Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

Національна академія наук України

УДК 574.23 : 582.288.4

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Екологічна характеристика мікроміцетів, що виявили ознаку позитивного радіотропізму

03.00.07 - мікробіологія

Карпенко Юлія Вікторівна

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії Наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Жданова Неллі Миколаївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фізіології та систематики мікроміцетів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Соломко Ельвіра Федорівна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, старший науковий співробітник відділу мікології

доктор біологічних наук, професор Гамалія Микола Федорович, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу клітинної фотобіології і фотомодуляції росту пухлин

Провідна організація: Одеський державний університет ім. І.І. Мечнікова, кафедра мікробіології, Міністерство освіти України, м. Одеса

Захист відбудеться “ 17 ” грудня 2003 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154

Автореферат розісланий “7” листопада 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Дослідження ґрунтових грибів, вилучених із зони відчуження ЧАЕС, дозволило виявити ряд цікавих морфологічних та фізіологічних характеристик вивченої мікобіоти, зокрема, здатність ряду грибів обростати та з часом руйнувати “гарячі” частинки в модельній системі [Жданова и др., 1991, 1994]. В результаті більш детального дослідження цього процесу виявилось, що він обумовлений направленим ростом грибного міцелію до “гарячої” частинки (позитивний радіотропізм - новий серед інших видів тропізмів грибів). Це дозволило прийти до висновку, що мікроміцети, які мають таку властивість, можуть брати участь в процесах біогенного руйнування “гарячих” частинок, помітно прискорюючи процес їх природного руйнування (за швидкістю росту в модельній системі - в 10-15 разів), тобто можуть бути перспективними в подальших розробках по знешкодженню радіоактивних відходів.

Оскільки вивчені нами штами грибів були виділені з твердих субстратів, ми вважали доцільним в першу чергу дати детальну характеристику їх ростових процесів як інтегрального показника метаболічного стану організму на агаризованих середовищах [Kotov, Reshetnikov, 1990; Moore, 1998], а також направлено дослідити ряд фізіолого-екологічних ознак, притаманних організмам, вилученим з радіоактивних субстратів.

Більшість живих організмів на 80% складаються з води, тому вплив іонізуючого випромінювання повинен викликати в них утворення активних форм кисню [Гамалей, Клюбин, 1991; Штамм и др., 1991]. Серед останніх найбільш стійким є перекис водню [Менщикова и др., 1994; Штамм и др., 1991], дію якого на різноманітні організми часто вивчають в лабораторних умовах. Стійкість організму до такої речовини може в ряді моментів корелювати з його стійкістю до іонізуючого випромінювання [Эйдус, 2001].

Виходячи з вищесказаного, продовження вивчення штамів з ознакою позитивного радіотропізму та більш детальне дослідження особливостей біології мікроміцетів, вилучених із зони відчуження ЧАЕС, є доцільним та актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту, зокрема з темами “Дослідити еколого-фізіологічну активність мікроміцетів в умовах екстремальних антропогенних навантажень” (№ державної реєстрації 0100U004338). Робота була підтримана грантом National Science Foundation grant (IBN 981141).

Наукова робота Карпенко Ю.В. була відзначена стипендією Президії НАН України на 2003-2004 роки.

Мета і задачі дослідження. Метою представленої роботи було еколого-фізіологічне дослідження мікроскопічних грибів, які були виділені з різних субстратів зони відчуження ЧАЕС та мали ознаку позитивного радіотропізму. Це вимагало вирішення таких завдань:

1. Дослідити основні ростові параметри (радіальна швидкість росту, одиниця гіфального росту, інтенсивність освоєння субстрату) мікроскопічних грибів, виділених з радіоактивно забруднених субстратів та штамів тих же видів, ізольованих з чистих від радіонуклідів територій;

2. Розробити модельну систему та дослідити вплив слабкого освітлення (1 лк) білим світлом на ряд мікроміцетів;

3. Провести порівняльне дослідження реакцій радіотропізму та фотостимуляції тих же грибів;

4. Вивчити вплив довготривалої дії градієнту перекису водню на апікальний ріст ряду грибів, виділених із зони відчуження ЧАЕС.

Об'єктами дослідження були мікроскопічні гриби відділів Zygomycota, Ascomycota та Mitosporic fungi, які були виділені з радіоактивно забруднених субстратів та з чистих відносно радіонуклідів регіонів (контрольні).

Предметом дослідження було вивчення ряду еколого-фізіологічних показників вищевказаних грибів.

