Порівняльне вивчення просторової структури ТРНКser і ТРНКleu із thermus thermophilus і ділянок їхнього контакту з гомологічними аміноацил - ТРНК синтетазами

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

Автореферат

Порівняльне вивчення просторової структури ТРНК^ser і ТРНК^leu із thermus thermophilus і ділянок їхнього контакту з гомологічними аміноацил - ТРНК синтетазами

КОВАЛЕНКО Оксана Петрівна

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі ензимології білкового синтезу Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Тукало Михайло Арсентійович,

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України,

завідувач відділу ензимології білкового синтезу.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Негруцький Борис Сергійович,

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України,

провідний науковий співробітник відділу

механізмів трансляції генетичної інформації;

доктор біологічних наук, професор

Виноградова Руфіна Петрівна,

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна

НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу біохімії ліпідів.

Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України,

м. Київ.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Транспортні РНК відіграють надзвичайно важливу роль у процесі трансляції генетичної інформації. Розуміння механізмів впізнавання тРНК, наслідком якого є специфічне аміноацилування тРНК аміноацил-тРНК синтетазою, досі залишається однією з невирішених проблем молекулярної біології, незважаючи на велику кількість робіт, присвячених цій темі. Результати рентгеноструктурного аналізу і біохімічних досліджень виявили значну подібність просторової будови молекул тРНК, які мають різну амінокислотну специфічність, що додатково ускладнює процес вибору аміноацил-тРНК синтетазою гомологічної тРНК серед інших молекул тРНК. За останні два десятиріччя за допомогою генетичних, біохімічних і біофізичних методів було показано, що для тРНК будь-якої амінокислотної специфічності характерний набір певних секвенс-специфічних елементів впізнавання. Але разом з тим було виявлено, що просторова структура тРНК не лише відіграє роль каркасу для належної репрезентації нуклеотидів - елементів впізнаваня. Встановлено, що для цілого ряду тРНК локальні особливості просторової структури важливі для їхнього ефективного специфічного аміноацилування (Giegй, 1993, 1998).

На особливу увагу заслуговують тРНК ІІ класу, варіабельна гілка яких складається більше ніж з десяти нуклеотидних залишків і утворює додатковий структурний домен, який відсутній в тРНК І класу. У клітинах прокаріотів три види тРНК містять довгу варіабельну гілку: тРНК^Ser, тРНК^Leu і тРНК^Tyr. За допомогою мутагенезу було визначено елементи впізнавання тРНК ІІ класу із E.coli (Asahara, 1993, 1994; Himeno, 1990; Tocchini-Valentini, 2000). Встановлено, що нуклеотиди антикодону не беруть участі у специфічному впізнаванні тРНК^Ser і тРНК^Leu, тоді як для тРНК І класу (за винятком тРНК^Ala) антикодон є основним елементом впізнавання (McClain, 1993; Giegй, 1998). Разом з тим критичну роль відіграють елементи просторової структури. Для впізнавання тРНК^Ser і тРНК^Tyr важливе значення мають довжина і правильна орієнтація варіабельної гілки, для тРНК^Leu - особливості будови корової частини (tertiary core) макромолекули, тоді як роль довгої варіабельної гілки не з'ясовано. З іншого боку, довга варіабельна гілка була запропонована як важливий елемент у процесах дискримінації між тРНК ІІ класу (Brennan, 1976; Himeno, 1990).

Істотним етапом у вирішенні проблеми специфічного аміноацилування тРНК з довгою варіабельною гілкою є визначення особливостей їхньої просторової організації, а також топографії комплексів з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами. Прямим методом для вирішення цих завдань є рентгеноструктурний аналіз, але його застосування обмежене труднощами, які виникають при кристалізації біологічних макромолекул, та невисокою якістю багатьох з одержаних кристалів. На сьогодні отримано кристали та вивчено будову лише двох комплексів тРНК ІІ класу з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами, а саме тРНК^Ser - серил-тРНК синтетаза і тРНК^Tyr - тирозил-тРНК синтетаза із Thermus thermophilus (Biou, 1994; Yaremchuk, 2002). Результати досліджень свідчать про наявність у структурах тРНК^Ser і тРНК^Tyr просторових взаємодій (tertiary interaction), які не знайдені в тРНК І класу. Але необхідно зауважити, що з одного боку умови кристалізації, а з іншого - взаємодія з ферментом можуть призводити до змін у просторовій організації тРНК (Giegй, 1983; Nureki, 1993; Goldgur, 1997). Тому виникає проблема відповідності структур тРНК у вільному стані та у складі комплексів з білками, а також станів комплексів у кристалі та у розчині. Отже, важливого значення набувають дослідження тРНК^Ser і тРНК^Tyr із T.thermophilus як у вільному стані, так і в комплексах з білками в умовах, наближених до фізіологічних, тобто у розчині.

У 70-х роках були отримані кристали тРНК^Leu із Escherichia coli (Spencer, 1979), але їхня якість не дозволила вивчити будову тРНК рентгеноструктурним аналізом. Незважаючи на накопичену детальну інформацію про функціональну роль елементів просторової структури прокаріотичних тРНК^Leu у процесах специфічного аміноацилування, конкретні особливості цієї будови залишаються нез'ясованими.

