Фізіологічні реакції перцю (Capsicum annuum L.) на вірусну інфекцію

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ФІЗІОЛОГІЧНІ РЕАКЦІЇ ПЕРЦЮ (CAPSICUM ANNUUM L.) НА ВІРУСНУ ІНФЕКЦІЮ

Спеціальність: Фізіологія рослин

Дьячкова Ольга Олександрівна

Київ, 2003 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Поширеність хвороб вірусної етіології в біогеоценозах України і всієї Земної кулі, останнім часом набуває все загрозливіших форм і сумних наслідків. (Бойко, 1990, Поліщук, 2001,). Незважаючи на чисельні дослідження присвячені вивченню вірусних захворювань рослин, механізми розвитку патологічного процесу залишаються не рідко маловивченими та актуальними для багатьох науковців. Більшість механізмів активування фізіологічних та біохімічних систем захисту при дії вірусної інфекції також залишаються недостатньо вивченими.

А між тим знання їх необхідно для розробки шляхів регулювання вірусного патогенезу (Реунов, 1999). На сьогоднішній день не існує надійних засобів для боротьби з вірусними інфекціями, це пов'язано з особливостями біології їх збудників (Поліщук, 2001).

За своєю природою віруси є строго облігатними паразитами і тому здатні до існування лише в живих системах.

Більшість із них в тій чи іншій мірі пригноблюють ріст та розвиток рослин і тільки окремі віруси при інфікуванні рослини-господаря призводять до її загибелі. Зважаючи на це, цікавим є питання про первинну відповідь рослинного організму на інфікування вірусом як один із стресових факторів.

Фото-синтез є найбільш чутливим процесом до дії різноманітних стресорів, у тому числі і біотичної природи (Balachandran, 1997).

Саме тому для розуміння характеру відповідних реакцій на вплив стресових факторів біотичної природи важливим є з'ясування структурних змін фотосинтетичного апарату, викликаних вірусною інфекцією.

Це пояснюється важливою роллю останнього в забезпеченні клітин рослин енергетичними та пластичними речовинами, які синтезуються при фото-синтезі і можуть використовуватись як рослинним організмом, так і вірусним патогеном. Проблема обумовлена відносною автономністю фотосинтетичного апарату. Всебічне дослідження функціональних особливостей рослин, інфікованих фітовірусами, необхідне для подальшого прогресу в розумінні механізмів патологічного процесу.

Мета і задачі дослідження. Метою досліджень було з'ясувати фізіологічні та біохімічні реакції, що виникають у рослин перцю при інфікуванні вірусом тютюнової мозаїки (ВТМ), на прикладі змін активності стресових ферментів та структури фотосинтетичного апарату.

Для досягнення даної мети необхідно було дослідити:

- первинну реакцію рослин солодкого перцю на інфікування ВТМ на прикладі зміни активності стресових ферментів (пероксидази, каталази та поліфенолоксидази);

- зміни в ультраструктурній організації клітин мезофілу солодкого перцю, інфікованого ВТМ;

- зміни вмісту фото-синтезуючих пігментів солодкого перцю, інфікованого ВТМ;

- якісний та кількісний склад білків хлоропластів рослин перцю при інфікуванні ВТМ;

- локалізацію вірусної нуклеїнової кислоти на клітинному та субклітинному рівнях.

Об'єкт дослідження - модельна система ВТМ - перець солодкий Capsicum annum L. (сорт Подарок Молдови).

Предмет дослідження - фізіологічна реакція рослин перцю солодкого на дію вірусної інфекції.

Методи дослідження - фізіологічні (визначення вмісту фотосинтетичних пігментів, виділення хлоропластів), вірусологічні (інфікування рослин ВТМ, діагностика вірусної інфекції), цитологічні (дослідження ультраструктури клітин), біохімічні (визначення активності пероксидази, каталази, поліфенолоксидази, якісних та кількісних змін хлоропластних білків, концентрації білка), молекулярні (ідентифікації та визначення локалізації білка та нуклеїнової кислоти), математично-статистичні (оцінка вірогідності отриманих результатів).

