми мембрани ГМК - з м.н.сп. Філіпповим І.Б. (Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України); на АТФ-азну активність скорочувальних білків, пептидоглікану - на скорочення t.coli - з к.б.н. Цимбалюк О.В.

Фактор переносу імунної реактивності до корпускулярних антигенів St. aureus, його субстанції отримано на кафедрі мікробіології та загальної імунології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка зав. кафедри д.б.н., проф. Позуром В.К, д.б.н., проф. Холодною Л.С., к.б.н. Любченком Т.А., к.б.н. Голєвою О.Г. та люб'язно надано здобувачу для досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені на семінарах спільних засідань кафедри біофізики біологічного факультету та відділу біофізики Інституту фізіології імені Петра Богача Київського національного університету імені Тараса Шевченка, кафедрі біофізики математико-фізичного факультету університету ім. Я. Каменського (Братислава), Інституту експериментальної фармакології Академії наук Словаччини (Братислава), ІІІ Всесоюзній міжуніверситетській конференції з фізико-хімічної біології (Тбілісі, 1982), ІІ науковій конференції з молекулярних механізмів та енергетики рухомості (Братислава, 1985), ХІІ з'їзді Українського фізіологічного товариства ім. І.П. Павлова (Львів, 1986), V міжнародному симпозіумі “Фізіологія і фармакологія гладеньких м'язів” (Варна, 1988), XIII з'їзді Українського фізіологічного товариства ім. І.П. Павлова (Харків, 1990), І, ІІ, ІІІ-му з'їздах Українського біофізичного товариства (Київ 1994, Харків 1998, Львів 2002), І конгресі Європейського фізіологічного товариства (Маастріхт, 1995), ХІІІ Міжнародному конгресі з фармакології (Мюнхен, 1998), XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998), ХІ Міжнародному конгресі по фактору переносу (Мехіко, 1999), VІ та VII-ій конференціях з інформотерапії (Київ, 2001, 2002), І конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2001), ІІІ школі Федерації Європейської фармакологічної асоціації (Леон, 2001), Міжнародній конференції, присвяченій 75-річчю зі дня народження А.М. Уголева (Санкт-Петербург, 2001), Міжнародній конференції з нових технологій отримання та застосування активних речовин (Алушта, 2002), XVI з'їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002), Всеукраїнській науковій конференції, присвяченої 160-річчю кафедри фізіології людини і тварин Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, 2002), а також на спільному засіданні кафедри біофізики та фізіології людини і тварин біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у лютому 2003 року.

Основні результати досліджень здобувача були відмічені грантом NAPL 064024 фонду “Відродження” в рамках Міжнародної науково-освітньої програми в галузі точних наук.

Публікації. Результати досліджень опубліковано в 45 наукових працях, в тому числі 25 статтях у фахових наукових журналах і у 20 тезах вітчизняних та міжнародних наукових конференцій, конгресів і симпозіумів.

Структура і обсяг роботи. Робота викладена на 343 сторінках машинописного тексту, і складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел із 453 найменувань, містить 2 таблиці та ілюстрована 92 рисунками.

мембранний клітинний імуноактивний м'я

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

Методом одинарного сахарозного містка у модифікації Артеменка з співавт. (1982) досліджували зміни мембранного потенціалу спокою, спонтанної електричної та скорочувальної активності, електротонічних, збуджувальних та НАНХ гальмівних синаптичних потенціалів ГМ шлунково-кишкового тракта морських свинок. Нормальний розчин Кребса (НРК) був такого складу (у мМ/л): NaCl - 120,4; NaHCO₃ - 15,5; NaH₂PO₄ - 1,2; KCl - 5,9; CaCl₂ - 2,5; MgCl₂ - 1,2; глюкоза - 11,5; рН 7,4. Гіперкалієвий розчин Кребса готували шляхом заміни іонами К⁺ еквімолярної кількості іонів Na⁺. Номінально безкальцієвий розчин Кребса (НБР) містив еквімолярну кількість MgCl₂ замість CaCl₂.

Каналоформуючі властивості бактеріальних субстанцій та простагландинів досліджувались з застосуванням методики реєстрації електричної провідності штучних БЛМ, сформованих за методом Мюллера (1962) з розчину яєчного лецитину у суміші з холестерином або азолектину.