Зв'язок роботи з науковими планами, програмами, темами. Дисертаційна робота відповідє основному плану науково-дослідних робіт відділу ензимології білкового синтезу Інституту молекулярної біології і генетики НАН України. Її виконано в рамках бюджетної теми “Вивчення молекулярних механiзмiв специфiчного впiзнавання i амiноацилювання тРНК амiноацил-тРНК синтетазами другого класу”, (номер державної реєстрації - 0100U000793), а також за підтримки гранта № 75195-4801 “Структурні основи специфічного впізнавання аміноацил-тРНК синтетазами гомологічних амінокислот і тРНК” Медичного інституту ім. Говарда Хьюза (м. Чеві Чейз, США).

Мета та завдання дослідження. Метою наших досліджень було встановити спільні та відмінні риси у просторовій організації тРНК^Ser і тРНК^Leu із T.thermophilus, а також визначити ділянки контакту цих тРНК з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:

Визначити нуклеотидну послідовність тРНК^Ser (GCU), тРНК^Ser (GGA) і тРНК^Leu (CAG) із T.thermophilus .

Дослідити участь залишків фосфорної кислоти і азотистих основ у формуванні просторової структури тРНК^Ser (GCU) і тРНК^Ser(GGA) із T.thermophilus. Порівняти отримані результати з даними рентгеноструктурного аналізу комплексу тРНК^Ser (GGA) - серил-тРНК синтетаза із T.thermophilus (Biou, 1994) з метою встановлення міри відповідності структури тРНК^Ser в розчині та у кристалі.

Визначити фосфатні залишки і азотисті основи, які беруть участь у підтриманні просторової структури тРНК^Leu(CAG).

Виявити ділянки контакту тРНК^Ser із серил-тРНК синтетазою і тРНК^Leu - з лейцил-тРНК синтетазою із T.thermophilus.

Об'єкт дослідження - серинова і лейцинова тРНК прокаріотичного типу.

Предмет дослідження - просторові структури тРНК^Ser і тРНК^Leu із T.thermophilus; ділянки контакту тРНК^Ser із серил-тРНК синтетазою і тРНК^Leu - з лейцил-тРНК синтетазою із T.thermophilus.

Методи дослідження - нуклеотидні послідовності тРНК визначали методом швидкого гель-секвенування (Peattie, 1979), участь залишків фосфорної кислоти і азотистих основ у підтриманні просторової структури тРНК, а також ділянки контакту тРНК з аміноацил-тРНК синтетазами - методами хімічної модифікації (Peattie, 1980; Vlassov, 1981).

Наукова новизна одержаних результатів. Одержало подальший розвиток вивчення просторової структури тРНК^Ser, а також структури комплексу тРНК^Ser - серил-тРНК синтетаза із T.thermophilus, яке було проведене в умовах, наближених до фізіологічних, тобто у розчині. Визначено фосфатні залишки і азотисті основи тРНК^Ser, які беруть участь у формуванні її просторової структури. Виявлено ділянки контакту тРНК^Ser із серил-тРНК синтетазою. Зроблено висновок про загальну відповідність просторової структури тРНК^Ser і ділянок її контакту із серил-тРНК синтетазою в розчині та у кристалі.

Визначено фосфатні залишки і азотисті основи, які беруть участь у підтриманні просторової структури прокаріотичної тРНК^Leu. Вперше одержано дані, що вказують на різну орієнтацію довгої варіабельної гілки в прокаріотичних тРНК^Ser і тРНК^Leu, а також показано відмінності в організації корових частин цих тРНК.

Виявлено ділянки контакту прокаріотичної тРНК^Leu із T.thermophilus з гомологічною лейцил-тРНК синтетазою. Вперше показано, що лейцил-тРНК синтетаза утворює контакти з фосфатами нуклеотидів - учасників корових триплетних взаємодій. Конфігурація останніх, за нашими даними, різна в тРНК^Ser і тРНК^Leu, що дозволило висунути припущення про важливу роль знайдених відмінностей для впізнавання лейцил-тРНК синтетазою гомологічної тРНК.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані про реакційну здатність азотистих основ і фосфатних залишків тРНК^Leu T.thermophilus дають необхідну інформацію для створення комп'ютерної моделі тривимірної структури цієї тРНК, що має важливе значення для виявлення особливостей просторової організації прокаріотичних тРНК^Leu.

Надалі створена модель разом з одержаними нами даними про ділянки контакту тРНК^Leu з гомологічною аміноацил-тРНК синтетазою, а також з даними рентгеноструктурного аналізу будови лейцил-тРНК синтетази із T.thermophilus (Сusack, 2000) нададуть можливість створити модель комплексу тРНК^Leu - лейцил-тРНК синтетаза із прокаріотів, що має важливе значення для подальшого вивчення структурних основ впізнавання тРНК ІІ класу гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами.

Одержана в роботі інформація про існування контактів між довгою варіабельною гілкою тРНК^Leu і лейцил-тРНК синтетазою є вкладом у вирішенняя участі довгої варіабельної гілки в процесах дискримінації серед тРНК ІІ класу.

