Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. В.Н.КАРАЗІНА

УДК 577.175.44+577.125

Роль тиреоїдних гормонів у регуляції обміну фосфоінозитидів у

Печінці щурів різного віку

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КРАСІЛЬНІКОВА ОКСАНА АНАТОЛІЇВНА

Харків - 2003

АНОТАЦІЯ

Красільнікова О.А. “Роль тиреоїдних гормонів в регуляції обміну фосфоінозитидів печінки щурів різного віку”. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини та тварин.- Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна, Харків, 2002.

Вивчали вікові особливості обміну фосфоінозитидів у печінці щурів, а також досліджували роль тиреоїдних гормонів у регуляції метаболізму фосфоінозитидів печінки щурів в онтогенезі. Установлено, що при старінні знижується базальний вміст і обмін фосфоінозитидів у печінці. При цьому спостерігається порушення у формуванні ацильного спектру фосфатидилінозиту та поліфосфоінозитидів. Встановлено, що тиреоїдний статус піддослідних тварин визначає інтенсивність утворення фосфоінозитидів у печінці. Онтогенетичні зміни тиреоїдного статусу організму є однією з важливих причин порушення синтезу фосфатидилінозиту і поліфосфоінозитидів при старінні. Встановлене існування вікових особливостей у відповіді клітин печінки на ранніх етапах після введення тироксину в організм піддослідних тварин. При безпосередній дії на ізольовані гепатоцити молодих тварин щурів стимулює активацію поліфосфоінозитидної сигнальної системи, яка супроводжується утворенням діацилгліцерину і інозит-1,4,5-трифосфату. Тироксин стимулює не тільки утворення, але й утилізацію вторинних месенджерів. В ізольованих гепатоцитах гормон індукує залежний від протеїнкінази С ресинтез фосфатидилінозит-4, 5-бісфосфату.

Ключові слова: печінка, тиреоїдні гормони, онтогенез, фосфатидилінозит, поліфосфоінозитиди, глікозилфосфатидилінозит.

АННОТАЦИЯ

Красильникова О.А. “Роль тиреоидных гормонов в регуляции обмена фосфоинозитидов в печени крыс разного возраста”. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Харьковский национальный университет им. В.Н.Каразина, Харьков, 2002 г.

Целью работы было выяснение роли тиреоидных гормонов в регуляции функционирования фосфоинозитидной сигнальной системы в клетках печени 3- и 24-месячных крыс.

Установлено, что с возрастом снижается базальный уровень и интенсивность процессов синтеза фосфатидилинозита, фосфатидилинозит-4-фосфата и фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата в печени крыс. У старых животных наблюдается торможение включения арахидоновой и увеличивается включение олеиновой кислоты в состав фосфатидилинозит-4-фосфата и фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата печени. Показано снижение интенсивности процессов образования гликозилфосфатидилинозита в печени 24-месячных крыс. В условиях in vitro установлено, что возрастное снижение содержания фосфатидилинозита является одной из основных причин снижения содержания его гликозилированного производного в печени старых животных.

Подавление функциональной активности щитовидной железы у молодых животных введением тиреостатического препарата мерказолила приводит к снижению образования вновь синтезированных фосфатидилинозит-4-фосфата и фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата и не влияет на уровень фосфатидилинозита. Заместительное введение тироксина сопровождается нормализацией синтеза фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата, увеличением - фосфатидилинозит-4-фосфата и снижением - фосфатидилинозита. Снижение уровня циркулирующих иодотиронинов у старых животных приводит к накоплению вновь синтезированного фосфатидилинозит-4-фосфата в печени. Введение тироксина нормализует интенсивность синтеза этого липида в печени. Введение тироксина на фоне мерказолила нивелирует возрастную динамику обмена изученных фосфоинозитидов в печени. В то же время интенсивность включения арахидоновой и олеиновой кислот в состав полифосфоинозитидов печени крыс различных экспериментальных групп (эутиреоидные, после введения мерказолила, после введения мерказолила и тироксина) достоверно не отличались в обеих возрастных группах.

Введение мерказолила сопровождается накоплением гликозилфосфатидилинозита в печени крыс обеих возрастных групп, тогда как заместительное введение тироксина сглаживает, но не нивелирует возрастные различия в содержании данного липида в печени.

На ранних этапах после введения гормона 3-месячным крысам в печени происходит быстрое, но краткосрочное накопление вновь синтезированных фосфатидилинозита и фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата на 15-й и 60-й минуте эксперимента и гликозилфосфатидилинозита - на 30-й минуте. Динамика и количественные показатели ответа клеток печени старых крыс существенно отличаются от таковых у молодых животных. У 24-месячных крыс наблюдалось одновременное накопление всех изученных фосфоинозитидов к 120-й мин после введения гормона. Полученные результаты свидетельствуют о существовании возрастных особенностей ответа клеток печени на ранних этапах после введения тироксина в организм.

В течение первых секунд тироксин стимулирует гидролиз фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата и накопление диацилглицеринов и инозит-1,4,5-трифосфата в изолированных гепатоцитах молодых крыс. Полученные результаты свидетельствуют об активации под действием тироксина фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С в изолированных гепатоцитах. Наблюдаемый эффект краткосрочен и не зависит от присутствия ионов Са²⁺ в среде инкубации клеток. Под влиянием тироксина в гепатоцитах наблюдается образование не только инозит-1,4,5-трифосфата, но и инозит-1,4-бифосфата, неактивного в отношении мобилизации кальция. В то же время хелатор внутриклеточного Са²⁺ ТМВ-8 стимулирует более значительное накопление диацилглицеринов. Полученные данные позволяют предположить, что мобилизация ионов Са²⁺, индуцированная инозит-1,4,5-трифосфатом, играет важную роль в утилизации диацилглицеринов. Таким образом, тироксин стимулирует образование в изолированных гепатоцитах вторичных мессенджеров: диацилглицеринов и инозит-1,4,5-трифосфата, но и способствует их быстрой утилизации.