Методом “patch-clamp” у конфігурації “whole-cell” (Hamill, 1981) досліджувались потенціалзалежні кальцієві струми Са²⁺-каналів L-типу ізольованих ГМК t. coli, які отримували шляхом ферментативно-механічної ізоляції в НБР, що містив колагеназу (тип ХІ) (0,2 %) та бичачий сироватковий альбумін (0,3 %). Ферментативно оброблену (температура 34^о С, тривалість 30-40 хв.) тканину пропускали через отвір пастерівської піпетки. Піпетки з м'якого молібденового скла, що застосовувались для відведення І_Са, мали діаметр 1-2 мкм та опір 2-5 МОм. Зовнішній розчин мав такий склад (мМ/л): NaCl - 135; CsCl - 6; CaCl₂ - 2,5; MgCl₂ - 1,2; ТЕА - 5; d-глюкоза - 5; HEPES - 10; рН 7,4. Піпетковий розчин містив (мМ/л): CsCl - 140; MgSO₄ - 2; Na₂АТФ - 2; Na₂ГТФ - 0,5; ЕГТА - 0,5; HEPES - 10; рН 7,3 (CsОН). Реєстрація іонних струмів проводилась за допомогою підсилювача PATCH-CLAMP L/M ЕРС-5. Сигнал з виходу перетворювача струм-напруга надходив через фільтр низьких частот (частота зрізу 1 кГц) на аналогово-цифровий перетворювач Digiolata-1200 і далі - в комп'ютер ІВМ РС/АТ. Дані аналізувались за допомогою програми “pClamp 6.01” та “MicroCaL Origin 5 або 6.1”.

Скінування сапоніном (40-60 мкг/мл) міоцитів ГМС (150-250 мкм) кільцевих ГМ сліпої кишки морських свинок здійснювали за методом Saida (1982) у релаксуючому розчині (мМ/л): К⁺ пропіонат - 130; MgСl₂ - 4; АТФ - 4; ЕГТА - 2; АТФ-регенеруюча система (креатинфосфат динатрієва сіль - 10; креатинфосфокіназа - 10 Од/мл); рН 6,8. На ГМС накладали лігатури - затискачі. Для реєстрації скорочень препаратів використовували електромеханічний перетворювач 6МХ-1С, сигнал з якого подавався на вхід підсилювача і далі - на реєструючий пристрій (КСП-4). Концентрацію вільних іонів Са²⁺ в активуючому розчині розраховували за допомогою машинної програми “Maxchel” або “EQCAL”.

Дослідження механічних властивостей судинних препаратів щурів проводили з використанням методики реєстрації їх генеруючої напруги (Dobrin, 1978). Для дослідження механічних характеристик міжклітинного матриксу судинні смужки обробляли денативуючим розчином такого складу (у мМ/л): ЕГТА - 30; йодацетат - 2; 2,4-динітрофенол - 2; кофеїн - 20. Розчин не містив іонів Са²⁺, Mg²⁺, глюкозу (Сох, 1984).

В інкубаційному середовищі ((мМ/л): MgCl₂ - 5; СаCl₂ - 0,1) з низькою іонною силою (додавання 0,08 мМ/л КCl) на основі імідазольного буферу визначали АТФ-азну активність актоміозину ГМ шлунку свині. В інкубаційному середовищі з високою іонною силою (0,5 мМ/л КCl) в присутності 5 мМ/л СаCl₂ визначалась АТФ-азна активність міозину цих м'язів. Результати статистичного аналізу експериментальних даних представлені в роботі як середнє арифметичне () стандартна похибка середнього арифметичного (s_x) для певної кількості вимірів. Для порівняльної оцінки середніх величин (контролю та тестових вимірів) застосовували закон t-розподілу. Розходження приймали за достовірні при р0,05. В роботі використовували комп'ютерну версію методів варіаційної статистики з оцінкою величини t-критерія Стьюдента (програмне забезпечення MicroCel Origin 5 або 6 (MicroCel Software, Inc., Норсхемптон, США)).

Результати досліджень та їх обговорення

Дія фактора переносу імунної реактивності до корпускулярних антигенів золотистого стафілокока на регуляторні механізми скорочення гладеньких м'язів. Встановлено, що ФП не тільки унікальна за своїми імуно-біологічними властивостями субстанція, але й ефективний модулятор електричної та скорочувальної активності ГМ t. сoli. ФП (10^-6-10^-3 мг/мл) здатний збільшувати амплітуду та частоту поодиноких спонтанних скорочень, які при деяких концентраціях ФП утворюють суцільний тетанус. Ці зміни скорочення супроводжуються деполяризацією ГМК. Додавання за даних умов до НРК блокатора ПКК L-типу ніфедипіну розслаблює ГМС до вихідного рівня.