Результати роботи можуть бути корисними при вивченні еволюційних аспектів функціонування молекул тРНК.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу виконано під керівництвом д.б.н., ст. н. с., зав. відділу ензимологігії білкового синтезу ІМБіГ НАН України М.А.Тукала. Основний обсяг експериментальної роботи виконаний за безпосередньої участі здобувача. Обробку і аналіз отриманих результатів виконано безпосередньо пошукачем. Експерименти із визначення нуклеотидних послідовностей обох тРНК^Ser, рівней реакційної здатності залишків фосфорної кислоти обох тРНК^Ser у вільному стані та у присутності серил-тРНК синтетази виконані у співробітництві з к.б.н. З.М. Петрушенко та Н. М. Мальченко. Здобувач висловлює подяку І. А. Крикливому за люб'язно надані препарати індивідуальних тРНК^Ser і тРНК^Leu із T.thermophilus, к.б.н. Г.Д. Яремчук - за визначення нуклеотидних послідовностей генів тРНК^Leu із T.thermophilus і люб'язно надані препарати індивідуальних серил- і лейцил-тРНК синтетаз із T.thermophilus. Автор висловлює подяку д. б. н., ст. н. с. М. А. Тукалу за керівництво, корисні поради і обговорення результатів. Одержані результати обговорено та опубліковано в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на конференціях Медичного інституту ім. Говарда Хьюза для міжнародних наукових співробітників із країн Балтії, центральної Європи і колишнього Радянського Союзу (Прага, Чехія, 1996; Москва, Росія, 1999), XVIII Міжнародній робочій нараді по тРНК (Кембридж, Велика Британія, 2000), VIII-му Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей та тези чотирьох доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 169 сторінках. Вона складається зі вступу, огляду літератури (1 розділ), експериментальної частини (4 розділи), узагальнення одержаних результатів, висновків, списку цитованої літератури, який охоплює 155 найменуваннь, і додатків. Дисертацію проілюстровано 53 рисунками і 2 таблицями.

Основний зміст

Матеріали та методи дослідження. Індивідуальні тРНК^Ser(GCU), тРНК^Ser(GGA) та тРНК^Leu(CAG) із T.thermophilus виділені та люб'язно надані І.А. Крикливим (ІМБіГ НАН України). Серил-тРНК синтетаза (90% чистоти) і лейцил-тРНК синтетаза (~90% чистоти) із T.thermophilus виділені і люб'язно надані к.б.н. Г.Д. Яремчук (ІМБіГ НАН України).

Для мічення молекул тРНК використовували [³²P]- ATP, [³²P] ATP з питомою активністю 2000-3000 Кі/ммоль і [ ³² P]pCp з питомою активністю 300 Кі/ммоль ( "Amеrsham", Велика Британія ).

Хімічну модифікацію молекул тРНК проводили із використанням диметилсульфату ("Fluka", Швейцарія), діетилпірокарбонату ("Calbiochem", США) і етилнітрозосечовини (синтезована к.х.н. А. Г. Терент'євим, ІМБіГ НАН України). фосфорний азотиста основа трнк

Мічення 3'- і 5'-кінців молекул тРНК проводили відповідно з роботами (Bruce, 1978; Vlassоv, 1981; Silberklang, 1977). Визначення нуклеотидної послідовності тРНК^Ser і тРНК^Leu проводили відповідно з роботою (Peattie, 1980).

Алкілування фосфатів тРНК^Ser і тРНК^Leu етилнітрозосечовиною здійснювали згідно з (Vlassоv, 1981), але з невеликими змінами. Інкубацію проводили в умовах, що стабілізують просторову структуру тРНК (300 мМ какодилат натрію рН 8,0, який містив 100 мМ NaCl; 20 мМ MgCl₂; 2 мМ EДTA; при 65?С протягом 5 хв), і в умовах денатурації (300 мМ какодилат натрію рН 8,0; 2 мМ EДTA 2 хв при 80?С).

Алкілування азотистих основ тРНК^Ser і тРНК^Leu. Хімічну модифікацію залишків гуанозину і цитидину диметилсульфатом, аденозину - діетилпірокарбонатом і наступний гідроліз тРНК за модифікованими основами здійснювали як в роботі (Peattie, 1980), але з невеликими змінами. Інкубацію проводили в 50мМ какодалаті натрію рН 7,0; 10 мМ MgCl₂ при 65С (контрольні інкубації і нативні умови) і в присутності 1 мМ ЕДТА, але за відсутності MgCl₂; при 65С (умови напівденатурації) або 90С (умови денатурації).

Визначення ділянок контакту тРНК^Ser і тРНК^Leu з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами здійснювали методом захисту фосфатів тРНК аміноацил-тРНК синтетазами від модифікації етилнітрозосечовиною відповідно до (Vlassоv, 1981). Алкілування тРНК у присутності гомологічної аміноацил-тРНК синтетази проводили в умовах, що сприяють комплексоутворенню, а саме - в 50 мМ трис-HCl рН 7,9; який містив 5 мМ MgCl₂; 2,5 мМ в-меркаптоетанол; при 37?С протягом 2 год. Суміш містила 1мкМ тРНК^Ser або тРНК^Leu і 4 мкМ відповідну аміноацил-тРНК синтетазу. Такий надлишок дозволяє не зважати на зниження активності ферменту під час інкубації.

Фрагменти міченої тРНК, отримані в результаті гідролізу модифікованих молекул, розділяли електрофорезом у поліакриламідному гелі різної концентрації (10%, 12,5%, 15% і 20%) у присутності 8М сечовини. Для радіоавтографії гелів використовували рентгенівську плівку Kodak. Інтенсивність електрофоретичних смуг, яка відображає ступінь модифікації фосфатів, визначали, використовуючи сканувальний денситометр "UltraScan XL" фірми LKB (Швеція).