Методи дослідження. Вирішення задач дослідження реалізувалось комплексом засобів, який включав класичні методи експериментальної мікології, а також оригінальні методики - визначення ознаки радіотропізму, вивчення фотостимуляції грибів, вивчення впливу градієнту концентрацій перекису водню на гіфальний ріст мікроміцетів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше для характеристики росту міцеліальних організмів було застосовано поняття інтенсивності освоєння субстрату (І) на прикладі мікроскопічних грибів. Вивчення ростових параметрів ряду мікроміцетів, виділених із зони відчуження ЧАЕС, дозволило виявити дві притаманні їм принципово різні стратегії освоєння субстрату: швидкий ріст з слабким спороношенням та, навпаки, досить повільний ріст з утворенням великої кількості дрібних конідій.

Дослідження властивості радіотропізму серед широкого кола грибів дозволило виявити адаптивний характер цієї ознаки, яка притаманна лише штамам, виділеним з радіоактивних субстратів. Реакція позитивного радіотропізму спостерігалась як у меланінвмісних, так і у світлозабарвлених видів, та проявлялась на штамовому, а не на видовому рівні.

Розроблено модельну систему для дослідження впливу слабкого освітлення (1 лк) білим світлом на розвиток грибів та показано їх високу чутливість до такої дії. Вперше виявлено повне співпадіння реакцій радіотропізму та фотостимуляції у досліджених нами грибів. Зроблено припущення про універсальність фото- та радіорецепторних систем у грибів

Розроблено та вперше використано оригінальну методику для вивчення впливу перекису водню на апікальний ріст грибів. Гриби, виділені з радіоактивних субстратів, проявили високу резистентність до великих концентрацій перекису водню (10-2-10-1 М), які не були летальними для грибів, виділених із зони відчуження ЧАЕС, що може свідчити про значну загальну резистентність таких організмів.

Практичне значення одержаних результатів. Визначення фотостимуляції як ознаки, сполученої з ознакою позитивного радіотропізму, може бути перспективним методом для виявлення радіотропічних штамів без використання джерела г-випромінювання.

Отримані ростові показники (зокрема, інтенсивність освоєння субстрату) можуть бути використані для екологічних прогнозів щодо біодеструкції будівельних конструкцій приміщень 4-го блоку ЧАЕС.

Матеріали дисертаційної роботи використовуються в курсі лекцій “Основи загальної мікології” на біологічному факультеті Київського Державного Університету ім. Тараса Шевченко, кафедра мікробіології.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором особисто. Автором самостійно проведено визначення ростових показників одиниці гіфального росту та інтенсивності освоєння субстрату ряду мікроміцетів на агаризованих середовищах. Розроблено систему для визначення фотоефектів грибів та досліджено реакції мікроскопічних грибів на слабке освітлення, а також зв'язок таких реакцій з реакціями позитивного радіотропізму. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з теми дисертації, проведено статистичну обробку всіх отриманих експериментальних даних, їх аналіз та співставлення з існуючими даними літератури, а також підготовку матеріалів результатів досліджень для їх публікації.

Визначення радіальної швидкості росту проведено сумісно з к.б.н. Вембер В.В., яка є співавтором відповідних публікацій. Дослідження ознаки позитивного радіотропізму проведене сумісно з к.б.н. Редчиць Т.І., яка також є співавтором публікацій. При дослідженні впливу перекису водню на ріст грибних гіф консультативну допомогу надавав д.ф.-м.н. К.Б. Асланіді (Інститут теоретичної та експериментальної біофізики РАН). У плануванні основних напрямків роботи та обговоренні результатів брав участь науковий керівник д.б.н. проф. Жданова Н.М.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені, доповідались та обговорювались на: Міжнародній науково-практичній школі для молодих вчених та спеціалістів “Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (м. Ужгород, жовтень 2001 р.); Щорічній науковій конференції в Інституті ядерних досліджень НАН України, секція “Радіоекологія. Радіобіологія” (Інститут ядерних досліджень НАН України, січень, 2002 р.; лютий 2003 р.); I съезде микологов России (м. Москва, Росія, квітень 2002 р.); Международной конференции “Микробиология и биотехнология XXI столетия” (Мінськ, Бєларусь, травень 2002 р.); Конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників в Інституті мікробіології та вірусології НАН України (грудень 2001 р.; грудень, 2002 р.); засіданні мікологічної секції Українського Ботанічного Товариства (Інститут ботаніки ім. Холодного НАН України, квітень, 2003 р.); 7-й Пущинской школе-конференции “Биология - наука XXI века” (м. Пущіно, Росія, квітень 2003 р.); 22nd Fungal Genetics Conference at Asilomar (Pacific Grove, California, USA, March 18-23, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць: 6 статей у наукових фахових виданнях та 5 тез.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 154 cторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали та методи досліджень”, “Експериментальна частина”, “Заключення”, “Висновки”, “Список використаних джерел”, який містить 287 найменувань, в тому числі 210 іноземних авторів. Робота містить 8 таблиць та 42 рисунки.