Кумулятивна дія ФП (510^-5-10^-2 мг/мл) на скорочення, викликані гіперкалієвою (90 мМ/л) деполяризацією ГМК в присутності фентоламіну (10^-6 М/л), пропранололу (10^-6 М/л), атропіну (10^-6 М/л) супроводжується збільшенням як фазного, так і тонічного їх компонентів. Ніфедипін (10^-6 М/л), зменшує амплітуду цих скорочень. Враховуючи те, що вхід через відкриті гіперкалієвою деполяризацією ПКК L-типу ПМ ГМК активує механізм Са²⁺-індукованого вивільнення Са²⁺ (КІВК) з ріанодинчутливого депо, досліджували дію ФП на кофеїн (20 мМ/л) викликані скорочення ГМС в номінально безкальцієвому розчині Кребса. Встановлено, що ФП в концентраціях 10^-6-10^-4 мг/мл збільшує, а при 10^-3 мг/мл - зменшує (на 48,71,3 %, р0,05) ці відповіді. Показано, що ФП посилює також ацетилхолінове (10^-5 М/л) скорочення ГМ t. coli . Але в номінально безкальцієвому розчині Кребса ФП (10^-6-10^-3 мг/мл) статистично достовірно зменшує амплітуду цих скорочень.

Відомо [Жолос, 1998; Шуба, 2002], що в ГМ кишечника холінергічне збудження та скорочення супроводжується не тільки вивільненням Са²⁺ з ІР₃-чутливого депо СР, але й входом екзогенного Са²⁺ до ГМК через ПККК L-типу внаслідок їх деполяризації. Ці іони Са²⁺ активують переважно тонічний компонент АХ скорочень, що за своїм механізмом аналогічний тонічному компоненту скорочення, яке викликається гіперкалієвою деполяризацією ГМК. Як зазначалось, ФП збільшував не тільки фазний, але й тонічний компоненти ацетилхолінових скорочень, а ніфедипін, аплікований на плато останнього, повністю його пригнічував. Отже, ФП здатний модулювати шляхи проведення сигналу агоніста як від М₃, так і від М₂ холінорецепторів до скорочувального апарата ГМК.

Передумовою утворення NO в організмі, інфікованому бактеріями стафілокока та його субстанціями, є активація ними макрофагів [Поздеєв, 2001], які презентуючи антиген Т-клітинам, активують синтез фактора переносу. ФП у свою чергу запускає реакції гіперчутливості сповільненого типу, певні компоненти яких регулюють [NO], надлишок якого може призводити до некрозу оточуючих тканин [Любченко з співавт., 1997]. З огляду на механізми, досліджували вплив ФП на пригнічувальну дію NO на спонтанні скорочення ГМ t.coli. Встановлено, що ФП усуває пригнічувальну дію нітропрусид натрію (НПН) (10^-4 М/л) на спонтанну скорочувальну активність ГМС. На фоні дії ФП (10^-3 мг/мл) та N^G-нітро-L-аргінін гідрохлориду розслаблюючий ефект НПН також пригнічувався. Дослідження дії ФП на фоні пригнічення ацетилхолінового (10^-5 М/л) скорочення ГМС НПН (10^-4 М/л) показало, що субстанція усуває цей ефект, навіть збільшує його. Подальші ж дослідження показали, що в НБР ФП не збільшує, а навпаки, посилює пригнічувальну дію НПН на ацетилхолінове скорочення ГМС. Тому припустили, що усунення фактором переносу пригнічувальної дії НПН на АХ збудження ГМ зумовлено активацією вивільнення іонів Са²⁺ з ріанодинчутливого депо СР за механізмом, відмінним від КІВК.