При более длительном действии гормона на гепатоциты тироксин стимулирует ресинтез фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата из [¹⁴С]пальмитиновой кислоты, которая включается в состав фосфолипидов в ходе их синтеза de novo. Предварительная инкубация клеток со сфингозином, ингибитором протеинкиназы С, полностью отменяет эффект гормона. При этом в клетках наблюдается усиление образования фосфатидной кислоты, меченой [¹⁴С]пальмитиновой кислотой. Инкубация гепатоцитов, выделенных из печени 3-месячных крыс, в присутствии активатора протеинкиназы С - форбол 12-миристат 13-ацетата стимулирует образование фосфатидилинозита, фосфатидилинозит-4-фосфата и имитирует эффект тироксина на накопление фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата. Предварительная инкубация клеток в присутствии сфингозина полностью отменяет эффект форбол 12-миристат 13-ацетата. Полученные результаты свидетельствуют о том, что тироксин активирует синтез фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата в изолированных гепатоцитах и этот процесс зависит от протеинкиназы С.

Ключевые слова: печень, тиреоидные гормоны, онтогенез, фосфатидилинозит, полифосфоинозитиды, гликозилфосфатидилинозит.

SUMMARY

Krasilnikova O.A. The role of thyroid hormones in regulation of phosphoinositide metabolism in rat liver during ageing. - Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.13 - physiology of human and animals.-V.N.Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2002.

Age-related features of phosphoinositides metabolism and a role of thyroid hormones in its regulation have been investigated. The content of phosphatidylinositol, polyphosphoinositides and glycosylphosphatidylinositol and their metabolism have been found to decrease with age.

It was established that phosphatidylinositol and polyphosphoinositides synthesis in the liver of rats of different age is regulated by the thyroid state of organism. In vitro thyroxine stimulated phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis in hepatocytes, which accompanied by accumulation of second messengers: diacylglycerol and inositol-1,4,5-triphosphate. The data obtained provide the evidence that in the liver cells thyroxine induces activation of phospholipase C. Thyroxine-induced accumulation of diacylglycerol and inositolphosphates was registered in both Ca²⁺-containing and Ca²⁺-free media. Following the phospholipase C activation in isolated hepatocytes, thyroxine causes hydrolysis of inosito-1,4,5-trisphosphate.

In isolated liver cells thyroxine activated protein kinase C-dependent resynthesis of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate.

Key words: liver, thyroid hormones, ontogenesis, phosphatidylinositol, polyphosphoinositides, glycosylphosphatidylinositol.

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Харківському національному університеті ім. В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України (м. Харків).

Науковий керівник: доктор біологічних наук Бабенко Наталія Олексіївна, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна МОН України, завідувач відділу фізіології онтогенезу Науково-дослідного інституту біології

Офіційні опоненти доктор біологічних наук, професор Соболєв Валерій Іванович, Донецький національний університет МОН України, завідувач кафедри фізіології людини і тварин

доктор біологічних наук, професор Давидов Вадим В'ячеславович, Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України, завідувач лабораторії вікової ендокринології та обміну речовин

Провідна установа Інститут геронтології АМН України (лабораторія регуляції метаболізму), м. Київ

Захист відбудеться “ 14 ” травня 2003 р. о 15¹⁵ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна (61077, м. Харків, площа Свободи, 4, ауд. ІІІ-15).

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “ 11 ”квітня 2003 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з важливих питань сучасної фізіології є створення уявлень про цілісну картину функціонування живої клітини, яке включає в себе вивчення особливостей сприйняття клітиною регуляторного сигналу, з'ясування шляхів передачі сигналу в клітині, а також механізми формування адекватної фізіологічної відповіді. Відомо, що фосфоінозитиди відіграють важливу роль у процесах росту і диференціації клітин, передачі гормонального сигналу, формуванні фізіологічної відповіді клітин [Martin, 1998, 2001; Marushige, Marushige, 1999; Weermser et al., 1999]. Агоніст-залежний гідроліз фосфатидилінозит-4,5-бісфосфату (ФІФ₂) за участю фосфатидилінозит (ФІ)-специфічної фосфоліпази С (ФЛС), що супроводжується утворенням вторинних посередників: діацилгліцерину (ДАГ) і інозит-1,4,5-трифосфату (ІФ₃), збільшенням концентрації іонів Са²⁺ у цитоплазмі й активацією протеїнкінази С (ПКС), - один з універсальних механізмів проведення гормонального сигналу у клітину [Rhee, Baе, 1997; Anderson et al., 1999]. Глікозилфосфатидилінозити (ГФІ) є також джерелом вторинних месенджерів - ДАГ та інозитфосфогліканів, які впливають на рівень цАМФ, активність протеїнкінази А, регулюють транспорт глюкози в клітину і процеси глюконеогенезу [Singh et al., 1996; Frick et al., 1998; Bogdanowich, Pujol, 2000]. Утворення вторинних месенджерів у відповідь на дію зовнішніх стимулів багато в чому визначається базальним вмістом фосфоінозитидів та інтенсивністю процесів їхнього синтезу в клітинах [Cunningham et al., 1995; Willars et al., 1995]. На цей час існує уявлення, що порушення функціонування поліфосфоінозитидної сигнальної системи на пізніх етапах онтогенезу багато в чому визначає зміну чутливості клітин до дії регуляторних стимулів при старінні [Lipschitz et al., 1991; Witkowski, 1999; Alvarez et al., 2001].

Відомо, що тиреоїдні гормони є не тільки могутніми модуляторами ліпідного обміну [Бабенко, 1991; Hulbert, 1999], але й беруть участь у регуляції чутливості клітин до дії різноманітних агоністів [Andersen et al., 1991; Daza et al., 1998]. Отримано дані про те, що тиреоїдні гормони і тиреоїдний статус організму, в цілому, впливають на регуляцію ключового ферменту обміну фосфоінозитидів - ФЛС [Iruishijima et al., 1992; Jakab et al., 1993]. Разом з тим інформації щодо ролі тиреоїдних гормонів у метаболізмі сигнальних інозитліпідів недостатньо, а онтогенетичний аспект цього питання практично не вивчений. Більш детально досліджені ефекти йодотиронинів, опосередковані ядерними рецепторами [Brent, 1996; Чин, Йен, 2001], але накопичена значна кількість даних і про негеномні ефекти тиреоїдних гормонів, які виявляються на рівні плазматичних мембран та інших субклітинних структур [Дейвис, Дейвис, 2001]. Так, роботами нашої лабораторії встановлено, що дія тироксину на клітини печінки супроводжується короткочасним накопиченням ДАГ, транслокацією ПКС із цитозоля в мембрану і багаторазовою активацією ферменту [Кавок и др. 2000; Кавок, Бабенко, 2001]. Lin et al. (1999) показали, що специфічний інгібітор ФЛС U73122 пригнічує ефект тироксину, який потенціює дію інтерферону- в клітинах HeLa. В той же час прямих доказів активації поліфосфоінозитидної сигнальної системи отримано не було.

