Размещено на http://www.allbest.ru/

Селекційно-генетичний інститут

Національний центр насіннєзнавства та сортовивчення УААН

Автореферат

Дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.15 - генетика

Генетична детермінація ознаки стійкості озимих м'яких пшениць півдня України до збудника фузаріозу колоса (Fusarium graminearum Schwabe)

Мірось Світлана Леонідівна

Одеса - 2003

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Для обґрунтованого та ефективного ведення селекції на стійкість до фузаріозу потрібно мати чіткі уявлення про генетичний контроль стійкості та можливі шляхи реалізації цієї ознаки. Існуючі дані стосовно генетичної детермінації даної ознаки небагаточисельні й суперечливі. Чимало дослідників постулюють кількісний характер успадкування та домінантну полігенну систему генетичного контролю (Snijders, 1990, Van Gilkel, 1996, Tomohiro, 1997), але існують також інші думки (Singh, 1995, Колесников, 2001). Інформація про функціональний стан загальноклітинних генів у стійких та сприйнятливих до фузаріїв пшениць у літературі практично відсутня. У зв'язку з цим не вирішеним є питання про співвідношення й взаємодію генетичних механізмів специфічної і неспецифічної стійкості рослин пшениці до ураження їх фузаріями. Не з'ясовано також ступінь кореляції між рівнем зазначеної стійкості та морфологічними й генетико-біохімічними параметрами досліджуваних рослин. Враховуючи сказане, вивчення генетичних засад стійкості пшениці до збудника фузаріозу колоса та зерна можна вважати важливою та актуальною проблемою сучасної генетики. Для вітчизняної науки особливо важливими є дослідження, проведені на генотипах пшениці, що культивуються в умовах півдня України.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження за темою дисертаційної роботи є складовою частиною науково-дослідної тематики кафедри генетики та молекулярної біології Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова „Генетико-біохімічні аспекти стійкості до фузаріозу в онтогенезі м'якої пшениці” (0100U002893 (№146)), а також державної науково-технічної програми відділу фітопатології та ентомології Селекційно-генетичного інституту (СГІ) „Теоретичні основи селекції та насінництва сільськогосподарчих культур” (03.04 - МВ/322-97, завдання 01.04.01).

Мета й завдання досліджень. Метою роботи було вивчення генетичних засад успадкування стійкості озимої м'якої пшениці до збудника фузаріозу колоса в умовах півдня України та пошук фенотипових маркерів цієї стійкості.

Для досягнення мети вирішували наступні завдання:

- отримати лінії пшениці різного генетичного походження з різними рівнями стійкості до збудника фузаріозу;

- провести схрещування одержаних ліній з сприйнятливою лінією сорту Одеська напівкарликова, здійснити аналіз гібридних популяцій F₁, F₁BC₁, F₂ та F₃ і розрахунковим методом встановити кількість домінантних генів стійкості в рослин досліджуваних ліній;

- визначити функціональний стан ген-ензимних систем окремих оксидоредуктаз - супероксиддисмутази (СОД) - КФ 1.15.11, цитохромоксидази (ЦХО) - КФ 1.9.3.1, фенолоксидази (ФО) - КФ 1.10.3.1 та пероксидази (ПО) - КФ1.11.1.7 за їх експресією в генотипів пшениць з різним вмістом домінантних генів стійкості за нормального розвитку рослин і інфікування F. graminearum;

- з'ясувати залежність експресії структурних генів означених оксидоредуктаз від наявності в генотипі домінантних генів стійкості;

- провести кореляційний аналіз отриманих даних з метою пошуку чітких асоціацій між наявністю в рослин домінантних генів стійкості та іншими (морфологічними, біохімічними) ознаками;

- обґрунтувати можливість використання морфологічних і біохімічних ознак досліджуваних генотипів пшениці як маркерів генетично обумовленої стійкості;

- провести порівняльний аналіз усіх отриманих даних і розробити певні рекомендації щодо подальшого вивчення генетичної детермінації стійкості пшениць до фузаріозу та селекції стійких до цієї хвороби генотипів.

Об'єкт дослідження - генетична обумовленість імунітету рослин до інфекційних хвороб.

Предмет дослідження - гени та ген-ензимні системи, що обумовлюють стійкість рослин озимої м'якої пшениці до фузаріозу колоса та зерна.

Методи дослідження. В роботі застосовували метод гібридологічного аналізу, метод електрофорезу у ПААГ, метод штучного зараження за допомогою ранцевого оприскувача, „твел-методом” для здійснення схрещувань та методи варіаційної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше з'ясована генна детермінація стійкості до F. graminearum ліній озимої м'якої пшениці, які використовуються в селекції сортів для півдня України. Визначено кількість генів, що обумовлюють стійкість до збудника фузаріозу колоса, з'ясовано джерела їх походження та типи взаємодії в окремих генотипах.

Доведено, що ознака стійкості до F. graminearum досліджуваних пшениць не корелює з ознаками стійкості до інших патогенів, а також з висотою рослин, як повідомлялося в роботах інших авторів (Zhaosu, 1987, Аблова, 2001, Колесников, 2001,Pritsch, 2001). Одночасно виявлена чітка кореляція між показниками стійкості пшениць до фузаріозу та кількістю наявних у них домінантних генів стійкості.

Уперше з'ясовано функціональний стан ген-ензимних систем досліджуваних оксидоредуктаз у стійких і сприйнятливих генотипів пшениці, заражених фузаріями. Виявлено асоціативні зв'язки між рівнем стійкості до фузаріозу та окремими множинними молекулярними формами (ММФ) досліджуваних ферментів. Таким чином, отримано нові наукові дані про генетичні механізми специфічної й неспецифічної стійкості рослин пшениці до фузаріозу.