Встановлено, що ФП трансформує гальмівну дію екзогенного АТФ (10^-5 М/л) у збуджувальну, що викликає замість гіперполяризації ГМК, деполяризацію.. Субстанція пригнічує також швидкий АТФ компонент НАНХ ГСП, не блокуючи повільний NO компонент. Цим дія ФП відрізняється від дії блокатора SK_Ca каналів ПМ ГМК травного каналу апаміну [Володимирова, Шуба, 1984]. Наступне додавання до НРК з ФП N^G-нітро-L-аргініну (10^-3 М/л) пригнічує NO компонент ГСП. В присутності неселективного блокатора пуринорецепторів піридоксилсульфат-6-азофеніл-2, 4-бісульфонієвої кислоти (ПСАБК) ФП в НРК збільшує фазний і тонічний компоненти ацетилхолінових скорочень В номінально безкальцієвому розчині Кребса в присутності ФП та ПСАБК ці параметри не змінюються. Наведені результати вказують на те, що механізми активації фактором переносу скорочень, викликаних АХ в НРК відрізняються від механізмів, які через пуринорецептори опосередковують розслаблюючу дію екзогенного АТФ.

Встановлено), що ФП усуває пригнічення АТФ-ом тонічного компонента АХ скорочення, трансформуючи його навіть у збудження. Неселективний блокатор пуринорецепторів ПСАБК частково, а Cibaсron blue - повністю повертає суцільний тетанус ГМС, що виникає за даних умов до вихідного рівня. Зазначене вище, дозволяє думати, що отримана в дослідах за умов впливу субстанції трансформація гальмівної дії АТФ у збуджувальну пов'язана з активацією аденозин-5-трифосфатом рецепторзалежних механізмів мобілізації іонів Са²⁺ у ГМК. Як зазначалось вище, кінцевою ланкою у формуванні гальмівного ефекту АТФ в ГМ кишечника є активація апамінчутливих SK_Ca каналів. Ефект гальмівної дії - агоністів має ту ж саму кінцеву ланку. Встановлено, що ФП (10^-6-10^-3 мг/мл) не змінює розслаблюючу дію норадреналіну (10^-5 М/л) на тонічну складову ацетилхолінових (10^-5 М/л) скорочень ГМ. Активована ФП спонтанна скорочувальна активність ГМС, пригнічується як ізопреналіном (10^-5 М/л), так і норадреналіном (10^-5 М/л). Враховуючи все вище зазначене, можна зробити висновок, що вірогідною причиною трансформації гальмівної дії екзогенного АТФ у збуджувальну в ГМ t. coli є блокування цією субстанцією певних внутрішньоклітинних ланок проведення сигналу агоніста від Р_2У-рецепторів до активації SК_Са каналів.

Дія очищеного білка А (БА) золотистого стафілокока на регуляторні механізми скорочення вісцеральних та судинних гладеньких м'язів. БА - поверхнево асоційований фактор вірулентності (імуноглобулін зв'язуючий білок), що рівномірно розташований у зовнішніх шарах клітинної стінки бактерій St. аureus [Холодна, 2001]. Дослідження, проведені на ГМС t. coli та міометрія морських свинок показали, що БА, як і ФП, також збільшує фазний компонент гіперкалієвого (80 та 90 мМ/л, відповідно) скорочення, найбільше значення якого досягається при його концентраціях 10^-1 та 510^-3 мг/мл, відповідно. Величина фазного компонента в першому випадку перевищує контрольний рівень у 2, а в другому - у 1,5 рази. Значення (р) в обох випадках було 0,05. Дослідження можливого внеску механізмів КІВК у формування активованої БА гіперкалієвої контрактури ГМ t.coli показало, що в НБР субстанція в концентраціях 10^-6-10^-4 мг/мл не викликає статистично достовірних змін амплітуди кофеїнового (20 мМ/л) скорочення, тоді як підвищення [БА] супроводжується їх пригніченням на порядок. Отримані результати, враховуючи дані літературних джерел [Шуба, 1981; 1994], вказують на те, що механізми КІВК з СР не беруть участі у потенціюючому ефекті білка А. Методом феноменологічного моделювання кінетики Са²⁺-залежного скорочення-розслаблення гладеньких м'язів було підтверджено, що зазначений ефект БА (концентрації <10^-3 мг/мл) пов'язаний переважно з активацією механізмів надходження до ГМК. Підтвердженням цьому також стали результати дослідів, отримані методом “patch-clamp” у конфігурації “whole-cell”. У відсутності активації рецепторів ГМК t. coli досліджували вхідний Са²⁺ струм (І_Са), що переноситься через високопорогові Са²⁺ канали L-типу. І_Са мав поріг активації (-40)-(-30) мВ, максимум вольт-амперної характеристики при (+10 мВ), потенціал половинної інактивації струму становив (-31 мВ), що співпадає з даними інших авторів [Зима, 1994; 1996], отриманими на цьому ж об'єкті. І_Са блокувався ніфедипіном (1 мкМ/л). Мембранний потенціал спокою підтримували на рівні (-60 мВ). Встановлено, що у порівнянні з контролем, прийнятим за 100 %, І_Са в присутності БА (510^-6 мг/мл) збільшується на 502,8 %, р0,05. Досліди, проведені на штучних БЛМ, показали, що БА (10^-4, 10^-3 мг/мл) викликає флуктуації електричної провідності з максимумом 10 і 36,4 nСм, n=30, відповідно. Зазначеним вище методом феноменологічного моделювання було показано, що в активуючому ефекті БА в концентраціях > 10^-3 мг/мл на гіперкалієву контрактуру починають переважати механізми не пов'язані з надходженням в ГМК. Дійсно, як показали результати експериментів, БА в зазначених концентраціях збільшує АТФ-азну активність скорочувальних білків ГМ.