Вивчення вікових особливостей ролі тиреоїдних гормонів у регуляції обміну фосфоінозитидів у клітинах печінки допоможе з'ясувати механізми, які лежать в основі регуляції тиреоїдними гормонами чутливості клітин до дії регуляторних стимулів, а також сприятиме розумінню причин порушеня функціональної реактивності клітин печінки при старінні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі фізіології онтогенезу НДІ біології ХНУ в рамках науково-дослідної роботи “Вікові особливості розвитку порушень функції залоз внутрішньої секреції і реалізації гормонального сигналу в тканинах-цілях” (№ держреєстрації 0100U003318).

Мета і задачі дослідження. Робота присвячена вивченню ролі тиреоїдних гормонів у регуляції функціонування фосфоінозитидної сигнальної системи у клітинах печінки щурів різного віку .

Відповідно до мети були поставлені такі задачі:

Вивчити особливості функціонального стану фосфоінозитидної сигнальної системи у печінці щурів різного віку.

Вивчити взаємозв'язок між тиреоїдним статусом організму та функціональним станом фосфоінозитидної сигнальної системи у клітинах печінки щурів в онтогенезі.

Вивчити швидкий ефект тиреоїдних гормонів на функціонування фосфоінозитидної сигнальної системи у гепатоцитах.

Об'єкт дослідження. Гормональна регуляція метаболізму фосфоінозитидів. фосфоінозитидний печінка щур тиреоїдний

Предмет дослідження. Вміст та утворення ФІ, поліфосфоінозитидів, ГФІ, а також водорозчинних інозитфосфатів у тканині печінки та ізольованих гепатоцитах щурів різного віку та тиреоїдного статусу; вміст тироксину та трийодотироніну в сироватці крові тварин.

Методи дослідження. Радіоімунологічні (визначення вмісту тиреоїдних гормонів у сироватці крові щурів), радіоізотопні (включення ³Н- і ¹⁴С-мічених попередників до складу фосфоінозитидів), хроматографічні (використовували тонкошарову та іонно-обмінну хроматографію для розподілу на класи ліпідів та інозитфосфатів), спектрофотометричні (визначення вмісту ліпідів і білку в пробах), статистичні (обробка результатів методом варіаційного аналізу).

Наукова новизна отриманих результатів. Встановлено, що при старінні значно знижується вміст та інтенсивність утворення поліфосфоінозитидів, яке супроводжується уповільненням включення арахідонової та посиленням включення олеїнової жирних кислот до складу цих ліпідів у клітинах печінки. Встановлено, що вікове падіння вмісту ФІ призводить до гальмування процесів утворення ГФІ у печінці старих щурів. Доведено, що тиреоїдні гормони контролюють утворення ФІ та поліфосфоінозитидів у печінці. Зміна тиреоїдного статусу тварин в старості викликає зниження утворення поліфосфоінозитидів у печінці. При цьому регулююча дія йодотиронинів виявляється як в умовах in vivo, так й при безпосередній дії на ізольовані гепатоцити. На ранніх етапах дії на гепатоцити тироксин стимулює гідроліз ФІФ₂ з утворенням ІФ₃, а також обумовлює терминацiю цього процесу завдяки посиленню метаболізму ІФ₃ і ресинтезу поліфосфоінозитидів. В ізольованих гепатоцитах тироксин стимулює синтез ФІФ₂, і цей процес залежить від ПКС.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Виявлені в роботі вікові особливості метаболізму фосфоінозитидів у клітинах печінки можуть стати основою для подальшого вивчення причин порушення функціональної реактивності клітин при старінні. Дані про активацію гідролізу ФІФ₂ і накопичення вторинних месенджерів - ДАГ та ІФ₃ на ранніх етапах дії тиреоїдних гормонів сприятимуть розвитку уявлень про механізми короткострокових ефектів йодотиронинів у клітинах-мішенях.

Отримані в роботі дані про те, що тиреоїдний статус тварин визначає рівень фосфоінозитидів, які беруть участь в передаванні в клітинах-мішенях регуляторних сигналів, сприяють розумінню молекулярних механізмів, що лежать в основі модулюючих ефектів йодотиронинів на чутливість клітин до дії регуляторних факторів.

З огляду на встановлений факт, що тиреоїдні гормони модулюють ефекти ₁-адренорецепторів [Daza et al., 1997] (дія яких опосередкована активацією поліфосфоінозитидної сигнальної системи), отримані в нашій роботі результати доцільно враховувати в клінічній практиці при спільному призначенні йодотиронинів з іншими гормонами і лікарськими препаратами.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційної роботи, встановлення мети та задач, вибір об'єкта та методів дослідження проведені спільно з науковим керівником Автор самостійно провів аналіз наукової літератури за даною проблемою. Експериментальні дослідження проведені автором самостійно. Інтерпретація отриманих даних проведена спільно з науковим керівником.

Апробація результатів. Основні положення дисертаційної роботи були повідомлені на конференції молодих учених біологічного факультету й інституту біології ХДУ (Харків, 1996), міжнародному симпозіумі “Биологические механизмы старения” (Харків, 2002), міській конференції молодих учених (Харків, 2002), науково-практичній конференції “Патогенетичні аспекти фармакотерапії ендокринних захворювань” (Харків, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 робіт серед яких 7 статей і 5 тез доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Матеріали роботи викладені на 133 сторінках друкованого тексту і містять: вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів дослідження, заключення, висновки, список використаних джерел. Матеріали дисертації проілюстровано 20 рисунками і 16 таблицями. Список літератури складається з 314 літературних джерел.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

В експериментах використовували 3- і 24-місячних щурів-самців лінії Вістар. Пригнічення функції щитоподібної залози викликали внутрішньочеревинним введенням 1 мг 1-метил-2-меркаптоімідазолу (мерказолілу) на 100 г маси тіла тварини протягом 16 днів. Тироксин вводили одноразово тваринам, обробленим мерказолілом, за 48 годин до експерименту і нормальним щурам за 15, 30, 60 і 120 хв до забою в дозі 200 мкг/100 г маси тіла. Контролем служили тварини, яким вводили відповідний об'єм фізіологічного розчину. Рівень гормонів щитоподібної залози у сироватці крові піддослідних тварин визначали за допомогою наборів для радіоімунологічного визначення вмісту гормонів РИА-Т3 и РИА-Т4. При вивченні дії тироксину за умов in vitro вміст гормону в інкубаційному середовищі складав 10 нМ. У цьому випадку контрольні проби інкубували в присутності розчинника тироксину - NaOH у концентрації 100 нМ.