Практичне значення отриманих результатів. Отримана в експериментах інформація про генетичний контроль стійкості рослин пшениці до фузаріозу має істотне значення для стратегії й тактики процесу створення сортів південної селекції, стійких до фузаріозу. У цьому відношенні дуже корисними можуть бути матеріали дисертації про типи успадковування та взаємодію виявлених генів стійкості до фузаріозної інфекції - їх комплементарність, адитивність і таке інше.

Проведені генетико-біохімічні дослідження та встановлені асоціативні зв'язки між станом окремих ген-ензимних систем та показниками генетично обумовленої стійкості до фузаріозу дали можливість запропонувати біохімічні маркери для оцінки ознаки стійкості рослин на стадії паростків, що важливо для селекційного процесу.

Внаслідок проведеної роботи отримана колекція форм, сортів та ліній пшениці, які мають різну за походженням і рівнем прояву стійкість до збудників фузаріозу колоса і можуть бути використані як донори цієї властивості в селекційному процесі. Чимало зразків з цієї колекції використовується відділами СГІ для створення сучасних стійких до фузаріозу сортів озимої та ярої пшениць. Окремі лінії використовуються на кафедрі генетики та молекулярної біології ОНУ для вивчення генетико-біохімічних механізмів реакції різних пшениць на інфекцію патогену.

Особистий внесок здобувача. Роботу з літературою й написання огляду літератури, схрещування, гібридологічний та структурний аналіз, оцінку стійкості рослин до збудників фузаріозу та інших захворювань проведено самостійно. Добір стійких рослин та створення колекції генотипів провадили разом з Л. Т. Бабаянц та О. В. Бабаянц. Отримання чистих ліній та зараження здійснювали разом з співробітниками відділу фітопатології та ентомології. Визначення експресії генів оксидоредуктаз за електрофоретичними спектрами цих ферментів провадили разом з Л. Ф. Дьяченко та В. А. Топтиковим - співробітниками кафедри генетики та молекулярної біології ОНУ. Аналіз та інтерпретацію одержаних результатів здійснювали разом з науковим керівником та зав. відділом фітопатології та ентомології СГІ Л. Т. Бабаянцем. Статистичну обробку цифрового матеріалу, написання тексту дисертації та її оформлення здійснювали самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати й основні положення роботи були представлені на звітних конференціях аспірантів і викладачів Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова (1999-2001 р.р.), на міжнародній конференції, присв'яченій 100-річчю генетики, місто Львів (2000 р.), на міжнародних наукових конференціях у місті Харкові (1999 - 2002 р.р.), на науково-практичній конференції “Зеленая революция П. П. Лукьяненко” у Краснодарі (2001 р.), на конференції студентів і молодих вчених, що відбулася в Києві в 2001 р., на “Первой всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям”, у Санкт-Петербурзі в 2002 р.

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 18 праць, з них 7 статей у фахових виданнях та 11 тез у збірках конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, чотирьох розділів, висновків, списку використаної літератури, додатків. Роботу викладено на 150 сторінках стандартного друкованого тексту, вона містить 17 таблиць, 17 рисунків. Список використаних літературних джерел включає 291 найменування, у тому числі 103 іншомовних праці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Узагальнена література стосовно проблеми генетичного контролю стійкості рослин до збудника фузаріозу, її вертикальної й горизонтальної складових. Показано існуючі розбіжності в поглядах на це питання. Висвітлені генетико-біохімічні аспекти неспецифічної стійкості рослин до патогенів, зокрема роль загальноклітинних генів та їх продуктів у формуванні захисної реакції рослин при ураженні фузаріями. Наведена інформація про стан та основні проблеми сучасної селекції пшениці на стійкість до збудника фузаріозу колоса.

ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У розділі обґрунтовано обраний напрям досліджень і наведені основні методи, що використовувалися при їх проведенні.

Зараження, оцінку та добір здійснювали за загальноприйнятою методикою (Бабаянц, 1994) у польовому фузаріозному розсаднику відділу ентомології та фітопатології Селекційно-генетичного інституту (СГІ). Чисті лінії отримували шляхом інбридингу рослин десяти відібраних із створеної колекції сортів та форм озимої м'якої пшениці, що мають різні родоводи:

Форми 5/81-91, 5/20-91, 8/77-91 - отримано від міжвидової гібридизації сортів Одеська напівкарликова та Aegilops cylіndrica.

Еритроспермум 898/91 отримано від схрещування між собою гібридів перших поколінь Обрія з Альбатросом одеським та Променя з Чайкою.

Еритроспермум 2593/90 - отримано в результаті схрещування сорту Ювілейна 75 з сортом Велютинум 97 і подальшими схрещуваннями з Прибоєм, Променем та Альбатросом одеським.

Еритроспермум 729/96 - отримано схрещуванням покоління F₁ від Одеської напівкарликової та Triticum palmovae з сортом Спартанка.

Еритроспермум 2582/89 отримано від схрещування покоління F₁ сорту Обрій та сорту Южная Заря з сортом Юннат одеський.

Еритроспермум 3059/92 походить від схрещування сорту 92/69-153/IMH//IMHDW та Одисеї.

Сорт Обрій отримано в результаті схрещування сортів Red River 68 та Одеської 51.

Угорський сорт Ringo Sztar, родовід якого невідомий.

Отримані для роботи чисті лінії являють собою потомків І₆ одної типової рослини зазначених сортів та гібридів. Дослідним лініям були надані назви, аналогічні назвам вихідного матеріалу.