Встановлено, що БА пригнічує збуджувальну дію АХ на ГМ міометрія і t.coli. Графіки, побудовані за методом Hunter, Downs [1945], виявились прямими паралельними вісі абсцис (-lg [AX]), екстраполяція яких на вісь ординат показала, що значення уявних констант інгібування становлять відповідно: 8,410^-4 мг/мл та 6,610^-5 мг/мл. Дослідження дії БА (10^-6-510^-3 мг/мл) на АХ скорочення ГМ міометрія в присутності ЕГТА (3 мМ/л) показали, що їх амплітуда у порівняні з контролем залишається без змін, тоді як в ГМ t.coli - збільшується. Відомо [Bolton, 1992; Жолос, 1999], що підвищення в ГМК під час холінергічного збудження є ключовим моментом для активації ВК_Са каналів, що пригнічуються ТЕА. Додавання до НРК, у складі якого був цей блокатор (4 мМ/л) білка А зменшує інтенсивність пригнічення субстанцією АХ (10^-5 М/л) збудження ГМ t.coli, а в ГМ міометрія амплітуда фазного компонента АХ скорочень збільшується.

Встановлено, що скорочення ГМС міометрія, зумовлені вивільненням Са²⁺ з ІР₃-чутливого депо в присутності БА (10^-6-10^-3 мг/мл) залишаються без змін. Отримані дані дозволяють думати, що причиною неконкурентного інгібування білком А збуджувальної дії АХ в ГМ міометрія і t. coli є активуючий вплив цієї субстанції на Са²⁺-залежну К⁺ провідність мембрани ГМК, підвищення в яких здійснюється за рахунок збільшення рецептор-, та потенціалкерованого входу цих катіонів у міоплазму.

Дослідження, проведені на препаратах стінки судин еластичного (грудний відділ, дуга аорти, легенева артерія) та м'язового (мезентеріальна, хвостова артерії) типу показали, що механізми збуджувальної дії норадреналіну (10^-6, 10^-4 М/л), серотоніну (10^-7- 10^-4 М/л), та АХ (10^-5 М/л) в них, як в НРК, так і в НБР нечутливий до дії БА (10^-7-10^-3 мг/мл). Не змінюються також під дією БА фазний і тонічний компоненти, кінетика гіперкалієвої (80 мМ/л) контрактури цих препаратів.

Дія пептидоглікану золотистого стафілокока на регуляторні механізми скорочення вісцеральних та судинних гладеньких м'язів. Імуномодулятор пептидоглікан - гетерополімер клітинної стінки St.aureus, що складається з гліканових одиниць, з'єднаних пентагліциновими містками [Смірнов з співавт., 1988; Franklin, 1998]. Дослідження показали, що як ФП, БА, так і пептидоглікан (10^-6 - 10^-2 мг/мл) в присутності фентоламіну, пропранололу, атропіну (t.coli) збільшує як фазний, так і тонічний компоненти гіперкалієвої контрактури ГМ t.coli та міометрія. Аплікація ПГ на плато тонічного компонента (ГМС t. coli) супроводжується його підвищенням. В той же час, ПГ в цих м'язах пригнічує кофеїном (20 мМ/л) індуковані скорочення.