Печінку наркотизованих діетиловим ефіром тварин перфузували 0,9%-ним розчином NaCl, суспензію тканини печінки одержували шляхом продавлення органу через перфоровану платівку з діаметром отворів 0,3 мм. Гепатоцити виділяли за методом Канаевой и др. (1975) і Hoek et al. (1985). Нативність клітин оцінювали загальновживаним методом за допомогою трипанового синього. Кількість життєздатних клітин складало 90-95% від їх загальної кількості.

Включення мітки в ліпіди печінки здійснювали шляхом внутрішньочеревинного введення [¹⁴C]ацетату натрію відповідно до схеми, розробленої Кейтсом (1975). В окремих експериментах суспензію тканини інкубували в присутності [³H]інозиту, [¹⁴C]глюкози, [¹⁴С]олеїнової і [³Н]арахідонової кислоти в кількості 0,1 мкКі/мл, 2 мкКі/мл, 0,2 мкКі/мл і 0,2 мкКі/мл, відповідно. Проби інкубували в буфері Кребс-Хенселейт протягом 0-60 хв за умов, описаних для інкубації гепатоцитів. Гепатоцити мітили відразу після виділення шляхом інкубації клітин (10⁷ клітин/мл) протягом 90 хв у буфері Кребс-Хенселейт, рН 7,5, що містив [¹⁴C]лінолеву кислоту (2 мкКі/мл), пеніцилін (61 мг/л), стрептоміцин (100 мг/л), при 37^оС в атмосфері О₂ (95%) - СО₂ (5%). В окремих експериментах [¹⁴C]пальмітинову кислоту (1 мкКі/мл) вносили до середовища інкубації гепатоцитів безпосередньо перед додаванням тироксину і інкубували протягом 0-60 хв в умовах, описаних вище. При дослідженні утворення водорозчинних інозитфосфатів щойновиділені гепатоцити мітили в присутності [³H]інозиту (1 мкКі/мл) протягом 24 годин у середовищі Ігла, рН 7,5, що містило 25 мМ Hepes, 200 мМ глутамін, 61 мг/л пеніцилін, 100 мг/л стрептоміцин, 10% ембріональної сироватки бика, при 37^оС в атмосфері повітря (95%) - О₂ (5 %). Після включення мітки гепатоцити відмивали буфером Кребс-Хенселейт з 0,1% альбуміном і розводили перед початком експерименту в тому же буфері. Концентрація гепатоцитів у цьому випадку складала 3х10⁶ клітин/мл.

В окремих випадках проби містили 127 мкМ сфінгозину, 1 мкМ форбол 12-міристат 13-ацетату (PMA) і 20 мкМ ТМВ-8, які додавали за 5 або 15 хв до внесення тироксину. При вивченні обміну водорозчинних інозитфосфатів частину проб ресуспендували в тому ж буфері, але без іонів Са²⁺ , у присутності 0,2 мМ ЕДТА.

Загальні фосфоліпіди і ДАГ із клітин та суспензії тканини печінки екстрагували за методом Bligh, Dyer (1959), фосфоінозитиди - за методом Andrews, Conn (1987), ГФІ - за методом vant' Hoff et al. (1997). Розподіл ліпідів на фракції проводили методом тонкошарової хроматографії в шарі силікагелю Woelm, використовуючи системи розчинників: 1) для ДАГ - гексан-діетиловый ефір-оцтова кислота (73:25:2, за об'ємом), 2) для фосфоінозитидів - хлороформ-метанол-ацетон-оцтова кислота-вода (30:10:11,5:9:6, за об'ємом), 3) для ГФІ - хлороформ-метанол-вода (10:10:3, за об'ємом). Ліпіди проявляли в парах йоду й ідентифікували порівнянням зі стандартами. Вміст фосфоінозитидів у пробах визначали за методом March, Weinstein (1966), вміст ГФІ - орциновим методом [Покровский, 1990]. Розподіл [³H]інозитфосфатів на фракції проводили за допомогою іонно-обмінної хроматографії за методом, запропонованим Jonson, Murray (1995).

Радіоактивність зразків визначали в рідкому сцинтиляторі ЖС-8 за допомогою лічильника радіоактивності БЕТА-1 ("Медприбор", Київ). Вміст білку в пробах визначали за методом Lowry et al.(1951). Результати дослідів обробляли статистично, використовуючи t-крітерій Стьюдента та непараметричний крітерій Вілкоксону-Манна-Уитні з допомогою пакете програм Statistica for Windows 5.1.

В роботі були використані ЕДТА, Тритон Х-100, сахароза, 8-(діетиламіно)октил 3,4,5-триметилбензоат (ТМВ-8) (“Fluka”, Швейцарія), натрій оцтовокислий-1-¹⁴С (10-50 мКі/ммоль) (ВПО “Изотоп”), набори РИА-Т3 и РИА-Т4 (ГП “ХОП ИБОХ НАНБ”, Білорусь), [³H]міо-інозит, [¹⁴C]олеїнова кислота (58 мКі/ммоль), [³Н]арахідонова кислота (58 мКі/ммоль), [¹⁴C]лінолева кислота (59 мКі/ммоль), [¹⁴C]пальмітинова кислота (60 мКі/ммоль), [³H]міо-інозит-1,4,5-трифосфат, [³H]міо-инозит-1,4-біфосфат, [³H]міо-інозит-1-фосфат, (“Amersham”, Англія), Hepes, трипановый синій (“Serva”, Німеччина), L-тироксин (“Reanal”, Угорщина), орцин (“Merk”, Німеччина), форбол 12-міристат 13-ацетат (РМА), дитіотрейтол, силікагель (“Woelm”, Німеччина), [U-¹⁴C]глюкоза (0,1-1 мКі/ммоль) (“Hemapol”, Чехія) та інші реактиви вітчизняного виробництва кваліфікації х.ч.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вікові особливості метаболізму фосфоінозитидів печінки щурів за умов різного тиреоїдного статусу.