Наукова новизна одержаних результатів. Розширено уявлення про особливості первинної відповіді рослинного організму на вірусну інфекцію. Встановлено, що зміни в активності досліджуваних ферментів виявляються ще до появи зовнішніх симптомів. Вивчені деструктивні зміни клітинних органоїдів перцю під впливом ВТМ, особливо хлоропластів. Показано, що світло-збиральні комплекси фото-системи ІІ є вразливішими при дії вірусної інфекції в порівнянні з фото-системою І.

Встановлено, що структурний білок ВТМ накопичується всередині хлоропластів. Показано про ідентифікацію та локалізацію нуклеїнової кислоти ВТМ безпосередньо в стромі пластид.

Практичне значення одержаних результатів. Вивчення особливостей фізіологічної реакції перцю солодкого на дію вірусної інфекції спрямоване на пізнання механізмів взаємодії вірусу та рослини, що відкриває шляхи регуляції патологічного процесу та способів зменшення шкодочинної дії вірусної інфекції. Отримані дані можуть використовуватись у дослідницьких роботах по вивченню природи стійкості рослин до дії біотичних стресів та розробці засобів підвищення їх толерантності до вірусних патогенів.

Модифіковано метод полімеразної ланцюгової реакції для діагностики ВТМ на рослинах перцю, який може бути рекомендований для діагностики ВТМ в сільському господарстві на різних культурах.

Дані, що викладені в дисертації, використовуються під час проведення практично-лабораторних занять з дисципліни фізіологія рослин у Національному аграрному університеті.

Особистий внесок здобувача полягає в самостійному опрацюванні літератури, оволодінні необхідними методами досліджень, безпосередній участі у плануванні і проведенні експериментів, обґрунтуванні та статистичній обробці результатів досліджень, підготовці до друку наукових робіт. Матеріали дисертаційної роботи отримані автором самостійно або спільно зі співробітниками лабораторії вірусології та біотехнології НАУ та Інституту фізіології рослин і генетики НАН України.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках науково-дослідної теми лабораторії вірусології та біотехнології НАУ на 1998-2002 рр. “Вивчення механізмів взаємодії фітовірусів із клітинами та розробка методів діагностики вірозів і отримання безвірусних рослин” (р/№0198U004073).

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати були представлені на Міжнародному симпозіумі “Plant under environmental stress” (Москва, 2001), VІІ Конференції молодих учених “Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин” (Київ, 2002), І Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих учених “Перспективні напрямки розвитку сільськогосподарської науки та виробництва в Україні” (Сімферополь, 2002), науково-практичних конференціях професорсько-викладацького складу НАУ (Київ, 2001-2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 робіт, з них 4 статті у провідних фахових виданнях 3 тези доповідей.

Об'єм та структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 137 сторінках машинописного тексту й складається зі вступу, огляду літератури, 4 експериментальних розділів, висновків та списку використаної літератури (налічує 246 найменувань). Робота містить 20 рисунків та 5 таблиць.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Перший розділ дисертації складається з 5 підрозділів, у яких узагальнено літературні дані стосовно особливостей фізіологічної реакції рослин на дію вірусів, а саме змін ультраструктури клітин у відповідь на вірусну інфекцію, змін у структурі та функціонуванні фото-синтезуючого апарату під дією біотичного стресу - вірусної інфекції.

Розглянуто відомості про зміну активності анти-окисних ферментів при інфікуванні рослин вірусами, а також про їх значення у формуванні захисних реакціях. На підставі аналізу вітчизняних та зарубіжних літературних джерел обґрунтовано актуальність проведення досліджень за темою дисертаційної роботи. Об'єктом досліджень були рослини перцю Capsicum annuum L. сорту Подарок Молдови, інфіковані ВТМ. Інокулювання рослин ВТМ здійснювали у фазі двох справжніх листків. Рослини вирощувались в умовах теплиці, забезпечувались нормальним поливом, денна температура коливалась у межах 22-26С. Чергування світлового та темнового періоду становило 14/10 годин. Наявність вірусу в зразках визначали за допомогою методів: рослин-індикаторів (Legg, 1965) електронної мікроскопії (Brenner, 1959), реакції подвійної імунодифузії в агарі (Shepard, 1972).