В ГМ t. coli ПГ підсилює, а в міометрії послаблює збуджувальну дію АХ (10^-6 М/л). Встановлено, що механізм вивільнення Са²⁺ з ІР₃-чутливого депо СР ГМК міометрія не змінюється пептидогліканом, тоді як в ГМ t. coli ПГ (концентрації 10^-5 мг/мл) активує його. Встановлено, що попереднє вивільнення іонів Са²⁺ з ріанодинчутливого депо СР ГМК t. coli усуває потенціюючий ефект ПГ на холінергічне збудження, що дозволяє думати про можливість одночасової активації субстанцією за даних умов вивіль-нення Са²⁺ як з ІР₃-, так і ріанодинчутливого депо цих м'язів. Відомо [Шуба,1988], що ацетилхолін, деполяризуючи плазматичну мембрану, збільшує вхід до ГМК через ПККК L-типу, активуючи переважно тонічний компонент АХ скорочень. ПГ збільшував не тільки фазний, але й тонічний їх компонент. Дослідження дії цієї субстанції (10^-3 мг/мл) на АХ скорочення ГМ t. coli в присутності блокатора Са²⁺ каналів L-типу ніфедипіну показало, що ці скорочення практично повністю пригнічуються ПГ. Застосування зазначеного вище методу Hunter, Dovns [1945] для з'ясування характеру пригнічення пептидогліканом збуджувальної дії АХ в ГМ міометрія дозволило встановити, що воно здійснюється за неконкурентним механізмом з уявною константою інгібування 5,810^-4 мг/мл, що, вірогідно, зумовлено збільшенням проникності ПМ до . Дійсно, дослідження дії ПГ (510^-6 -510^-3 мг/мл) на АХ (10^-5 М/л) скорочення ГМС міометрія в присутності ТЕА (20 мМ/л), показало, що їх амплітуда зростає, статистично достовірно перевищуючи контрольний рівень, що підтверджує вище зроблене припущення.

З метою з'ясування питання про можливість безпосереднього впливу ПГ на скорочувальний апарат ГМК, досліджували його (10^-6-10^-2 мг/мл) дію на АТФ-азну активність препаратів міозину та нативних неочищених препаратів актоміозину ГМ шлунку. Встановлено, що ПГ не викликає статистично достовірних змін Са²⁺, Mg²⁺- АТФ-азної активності актоміозину, в той же час, дозозалежно, починаючи з концентрації 10^-6 мг/мл пригнічує Са²⁺- АТФ-азну активність міозину.

Дослідження, проведені на м'язових препаратах аорти, легеневої, хвостової та мезентеріальної артерій показують, що ПГ (10^-7-10^-3 мг/мл) не змінює амплітудні та кінетичні параметри скорочень, отриманих у відповідь на аплікацію норадреналіну (10^-6-10^-4 М/л), серотоніну (10^-7-10^-4 М/л), ацетилхоліну (10^-5 М/л) та гіперкалієвого (80 мМ/л) розчину Кребса. В той же час, встановлено, що ПГ модулює механічне напруження денативованих дією йодацетату (2 мМ/л), 2,4-динітрофенолу (1 мМ/л) в присутності ЕГТА (30 мМ/л) та кофеїну (20 мМ/л) ізольованих м'язових смужок стінки аорти, знижуючи базальний тонус та збільшуючи термоіндуковані їх реакції.