У ході проведених досліджень в печінці 24-місячних щурів було встановлене різке зниження базального вмісту ФІ, ГФІ, фосфатидилінозит-4-фосфату (ФІФ) і ФІФ₂ у порівнянні з 3-місячними тваринами (рис. 1). Зниження в онтогенезі утворення [³H]ФІ, [³H]ФІФ і [³H]ФІФ₂ з [³H]інозиту, яке було виявлене в роботі, може бути важливою причиною падіння рівня цих ліпідів при старінні.

Відомо, що основними джерелами вторинних месенджерів у клітинах є поліненасичені молекулярні різновиди поліфосфоінозитидів, які містять залишки арахідоновї кислоти [Meij et al., 1992]. Збільшення з віком насиченості жирнокислотних компонентів поліфосфоінозитидів у кардіоміоцитах супроводжується порушенням утворення вторинних месенджерів у відповідь на дію агоністів ₁-адренорецепторів [Bordoni et al., 1997]. Ці дані обумовили інтерес до вивчення процесів формування ацильного спектру ФІ та поліфосфоінозитидів печінки тварин різного віку. Встановлено, що у 24-місячних щурів у порівнянні з 3-місячними знижується інтенсивність включення [³Н]арахідонової кислоти до складу ФІФ₂ і збільшується включення [¹⁴С]олеїнової кислоти у ФІФ і ФІФ₂ (табл. 1).

Рис. 1. Вміст ФІ, поліфосфоінозитидів і ГФІ в печінці 24-місячних щурів (Мm, n=6).

Примітки: за 100% прийнятий вміст ФІ, ФІФ, ФІФ₂ і ГФІ в печінці 3-місячних щурів; * - вірогідно у порівнянні з відповідним показником у 3-місячних тварин (р<0,05).

Таблиця 1

Включення [³Н]арахідонової і [¹⁴С]олеїнової кислоти у фосфоінозитиди печінки щурів різного віку (нмоль/мг білку за 60 хвилин інкубації) (Мm, n=6)

Фосфоінозитид	Жирна кислота, яка використовувалася для мічення	Вік тварин, місяці
		3	24
ФІ	[3Н]арахідонова	0,6040,057	0,4560,087
	[14С]олеїнова	0,7980,136	0,3710,025 *
ФІФ	[3Н]арахідонова	0,5510,093	0,5190,061
	[14С]олеїнова	0,2100,025	0,4340,016 *
ФІФ2	[3Н]арахідонова	0,5300,041	0,4270,029 *
	[14С]олеїнова	0,1660,012	0,2640,019 *

Примітка: * - вірогідно у порівнянні з відповідним показником у 3-місячних тварин (р<0,05).

Виходячи з того, що ФІ є попередником ГФІ, було проведено дослідження синтезу ГФІ у печінці тварин різного віку. В старості в 1,6 рази знижується утворення [¹⁴С]ГФІ печінки з екзогенного попередника [¹⁴С]глюкози у порівнянні з 3-місячними щурами. Оскільки в печінці 24-місячних тварин спостерігається падіння вмісту і синтезу ФІ, виникло припущення, що цей факт є причиною зниження інтенсивності синтезу ГФІ. Внесення екзогенного ФІ стимулює утворення [¹⁴С]ГФІ в печінці старих щурів. Отримані дані свідчать про те, що зниження рівня ФІ в клітинах печінки є однією з основних причин порушення синтезу ГФІ при старінні.

Таким чином, при старінні у печінці щурів спостерігається значне зниження базального рівня й обміну ФІ, ФІФ, ФІФ₂ і ГФІ, а також зниження включення поліненасичених жирних кислот до складу поліфосфоінозитидів.

З огляду на той факт, що модифікація рівня й обміну фосфоліпідів у печінці в ході постнатального онтогенезу багато в чому визначається віковими змінами функціональної активності щитоподібної залози [Бабенко, 1991; Нікітін, Бабенко, 1992], у нашій роботі вивчали зв'язок між зміною тиреоїдного статусу і рівнем обміну фосфоінозитидів в онтогенезі.

Пригнічення функціональної активності щитоподібної залози у 3-місячних щурів супроводжується зниженням включення [³Н]інозиту до складу ФІФ і ФІФ₂, тоді як вміст [³Н]ФІ практично не змінюється (рис. 2А). Введення тироксину тваринам, обробленим мерказолілом, приводить до зниження рівня [³Н]ФІ і збільшення вмісту [³Н]ФІФ і [³Н]ФІФ₂ (рис. 2Б).

У старих тварин зниження рівня тиреоїдних гормонів стимулює накопичення [³Н]ФІФ, тоді як вміст [³Н]ФІ і [³Н]ФІФ₂ вірогідно не змінюється (рис. 3А). Оскільки ФІФ є проміжною ланкою у ланцюзі синтезу сигнальних фосфоінозитидів, у тому числі фосфатидилінозит-3,4,5-трисфосфату [Rameh, Cantley, 1999], то накопичення, що спостерігається, може бути пов'язане з порушенням подальшої утилізації цього ліпіду в клітинах печінки 24-місячних тварин за даних експериментальних умов. Замісне введення тироксину старим щурам знижує рівень [³Н]ФІФ у печінці (рис. 3Б).

Введення тироксину на тлі ін'єкцій мерказолілу нівелює вікові відмінності утворення [³Н]ФІ, [³Н]ФІФ і [³Н]ФІФ₂ у печінці щурів (рис. 4).

Таким чином, синтез ФІ і поліфосфоінозитидів тісно пов'язаний з тиреоїдним статусом тварин, тому зниження функціональної активності щитоподібної залози в старості може обумовлювати виявлене нами порушення метаболізму цих ліпідів у печінці 24-місячних тварин. Введення тваринам обох вікових груп тиреостатичого препарату супроводжується накопиченням у печінці ГФІ. Тироксин не змінює вмісту ГФІ в печінці 3-місячних щурів, але приводить до збільшення ГФІ в печінці 24-місячних. Введення тироксину згладжує, але не нівелює, вікові розходження у вмісті ГФІ.