РОЗДІЛ 1. Огляд літератури

Складається з 3 підрозділів, в яких докладно розглянуті питання росту мікроскопічних грибів на щільних середовищах, розвитку грибної колонії, ритмічного росту колонії. Розглянуті тропічні реакції грибів, зокрема реакція фототропізму та впливу світла на розвиток грибів. Також проаналізовані питання впливу іонізуючого випромінювання на грибні об'єкти та участі перекису водню в цьому процесі, а також питання радіостійкості грибів.

РОЗДІЛ 2. Матеріали та методи досліджень

Об'єктами досліджень були 65 штамів 13 видів 8 родів мікроміцетів, виділених з радіоактивно забруднених субстратів 10-км зони ЧАЕС та місцеіснувань з фоновим рівнем радіоактивності. Ці ізоляти були отримані з колекції відділу фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології НАНУ.

Ростові показники було досліджено для 63 штамів 13 видів 8 родів. Порівняльне вивчення реакцій радіотропізму та фотостимуляції було проведено для 23 штамів 11 видів 8 родів. Вплив градієнту перекису водню вивчено для 3 видів 3 родів (7 штамів).

Методи досліджень. В залежності від мети дослідження штами грибів культивували на агаризованих середовищах - сусло-агарі (СА), голодному агарі (ГА), середовищі Чапека та на модифікованому рідкому поживному середовищі Чапека з вмістом сахарози 100 мг/л.

Визначення радіальної швидкості росту проводили за загально відомими методами (Паников, 1991; Перт, 1978, Методи…, 1982). Висновки про галуження грибного міцелію робили за значеннями показника одиниці гіфального росту, який визначали за загальноприйнятим методом Trinci [1974]. Показник інтенсивності освоєння субстрату на основі радіальної швидкості росту та одиниці гіфального росту розраховували, використовуючи викладки Prosser [1993].

Ознаку позитивного радіотропізму визначали за методом, розробленим Ждановою Н.М. та Редчиць Т.І. [1991, 1994] (Рис. 1).



Рис. 1. Схема пристрою для визначення реакцій радіотропізму мікроскопічних грибів: 1 - свинцевий захисний контейнер; 2 - кришка свинцевого захисного контейнеру; 3 - відсік, в якому знаходиться радіоактивний матеріал; 4 - регулятор висоти радіоактивного матеріалу; 5 - радіоактивний матеріал; 6 - коліматор, d=1 мм; 7 - предметне скло з лункою, в яку вносили суспензію конідій гриба.

Фотостимуляцію грибів вивчали за методом [Блажеєвська, Редчиць, 2003], розробленим на основі експрес-методу для визначення радіотропізму [Жданова и др., 1991, 1994] (Рис. 2).

При розрахунках інтенсивності освітлення, яке супроводжує іонізуюче випромінювання радіоактивного джерела, було встановлено, що в нашому випадку воно дорівнювало 1 лк [Вальтер, Залюбовский, 1991].

Вивчення тривалого впливу перекису водню на апікальний ріст проводили на базі Інституту теоретичної та експериментальної біофізики РАН під керівництвом доктора фізико-математичних наук Асланіді К.Б.

Отримані в роботі дані оброблені статистично [Лакин, 1968], з використанням програм Microsoft Exel_97 та SigmaStat_2.0.

Рис. 2. Схема пристрою для визначення фотореакцій мікроскопічних грибів: 1 - лампа білого світла, 100 Вт; 2 - тепловий фільтр; 3 - діафрагма, відкрита на 1 мм; 4 - предметний столик мікроскопа; 5 - чорна підложка з отвором d=1 мм; 6 - предметне скло з лункою, в яку вносили суспензію конідій гриба.

РОЗДІЛ 3. Дослідження ряду ростових параметрів у мікроміцетів, виділених з радіоактивних субстратів

Крім радіальної швидкості росту, у вивчених штамів визначали такі ростові параметри: тривалість лаг-фази, максимальний (в рамках експерименту) діаметр колонії, максимальні та мінімальні значення радіальної швидкості росту та характер ритмічного росту.

На СА тривалість лаг-фази всіх вивчених штамів коливалась від 7 (швидкоростучі ізоляти родів Penicillium та Ulocladium) до 39 год. (представники повільноростучого Cladosporium sphaerospermum). Лише штами Alternaria alternata практично не мали лаг-фази на СА, що може пояснюватись можливістю розмноження цього виду не конідіями, а фрагментами міцелію певної довжини, проростання яких на повноцінному середовищі відбувається практично без затримки [Иванова, 1999; Иванова, Марфенина, 1998]. На ГА початок росту штамів цього виду відбувався через 24 год., а для решти штамів коливався в межах 7-39 год.

Наприкінці експерименту (240-432 год.) на обох середовищах максимальний радіус колонії мали представники видів U. consortiale, A. alternata, P. roseo-purpureum, C. cladosporioides та P. spinulosum. Мінімальний - штами C. sphaerospermum 5-1 та 60, виділені з високорадіоактивних субстратів.