Рівень стійкості або сприйнятливості сортів пшениці до збудників фузаріозу колоса визначали за комплексом ознак: зовнішнім ураженням колоса, відсотком ураженого зерна з рослини, зниженням маси зерна з колоса або маси 1000 зерен, ступенем токсикації рослин.

Стійкість ліній до збудників інших захворювань - борошнистої роси (Erysiphe graminis DC. f. sp. tritici March.), бурої іржі (Puccinia recondita Rod. ex Desm. f. sp. tritici) та септоріозу (Septoria tritici Rob. ex Desm.) визначали за загальноприйнятими методиками (Бабаянц, 1988). Ступінь ураження рослин у цих дослідах вивчали на природному інфекційному фоні.

Аналіз елементів структури врожаю рослин провадили за методикою Держкомісії України. Вивчали такі показники: висоту рослини, кущінння (загальне й продуктивне), масу 1000 зерен, масу зерна з колоса, кількість зерен у колосі, кількість колосків у колосі, вид колосу (остистий або безостий). Для проведення аналізу всі рослини виривали з ґрунту з коренем і обмолочували кожен колос окремо.

Генетичну детермінацію стійкості з'ясовували на селектованих лініях озимої м'якої пшениці, які мали різний ступінь стійкості.

Для вивчення генетичної детермінації стійкості користувалися якісною моделлю (Доспехов, 1965, Singh, 1995), а для визначення кількості генів, що контролюють специфічну стійкість до збудника фузаріозу колоса, застосовували гібридологічний аналіз. За сприйнятливого батька було обрано лінію надсприйнятливого сорту Одеська напівкарликова. Отримували та аналізували покоління F₁, F₁BC₁, F₂ та F₃. Отримані гібридні рослини за кількістю ураженого в рослині зерна поділяли на два класи - стійкий (1-15 % ураженого зерна) та сприйнятливий (16- 100 % ураженого зерна). Схрещування й отримання гібридного насіння провадили в умовах фітотрону. Аналіз гібридних поколінь F₁, F₁BC₁ і F₂ здійснювали протягом одного року. Зараження піддослідних рослин провадили найбільш шкідливим та розповсюдженим на півдні України штамом К-90 Fusarium graminearum Schwabe.

Дослідження ген-ензимних систем здійснювали на 7-тижневих етіольованих паростках досліджуваних ліній пшениці, зрощених на стерильному середовищі, а також на середовищі з доданням фільтрату F. graminearum. Досліджували множинні молекулярні форми (ММФ) супероксиддисмутази (СОД), цитохромоксидази (ЦХО), фенолоксидази (ФО) та пероксидази (ПО).

Для вивчення ММФ екстракцію ферментів з тканин здійснювали буфером (0,05 М трис-HCl, pH 6,8, 0,1% дитіотреітол, 0,1% аскорбінова кислота, 15% цукроза, 1% тритон Х-100) у співвідношенні тканина : буфер - 1 : 1. З метою кращої екстракції гомогенати залишали на ніч у холодильнику (+4 - +8 С), потім центрифугували (5000 g; 10-15 хв). Завдяки наявності детергента в буфері надосадова рідина містила легкорозчинні та мембранозв'язані форми ферментів.

Електрофорез цих ферментів провадили за варіантом неперервної системи Девіса (Davis, 1964) у 10% поліакриламідному гелі (2,7 % ПААГ) при напрузі 260 V і силі струму 13 мА/см². Тривалість розподілу (до початку виходу з геля в буфер барвника бромфенолового синього) - 3-4 години. Фарбування гелів здійснювали за перевіреними методиками (Гааль, 1982, Бертсон, 1965, Ермаков, 1987, Сафонов, 1971, Топтиков, 1997).

Математичну обробку даних здійснювали за загальноприйнятими методами варіаційної статистики та кореляційного аналізу (Рокицкий, 1973, Доспехов, 1965).

РЕЗУЛЬТАТИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Створення колекції пшениць, стійких до збудника фузаріозу. Тестування сортів на ознаку стійкості до фузаріозу провадили у 1997-1998 р.р. на штучно створеному інфекційному фоні в польовому фузаріозному розсаднику. З урахуванням розповсюдження видів фузарію на півдні України зараження провадили в трьох варіантах: перший - рослини обробляли штамом К-90 F. graminearum Schwabe, другий - штамом 20 F. sporotrichiella var. sporotrichoides Sheb. Bilai і третій - сумішю штамів К-90 F. graminearum Schwabe, 78/90 F. culmorum (Sm.) Sacc. і 48 F. macroceras Wr. et Rg. Четвертий варіант був контрольним - без ураження. Всього було проаналізовано 278 зразків. До колекції увійшли сорти озимої та ярої м'якої пшениці закордонної селекції, сорти та селекційні форми озимої м'якої пшениці селекції СГІ, з яких потрібно окремо вказати на лінії, отримані від гібридизації Tr. aestivum з Ae. cylindrica, Ae. ventricosa та Tr. diccocoides. Вони мають високу стійкість до збудника фузаріозу колоса. Серед сортів твердої пшениці стійких форм знайдено не було.

Стійкі зразки пшениці, що увійшли до колекції, у більшості випадків походять з країн, де фузаріозні епіфітотії є частими та шкідливими, що підтверджує концепцію М. І. Вавілова про закономірності розподілу стійких форм у зв'язку з особливостями місцезнаходження.