Відомо, що процеси ацилювання фосфоліпідів тісно пов'язані з тиреоїдним статусом організму [Бабенко, Кавок, 1994], тому у наступній серії експериментів вивчали вікові особливості включення жирних кислот різного ступеня насиченості у ФІ і поліфосфоінозитиди печінки щурів. Інтенсивність включення [³Н]арахідонової і [¹⁴С]олеїнової кислоти в поліфосфоінозитиди клітин печінки щурів різних експериментальних груп (еутиреоїдні, мерказоліл і мерказоліл+тироксин) практично не відрізняється в обох вікових групах тварин. Це дозволяє припустити, що вікове порушення обміну ацильних компонентів поліфосфоінозитидів не пов'язане зі зниженням функціональної активності щитоподібної залози при старінні.

Наведені дані свідчать про те, що тиреоїдні гормони відіграють важливу роль у регуляції синтезу ФІ, ФІФ і ФІФ₂, а також залучені до регуляції вмісту ГФІ печінки щурів різного віку. В той же час обмін ацильних компонентів поліфосфоінозитидів не залежить від тиреоїдного статусу організму.

Наступна серія експериментів була присвячена вивченню особливостей обміну фосфоінозитидів у печінці щурів різного віку на ранніх етапах дії тиреоїдних гормонів. Введення тироксину 3-місячним щурам, ліпіди печінки яких були попередньо мічені з використанням [¹⁴С]ацетату натрію, супроводжувалося швидким, але короткочасним збільшенням вмісту [¹⁴С]ФІ та [¹⁴С]ФІФ₂ на 15-й і 60-й хв і [¹⁴С]ГФІ - на 30-й хв експерименту (рис. 5А). В подальшому, на 120-й хв дії гормону вміст усіх досліджених [¹⁴С]фосфоінозитидів нормалізувався. Кількісні характеристики і динаміка обміну фосфоінозитидів у печінці 24-місячних щурів після введення тироксину різко відрізнялася від таких у молодих тварин. У старих щурів підвищення рівня усіх [¹⁴С]фосфоінозитидів спостерігалося водночас, на 120-й хв експерименту (рис. 5Б).

Таким чином, установлено, що тиреоїдні гормони беруть участь у регуляції обміну фосфоінозитидів у печінці не тільки через тривалий лаг-період, але і на ранніх етапах після їх введення в організм. З огляду на те, що вікова зміна чітливості клітин до дії регіляторних стимулів може бути пов'язана з порушенням утворення сигнальних месенджерів [Sawaki et al., 1995], а також враховуючи той факт, що при короткочасній дії тироксину на гепатоцити старих тварин спостерігається порушення утворення ДАГ [Кавок, Бабенко, 2001], важливим джерелом яких є фосфоінозитиди, наступна серія експериментів присвячена вивченню швидких ефектів тироксину на метаболізм фосфоінозитидів у ізольованих клітинах печінки.

Участь фосфоінозитидів у реалізації швидких ефектів тиреоїдних гормонів на клітини печінки щурів.

Відомо, що гідроліз поліфосфоінозитидів є важливим джерелом утворення ДАГ [Wakelam, 1996]. Раніше було показано, що тироксин стимулює накопичення ДАГ в ізольованих гепатоцитах 3-місячних щурів протягом перших секунд і хвилин дії гормону [Кавок и др., 2000; Кавок, Бабенко, 2001]. Наші експерименти показали, що протягом перших секунд дії на ізольовані гепатоцити, які попередньо мітили в присутності [³Н]інозиту і [¹⁴C]лінолевої кислоти, тироксин стимулює падіння рівня ФІФ₂ і накопичення ДАГ (табл. 2) та ІФ₃ (табл. 3). Ці дані свідчать про те, що на ранніх етапах дії тироксин активує ФІ-специфічну ФЛС. Використання [¹⁴C]лінолевої кислоти в цих дослідах було зумовлене тим, що переважно поліненасичені різновиди ДАГ беруть участь у активації ПКС [Abdel-Latif, 1986].

Відомо, що іони кальцію відіграють важливу роль в активації ФІ-специфічних ФЛС [Pawelcsyk et al., 1997]. Hummerich and Soboll [1989] установили, що тироксин протягом перших секунд стимулює збільшення концентрації іонів кальцію в клітинах печінки. У зв'язку з цим виникло припущення, що іони Са²⁺ виступають посередниками в активації ФЛС під дією тироксину. Як видно з результатів, наведених у табл.3, вилучення іонів кальцію із середовища інкубації клітин не відміняло ефекту тироксину на накопичення ДАГ та інозитфосфатів. Ці дані свідчать про те, що процес активації ФЛС в гепатоцитах під дією тироксину не пов'язаний зі швидким входженням іонів кальцію в клітину. Оскільки на цей час встановлене існування механізму реалізації негеномних ефектів йодотиронінів, початковим етапом якого є взаємодія гормону зі специфічним рецептором [Lin et al., 1999], а також враховуючи дані літератури щодо наявності на плазматичній мембрані гепатоцита рецепторів до тироксину [Guliamova et al., 1995], можна припустити, що активуюча дія тироксину на ФЛС зумовлена взаємодією тироксину зі специфічним рецептором.

Важливим етапом процесу передачі гормонального сигналу є утилізація метаболічно активних вторинних месенджерів з утворенням неактивних похідних сполук [Berridge, 1986]. Відомо, що ІФ₃ стимулює вивільнення іонів кальцію з внутрішньоклітинних депо [Igwe, Filla, 1997], а підвищення концентрації Са²⁺ у цитоплазмі клітин, в свою чергу, сприяє активації ферментів, залучених до утилізації ДАГ - ДАГ-кінази і ДАГ-ліпази [Abdel-Latif, 1986; Topham, Prescott, 1999]. Оскільки в наших умовах експерименту тироксин не викликав вивільнення [¹⁴C]жирних кислот у гепатоцитах, можна виключити участь ДАГ-ліпази в утилізації новоутворених [¹⁴C]ДАГ. При дії тироксину на гепатоцити, які преінкубували з хелатором внутрішньоклітинного кальцію ТМВ-8, спостерігається більш значне накопичення [¹⁴C]ДАГ, у порівнянні з ефектом гормону на інтактні гепатоцити (табл. 2). Отже, ТМВ-8, зв'язуючи іони кальцію, збільшення концентрації яких індукується ІФ₃, може перешкоджати активації ДАГ-кінази [Topham, Prescott, 1999] клітин печінки і утилізації новоутворених [¹⁴C]ДАГ.