Для переважної більшості вивчених нами штамів була характерна здатність генерувати 1,0-добові біоритми.

Найбільшими значеннями біоритмів (1,5-2 доби) характеризувались штами C. sphaerospermum, які мали найменшу швидкість росту. Найменші значення біоритмів - 0,5 доби - мали штами U. сonsortiale, які росли найшвидше. Тобто, порівнюючи тривалість біоритмів та радіальну швидкість росту, можна спостерігати певний зв'язок між ними - чим більше значення радіальної швидкості росту, тим менше тривалість біоритмів, і навпаки. Виключення становили лише штами A. alternata, які мали найвищі значення швидкості росту, але тривалість їх біоритмів складала 1-1,5 доби.

За середніми значеннями радіальної швидкості росту всі вивчені види розподілились на три основні групи: 1) види з найвищою швидкістю росту - U. consortiale (0,16-0,19 мм/год.) та A. alternata (0,15-0,20 мм/год.); 2) вид, швидкість росту якого була найнижчою - C. sphaerospermum (0,02-0,06 мм/год.); 3) інші досліджені види з проміжним положенням за цим параметром (0,07-0,15 мм/год.).

Порівняння радіальної швидкості росту на СА та ГА показало, що з 63 вивчених нами штамів, 32 росли на СА на 40-75% краще, ніж на ГА. Лише один штам (A. strictum 64, вилучений з приміщення 4-го блоку ЧАЕС) на голодному середовищі ріс на 56% краще, ніж на багатому. Решта (30 штамів) однаково росли на обох досліджених середовищах - багатому та голодному. Тенденція до такої подібності може передбачати толерантність грибів до широкого градієнту концентрацій вуглецю в поживному середовищі [Курченко, 1996, 1999].

Вивчення галуження грибного міцелію на СА та ГА (ОГР) показало, що більшість досліджених штамів (21 з 23) утворювали краще галуження на СА або однаково галузились на цих двох середовищах. Лише 2 штами - M. isabellina 2 та P. spinulosum 2г - мали тенденцію до кращого галуження на голодному агарі. Обидва вони були виділені з субстратів, рівень радіоактивності яких був високим та становив 2,1·105 Бк/кг та 1,4·107 Бк/кг відповідно.

Базуючись на викладках Prosser [1993] з приводу взаємозв'язку ОГР та радіальної швидкості росту, ми поєднали вищевказані два параметри та отримали новий показник - здатність гриба освоювати запропонований субстрат. Порівнюючи значення інтенсивності освоєння субстрату на СА та ГА, в залежності від того, як вони змінювались при перенесенні штаму на лімітоване за основними поживними речовинами середовище, ми робили висновки про характер росту досліджених нами штамів в несприятливих умовах існування.

Більшість вивчених нами штамів (14 з 23) краще освоювала багате середовище. Решта (9 штамів) проявила здатність однаково освоювати СА та ГА. Цікаво, що з цих 9 штамів, 6 були виділені з радіоактивних субстратів. Тобто, можна припустити, що такі ізоляти були більш пристосовані до несприятливих умов існування.

При дослідженні інтенсивності освоєння субстрату на початкових етапах онтогенезу (20-24 год.) було відмічено, що у швидкоростучих видів вона була значно меншою, ніж надалі, а у повільноростучих видів - навпаки.

Враховуючи вивчені ростові показники, можна сказати, що освоєння радіоактивних субстратів дослідженими нами грибами відбувається, як мінімум, двома шляхами. Перший реалізують гриби, які характеризуються уповільненим ростом та утворенням великої кількості дрібних конідій, і як наслідок - великої кількості колоній. Другий спосіб реалізують гриби, які мають високу швидкість росту міцелію та слабке конідієутворення. Для першого типу був притаманний уповільнений ріст на початкових етапах онтогенезу та його значне збільшення в процесі подальшого розвитку, і для другого - швидкий ріст на початку, який уповільнюється по мірі росту гриба.

Найбільш характерні представники, які реалізують перший спосіб освоєння субстрату - штами видів C. sphaerospermum та M. isabellina, а види, яким притаманний другий спосіб - A. alternata та U. consortiale. Решта видів поєднує в собі ознаки обох зазначених способів освоєння субстрату.

РОЗДІЛ 4. Порівняльне вивчення реакцій радіотропізму та фотореакцій мікроскопічних грибів

Процес пошуку штамів з ознакою радіотропізму почався в 90-х роках та продовжується досі. Дослідження цього напрямку розпочались роботами Н.М. Жданової та Т.І. Редчиць. Вони розробили модельну систему для виявлення позитивного радіотропізму, в якій згодом було перевірено 46 видів 25 родів (202 штами). Про ознаку позитивного радіотропізму висновки робили за морфологічним показником - направленим ростом грибних апексів до точкового джерела зовнішнього г-випромінювання.