Результати визначення загальної стійкості рослин досліджуваних ліній. Патогеном слугував штам К-90 F. graminearum, який є найбільш шкідливим на півдні України. На протязі чотирьох років (1997-2000) з метою з'ясування тривалості збереження вихідного рівня стійкості рослин у поколіннях, вивчали зовнішні симптоми ураження колоса (ураження остей, лусочок), кількість ураженого зерна з рослини, зниження маси 1000 зерен та ступінь токсикації. За весь період дослідів спостерігалися певні зміни рівня досліджуваних показників залежно від лінії та року вимірів, однак основні генотипові відмінності ознаки стійкості зберігалися, що, на нашу думку, пов'язано з різним генетичним контролем стійкості до фузаріозу в досліджуваних генотипів. Тенденції до зниження рівня стійкості залежно від часу помічено не було.

Аналіз результатів, що були отримані за чотири роки дослідження, привів до висновку, що такі показники як зовнішнє ураження колосу, зниження маси зерна, кількість інфікованого зерна та ступінь його токсикації не завжди змінюються пропорційно один до одного, але виявляють високу взаємозв'язаність між собою в межах кожної конкретної лінії (рис.1) і залежить від кількості та якості наявних у генотипі домінантних генів стійкості.

Рис.1 Порівняльна оцінка показників ураженості фузаріозом рослин досліджуваних ліній озимої м'якої пшениці (середнє за чотири роки):

- Зовнішнє ураження, - Кількість ураженого зерна,

- Зниження маси, - Ступінь токсикації.

Співвідношення зовнішніх симптомів ураження рослин фузарієм з кількістю ураженого зерна з рослини, зниженням маси 1000 зерен та ступенем токсикації досить різні в кожному конкретному випадку, бо кожна з цих ознак виявляє різну залежність від взаємодій, що встановлюються між рослиною-хазяїном, патогеном і середовищем, а також від особливостей генетичної детермінації стійкості даної рослини (Гешеле, 1978, Mesterhazy, 1997). Тому ми вважаємо, що для отримання більш достовірного та повного уявлення про рівень генетично обумовленої стійкості рослин треба провадити комплексну оцінку цього показника за всіма його основними критеріями.

Основуючись на такій оцінці, досліджувані лінії пшениці ми умовно поділили на такі класи: VR - високостійкі (5/81-91, 5/20-91, 8/77-91), R - стійкі, (Еритроспермум 898/91, Ringo Sztar, Еритроспермум 2593/90, Еритроспермум 729/96), MR - помірностійкі (Еритроспермум 2582/89, Обрій, Еритроспермум 3059/92) та VS - надсприйнятливі (Одеська напівкарликова).

Одночасно з вивченням ступеня стійкості досліджуваних пшениць до фузаріозу ми з'ясовували їх відношення до збудників інших захворювань - борошнистої роси, септоріозу та бурої іржі. Мета цих досліджень - отримати інформацію про співвідношення генетичних систем специфічної й неспецифічної стійкості досліджуваних рослин.

Згідно з цими даними Одеська напівкарликова є своєрідним еталоном сприйнятливості до всіх досліджуваних захворювань - вона сильно уражується як збудниками фузаріозу, так і збудниками борошнистої роси, септоріозу та бурої іржі. У протилежність цьому лінії, що містять гени від егілопса (5/81-91, 5/20-91, 8/77-91), мають дуже високі показники стійкості до цих патогенів.

Іншим лініям властива помірна стійкість до зазначених хвороб. Найбільшу сприйнятливість рослини всіх ліній виявляли до бурої іржі. Відомо, що комплексна (неспецифічна) стійкість рослин до різних захворювань є основним показником так званої горизонтальної стійкості (Жученко, 1988). Слід зазначити, що високої кореляції ознаки стійкості до фузаріозу та інших захворювань у досліджуваних ліній не спостерігалося. Виходячи з цього, можна вважати, що високий рівень стійкості піддослідних рослин, в основному, визначається генами вертикальної стійкості.

Генетична детермінація стійкості досліджуваних пшениць до F. graminearum. Серед гібридних потомків F₁, що були отримані від схрещування досліджуваних ліній пшениці зі сприйнятливою лінією Одеська напівкарликова, не було помічено розщеплення. Рівень стійкості отриманих рослин відповідав рівню цієї ознаки в їх стійкого батька (табл. 1), що свідчить про домінантний характер генного контролю ознаки стійкості. Серед гібридних популяцій F₂ спостерігалося розщеплення на два класи, а саме: стійких та сприйнятливих рослин у різних співвідношеннях, залежно від комбінації схрещування.

Таблиця 1. Результати визначення кількості домінантних генів стійкості до F. Graminearum у рослин досліджуваних ліній шляхом гібридологічного аналізу

Така ж ситуація була характерна для потомків аналізуючого схрещування F₁BC₁ (табл. 2). Аналіз розщеплень F₂ і F₁BC₁ дав змогу висунути гіпотезу щодо генного контролю ознаки стійкості до збудника фузаріозу колоса. Згідно з висунутою гіпотезою стійкість до збудника фузаріозу колоса у ліній 5/81-91, 5/20-91, 8/77-91, Еритроспермум 898/91, Ringo Sztar контролюється трьома домінантними генами, у ліній Еритроспермум 2593/90, Еритроспермум 729/96 - двома, у Еритроспермум 2582/89, Обрій та Еритроспермум 3059/92 - одним. Встановлені гени взаємодіють за принципом комплементарності та адитивності. Так, при дигенному контролі стійкості до фузаріозу у F₂ спостерігається розщеплення, що відповідає теоретично очікуваному 9 : 7; в аналізуючому схрещуванні це розщеплення складає 1 : 3. Таке співвідношення властиве простій комплементарній взаємодії двох домінантних генів.