Таблиця 2

Вплив іонів кальцію на індуковане тироксином утворення [¹⁴C]ДАГ в гепатоцитах (імп/хв на 10⁷ клітин) (Мm, n=5).

Умови експерименту	[14C]ДАГ
Контроль	1831337
Тироксин	4272780*
Контроль + ТМВ-8	1610349
Тироксин +ТМВ-8	75371139*

Примітки: час інкубації клітин с гормоном - 15 сек., * - вірогідно по відношенню до контролю (р< 0,05).

Протягом перших секунд дії гормону в гепатоцитах спостерігалося накопичення не тільки ІФ₃, але й ІФ₂, неактивного по відношенню до мобілізації іонів Са²⁺ (табл. 3). Таким чином, отримані дані свідчать про стимуляцію тироксином не тільки утворення вторинних месенджерів, але і їхню утилізацію, що відіграє важливу роль у термінації сигнального процесу.

Таблиця 3

Вплив тироксину на утворення окремих фракцій інозитфосфатів у гепатоцитах, попередньо мічених [³H]інозитом (імп/хв на 10⁷ кл) (Мm, n=5).

Інозит-фосфати	Варіант досліду
	Контроль	Тироксин	Тироксин + ЕДТА
ІФ	1360182	148395	1538207
ІФ2	901132	1856125 *	1620150 *
ІФ3	63232	108637 *	109125 *

Примітки: час інкубації клітин с гормоном - 15 сек., * - вірогідно по відношенню до контролю (р< 0,05).

Відсутність накопичення ДАГ у клітинах печінки 24-місячних щурів у відповідь на дію йодотиронинів, виявлене в роботі Кавок, Бабенко (2001), може свідчити про порушення у функціонуванні поліфосфоінозитидної сигнальної системи і бути однією з причин зміни відповіді клітин печінки на більш пізніх етапах дії гормону. Порушення процесів передачі гормонального сигналу в клітинах печінки при старінні спричиняється, очевидно, віковим гальмуванням процесів синтезу ФІ і поліфосфоінозитидів, а також зниженням долі арахідонової кислоти в складі ФІФ₂, що свідчить про редукцію поліненасичених різновидів цього ліпіду, головного попередника ДАГ.

Відомо, що ресинтез ФІ і поліфосфоінозитидів є невід'ємною частиною агоніст-залежної активації поліфосфоінозитидної сигнальної системи [Antonsson, 1997]. Нашими дослідженнями встановлено, що в ізольованих гепатоцитах 3-місячних щурів тироксин стимулює включення [¹⁴С]пальмітинової кислоти до складу ФІФ₂ (табл. 4) і фосфатидної кислоти - попередника синтезу фосфоінозитидів. Спираючись на дані про те, що [¹⁴С]пальмітинова кислота включається до складу фосфоліпідів в ході їх синтезу de novo, отримані дані свідчать, що тироксин стимулює новоутворення ФІ та поліфосфоінозитидів у ізольованих гепатоцитах.

Спираючись на припущення про участь ПКС у регуляції тиреоїдними гормонами синтезу фосфоліпідів печінки [Бабенко и др., 1992], ми провели серію досліджень щодо вивчення участі ПКС у синтезі ФІФ₂ на моделі ізольованих гепатоцитів. Інкубація клітин у присутності активатору ПКС РМА стимулювала включення [¹⁴С]пальмітинової кислоти до складу фосфоінозитидів, тоді як попередня інкубація клітин зі сфінгозином (інгібітором ПКС) цілком відміняла цей ефект (табл. 5).Той факт, що РМА імітує дію тироксину на накопичення [¹⁴С]ФІФ₂, тоді як сфінгозин відміняє ефект гормону (табл. 4), свідчить про важливу посередницьку роль ПКС у дії гормону на синтез ФІФ₂ в ізольованих гепатоцитах 3-місячних щурів.

Таблиця 4

Вплив короткочасної дії тироксину на синтез фосфоінозитидів у ізольованих гепатоцитах (нмоль на 3?10⁶ клітин) (Мm, n=7).

Фосфоінозитид	Варіант досліду
	Контроль	Тироксин	Сфінгозин + тироксин
ФІ	0,6720,200	1,040,25	1,120,17
ФІФ	0,3610,044	0,3850,031	0,3610,051
ФІФ2	0,2630,023	0,3790,031 *	0,3180,026

Примітки: час інкубації клітин с гормоном - 60 хв., сфінгозин вносили до інкубаційного середовища за 5 хв. до тироксину; * - вірогідно по відношенню до контролю (р < 0,05).

Таблиця 5

Вплив РМА на процес включення [¹⁴С]пальмітинової кислоти в фосфоінозитиди гепатоцитів, попередньо оброблених сфінгозином (нмоль/3 · 10⁶ клітин) (Мm, n=8)

Ліпід	Варіант досліду
	Контроль	РМА	РМА + сфінгозин
ФІ	0,3720,077	0,9820,301*	0,4140,075
ФІФ	0,3680,043	0,9360,180*	0,3810,075
ФІФ2	0,3080,047	1,1030,166*	0,2790,022

Примітки: час інкубації клітин с РМА - 20 хв., сфінгозин вносили до інкубаційного середовища за 5 хв. до внесення РМА; * - вірогідно по відношенню до контролю (р< 0,05).

Таким чином, у ході проведених досліджень було встановлено, що при старінні відбувається зниження базального рівня ФІ, ФІФ, ФІФ₂ і ГФІ на тлі зниження інтенсивності синтезу цих ліпідів de novo і порушення процесів ацилювання ФІ і поліфосфоінозитидів. Зміна тиреоїдного статусу тварин різного віку введенням мерказолілу й екзогенного тироксину супроводжувалася глибокими порушеннями синтезу досліджених фосфоінозитидів. Зниження функціональної активності щитоподібної залози при старінні є однією з причин падіння синтезу ФІ і поліфосфоінозитидів. Регулюючий ефект гормону на обмін фосфоінозитидів проявлявся не тільки за умов дії гормону in vivo, але і при короткочасному безпосередньому впливі на ізольовані гепатоцити. При цьому найбільш ранньою відповіддю клітин була активація поліфосфоінозитид-специфічної ФЛС, яка супроводжувалася посиленням ПКС-залежного ресинтезу ФІФ₂ і перетворенням ІФ₃ на неактивні водорозчинні інозитфосфати.