Ознаку позитивного радіотропізму виявили у 17 видів 9 родів (38 штамів), що складало 18,8 % від загального числа досліджених культур.

Практично всі штами, що проявили реакцію позитивного радіотропізму, були виділені з радіоактивних субстратів зони відчуження ЧАЕС. Виключення становив лише штам A. pullulans 2275, виділений з місця з фоновим рівнем радіоактивності. Ознака позитивного радіотропізму була притаманна як темногпігментованим, так і світлозабарвленим штамам вивчених грибів (з 18 досліджених видів грибів, представники яких характеризувались ознакою радіотропізму, 9 були темнопігментованими та 9 - світлозабарвленими). Ця ознака відноситься до розряду адаптивних реакцій виду на забрудненість оточуючого середовища та є не видовою, а штамовою ознакою.

Позитивний радіотропізм у більшості штамів відмічали на стадії утворення міцелію та його початкового галуження. Але у окремих штамів він проявлявся на стадії утворення репродуктивних органів (P. spinulosum) або протягом всього життєвого циклу (U. consortiale).

Дослідження фотореакцій грибів проводили в модифікованій модельній системі для визначення ознаки радіотропізму, але джерело -випромінювання в ній було замінене на джерело слабкого освітлення білим світлом.

Освітлення проводили протягом 5 год. та в кінці досліду порівнювали освітлений препарат з контрольним препаратом того ж штаму, який весь час знаходився у темряві. До початку експерименту конідіальні суспензії кожного штаму вирощували 17-20 год. (в залежності від виду) в темряві при температурі 2520С до досягнення ними частоти проростання конідій 10-20% та довжини міцелію 50-100 мкм.

При визначенні фотостимуляції росту грибів найбільш інформативним параметром була стимуляція росту міцелію з галуженням 1-го порядку, яка у штамів різних видів складала від 35% до 167% у порівнянні з контролем.

Проростання спор стимулювалось таким світлом майже у всіх штамів з ознакою позитивного радіотропізму, тоді як на їх галуження слабке освітлення білим світлом низької інтенсивності практично не впливало.

РОЗДІЛ 5. Дослідження впливу перекису водню на апікальний ріст мікроміцетів

Обидві вищевказані модельні системи - для визначення радіотропізму та фотостимуляції грибів - були створені на основі рідких суспензій грибних конідій. Дія іонізуючого випромінювання на воду призводить до утворення нестабільних продуктів радіолізу, які зазнають подальшого перетворення, формуючи численні активні форми кисню. Одною з найнебезпечніших для клітини та найстабільнішою активною формою кисню є перекис водню.

Вплив дії градієнту концентрацій перекису водню на швидкість росту грибних гіф вивчали на трьох видах - A. alternata, C. сladosporioides та P. lilacinus, кожен з яких був представлений штамами, виділеними з радіоактивних субстратів та контрольними - з відносно чистих за вмістом радіонуклідів місцеіснувань. Тривалість досліду - 90 хв.

Штами, виділені з радіоактивних субстратів, проявили більшу резистентність до високих концентрацій (10-2 М - 10-1 М) перекису водню, ніж контрольні. Це виражалось, головним чином, в різниці концентрацій перекису водню, які викликали зупинку росту гіф та здатності до відновлення росту після припинення дії таких концентрацій. Так, ріст грибів, виділених з радіоактивно забруднених субстратів, зупинявся при концентрації H2O2 10-2 М (вид A. аlternata - 10-1 М), а контрольних штамів - при 10-3 М (A. аlternata - 10-2 М).

Після припинення дії перекису водню здатність до повного відновлення росту гіф через 3-7 год. мали лише штами, виділені з радіоактивно забруднених субстратів.

Аналізуючи ростові показники штамів, вилучених з зони відчуження ЧАЕС, ми дійшли до висновку, що існування в умовах підвищеної радіоактивності практично не вплинуло на такі консервативні для грибів показники як радіальний ріст та галуження. Крім того, було визначено 2 основних типи освоєння субстрату дослідженими грибами, що може стати у нагоді при створенні екологічних прогнозів щодо зони відчуження ЧАЕС.

Порівнюючи реакції радіотропізму та фотореакції вивчених штамів, ми встановили, що ріст практично всіх ізолятів, що характеризувались чіткими реакціями позитивного радіотропізму, стимулювався слабким білим світлом (1 лк). При цьому ми не спостерігали класичних реакцій фототропізму, а констатували фотостимуляцію міцелію та проростання спор, тобто, вочевидь, реакція радіотропізму не є звичайною реакцією на світло. Оскільки співпадіння цих двох реакцій було повним, можна припустити існування між ними певного зв'язку, який, можливо, пов'язаний з універсальністю фоторецепторних систем у грибів. Метод визначення фотостимуляції грибів як ознаки, сполученої з ознакою позитивного радіотропізму, може знайти практичне застосування для скринінгу штамів, які проявляють ознаку позитивного радіотропізму без використання складних, дорогих та небезпечних радіоактивних джерел. Такі штами, в свою чергу, можуть бути перспективними в подальших розробках по знешкодженню радіоактивних відходів.