Для досліджень використовували листки з характерними вірусспецифічними ознаками.

Зміни в структурі клітин мезофілу перцю під впливом інфікування ВТМ визначали методом електронної мікроскопії за загальноприйнятою методикою (Brenner, 1959).

Визначення концентрації хлорофілу у листках, інфікованих рослин, проводили спектрофотометричним методом за загальноприйнятою методикою (Arnon, 1949).

Активність ферментів (пероксидази, поліфенолоксидази, каталази) визначали спектрофотометричним методом за загальноприйнятими методиками (Гавриленко, 1975, Єрмаков, 1972).

Визначення вмісту білку проводили за методом (Bredford, 1976).

Електрофорез хлорофіл-білкових комплексів хлоропластів проводили у поліакріламідному гелі (ПААГ) за методом описаним раніш (Anderson, 1980).

Електрофорез білків хлоропластів перцю, інфікованих ВТМ проводили за модифікованим методом (Laemmli, 1970).

Імуноблотинг білків хлоропластів перцю проводили за методом описаним раніш (Reneiro, 1989). Сумарну РНК виділяли з хлоропластів за допомогою набору “Рибо-Сорб” (”Амплисенс”, Москва, Росія), згідно інструкції виробника. Реакцію зворотної транскрипції (RT PCR) проводили в об'ємі 20 мкл при температурі 37С протягом 30 хв. з використанням набору “Реверта” (”Амплисенс”, Москва, Россия). Амплификацию проводили на амплификаторе “GeneAmp 2400” (Applied Biosystems).

Статистична обробка експериментальних даних виконана загальноприйнятим методом (Доспехов, 1985), із використанням сучасних пакетів програм Microsoft Excel.

Вірус специфічні симптоми на рослинах перцю, інфікованих ВТМ. Відмічено, що інфікування ВТМ рослин перцю призводить до розвитку вірус специфічних симптомів, а саме здуття, гофрування листкової пластинки, деградації листкової пластинки, просвітлення жилок, некрозів, мозаїк, хлорозів. Такі вірус специфічні симптоми, як мозаїка, хлороз та некроз були найбільш поширеними у рослин перцю, інфікованих ВТМ. Вони проявлялись на 10-20 добу після інфікування рослин вірусом. Одним з найперших симптомів хвороби є просвітлення жилок. На більш пізніх етапах розвитку хвороби розвивалась хлоротичність листків.

Вплив ВТМ на ультраструктуру клітин мезофілу листків перцю. Встановлено, що в клітинах хлоротичних зон накопичувалась значна кількість вірусних часток. Цитоплазма утворювала інвагінації, що містили велику кількість вірусних часток. Мітохондрії також підлягали змінам внаслідок інфікування ВТМ. Органоїди мали набубнявілий вигляд із частково зруйнованими кристами та матриксом. Значного патологічного впливу набували хлоропласти. Вірусні частки локалізувались навколо зовнішньої мембрани хлоропластів, що обумовлювало часткову агрегацію пластид. В структурі хлоропластів збільшувалась кількість осміофільних глобул. Спостерігалось необмежене розростання периферійного ретикулума. Більшість органоїдів мали видовжену форму, тилакоїди втрачали структурність, а грани перетворювались в аморфні конгломерати. Також нами відмічено зменшення кількості та розмірів крохмальних зерен в органоїдах. Фотосинтетичні пігменти рослин перцю при інфікуванні ВТМ. В ході експериментів проводився аналіз вмісту пігментів на 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30 добу після інокулювання рослин ВТМ. Інфікування перцю ВТМ призводило до вірогідного зменшення вмісту хлорофілів а та b вже на 3-ту та 5-ту добу досліду відповідно. Надалі з розвитком інфекції відбувалось поступове зниження кількості хлорофілів. Подібна картина при вірусному патогенезі відмічена рядом авторів (Серова, 1973, Tu, 1968). І хлорофіл а, і хлорофіл b деградували в середньому в два рази в порівнянні з контролем.