Таблиця 2. Результати визначення кількості домінантних генів стійкості до F. Graminearum у досліджуваних ліній на підставі зворотних схрещувань (F₁BC₁)

При тригенному контролі спостерігається два типи комплементарної взаємодії генів. У ліній 5/20-91, 8/77-91, Еритроспермум 898/91 та Ringo Sztar в F₂ спостерігається розщеплення, що відповідає теоретично очікуваному 45 : 19 та в F₁BC₁ - 3 : 5. При такому співвідношенні стійких та сприйнятливих класів рослин можна припустити, що стійкість до фузаріозу в них визначається домінантними генами трьох локусів. При цьому один з цих домінантних генів, умовно позначений як „А”, контролює стійкість тільки за умови комплементарної взаємодії з одним із двох інших генів, умовно позначених як В і С.

У лінії 5/81-91 фактично отримане розщеплення в F₂ відповідає теоретично очікуваному 57 : 7 та 5 : 3 в F₁BC₁. За такого типу розщеплення домінантний ген А обумовлює стійкість діючи самостійно, а гени В і С - тільки за комплементарної взаємодії між собою. Отримані в досліді дані достовірно не відрізнялися від теоретично очікуваних. Для ще більш переконливого підтвердження висунутого припущення щодо генної детермінації стійкості пшениць до фузаріозу аналізували покоління F₃, отримане від стійких нащадків F₂, на предмет гомо- та гетерозиготності (табл. 3). Насіння F₂ для отримання рослин F₃ сіяли так, що кожний рядок був потомством однієї рослини з популяції F₂. Завдяки цьому можна було встановити, яка рослина з F₂ є гомозиготною, а яка гетерозиготною. Для цього визначали співвідношення рядків, що мали стійкі та сприйнятливі рослини, та рядків без розщеплення.

Таблиця 3. Аналіз рослин F₃ на гомо- та гетерозиготність з метою визначення кількості домінантних генів стійкості до F. graminearum

Гмз - кількість гомозиготних рослин; гтз - кількість гетерозиготних рослин.

Достовірність різниці (Р) між фактично отриманими результатами в F₃ та теоретично розрахованими знаходилась у межах від 0,10 до 0,90 залежно від комбінації схрещування, тобто істотних розбіжностей між теоретично очікуваними й експериментально отриманими даними не спостерігалося. Це підтверджує висунуту нами гіпотезу стосовно генної детермінації ознаки стійкості до збудника фузаріозу колоса.

Результати визначення експресії генів досліджуваних оксидоредуктаз. На кожній з ензимограм досліджуваних ферментів контрольних зразків озимої м'якої пшениці спостерігали однакову кількість та однаковий розподіл у гелі ММФ. Міжлінійні розбіжності спостерігалися лише в розмірах та інтенсивності забарвлення окремих смуг, що може бути пов'язано з різною активністю та концентрацією відповідних ізозимів у пробах (Тоцький, 2001). Виявлені міжлінійні відмінності експресивності ген-ензимних систем контрольних зразків не корелюють зі ступенем стійкості пшениць до збудника фузаріозу колоса.

Більш чітка залежність між експресією генів досліджуваних оксидоредуктаз і ступенем стійкості рослин виявилася за екстремальних умов - зараження рослин фузаріями. З'ясувалося, що досліджувані ген-ензимні системи по-різному реагують на інфекцію; у стійких рослин, в основному, спостерігається зростання експресивності смуг окремих ММФ на ензимограмах. Найбільш яскраво подібні зміни проявлялися в спектрах ізоформ супероксиддисмутази (СОД), однак вони спостерігалися також з боку інших ММФ - фенолоксидази, пероксидази та цитохромоксидази.

В протилежність цьому, у сприйнятливих рослин лінії Одеська напівкарликова експресія зазначених ген-ензимних систем або мало змінювалася, або навіть зменшувалася. Оскільки в рослин цієї лінії домінантних генів вертикальної стійкості не виявлено, є підстави вважати, що саме ці гени стійких рослин необхідні для посилення експресії загальноклітинних генів при фузаріозі.

АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Опираючись на літературні джерела та отримані експериментально факти, ми довели наявність та визначили походження домінантних генів стійкості досліджуваних ліній пшениці до F. graminearum. Досліджені кореляційні та асоціативні зв'язки між ознакою стійкості та іншими фенотиповими ознаками рослин, обґрунтовано рекомендації щодо практичного впровадження отриманих результатів.

Стосовно генної детермінації ознаки стійкості до збудника фузаріозу колоса в досліджених ліній, їх рівня стійкості до цієї хвороби та джерел походження генних детермінантів стійкості, ми прийшли до висновку, що рівень стійкості досліджуваних ліній до фузаріозу визначається кількістю та ефективністю домінантних генів, які походять із різних джерел.

Високоефективні гени стійкості ліній 5/20-91, 5/81-91 та 8/77-91 походять від дикого співродича пшениці Aegilops cylindrica. Однакове генетичне походження генів стійкості, вірогідно, мають лінії Еритроспермум 2582/89, Обрій та Еритроспермум 898/91. Гени стійкості цих ліній походять від сорту Red River. У лінії Еритроспермум 898/91 присутні гени, які походять від стійкого до фузаріозу сорту Промінь, родовід якого в свою чергу містить також стійкий сорт Red River; ці ж гени властиві лінії Еритроспермум 2593/90. Не мають спільних генів з іншими досліджуваними лініями такі пшениці, як Еритроспермум 729/96 (донор стійкості Triticum palmovae), Еритроспермум 3059/92 (донор стійкості 92/69-153/IMH//IMHDW) та Ringo Sztar (донор стійкості невідомий). Таким чином, можна зазначити, що в досліджуваних ліній генетичний контроль стійкості здійснюється генами різного походження, які відрізняються між собою ступенем експресивності й ефективністю взаємодій у випадку їх суміщення в одному генотипі. Результати проведених досліджень свідчать, що найбільш властивою для цих генів є адитивно-домінантна та комплементарна взаємодія.