ВИСНОВКИ

При старінні в печінці щурів знижується вміст і обмін досліджених сигнальних фосфоінозитидів. Вікова зміна тиреоїдного статусу організму впливає на обмін ФІ і поліфосфоінозитидів печінки. При безпосередній дії тироксину на гепатоцити спостерігається короткочасна активація поліфосфоінозитидної сигнальної системи.

При старінні у клітинах печінки знижується базальний рівень і інтенсивність синтезу ФІ, ГФІ, ФІФ і ФІФ₂ de novo. У 24-місячному віці уповільнюється включення арахідонової кислоти і прискорюється - олеїнової кислоти до складу ФІФ і ФІФ₂ у порівнянні з 3-місячним.

Пригнічення функції щитоподібної залози у молодих тварин призводить до гальмування включення [³H]інозиту у ФІФ і ФІФ₂ печінки. Нормалізація тиреоїдного статусу компенсує порушення синтезу ФІФ₂, збільшує утворення ФІФ і пригнічує - ФІ. У старих тварин зниження рівня йодотиронинів викликає накопичення в печінці новосинтезованого ФІФ і не впливає на синтез інших ліпідів. Введення тироксину старим тваринам сприяє нормалізації процесів синтезу ФІФ у печінці.

На ранньому етапі дії тироксину на організм статевозрілих тварин спостерігається швидкі та короткочасні, але різнонаправлені зміни рівня новосинтезованих ФІ, ФІФ₂ і ГФІ у печінці. У старих тварин, на відміну від молодих, при дії тироксину відбувається збільшення вмісту всіх вивчених фосфоінозитидів через більш значний відрізок часу.

В ізольованих гепатоцитах тироксин викликає швидке, але короткочасне накопиченням ДАГ та ІФ₃ на тлі зниження рівня ФІФ₂, що свідчить про активацію ФІ-специфічної ФЛС.

Ефект тироксину на накопичення ДАГ і водорозчинних інозитфосфатів у гепатоцитах не відміняється при вилученні іонів Са²⁺ з середовища інкубації клітин.

Тироксин сприяє термінації процесу деградації ФІФ₂, через посилення метаболізму ІФ₃ і ресинтезу ФІФ₂.

У молодих тварин тироксин стимулює синтез de novo ФІФ₂ і фосфатидної кислоти в ізольованих гепатоцитах. Ефект тироксину на накопичення ФІФ₂ імітується РМА і нівелюється сфінгозином, що свідчить про залучення ПКС у цей процес.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Красильникова О.А., Бабенко Н.А. Роль тиреоидных гормонов в регуляции синтеза фосфатидной кислоты, фосфатидилинозита и полифосфоинозитидов в клетках печени //Биохимия.-1996.-Т.61, №8.-С.1422-1431.

Красільнікова О.А., Натарова Ю.О., Бабенко Н.О. Особливості впливу тироксину на синтез сфінгозину та фосфоінозитидів у печінці щурів в онтогенезі //Фізіологічний журнал.-2000.-Т.46, №3.-С.26-32.

Кавок Н.С., Красильникова О.А., Бабенко Н.А. Роль тиреоидных гормонов в регуляции обмена полифосфоинозитидов и фосфатидилхолина в печени крыс //Вісник Харківського університету.-2000.-Т.456.-С.99-101.

Красильникова О.А. Участие тиреоидных гормонов в регуляции метаболизма фосфатидилинозита и полифосфоинозитидов в печени крыс //Вісник Харківського університету.-2001.-Т.506.-С.266-268.

Kavok N.S, Krasilnikova O.A., Babenko N.A. Thyroxine signal transduction in liver cells involves phospholipase C and phospholipase D activation. Genomic independent action of thyroid hormone //BMC Cell Biology.-2001.-Vol.2-P.5.

.http://www.biomedcentral.com/1471-2121/2/5

Красильникова О.А. Синтез фосфатидилинозита, полифосфоинозитидов и гликозилфосфатидилинозита в печени крыс различного возраста и тиреоидного статуса //Вісник Харківського університету.-2002.-Т.551.-С159-164.

Krasilnikova O.A., Kavok N.S., Babenko N.A. Drug induced and postnatal hypothyroidism impairs the accumulation of diacylglycerol in liver and liver cell plasma membranes//BMC Physiology.-2002.-Vol.2.-P.12

http://www.biomedcentral.com/1472-6793/2/12.

Babenko N.A., Kavok N.S., Krasilnikova O.A. Agе-peculiarities of liver and intestine lipids metabolism regulation //III European Congress of Gerontology. Abstracts. 30 August - 1 September 1995, Utrecht, Netherlands - 0196.

Красильникова О.А. Влияние тироксина на обмен инозитсодержащих липидов// Материалы научной конференции молодых ученых биологического факультета и научно-исследовательского института биологии.-Харьков:ХГУ, 1996.-С.29.

Красільнікова О.А. Вплив тироксину на обмін поліфосфоінозитидів у печінці білих щурів //Матеріали ХV з'їзду Українського фізіологічного товариства.-Фізіологічний журнал.-1998.-Т.44, №3.-С.212-213.

Красильникова О.А., Никитина И.В., Бабенко Н.А. Роль тиреоидных гормонов в регуляции обмена инозитсодержащих фосфолипидов в печени крыс //Матеріали науково-практичної конференції. Патогенетичні основи фармакотерапії ендокринних захворювань.-Тез. доп.-6-7 лютого 2002 р.-Харків, 2002.-С.65.

Красильникова О.А. Возрастные особенности включения олеиновой и арахидоновой кислот в полифосфоинозитиды печени крыс // V Международный симпозиум. Биологические механизмы старения.-Тез.докл.-30 мая-1 июня 2002 г.-Харьков, 2002.-С.30.

Размещено на Allbest.ru

...