Дія стандартного стафілококового токсину (ССТ) (Staphylococсus aureus, штам Wood 46, Lh 0,18) на регуляторні механізми скорочення гладеньких м'язів. Дослідження, проведені на тонких (150-200 мкм) ГМС кільцевих гладеньких м'язах сліпої кішки показали, що ССТ в залежності від ступеня розведення (1:10000000-1:100) у порівнянні з контролем збільшує (1:10000000), не викликає статистично достовірних змін (1:1000000-1:10000) або пригнічує (1:1000, 1:100) фазний компонент гіперкалієвої (80 мМ/л) контрактури. ССТ (розведення: (1:10000000-1:100) пригнічує вивільнення Са²⁺ з ріанодинчутливого депо СР. Так, наприклад, токсин у розведеннях: 1:10000000, 1:100 зменшує у порівнянні з контролем, прийнятим за 100 %, амплітуду, зареєстрованих в НБР кофеїн (20 мМ/л) індукованих скорочень на 20,30,8 %, р0,05 та 39,71,8 %, р0,05. Кінетичний аналіз механокінетичних кривих, проведений за методом Костеріна (1990) показує, що за певних розведень ССТ (1:10000-1:100) його вплив має місце як на механізми входу, так і виходу Са²⁺ з СР гладеньком'язових клітин. Дослідження дії ССТ на викликані АХ (10^-6 М/л) скорочення зазначених вище препаратів показало, що цей білок у розведеннях: (1:10000000, 1:1000000, 1:100000, 1:10000, 1:100) пригнічує їх фазний компонент відповідно на: 67,02,0 %, р0,05; 60,32,5 %, р0,05; 70,43,0 %, р0,05; 75,93,2 %, р0,05; 80,23,0 %, р0,05. За даних умов, розраховані коефіцієнти максимальної швидкості скорочення-розслаблення у порівнянні з контролем збільшуються, що, згідно з зазначеним вище методом, вказує на пригнічення ССТ як механізмів надходження, так і виведення Са²⁺ з ГМК. Встановлено, що токсин пригнічує також АХ (10^-5 М/л) скорочення, зареєстровані в НБР. Отримані дані вказують на здатність ССТ блокувати проведення сигналу агоніста по електро- та фармакомеханічному шляхах від М₂ та М₃ холінорецепторів до скорочувального апарата.

Дія простагландинів групи Е, брадикініну, флавоноїдів на електричні властивості мембрани гладеньких м'язів та синаптичну передачу в них. Відомо [Громыхина, 1996], що за умов антигенного впливу і, зокрема, St. aureus, мононуклеарні фагоцити синтезують простагландини групи Е, що опосередковують ефекти імуноактивних молекул. Проведені дослідження показали, що ПРГЕ₂, деполяризує ГМ сліпої кишки, зменшує електротонічні потенціали (ЕТП) та НАНХ гальмівні синаптичні потенціали. В атропінізованих (10^-6 М/л) кільцевих гладеньких м'язах фундальної частини шлунку ПРГЕ₂ (10^-7 М/л) також зменшує мембранний потенціал спокою, ЕТП і повністю блокує НАНХ ГСП. Встановлено, що в ГМ t. coli, ПРГЕ₂ викликає деполяризацію, збільшення амплітуди та частоти ПД та спонтанну скорочувальну активність. В НБР ПРГЕ₂ також деполяризує ГМ, але ці зміни не супроводжуються скороченням ГМС. Зв'язування в НРК іонів Ca²⁺ за допомогою ЕГТА (1 мМ/л) усуває деполяризуючий ефект простагландину. Експерименти, проведені на неатропінізованих ГМС кільцевого шару ГМ фундальної частини шлунку, показали, що ПРГЕ₂ (10^-7 г/мл) деполяризує ГМ та пригнічує збуджувальні синаптичні потенціали і ЕТП. Встановлено також, що механізми збуджувальної дії ацетилхоліну (10^-5 М/л) та норадреналіну (10^-5 М/л) в ГМ t. coli нечутливі до впливу ПРГЕ₂ . Для з'ясування вірогідних причин змін пасивних електричних властивостей ПМ простагландинами, досліджували дію ПРГЕ₁ та Е₂ на електричну провідність штучних БЛМ. Встановлено, що ПРГЕ₁ (210^-10 - 410^-7 г/мл) формує дискретну провідність БЛМ (електроліт KCl (1 М/л)), а також суттєво підвищує провідність БЛМ, модифікованих граміцидином Д.. ПРГЕ₂ (10^-6 г/мл) - модифіковані лецитин-холестеринові БЛМ мали постійну провідність 440,19,2 nCм, n=32 з флуктуаціями: 2134,6 nCм та 346,33,2 nCм (електроліт CaCl₂). Вимірювання на змінному струмі з =40 Гц ( ПРГЕ₂ додавався в ліпідний розчин (1 М/л на 100 М/л ліпідів) та електроліт ( [CaCl₂] від 0,01 до 2 М/л)) третьої гармоніки струму та визначення коефіцієнта не-лінійності вольт-амперних характеристик азолектинових ПРГЕ₂ - модификованих БЛМ показало, що зі збільшенням [CaCl₂], його величина зростає, змінюючись від від'ємних до додатніх значень. Аналогічний результат було отримано на граміцидин Д модифікованих БЛМ. В той же час, в присутності валіноміцину (10^-9 М/л) коефіцієнт змінювався від додатніх до від'ємних значень. Аналогічний результат було отримано також на ПРГЕ₁ - модифікованих холестерин-лецитинових БЛМ (електроліт KCl ).