Визначення кореляцій між окремими показниками має дуже важливе значення для генетики. Це дозволяє більш ефективно оцінювати взаємодію генів специфічної стійкості до фузаріозу з генами загальноклітинного значення, які визначають генотипові відмінності морфологічних та біохімічних ознак і тим самим обумовлюють неспецифічну стійкість.

Нами з'ясовано кореляційні зв'язки між кількістю ураженого фузаріями зерна з рослини та іншими ознаками, що можуть слугувати маркерами стійкості рослин і бути корисними за селекційного процесу. Дослідження провадили серед гібридних популяцій F₂.

Коефіцієнти кореляції між ураженістю зерна та такими показниками, як маса 1000 зерен, маса зерна з колоса і кількість зерна у колосі, були достовірними і залежно від комбінації схрещування коливалися досить широко - від слабкої до сильної кореляції, а саме: щодо кількості зерна у колосі - від -0,18 до -0,50, щодо маси зерна з колоса - від -0,39 до -0,65, щодо маси 1000 зерен - від -0,20 до -0,74. Можливо, це пов'язано з різними механізмами генетичного контролю стійкості у отриманих гібридних рослин, а, отже, і з різними проявами розвитку інфекційного процесу. Все це висуває певні вимоги щодо оцінки селекційного матеріалу - його відбір на стійкість до збудника фузаріозу колоса повинен вестися за комплексом ознак, а не за якоюсь однією ознакою.

Кореляції ознаки стійкості гібридних рослин з показниками їх висоти на відміну від батьківських форм не спостерігалося. Достовірною, але досить слабкою ця кореляція була у Еритроспермума 2582/89 (-0,35) та Ringo Sztar (-0,36), у той час, як у батьківських рослин кореляція між вищезазначеними показниками була середньою (-0,47). Зазначене свідчить на користь існування слабкої залежності між цими показниками і в одночас про відсутність генетичної зчепності генів вказаних ознак.

Визначення рівня кореляції у гібридів F₂ показало відсутність чіткої асоційованості показника стійкості до збудника фузаріозу колоса із стійкістю рослин до збудників борошнистої роси, бурої іржі та септоріозу. У нащадків від схрещування з Ringo Sztar виявлена досить слабка кореляція стійкості з інтенсивністю ураження бурою іржою (0,30), у гібридів Еритроспермума 2593/90 - з ураженням борошнистою росою (-0,23), а у гібридів Еритроспермума 2582/89 - з інтенсивністю ураження септоріозом (0,26). Зазначене свідчить на користь припущення, що загальна стійкість рослин до фузаріозу в основному визначається генетичною системою специфічної стійкості.

Викликає інтерес питання про генетичні механізми неспецифічної стійкості досліджуваних пшениць до F. graminearum. Для цього з'ясовували стан ген-ензимних систем окремих оксидоредуктаз, функція яких надзвичайно важлива для прояву горизонтальної, а, можливо, і вертикальної стійкості (Палилова, 1993).

Рис. 2. Зміни експресивності ММФ досліджуваних ферментів при вирощуванні паростків в умовах зараження F. graminearum: Субстрати: 1 - бензидин, 2 - ФДА, 3 - пірокатехін, 4 - бензидин + фелурова кислота, 5 - бензидин + флороглюцин.

При зараженні фузаріями стійких генотипів найбільша кількість смуг на ензимограмах екстрактів змінювалася (більш інтенсивно забарвлювалася) у випадку СОД - 81% (рис. 2). Особливості, виявлені в реакціях ген-ензимних стійких та сприйнятливих рослин на зараження, свідчать про можливу участь генів досліджуваних ферментів у функціонуванні системи захисту рослин від фузаріозної інфекції під контролем генів вертикальної стійкості. Цілком можливо, що для формування стійкості пшениці до фузаріозу найбільш важливими є ті ММФ, які в умовах інфікування в стійких генотипів експресуються краще, а в чутливих не змінюють своєї активності або, навпаки, пригнічуються. За допомогою комп'ютерної програми (Календарь, 1994) були встановлені асоціації деяких ММФ досліджуваних ферментів з ознакою стійкості до фузаріозу в ліній озимої м'якої пшениці. Найбільш показовими в цьому відношенні виявилися ММФ СОД з Rf 0,08, ФО з Rf 0,45 та ПО з Rf 0,03. Отримані результати дають підстави для припущення, що в досліджуваних рослин пшениці виявляється певна залежність між наявністю окремих ізоформ досліджуваних оксидоредуктаз та наявністю й функціонуванням у генотипах постульованих нами на підставі гібридологічного аналізу генів вертикальної стійкості до фузаріозу колоса.