Результати досліджень та обговорення. Визначення нуклеотидних послідовностей тРНК^Leu і тРНК^Ser із T.thermophilus. Було досліджено дві ізоакцепторні тРНК^Ser і одну тРНК^Leu із T.thermophilus. Нуклеотидні послідовності тРНК^Ser(GCU), тРНК^Ser(GGA) і тРНК^Leu(CAG) із T.thermophilus визначали методом швидкого гель-секвенування (Peattie, 1979), в основі якого лежить специфічна хімічна деградація полінуклеотидного ланцюга тРНК. Мінорні нуклеотидні залишки визначені к.б.н З.М. Петрушенко та Н.М. Мальченко (ІМБіГ НАН України) (Петрушенко, 1997).

Встановлено, що тРНК^Ser(GCU) складається із 93, тРНК^Ser(GGA) - із 94 нуклеотидних залишків, з яких 62 гомологічні залишкам у структурі тРНК^Ser(GCU) (рис.1). Послідовності акцепторних стебел, Т- і D -гілок майже ідентичні (за винятком пари 10-25), в антикодоновій і варіабельних гілках гомології практично відсутні. Довжина варіабельної петлі тРНК^Ser(GGA) збільшена порівняно з тРНК^Ser(GCU) на 1 нуклеотидний залишок. тРНК^Leu T.thermophilus складається із 87 нуклеотидних залишків, з яких 37 - гомологічні залишками в "узагальненій" послідовності двох ізоакцепторних тРНК^Ser із T.thermophilus. Аналіз послідовностей D- петель і варіабельних гілок тРНК^Ser і тРНК^Leu виявив , що D - петля тРНК^Ser має структуру б =1, в=3, між варіабельним стеблом і нуклеотидом у положенні 48 немає неспарених нуклеотидних залишків;

у тРНК^Leu D-петля має структуру б =2, в=2 і присутній один неспарений залишок між варіабельним стеблом і нуклеотидом 48, що є характерними особливостями послідовностей тРНК^Ser і тРНК^Leu із клітин прокаріотів. За цими ознаками, що запропоновані як важливі для формування просторової структури тРНК ІІ класу (Himeno, 1990), тРНК^Ser і тРНК^Leu є типовими прокаріотичними сериновими і лейциновими тРНК відповідно.

Дослідження просторової структури тРНК^Ser і тРНК^Leu із T.thermophilus. Для дослідження тРНК^Ser і тРНК^Leu із T.thermophilus використовували методи хімічної модифікації, які дозволяють вивчити елементи просторової структури РНК на рівні окремих нуклеотидів. Реакційну здатність залишків фосфорної кислоти тРНК^Ser визначали за допомогою етилнітрозосечовини, яка реагує з кисневими атомами фосфатних груп нуклеїнових кислот. Низька реакційна здатність фосфатних залишків свідчить про їхню участь в утворенні водневих зв'язків з іншими елементами структури тРНК або у зв'язуванні іонів металу. Доступність фосфатів для модифікації вивчали в умовах, що стабілізують просторову структуру тРНК, і в умовах денатурації. В обох тРНК^Ser неможливо дослідити рівень модифікації 5'-фосфату нуклеотиду G19 через присутність у положенні 18 залишку з 2'-О-метилрибозою (Петрушенко, 1997), що значно ускладнює розрив фосфодіефірного зв'язку між нуклеотидами 18 і 19. Відносні реакційні здатності залишків фосфорної кислоти визначали на основі розрахунків денситограм відповідних електрофоретичних доріжок.

З кривих розрахунку денситограм ( рис.2 ) видно, що фосфати з низьким рівнем модифікації розташовані переважно на гомологічних ділянках в тРНК^Ser(GCU) і тРНК^Ser(GGA): у куті між акцепторним і D-стеблами (Р7-P11), у D-петлі (Р20 - Р22), у варіабельній (Р47h-P47j) і Т-петлях (Р57-Р60), а також на ділянці з'єднання варіабельного і Т-стебел (Р47q - Р49). У тРНК^Ser(GGA) додатково низький рівень модифікації мають 5'-фосфати нуклеотидів антикодонової петлі (Р36, Р37).

Реакційну здатність азотистих основ тРНК^Ser визначали в умовах стабілізації, напівденатурації і денатурації просторової структури тРНК. Для модифікації використовували диметилсульфат, який алкілує атом N7 гуаніну і атом N3 цитозину, а також діетилпірокарбонат, який етилює атом N7 аденіну. Оскільки атом N3 цитозину бере участь в утворенні Вотсон-Криківських пар нуклеотидів, а реакції модифікації залишків гуанозину і аденозину чутливі до стекінг-взаємодій, що виникають на двоспіральних ділянках тРНК, визначити участь у просторових взаємодіях можливо лише для тих залишків, які розташовані на одноланцюгових ділянках. Винятком є залишки G51-G53, низька реакційна здатність яких пов'язана, найімовірніше, із взаємодією основ з іоном Mg²⁺, що стабілізує просторову структуру тРНК. Таку взаємодію спостерігали в кристалі тРНК^Phe дріжджів (Teeter, 1980; Shi, 2000), а також запропоновано для тРНК^Ser дріжджів при комп'ютерному моделюванні її просторової структури (Dock-Bregeon, 1989).