На прикладі впливу перекису водню, як продукту радіолізу води, було показано більшу резистентність штамів, вилучених з високорадіоактивних субстратів, до іонізуючого випромінювання.

Існування живих організмів в природі відбувається згідно з певними закономірностями, які в екології отримали назву життєвих стратегій [Grime, 1988; Pugh, 1980; Уиттекер, 1980]. За класифікацією Веліканова та Сидорової [Великанов, Сидорова, 1983] практично всі вивчені нами види грибів поєднують в собі ознаки представників r- та K-стратегів - більшість з них характеризується активним та досить швидким ростом; в той же час всі вони є достатньо стійкими до екстремальних умов існування, які, безумовно, склалися в зоні відчуження ЧАЕС. Тобто ці види з великою долею ймовірності можна віднести до групи Р (патієнти). Виключенням можуть бути лише представники видів A. strictum, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, M. isabelina та P. lilacinus, які ростуть достатньо повільно та характеризуються високою конкурентноздатністю. На нашу думку, вони більш відносяться до крайньої групи С-стратегів.

Висновки

1. Вперше отримані ростові характеристики мікроміцетів 13 видів 8 родів (63 штами), ізольованих з радіоактивних субстратів (ґрунти та лісові підстилки 10-км зони ЧАЕС, приміщення 4-го блоку). Виявлено, що тривале існування міцеліальних грибів на субстратах з підвищеною радіоактивністю слабо впливало на їх радіальний ріст, що може свідчити про консервативність цього показника.

2. На прикладі досліджених мікроскопічних грибів нами вперше застосований інтегральний показник інтенсивності освоєння субстрату (І). В результаті встановлено 2 шляхи його освоєння: перший реалізують гриби, які характеризуються уповільненим ростом та утворенням великої кількості дрібних конідій, і другий - гриби, яким притаманні висока швидкість росту міцелію та слабке конідієутворення. До видів, які реалізують перший спосіб освоєння субстрату можна віднести C. sphaerospermum та M. isabellina, а до видів, яким притаманний другий спосіб - A. alternata та U. consortiale.

3. На основі розробленого раніше експрес-методу визначення ознаки радіотропізму у грибів виявлено, що ця ознака притаманна лише видам, вилученим з радіоактивних субстратів, тобто вона належить до адаптивних реакцій та проявляється не на видовому, а на штамовому рівні. Це послужило основою для співставлення реакцій ряду штамів на іонізуюче випромінювання та слабке освітлення білим світлом (1 лк). Виявлений ефект фотостимуляції проявлявся на рівні проростання спор та утворення міцелію з галуженням 1-го порядку. Фотостимуляція, як і ознака позитивного радіотропізму, була притаманна лише ізолятам з радіоактивних субстратів та проявлялась на штамовому рівні.

4. Вперше виявлено співпадіння реакцій направленого росту до джерела іонізуючого випромінювання (позитивного радіотропізму) та фотостимуляції слабким світлом, що може знайти своє застосування для скринінгу штамів з ознакою позитивного радіотропізму - активних деструкторів важкодоступних радіоактивних субстратів.

5. Виявлено високу резистентність досліджених штамів A. alternata, C. сladosporioides та P. lilacinus до градієнту концентрацій Н2О2, який належить до найбільш стабільних продуктів радіолізу води. Резистентність штамів, виділених з радіоактивних субстратів на порядок перевищувала таку контрольних штамів. Здатність до практично повного відновлення росту після 90-хв. контакту з концентраціями Н2О2, що викликали зупинку росту, мали лише штами, виділені з радіоактивних субстратів.

6. Аналіз отриманих нами даних дозволив визначити тип життєвої стратегії ізолятів грибів, виділених з зони відчуження ЧАЕС. Переважна більшість з них (види родів Acremonium, Alternaria, Aureobasidium, Penicillium, Ulocladium та окремі штами C. сladosporioides) реалізують тип Р (патієнти) життєвої стратегії (поєднують ознаки r- та К-стратегів). Представники видів A. strictum, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, M. isabelina та P. lilacinus були віднесені нами до С-стратегів.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Блажеєвська Ю.В.*, Вембер В.В. Порівняльне вивчення радіальної швидкості росту мікроміцетів, виділених із забруднених радіонуклідами та чистих регіонів // Науковий вісник Ужгородського університету. - Серія “Біологія”. - №10. - Ужгород, 2001. - С. 155-158.