Між специфічною та неспецифічною стійкістю, кожна з яких є генетично обумовленою, існує закономірний зв'язок. У цьому ми переконалися, з'ясувавши ступінь асоційованості експресії досліджуваних ген-ензимних систем з показниками стійкості рослин до фузаріозу. Виявилося, що прямої залежності ознаки стійкості пшениць до фузаріозу від досліджуваних ген-ензимних систем не спостерігається. Можна вважати, що постульовані нами гени специфічної стійкості не проявляються через ген-ензимні системи оксидоредуктаз безпосередньо, але, без сумніву, гени вертикальної та горизонтальної стійкості знаходяться між собою в тісній взаємодії, обумовлюючи певний рівень імунності генотипів. Результати проведених дослідів свідчать, що експресія генів вертикальної стійкості й окремих ММФ досліджуваних оксидоредуктаз виявляє досить високий ступінь асоційованості, що можна використати з практичною метою в селекції, прийнявши ці ММФ за маркери стійкості.

ВИСНОВКИ

1. З'ясування механізмів стійкості рослин пшениці до фузаріозу та створення вихідного матеріалу, придатного для селекції стійких сортів, є актуальним, але ще не вирішеним завданням сучасної генетики.

2. Створена колекція стійких до збудника фузаріозу колоса генотипів пшениці різного походження. Від рослин сортів та форм цієї колекції шляхом інбридингу отримано високостійкі, стійкі, помірностійкі та одну дуже сприйнятливу лінії озимої м'якої пшениці, які можна використовувати для генетичних досліджень та в селекції.

3. Високостійкі (5/81-91, 5/20-91, 8/77-91) та стійкі (Еритроспермум 898/91 і Ringo Sztar) лінії озимої м'якої пшениці утримують в генотипі по три домінантних гени стійкості з домінантно-адитивною та комплементарною взаємодією. Стійкі лінії 2593/90, Еритроспермум 729/96, Еритроспермум 2582/89 мають по два комплементарно взаємодіючих домінантних гени стійкості, а помірностійкі - Обрій та Еритроспермум 3059/92 - по одному.

4. Стійкість рослин пшениці до фузаріозу визначається не тільки кількістю домінантних генів стійкості, але й генетичним походженням зазначених генів. Найбільш стійкими до фузаріозу є рослини тих ліній, які несуть домінантні гени стійкості від егілопса (5/81-91, 5/20-91, 8/77-91); лінії з тією ж кількістю домінантних генів, але іншого походження (Еритроспермум 898/91, Ringo Sztar) виявляють значно меншу стійкість.

5. Ознака стійкості досліджуваних ліній пшениці до збудника фузаріозу колоса не корелює з їх стійкістю до збудників інших грибкових захворювань - борошнистої роси, септоріозу та бурої іржі. Не виявлено також чіткої залежності між стійкістю досліджуваних пшениць до фузаріозу та їх морфологічними ознаками. Відсутність достовірної кореляції між зазначеними показниками свідчить про те, що стійкість досліджуваних ліній пшениці до фузаріозу визначається переважно генами вертикальної стійкості.

6. Експресія генів досліджуваних оксидоредуктаз у стійких та сприйнятливих до фузаріозу колоса пшениць виявляє істотні відмінності: при ураженні фузаріозом електрофоретичні смуги окремих ММФ у стійких генотипів значно інтенсивніше експресуються, ніж у сприйнятливих до фузаріозу рослин. Зазначене свідчить про участь генів досліджуваних оксидоредуктаз у захисних реакціях рослин пшениці до фузаріозу.

7. Інтенсифікація експресії загальноклітинних генів (оксидоредуктаз) спостерігається в заражених фузаріями рослин за умови, що генотипи цих рослин утримують домінантні гени специфічної стійкості. У зв'язку з цим сукупність генів вертикальної й горизонтальної стійкості рослини можна розглядати як єдину генетичну систему, що обумовлює загальну стійкість до фузаріозу.

8. Виявлено стійкі асоціації між наявністю окремих множинних молекулярних форм досліджуваних оксидоредуктаз, інтенсивністю їх забарвлення на електрофореграмах і ознакою стійкості рослин пшениці до фузаріозу. Це дозволяє використовувати окремі ММФ супероксиддисмутази, фенолоксидази й пероксидази як фенотипові маркери стійких генотипів.

Рекомендації для практичного використання

Досліджені нами лінії 5/81-91, 5/20-91, 8/77-91, отримані від міжвидових гібридів Одеської напівкарликової з Ae. cylindrica, крім підвищеної стійкості до фузаріозу, виявляють групову стійкість до збудників борошнистої роси, септоріозу та бурої іржі. Ці лінії разом з лініями Еритроспермум 898/91 і Ringo Sztar, що виявляють стійкість до фузаріозу колоса, можна рекомендувати для використання донорами цієї властивості. Усі вищезазначені лінії мають досить сильні домінантні гени стійкості до F. graminearum, а під час схрещувань зі сприйнятливою лінією Одеська напівкарликова проявили високу успадковуваність цієї ознаки. Решта досліджуваних ліній, що мають менш ефективні гени стійкості, може бути використана в комбінаційній селекції для отримання трансгресивного ефекту.

Ведучи добір на стійкість рослин пшениці до фузаріозу колоса, слід враховувати не тільки зовнішні симптоми ураження колосся, але й кількість ураженого в ньому зерна, схожість, масу врожаю тощо. Як найбільш показову фенотипову ознаку стійкості або чутливості до збудника фузаріозу колоса можна рекомендувати відсоток ураженого зерна в рослини.

Окремі ММФ досліджуваних ферментів, які в дослідах виявили асоціації з ознакою стійкості до фузаріозу, можна рекомендувати маркерами стійкості в селекційному процесі. Найбільш перспективними в цьому відношенні видаються ММФ супероксиддисмутази з Rf 0,08, фенолоксидази з Rf 0,45 і пероксидази з Rf 0,03.