В умовах збереження просторової структури в обох тРНК^Ser нереакційноздатні основи залишків G9, G13, A14, A22, С48, C56, G57, A59, а також пуриновий залишок у положенні 26. Додатково в тРНК^Ser(GGA) низький рівень модифікацій мають основи С32, ms²i⁶A37, A38 і A47j.

Результати модифікації фосфатних груп і азотистих основ тРНК^Ser наведено на рис.3. Порівняння одержаних результатів свідчить, що розбіжності в реакційній здатності гомологічних фосфатів і азотистих основ характерні переважно для нуклеотидів антикодонової петлі. У тРНК^Ser(GGA) в положеннях 35 і 36 знаходяться залишки пуринів на відміну від тРНК^Ser(GCU), де вони представлені піримідинами. Таким чином, 3'-ділянка антикодонової петлі тРНК^Ser(GGA) складається виключно із залишків пуринів, що створює інші порівняно з тРНК^Ser(GCU), умови для стекінг-взаємодій основ і може призводити до виникнення такої локальної конформації петлі, для стабілізації якої необхідне зв'язування катіону. Отже, знижена реакційна здатність нуклеотидних залишків антикодонової петлі тРНК^Ser(GGA), найімовірніше, пов'язана з існуванням центру зв'язування іона Mg²⁺, як це спостерігали, наприклад, у тРНК^Phe дріжджів (Shi, 2000). Знайдені відмінності, очевидно, не мають принципового значення для формування особливої просторової структури тРНК^Ser. Аналіз одержаних результатів вказує на те, що незважаючи на значні відмінності у нуклеотидних послідовностях, тРНК^Ser(GCU) і тРНК^Ser(GGA) iз T.thermophilus мають однакову загальну просторову конфігурацію.

Формування просторової структури тРНК^Ser, ймовірно, відбувається з виникненням пар нуклеотидів G19-C56, U8-A14, Pu26-U44 (де Pu - залишок пурину) і G15-C48. Основа А59, найімовірніше, розташована над нуклеотидами пари 15-48 і знаходиться з ними у стекінг-взаємодії. В корі тРНК^Ser виникає незвичайна триплетна взаємодія G9-A22-G13, додатково стабілізована водневим зв'язком між основою G9 і фосфатною групою нуклеотиду А22. У Т-петлі виникають водневі зв'язки між фосфатами нуклеотиду U60, атомом N4 основи С61 і рибозою нуклеотиду m¹A58, між Ш55 і фосфатом нуклеотиду m¹A58, що вказує на канонічну просторову структуру Т-петлі, обумовлену наявністю консервативних нуклеотидних залишків у положеннях 54, 58 і 61 (Romby, 1987). Просторова структура тРНК^Ser стабілізована взаємодією нуклеотидів, які розташовані на стику акцепторного та D-стебел (Р7-Р10), у варіабельній петлі (Р47h-P47j в тРНК^Ser(GCU) ; Р47і i А47j в тРНК^Ser(GGA)) і Т-стеблі (G51-G53) з іонами Mg².

Одержана нами інформація про реакційні здатності фосфатів і азотистих основ в тРНК^Ser T.thermophilus, узгоджується з даними, які очікували, виходячи з будови тРНК^Ser у кристалі (Biou, 1994). Це дозволило нам зробити висновок про загальну відповідність просторової структури тРНК^Ser в розчині та у кристалі в межах застосованих методів дослідження.

При вивченні просторової структури тРНК^Leu із T.thermophilus застосовували ті ж методичні підходи, що й для тРНК^Ser. Через неспецифічну деградацію полінуклеотидного ланцюга не вдалося визначити реакційну здатність фосфатів нуклеотидів 20а, 28 і 47d. З кривої розрахунку денситограм (рис. 4) видно, що в умовах, які стабілізують просторову структуру, в тРНК^Leu T.thermophilus низький рівень модифікації мають фосфати D-гілки (Р11, Р12, Р21, Р22), фосфати, які розташовані у кутах між антикодоновим і варіабельним стеблами (Р45) та між варіабельним і Т-стеблами (Р48), а також у Т-петлі (Р58-60). Нереакційноздатними виявились основи залишків G9, A14, A15, A20a, G21, A22, A26, C56, A57 і G59, що свідчить про їхню участь у підтриманні просторової структури тРНК^Leu (рис. 5).

Аналіз одержаних результатів свідчить про те, що молекули тРНК^Leu T.thermophilus мають канонічну просторову L-форму, при утворенні якої відбувається взаємодія D- і Т-петель з виникненням пар G19-C56 і G26-U44. Т-петля, найімовірніше, має канонічну просторову конфігурацію. Довга варіабельна гілка експонована у розчин. У коровій частині тРНК^Leu виникає триплетна взаємодія нуклеотидів (8-14)-21, характерна для тРНК як І, так і ІІ класу (Jack, 1976; Moras, 80; Biou, 1994; Yaremchuk, 2002). Одержані нами результати вказують на існування в корі тРНК^Leu ще двох триплетних взаємодій (15 - 48) - 20а і 9 - (13 - 22), які не знайдені в тРНК І класу (триплет 9 - (13 - 22), можливо, існує лише в тРНК^Cys E.coli (Nissen, 1999; Christian, 2000), але присутні у двох інших

тРНК ІІ класу із T.thermophilus, тРНК^Ser (Biou, 1994) і тРНК^Tyr (Yaremchuk, 2002), і,

мабуть, є характерною особливістю тРНК з довгою варіабельною гілкою. Структура тРНК^Leu T.thermophilus стабілізована взаємодіями з іонами Mg²⁺, які відбуваються за участю фосфатних залишів нуклеотидів С11, G12, G18 і азотистих основ залишків G51, G52, G53.