Кількісний вміст каротиноїдів зменшувався на початкових етапах репродукції ВТМ в рослинах перцю. Подальший розвиток вірусу не мав суттєвого впливу на вміст жовтих пігментів. На 30-ту добу після інфікування відмічено вірогідне збільшення кількості каротиноїдів в листках інфікованих рослин. Таким чином, інфікування перцю ВТМ призводило до патологічного для рослини зменшення відносного вмісту хлорофілів та каротиноїдів на початкових етапах вірусної інфекції. Вміст каротиноїдів підвищувався при подальшому розмноженні вірусу в тканинах рослин перцю.

Зміна активності пероксидази, поліфенолоксидази, каталази рослин перцю при інфікуванні ВТМ. Адаптація рослин до абіотичного та біотичного стресу прямо пов'язана із функціонуванням антиоксидантної системи (Андреева, 1988). Проводились дослідження зміни активності пероксидази, поліфенолоксидази та каталази у відповідь на інфікування рослин перцю ВТМ на 3, 5, 10, 15, 20, 25 добу експерименту. Рослини перцю на інфікування ВТМ відповідали зміною активності досліджуваних ферментів. За перші три доби після інфікування ВТМ активність пероксидази збільшувалась в 3 рази. Підвищення активності ферменту співпадало в часі з процесами некроз утворення. Починаючи з 10-ої доби експерименту спостерігалось зменшення активності пероксидази. Надалі активність ферменту вірогідно не відрізнялась від активності ферменту контрольного варіанту.

Стосовно зміни активності поліфенолоксидази відмічено її максимальну активність на 10-ту добу після інфікування. Утворення некрозів пояснюється накопиченням в рослинній клітині великої кількості хінонів (Коваленко, 1983), а так як активність ферменту корелювала в часі з утворенням некрозів, то ми вважаємо, що підвищення її активності не пов'язано із процесами некроз утворення, а є результатом зміни в фенольному обміні. Активність каталази у рослин протягом досліду була значно більша, ніж у контрольних рослин. Протягом всього експерименту спостерігались стабільно високі значення активності цього ферменту. Висока активність каталази призводить до руйнування перекису водню, який є фактором імунітету (Тарчевский, 1999). Тобто висока активність цього ферменту є несприятливим фактором для стійкості рослин.

Вивчення пігмент-білкових комплексів хлоропластів, інфікованих ВТМ, рослин перцю. Відносна частка кожної смуги в загальному складі пігмент-білків та співвідношення між вмістом окремих пігмент-білкових комплексів у хлоропластах подана в таблиці.

Особливості методики виділення інтактних хлоропластів з інфікованих ВТМ рослин перцю. Запропоновано методику виділення інтактних хлоропластів з інфікованих ВТМ рослин перцю. Методика полягає в використанні середовища виділення наступного складу: 0,4 М сахароза, 0,05 М тріс-HCL, 5 М аскорбінова кислота, 0,1% БСА, рН 7,8, 20 мМ меркаптоетанол, цистеїн, рН 7,8. Введення до середовища виділення цистеїну та меркаптоетанолу виключає окислення сульфгідрильних груп ферментів. Осад ресуспендували в тому самому середовищі та нашаровували на 40 - 90% ний градієнт перколу. Після центрифугування ділянку інтактних хлоропластів збирали на межі 40 та 90% перколу. Отримані інтактні хлоропласти використовували для виділення гідрофільних білків строми та гідрофобних білків фотосинтетичної мембрани шляхом шокування пластид.