флора таксономічний фітогеографічний

ЛІТЕРАТУРА

1. Мірось С. Л. Сорти пшениці, стійкі щодо збудника фузаріозу колоса (Fusarium graminearum) в умовах півдня України // Вісник ОДУ. - 1999. - Т. 4, вип. 3.- С. 41-46.

2. Бабаянц О. В., Мірось С. Л., Залогіна М. А., Мірось О. Л. Стійкість рослин різних сортів озимої пшениці до Fusarium graminearum // Вісник ОДУ. - 2000. - Т. 5, вип. 1.- С. 81-86.

3. Мірось С. Л., Бабаянц О. В. Генетичні основи стійкості ліній озимої м'якої пшениці до збудника фузаріозу колоса Fusarium graminearum // Вісник ОДУ. - 2001.- Т. 6, вип. 1. - С. 67-74.

4. Дьяченко Л. Ф., Топтіков В. А., Мірось С. Л., Бабаянц Л. Т., Тоцький В. М. Множинні молекулярні форми деяких оксидоредуктаз і резистентність м'якої пшениці до фузаріозу // Вісник ОДУ. - 2001. - Т. 6, вип. 1.- С. 59-66.

5. Бабаянц Л. Т., Мирось С. Л., Тоцкий В. Н., Бабаянц О. В. Генетическая детерминация и наследование признака устойчивости пшеницы к Fusarium graminearum // Цитология и генетика. - 2001. - Т. 35, № 3.- С. 22-29.

6. Мірось С. Л., Гандірук Н. Г., Тоцький В. М. Активність супероксиддисмутази і стійкість озимої м'якої пшениці до фузаріозу колоса // Вісник Одеського національного університету. - 2002. - Т. 1, вип. 1.- С. 95-99.

7. Топтиков В. А., Мирось С. Л., Дьяченко Л. Ф., Тоцький В. Н., Залогина М. А. Сопряженность устойчивости озимых мягких пшениц к Fusarium graminearum Schwabe и множественных молекулярных форм некоторых ферментов // Цитология и генетика - 2002.- Т. 36, № 2. - С. 3-11.

8. Miros S. L., Babayants O. V. Genetic Wheat base resistanse to Fusarium graminearum // Conference on genetics and molecular biology for students and young scientists devoted 100-th anniversary of genetics, 20-22 of april, 2000. - Lviv. - 2000 - P. 94.

9. Бабаянц О. В., Мирось С. Л Устойчивость озимой мягкой пшеницы к возбудителям фузариоза колоса на юге Украины // тез. доп. мiжнар. конф. „Науковi основи стабiлiзацiї виробництва продукцiї рослинництва”. - Харкiв. - 1999. - С. 385.

10. Мирось С. Л. Устойчивость пшеницы к возбудителю фузариоза колоса и ее генетическая основа // междунар. конф. молодых ученых „Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений”, 2-7 июля, 2001 г. - Харьков. - 2001. - С. 98.

11. Бабаянц Л. Т., Рыбалка А. И., Бабаянц О. В., Васильев А. А., Дубинина Л. А., Омельченко Л. И., Бушулян М. А., Мирось С. Л. Источники и доноры новых генов устойчивости пшеницы к фитопатогенам // Труды по фундаментальной и прикладной генетике (к 100-летнему юбилею генетики) - Харьков: Штрих. - 2001. - С. 232-241.

12. Бабаянц Л. Т., Рыбалка А. И., Бабаянц О. В., Бушулян М. А., Васильев А. А., Дубинина Л. А., Мирось С. Л. Новый исходный материал для селекции пшеницы на устойчивость к возбудителям инфекционных заболеваний // Пшеница и тритикале. Материалы научно-практической конференции “Зеленая революция П. П. Лукьяненко”, Краснодар, 28-30 мая 2001 г. - Краснодар: Советская Кубань”. - 2001. - С. 329 - 336.

13. Miros S. L., Babayants O. V. Inheritance of resistance to Fusarium graminearum // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics, September 20-22, 2001 - Kyiv. - 2001. - P.110.

14. Мірось С. Л. Стійкість озимої пшениці до збудника фузаріозу колосу і її корелятивні зв'язки з іншими господарчоцінними показниками // 54 наукова конференція професорсько-викладацького складу і наукових працівників, присвячена 135-й річниці ОДУ. - Одесса. - 1999. - С. 30.

15. Мірось С. Л., Тоцький В. М. Генетична детермінація стійкості до фузаріозу озимої м'якої пшениці // 55 наукова конференція професорсько-викладацького складу і наукових працівників, присвячена 10-й річниці незалежності України. - Одесса. - 2000. - С. 42.

16. Мірось С. Л. Генетико-біохімічні аспекти стійкості ліній озимої пшениці до збудника фузаріозу колоса Fusarium graminearum // 56 наукова конференція професорсько-викладацького складу і наукових працівників. - Одесса. - 2001. - С. 43.

17. Бабаянц Л. Т., Рыбалка А. И., Бабаянц О. В., Васильев А. А., Дубинина Л. А., Бушулян М. А., Мирось С. Л. Новый исходный материал и его использование при селекции пшеницы на групповую устойчивость к фитопатогенам // Первая всероссийская конференция по иммунитету растений к болезням и вредителям посв. 300-летию Санкт-Петербурга. - Санкт-Петербург - 2002. - С.167.

18. Дьяченко Л. Ф., Топтиков В. А., Мирось С. Л. Молекулярные формы оксидоредуктаз при адаптации растений к внешней среде // Сборник тезисов международной конференции „Адаптивная селекция растений Теория и практика”, 11-14 ноября 2002 г. - Харьков - 2002. - С. 107-108.

Размещено на Allbest.ru