Умови експериментів були аналогічними для тРНК^Ser і тРНК^Leu із T.thermophilus, що дозволило порівняти одержані результати. Очевидно, що встановлені нами взаємодії, які виникають при утворенні просторової структури

тРНК^Leu, аналогічні взаємодіям у тРНК^Ser. Разом з тим знайдено і суттєві відмінності. Порівняння рівней модифікації фосфатів варіабельних гілок виявило, що в тРНК^Ser нереакційноздатні фосфати, розташовані у куті між варіабельним і Т-стеблами (Р47q - Р49), у тРНК^Leu нереакційноздатний лише Р48, але низьку реакційну здатність має також фосфат Р45, розташований у куті між варіабельним і антикодоновим стеблами. Різні картини модифікації фосфатних груп нуклеотидів, розташованих в основі варіабельного стебла, вказують на різні способи взаємодії варіабельної гілки з "тілом" молекули і, як наслідок, на різну орієнтацію варіабельних гілок у тРНК^Ser і тРНК^Leu. У тРНК^Ser перша пара нуклеотидів варіабельного стебла знаходиться у стекінг-взаємодії з основою G20b (D-петля), яка і визначає напрямок варіабельної гілки (Biou, 1994). У тРНК^Leu залишок 20b відсутній, але встановлено, що певна роль у взаємодії варіабельної гілки з коровою частиною тРНК належить залишку 47j, реакційна здатність якого знижена. Наявність неспареного нуклеотидного залишку перед залишком U48 є характерною особливістю прокаріотичних тРНК^Leu (Himeno, 1990), тому можливо, що G47j у тРНК^Leu T.thermophilus є функціональним аналогом залишку G20b в тРНК^Ser.

Другу важливу відмінність було знайдено у реакційній здатності основ залишків 15 і 21, які входять до складу корових триплетних взаємодій (8 -14) - 21 і (15 - 48) - 20а. У тРНК^Ser залишок 21 повністю реакційноздатний, а реакційна здатність залишку 15 лише дещо знижена. У тРНК^Leu обидва залишки нереакційноздатні, що на нашу думку, свідчить про різні умови для стекінг-взаємодій основ у корових частинах досліджуваних тРНК, а отже, про різну конфігурацію триплетних взаємодій в тРНК^Ser і тРНК^Leu із T.thermophilus. Одним із можливих пояснень виникнення сильних стекінг-взаємодій в корі тРНК^Leu є збереження планарності триплетів (8 - 14) - 21 і 9 - (13 - 22), яка порушена в тРНК^Ser (Biou, 1994). Очевидно, що причиною виникнення відмінностей в структурах корових частин тРНК^Ser і тРНК^Leu є відсутність на в-ділянці D-петлі тРНК^Leu додаткового нуклеотидного залишку в положенні 20b, який відіграє важливу роль у формуванні "внутрішньомолекулярного простору" двох інших тРНК ІІ класу із T.thermophilus, тРНК^Ser (Biou, 1994) і тРНК^Tyr (Yaremchuk, 2002). Визначення ділянок контакту тРНК^Ser і тРНК^Leu із T.thermophilus з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами проводили методом захисту фосфатних залишків тРНК від модифікації етилнітрозосечовиною в присутності аміноацил-тРНК синтетаз. Як було показано (Vlassov, 1981), у зоні контакту з ферментом доступність фосфатів для дії реагенту зменшена. Стратегія експериментів аналогічна до таких для вільної тРНК. Через ефект "стиснення" електрофоретичних смуг не вдалося визначити рівень модифікації фосфатів, які розташовані у куті між варіабельною гілкою і Т-стеблом, а також фосфатів з 5'-боку Т-стебла (Р47і-Р53) в тРНК^Leu.

З кривих розрахунку денситограм (рис.6) видно, що серил-тРНК синтетаза із T.thermophilus захищає від модифікації етилнітрозосечовиною 5'-фосфати нуклеотидів, які в обох тРНК^Ser розташовані на трьох ділянках: у варіабельному стеблі (фосфати 46- 47c, 47o, 47p), Т-гілці (Р 53, Р54, Р57) і акцепторному стеблі (Р67-Р69). Реакційну здатність фосфатної групи залишку G57 у тРНК^Ser(GCU) встановити не вдалося через неспецифічний гідроліз полінуклеотидного ланцюга на відповідній ділянці. Фосфати антикодонової і D-гілок мають високий рівень модифікації, тобто не беруть участі в утворенні зв'язків з ферментом. Ділянки контакту з білком в обох ізоакцепторних тРНК^Ser збігаються, незважаючи на відмінності у нуклеотидних послідовностях варіабельних гілок.