2. Блажеевская Ю.В.*, Вембер В.В., Жданова Н.Н. Сравнительный анализ скорости радиального роста микромицетов, выделенных из различных экотопов // Микробиол. журн. - 2002. - Т. 64, № 3. - С. 3-13.

3. Блажеевская Ю.В.*, Вембер В.В., Жданова Н.Н. Изучение некоторых ростовых и трофических особенностей грибов, способных активно расти в условиях 4-го блока ЧАЭС // Збірник наукових праць Інституту ядерних досліджень. - 2002. - Т. 8, №2. - С. 145-151.

4. Блажеєвська Ю.В.*, Редчиць Т.І. Реакції радіотропізму та фотореакції мікроміцетів, виділених із зони відчуження ЧАЕС // Збірник наукових праць Інституту ядерних досліджень. - 2003. - Т. 10, №2. - С. 85-93.

5. Блажеевская Ю.В.* Ростовые характеристики микроскопических грибов, активно растущих в условиях 4-го блока ЧАЭС // Микробиол. журн. - 2003. - Т. 65, № 3. - С. 30-34.

6. Иванова А.Е., Блажеевская Ю.В.*, Белозерская Т.А., Жданова Н.Н., Асланиди К.Б. Резистентность микроскопических грибов к окислительному стрессу // Доклады Российской Академии Наук. - 2003. - в друці.

7. Жданова Н.Н., Захарченко В.А., Редчиц Т.И., Вембер В.В., Блажеевская Ю.В.*, Краснов В.А., Пазухин Э.М. Распостранение признака позитивного радиотропизма среди грибов, изолированных из высокорадиоактивных субстратов // Вісник ОНУ. По матеріалам конференції. Серія “Біологія” (Одеса, 2001). - 2001. - 6, № 4, С. 109-112.

8. Блажеевская Ю.В.*, Вембер В.В. Изучение ростовых процессов грибов, растущих в условиях 4-го блока ЧАЭС // I съезд микологов России. Тез. Докл.: Москва, 2002 . - С. 44-45.

9. Блажеевская Ю.В.*, Жданова Н.Н. Изучение некоторых ростовых особенностей грибов, способных активно расти в условиях 4-го блока ЧАЭС // Материалы международной конференции ”Микробиология и биотехнология XXI столетия“ (Минск, 2002). - 2002. - С. 14-15.

10. Блажеевская Ю.В.*, Редчиц Т.И. Сравнительное изучение реакций радиотропизма и фотореакций грибов, выделенных из мест повышенного радоактивного загрязнения. Сборник тезисов 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2003). - 2003. - С. 266.

11. Tatiana A. Belozerskaya, Yuliya V. Blazheevskaya*, Konstantin B. Aslanidi, Anna E. Ivanova, Nelly N. Zhdanova. H2O2 resistance of microfungi isolated from regions of various radioactivity. 22nd Fungal Genetics Conference at Asilomar (Pacific Grove, California, 2003). - 2003. (http://www.fgsc.net)

Анотація

Карпенко Ю.В. Екологічна характеристика мікроміцетів, що виявили ознаку позитивного радіотропізму. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ, 2003.

Дисертація присвячена вивченню мікроскопічних грибів, що були виділені з зони відчуження ЧАЕС та проявили ознаку позитивного радіотропізму. На основі вивчення ряду ростових показників таких мікроміцетів було визначено, що навіть тривале існування на високорадіоактивних субстратах слабо впливало на їх ростові показники - радіальну швидкість росту та галуження міцелію. Вивчення узагальнюючого показника І дозволило нам за способом освоєння субстрату віднести вивчені види грибів до двох груп.

При визначенні ознаки позитивного радіотропізму було показано, що вона відноситься до розряду адаптивних реакцій виду на забрудненість оточуючого середовища, та є не видовою, а штамовою ознакою.

Вивчення реакцій фотостимуляції мікроміцетів показало, що ріст молодого міцелію штамів, які характеризувались ознакою позитивного радіотропізму, стимулювався слабким освітленням білим світлом. Тобто, можна припустити існування взаємозв'язку між цими реакціями, який, можливо, полягає в універсальності фоторецепторних систем грибів.

При дослідженні впливу градієнту перекису водню на гіфальний ріст грибів виявилось, що найбільш резистентними до такого впливу були штами, виділені із зони відчуження ЧАЕС.

Аналізуючи отримані дані, ми прийшли до висновку, що практично всі вивчені види грибів поєднують в собі ознаки представників r- та K-стратегів та можуть бути віднесені до групи Р (патієнти). Виключення становили лише деякі штами видів A. strictum, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, M. isabelina та P. lilacinus, які більш відносяться до крайньої групи С-стратегів.

Ключові слова: мікроміцети, зона відчуження ЧАЕС, радіальний ріст, радіотропізм, фотостимуляція.