У хлоропластах, інфікованих рослин, співвідношення двох форм реакційного центру фото-системи І (CP1a/Cp1) значно зменшувалось по відношенню до контролю. Дані зміни відбувалися внаслідок суттєвого зменшення відносного вмісту СР1а. У хлоропластах інфікованих рослин спостерігався перерозподіл відносних часток олігомерної (LHCP1) та мономерної (LHCP3) форм світлозбираючого комплексу на користь останньої. У випадку найближчої антени фото-системи ІІ (СРа) спостерігалось зменшення (приблизно в 2 рази) її відносного вмісту. В інфікованому варіанті була виявлена нова смуга між СР1 та LHCP1, відомостей про склад останньої в науковій літературі немає. Візуально смуга мала жовто-зелений колір, що свідчило про перевагу в її складі хлорофілу b. Тому ймовірна її належність до світлозбираючого комплексу фото-системи ІІ, тобто вона може бути специфічною формою світлозбираючого комплексу фото-системи ІІ, синтез якої відбувається за дії стресових факторів.

Таким чином, інфікування ВТМ рослин перцю призводило до деструктивних змін у складі світлозбиральних комплексів як фото-системи І, так і фото-системи ІІ. Світлозбиральні комплекси фото-системи ІІ виявилися більш вразливими до дії вірусної інфекції, про що свідчило зменшення відносного вмісту СРа, а також поява нової смуги, яку ми відносимо до світлозбиральних комплексів фото-системи ІІ.

Дослідження мембранних та стромальних білків хлоропластів здорових та інфікованих ВТМ рослин перцю. Розвиток хлорозів на листках перцю при інфікуванні ВТМ викликав деструкцію білкових компонентів мембран хлоропластів. Вірусна інфекція викликала суттєве зменшення відносного вмісту реакційного центру фото-системи І, світлозбираючого комплексу фото-системи ІІ, білків кисеньвидільного комплексу фото-системи ІІ - 33 кДа та 43 кДа. Репродукція ВТМ у рослинах перцю призводила до появи нових низькомолекулярних білків, що може бути наслідком активування протеолітичних процесів у стресових умовах.

У випадку стромальних білків хлоропластів перцю вірусний процес викликав зменшення відносного вмісту великої субодиниці РУБІСКО та білків у межах 17 кДа - 50 кДа. Відносний вміст малої субодиниці РУБІСКО зменшувався внаслідок дії вірусної інфекції.

Виявлено новий білок як серед мембранних, так і стромальних білків в області 17-18 кДа. Використовуючи метод імуноблотингу, нами показано, що серед хлоропластних білків рослин перцю, інфікованих ВТМ, присутній капсидний білок вірусу. Серед білків строми концентрація вірусного білку вища порівняно з мембранною фракцією. Наявність вірусного білку в хлоропластах відмічена й іншими дослідниками (Reneiro, 1986).

Таким чином, інфікування ВТМ рослин перцю призводило до деструкції білків, що входять до складу фото-систему ІІ. Репродукція ВТМ в клітинах перцю викликала деструкцію РУБІСКО.

Розробка умов проведення полімеразної ланцюгової реакції. Здійснена робота по тестуванню та визначенню оптимальних умов проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), які дозволяють отримувати максимальну кількість ПЛР продуктів з праймерами до ВТМ. Для оптимізування умов проведення ПЛР нами тестувались наступні параметри: температура відпалу праймера, концентрація MgCl2, концентрація Tag полімерази. Ампліфікацію проводили в наступному температурному режимі: початкова денатурація: 2 хв. при 94С, 36 циклів: 30 сек. при 94С, 30 сек. при 63С, 2 хв. при 72С, термінальна елонгація: 5 хв. при 72С.

Для інших параметрів умов проведення ПЛР нами встановлені наступні параметри: концентрація MgCl2 в межах 1,8-2,5 мм., концентрація Tag полімерази в діапазоні 0,8-1,5 одиниць/20 мкл реакційної суміші.