Порівняння ділянок взаємодії тРНК^Ser із серил-тРНК синтетазою в розчині та у кристалі (рис.7), виявило відповідність одержаних нами результатів даним рентгеноструктурного аналізу. Таким чином, наші результати дозволяють зробити висновок про те, що взаємодія тРНК^Ser із серил-тРНК синтетазою із T.thermophilus у розчині та у кристалі відбувається аналогічно, при визначальній ролі рибозофосфатного остова молекули тРНК. Відомо, що правильна орієнтація варіабельної гілки є найважливішою умовою специфічного аміноацилування тРНК^Ser E.coli (Аsahara, 1994), тому очевидно, що безпосередній контакт серил-тРНК синтетази з довгим варіабельним стеблом не лише відіграє важливу роль у впізнаванні тРНК^Ser із T.thermophilus, але й дозволяє уникнути помилкового аміноацилування серином тРНК^Leu, в якій орієнтація варіабельної гілки, як ми встановили, відрізняється від такої в тРНК^Ser.

У тРНК^Leu із Thermus thermophilus у присутності лейцил-тРНК синтетази захисту від модифікації етилнітрозосечовиною зазнають фосфати, які локалізовані в чотирьох зонах: у D-петлі (Р14, Р15), з 3'-боку D-стебла (Р24, Р25), в антикодоновому (Р38-Р40) і варіабельному (Р47і) стеблах (рис. 8 і рис.9). Фосфатні групи антикодонової петлі не захищені ферментом від модифікації, більше того, у присутності лейцил-тРНК синтетази відбувається деградація полінуклеотидного ланцюга на ділянці антикодону (Р34 - Р36), якій не запобігає додавання у реакційну суміш інгібітора нуклеаз. Можливо, при взаємодії з тРНК фермент спричиняє конформаційні зміни в антикодоновій петлі, внаслідок чого її структура на окремих ділянках стає менш стабільною (Deitrich, 1989; Петрушенко, 1989).

Розташування ділянок контакту вказує на те, що лейцил-тРНК синтетаза із T.thermophilus взаємодіє з гомологічною тРНК з боку D-гілки. На відміну від серил-тРНК синтетази контакт лейцил-тРНК синтетази з варіабельним стеблом тРНК^Leu, ймовірно, відіграє лише допоміжну роль у процесах дискримінації серед тРНК ІІ класу. Основними детермінантами специфічного впізнавання тРНК^Leu E.coli є структура б- і в-ділянок D-петлі, а також залишки А14, А15 і А20а, які важливі саме як елементи просторової структури (можливо, за винятком А14) (Asahara, 1993, 1998). Отже, важливого значення набувають знайдені нами контакти лейцил-тРНК синтетази з фосфатами нуклеотидів 14 і 15 тРНК^Leu T.thermophilus. За результатами наших досліджень структура корової частини тРНК^Leu, побудована за участю саме цих нуклеотидів, відрізняється від структури кору тРНК^Ser, що дозволило висунути припущення про важливу роль знайдених відмінностей для впізнавання лейцил-тРНК синтетазою гомологічної тРНК. Можливо, на ділянці залишків 14 і 15 відбувається формування унікальної конфігурації цукрово-фосфатного остова.

Результати наших досліджень є основою для подальшого вивчення особливостей функціонування прокаріотичних тРНК^Leu і вказують на необхідність ретельного дослідження можливості секвенс-специфічного впізнавання залишку А14 в корі тРНК^Leu, а також ролі довгої варіабельної гілки тРНК^Leu у процесах дискримінації серед тРНК ІІ класу.

Висновки

У дисертаційній роботі досліджено просторову структуру прокаріотичних тРНК^Ser і тРНК^Leu у розчині, а також ділянки контакту цих тРНК з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами, що важливо для вивчення структурних основ функціонування тРНК ІІ класу.

Методом швидкого гель-секвенування встановлено нуклеотидні послідовності двох ізоакцепторних тРНК^Ser і однієї тРНК^Leu із екстремального термофілу Thermus thermophilus. Виявлено характерну для прокаріотичних тРНК^Ser і тРНК^Leu будову D-петлі і варіабельного стебла, які важливі для формування особливої просторової структури цих тРНК.

Визначено рівень модифікації залишків фосфорної кислоти етилнітрозосечовиною, залишків гуанозину і цитидину - диметилсульфатом, аденозину - діетилпірокарбонатом у тРНК^Ser(GCU) і тРНК^Ser(GGA) і виявлено нуклеотиди, які беруть участь у підтриманні просторової структури цих тРНК. Показано відповідність внутрішньомолекулярних взаємодій в ізоакцепторних тРНК^Ser, що свідчить про значну подібність їхніх просторових структур.

Показано загальну відповідність просторової структури тРНК^Ser(GGA) у розчині та у кристалі комплексу тРНК^Ser(GGA) - серил-тРНК синтетаза.

Визначено рівень модифікації специфічними хімічними реагентами залишків фосфорної кислоти і азотистих основ у тРНК^Leu із T.thermophilus та проведено порівняння з відповідними узагальненими даними, одержаними для тРНК^Ser T.thermophilus, що дозволило встановити відмінності в реакційній здатності фосфатів нуклеотидів, розташованих в основі варіабельного стебла в тРНК^Ser і тРНК^Leu, а також виявити відмінності в реакційній здатності основ нуклеотидів - учасників корових триплетних взаємодій.

Методом хімічних модифікацій виявлено залишки фосфорної кислоти тРНК^Ser, реакційна здатність яких знижена у присутності серил-тРНК синтетази із T.thermophilus, і встановлено, що основною ділянкою взаємодії з ферментом є варіабельне стебло. Показано відповідність ділянок контакту тРНК^Ser із серил-тРНК синтетазою в розчині та у кристалі.