Основу будови ефективних природних імономодуляторів організму, інфікованого бактеріями St. aureus - флавоноїдів [Nanayakkava, 2002] складає фенілпропановий скелет, утворений 15 атомами вуглецю, ароматичні групи якого з'єднані фрагментом С₆ -С₃ -С₆ [Запрометов, 1984]. Дослідження дії рутину на синаптичну передачу в кільцевих ГМ сліпої кишки показало, що ця речовина в концентрації 10^-7 г/мл гіперполяризує ПМ, зменшуючи ЕТП та НАНХ ГСП, які з часом, не дивлячись на гіперполяризацію, збільшуються, досягаючи контрольного значення. В більших концентраціях (10^-6-10^-4 г/мл) рутин деполяризує ПМ, зменшуючи як ЕТП, так і ГСП. Атропінізація (10^-6 М/л) ГМС практично усуває деполяризуючий ефект рутину. Інший флавоноїд - кверцетин в концентраціях: 10^-7 , 10^-6, 10^-5 г/мл, як показали результати досліджень, дозозалежно деполяризує мембрану кільцевих ГМ сліпої кишки, збільшуючи амплітуду та частоту спонтанних ПД, зменшуючи по відношенню до контролю, прийнятого за 100% , ЕТП відповідно на: 301,2%, p0,05; 36,41,0%, p0,05; 47,3 1,5%, p0,05. При цьому, амплітуда НАНХ ГСП залишається без змін. З часом деполяризація ПМ змінюється гіперполяризацією, а ЕТП залишаються нижче контрольного рівня. Не дивлячись на гіперполяризацію, амплітуда ГСП збільшується у порівнянні з контролем на 38,81,2%, p0,05; 44,01,5%, p0,05, відповідно. При дії цієї речовини в концентрації 10^-5 г/мл ГСП зменшуються. Через певний проміжок часу, що визначається концентрацією кверцетину, гіперполяризація змінюється стійкою деполяризацією, величина якої, а також величина ЕТП, набувають таких же значень, як і до розвитку гіперполяризації. Кверцетин в більшій концентрації (10^-4 г/мл) на 5-10-ту хвилину аплікації деполяризує (на 8-10 мВ, n=16) ГМК, зменшуючи майже у 2 рази, у порівнянні з контролем, як ЕТП, так і ГСП.

Бактеріальний патогенез, зумовлений патогенними бактеріями, в т.ч. золотистим стафілококом, з такими різними клінічними проявами як перитоніти та бактеріальний сепсис супроводжуються активацією синтезу брадикініну, одна з функцій якого полягає в активації міграції лейкоцитів [Яровая, 2001; Georgescu et al., 2001]. Дослідження, проведені на ГМС t.coli показали, що брадикінін (210^-5 г/мл) деполяризує (на 6-7 мВ) ГМК, збільшує амплітуду та частоту спонтанних ПД, зменшує на 46,71,2 %, р0,05 ЕТП. Амплітуда НАНХ ГСП збільшувалась на 44,41,8%, р0,05, що враховуючи К⁺ природу цих потенціалів [Tomita, 1972; Володимирова, Шуба, 1972], вірогідно, пов'язано переважно зі зменшенням під дією цієї речовини рівня поляризації ПМ. Дослідження дії БК на НАНХ ГСП атропінізованих (10^-6 М/л) ГМС кільцевого шару м'язів фундальної частини шлунку показало, що БК (210^-5 г/мл) деполяризує ПМ, зменшує спонтанну електричну активність та більше, ніж у 1,5 рази ЕТП та НАНХ ГСП. Останнє, вірогідно, зумовлене переважно пресинаптичним ефектом дії цього пептиду. БК (210^-5 г/мл) в ГМ шлунку не викликав статистично достовірних змін амплітуди збуджувальних синаптичних потенціалів. Отримані результати досліджень вказують на здатність таких імуноактивних речовин як простагландини групи Е, брадикінін, рутин, кверцитин модулювати збуджувальну і НАНХ гальмівну синаптичну передачу в ГМ кишечнику як за рахунок змін електричних властивостей ГМК, так і за рахунок, вірогідно, їх впливу на пресинаптичну мембрану.