Аннотация

Карпенко Ю.В. Экологическая характеристика микромицетов, проявивших признак позитивного радиотропизма. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению микроскопических грибов, которые были выделены из зоны отчуждения ЧАЭС и проявили признак позитивного радиотропизма. На основе изучения ряда ростовых показателей таких микромицетов мы сделали вывод, что даже их длительное пребывание на высокорадиоактивных субстратах слабо повлияло на их ростовые показатели - радиальную скорость роста и ветвление мицелия. Изучение обобщающего коэффициента І позволило нам, в зависимости от способа освоения субстрата, отнести изученные виды грибов к двум группам: к первой группе относились виды, которые характеризовались медленным ростом и образованием большого количества конидий, и ко второй - грибы с высокой скоростью роста и слабым конидиобразованием.

Признак позитивного радиотропизма отмечали у 17 видов 9 родов (38 штаммов) микромицетов, что составляло 18,8% от общего числа исследованных штаммов (202). Было показано, что это свойство относится к разряду адаптивных реакций вида на загрязненность окружающей среды и является не видовым, а штаммовым признаком.

Реакции фотостимуляции роста грибов изучали, используя источник освещения белого света, интенсивность которого приближалась к интенсивности светового потока (1 лк), сопровождающего г-излучение, применяемое при определении реакций позитивного радиотропизма. Было показано, что наибольшее влияние такой свет оказывал на рост молодого мицелия (стимуляция по сравнению с контролем составляла 35-167%). Прорастание спор стимулировалось на 10-50% практически у всех штаммов, характеризующихся признаком позитивного радиотропизма, тогда как на их ветвление слабое освещение практически не влияло. Контрольные штаммы, у которых не наблюдали признака позитивного радиотропизма, не реагировали на использованное в эксперименте освещение.

При исследовании влияния градиента перекиси водорода на гифальный рост грибов обнаружили, что штаммы, выделенные из зоны отчуждения ЧАЭС, были более резистентными к воздействию высоких концентраций H2O2 (10-2 М - 10-1 М). Это проявлялось, главным образом, в разнице концентраций H2O2, вызывающих остановку роста грибных гиф и способности к восстановлению после окончания воздействия такими концентрациями. Так, рост грибов, выделенных из радиоактивно загрязненных субстратов, останавливался при концентрации H2O2 10-2 М (вид A. аlternata - 10-1 М), а у контрольных штаммов - при 10-3 М (A. аlternata - 10-2 М). После прекращения воздействия перекиси водорода способность к практически полному восстановлению роста через 3-7 час проявили только резистентные штаммы, выделенные из зоны отчуждения ЧАЭС.

Анализируя полученные данные, мы сделали вывод, что, по классификации Великанова и Сидоровой, практически все изученные нами виды грибов объединяют в себе признаки представителей r- та K-стратегов - большинство из них характеризуется активным и достаточно быстрым ростом, в то же время все они являются достаточно устойчивыми к экстремальным условиям существования, которые сложились в зоне отчуждения ЧАЭС. Таким образом, эти виды с большой долей вероятности можно отнести к группе Р (патиенты). Исключение составляли только представители видов A. strictum, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, M. isabelina и P. lilacinus, которые растут достаточно медленно и характеризуются высокой конкурентоспособностью, т.е. скорее относятся к крайней группе С-стратегов.

Ключевые слова: микромицеты, зона отчуждения ЧАЭС, радиальный рост, радиотропизм, фотостимуляция.

Abstract

Karpenko Yu.V. Ecological characteristic of micromycetes with positive radiotropism feature. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.07 - microbiology. - Institute of microbiology and virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

The work is devoted to investigation of the micromycetes with positive radiotropism feature, isolated from ChNPP alienation zone. It was defined on the base of some growth indexes of such fungi that even long-term stay on high-radioactive substrates have poor effect to their growth parameters - radial growth velocity and mycelium branching. Resumptive index I study let us divide all studied fungi into two groups in accordance with substrate settling manner.

Positive radiotropism feature is not specific but strain feature and belongs to environmental pollution adaptive response.

Study of micromycetes photostimulation reaction showed that young mycelium growth of strains with positive radiotropism feature was stimulated by weak white light. Thus, we can presume these two reactions correlation that consists in fungal photoreceptor systems universality.

During the investigation of hydrogen peroxide gradient influence on fungi hyphal growth we discovered that strains isolated from ChNPP alienation zone were most resistant to such effect.

Analyzing all obtained data we concluded that almost all investigated fungi species have features of r- and K-types of the life strategy and can be concerned to group Р (patient). Species A. strictum, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, M. isabelina and P. lilacinus that concern to С-type of the life strategy were the exception.

Key words: micromycetes, ChNPP alienation zone, radial growth, radiotropism, photostimulation.

Размещено на Allbest.ru

...