Наявність вірусної нуклеїнової кислоти може служити непрямим індикатором місця синтезу вірусного білка в хлоропластах (Almasi A., 2001). Використання методу ПЛР дозволило встановити наявність нуклеїнової кислоти ВТМ в інтактних хлоропластах та стромальній фракції гідрофільних білків. Показано, що РНК вірусу тютюнової мозаїки була відсутня в фракції гідрофобних білків фотосинтетичних мембран.

Таким чином, проведені нами дослідження показали наявність і локалізацію вірусної РНК в стромі хлоропластів перцю, інфікованого ВТМ, що може свідчити про безпосередню участь хлоропластів у процесах реплікації вірусної РНК та синтезі білку.

ВИСНОВКИ

1. ВТМ викликає найбільші деструктивні зміни в структурі хлоропластів, що проявляється в руйнуванні ламелярної структури органоїду, зменшенні кількості крохмальних зерен, розростанні периферійного ретикулума та підвищенні кількості осміофільних глобул;

2. В інфікованих ВТМ рослинах перцю відбувається зменшення концентрації хлорофілів а і b на 30-40% та підвищення каротиноїдів на 20% на кінцевих етапах вірусного патогенезу;

3. Підвищення активності пероксидази обумовлює утворення некрозів. Високий рівень активності каталази визначає системну відповідь рослин на інфікування ВТМ. Зміна активності поліфенолоксидази є наслідком порушення фенольного обміну рослин при інокулюванні ВТМ;

4. ВТМ викликає зміни в організації пігмент-білкових комплексів. Світлозбираючий комплекс фото-системи ІІ є більш вразливим до дії вірусної інфекції, про що свідчить зменшення відносного вмісту СРа, а також поява нової смуги у складі фото-системи ІІ;

5. Інфікування ВТМ призводить до руйнування мембранних білків, які формують поліпептиди фото-системи ІІ та появи низькомолекулярних білків. Вірусний патогенез викликає деструкцію стромальних білків;

6. Показано, що РНК ВТМ локалізується в стромі хлоропластів перцю, а накопичення вірусного білку відбувається в стромі та мембранах пластид.

рослина вірус біологічний

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мельничук М.Д., Дьячкова О.О., Смирнова С.О. Морфофізіологічні та біохімічні зміни рослин перцю (Capsicum annuum L.) при інфікуванні вірусом тютюнової мозаїки // Науковий вісник Національного аграрного університету, 2002, №50. - С. 13-18.

2. Мельничук М.Д., Дьячкова О.О., Кожукало В.Є., Ситник С.К. Особливості виділення хлоропластів з рослин перцю Capsicum annuum, інфікованих ВТМ // Аграрна освіта і наука. - 2002. - 3, №3-4. - С. 5-8.

3. Мельничук М.Д., Кожукало В.Е., Дьячкова О.А., Сытник С.К., Алексеенко И.П., Смирнова С.А. Влияние вируса табачной мозаики на ультраструктуру клеток мезофилла листа перца Capsicum annuum // Мікробіологічний журнал. - 2002. - 64, №6. - С. 35-40.

4. Мельничук М.Д., Дьячкова О.О., Смирнова С.О., Олексієнко І.П. Зміни ферментативної активності рослин під впливом інфікування вірусом тютюнової мозаїки // Физиология и биохимия культурных растений. - 2003. - 34, №1. - С. 43-47.

5. Мельничук М.Д., Дьякова О.О., Смирнова С.О. Зміни активності поліфенолокидази рослин перцю та тютюну під впливом інфікування вірусом тютюнової мозаїки // Научные труды Крымского Государственного Аграрного Университета. Симферополь. - 2002. - С. 89-91.

6. Melnychuk M.D., Dyachkova O.O., Smirnova S.O. Some reciprocal morphophisiological and biochemical reactions of plants at biological stress under virus infection // Plant under environmental stress - International Symposium, Moscow, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology, October 23-28, 2001. - 342 p.

Размещено на Allbest.ru