Визначено залишки фосфорної кислоти тРНК^Leu, реакційна здатність яких зменшується при утворенні комплексу з лейцил-тРНК синтетазою із T.thermophilus. Показано, що фермент взаємодіє з тРНК^Leu з боку D-петлі та утворює контакти з фосфатами нуклеотидів-учасників корових триплетних взаємодій, що дозволило висунути припущення про важливу роль знайдених відмінностей в побудові корових частин тРНК^Ser і тРНК^Leu із T.thermophilus для впізнавання лейцил-тРНК синтетазою.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

Петрушенко З.М., Коваленко О.П., Мальченко Н.Н., Крикливый И.А., Яремчук А.Д., Тукало М.А. Первичная структура тРНК^Ser из Thermus thermophilus //Биополимеры и клетка.- 1997.- Т. 13, № 3.- С.202-208.

Особистий внесок дисертанта - визначення нуклеотидних послідовностей тРНК^Ser(GCU) і тРНК^Ser(GGA) із T.thermophilus методом швидкого гель-секвенування.

Коваленко О.П., Петрушенко З.М., Мальченко Н.Н., Крикливый И.А., Яремчук А.Д., Тукало М.А. Изучение участков взаимодействия тРНК₂^Ser из Thermus thermophilus с серил-тРНК синтетазой методом химической модификации // Биополимеры и клетка. - 1997. - Т. 13, № 4. - С. 298 - 302.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних груп тРНК^Ser(GGA) в присутності серил-тРНК синтетази із T.thermophilus.

Коваленко О.П., Петрушенко З.М., Крикливый И.А., Яремчук А.Д., Тукало М.А. Сравнительное изучение реакционной способности остатков фосфорной кислоты, входящих в состав тРНК^Ser и тРНК^Leu из Thermus thermophilus // Биоорг. химия. - 1999. - Т. 25, № 10. - С.768-773.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних груп в тРНК^Ser(GCU) і тРНК^Leu(CAG) із T.thermophilus.

Коваленко О.П., Крикливий І.А., Тукало М.А. Вивчення елементів просторової структури тРНК^Ser Thermus thermophilus у розчині // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т. 16, № 2. - С. 115-123.

Особстий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних груп і азотистих основ, що входять до складу тРНК^Ser(GCU).

Коваленко О. П., Крикливий І. А., Тукало М.А. Участь азотистих основ у формуванні просторової структури тРНК^Leu із Thermus thermophilus // Біополімери і клітина. - 2003. - Т. 19, № 2. - С. 151-156.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності азотистих основ, що входять до складу тРНК^Leu(CAG) із T.thermophilus.

Tukalo M., Yaremchuk A., Krikliviy I., Egorova S., Gudzera O., Petrushenko Z., Mal'chenko N., Kovalenko O., Cusack S. The structural basis for the specific recognition of Thermus thermophilus aminoacyl-tRNA synthetases for their tRNA // Meeting of International Research Scholars from the Baltics, Central Europe, and Former Soviet Union . - Prague (Czech Republic). - 1996. - P. 32.

Особистий внесок дисертанта - визначення нуклеотидної послідовності двох ізоакцепторних тРНК^Ser із T.thermophilus методом швидкого гель-секвенування; визначення ділянок контакту тРНК^Ser з серил-тРНК синтетазою із T.thermophilus.

Tukalo M., Kovalenko O., Yaremchuk А., Egorova S., Krikliviy І., Cusack S.. Comparative studies on the structural basis for the specific recognition of Thermus thermophilus tRNA^Leu and tRNA^Ser by cognate aminoacyl-tRNA synthetases // Meeting of International Research Scholars from Belarus, Czech Republic, Estonia, Hungary, Latvia, Lithuania, Polland, Russia, Slovak Republic, and Ukraine. - Moscow (Russia). - 1999. - P. 45.

Особистий внесок дисертанта - визначення нуклеотидної послідовності тРНК^Leu із T.thermophilus; визначення реакційної здатності фосфатних залишків в тРНК^Leu і тРНК^Ser із T.thermophilus; визначення ділянок контакту тРНК^Leu і тРНК^Ser з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами.

Kovalenko O., Krikliviy I., Yaremchuk A., Tukalo M. Comparative studies of the tertiary structure of T.thermophilus tRNA^Ser and tRNA^Leu and the sites of interaction with cognate aminoacyl-tRNA synthtases by chemical modification methods // 18-th tRNA Workshop "tRNA 2000". - Cambridge (United Kingdom). - P. 20.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних залишків і азотистих основ в тРНК^Leu і тРНК^Ser із T.thermophilus; визначення ділянок контакту тРНК^Leu і тРНК^Ser з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами.

Коваленко О.П., Крикливий І.А., Яремчук Г.Д. Порівняльне вивчення просторової структури і ділянок контакту тРНК^Ser і тРНК^Leu із Thermus thermophilus з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами / Матеріали VIII Українського біохімічного з'їзду // Український біохімічний журнал. - 2002. - Т. 74, № 4б (додаток 2). - Чернівці (Україна). - С. 36-37.

Особистий внесок здобувача - визначення реакційної здатності фосфатних залишків і азотистих основ в тРНК^Leu і тРНК^Ser із T.thermophilus; визначення ділянок контакту тРНК^Leu і тРНК^Ser з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами.

Анотація

Коваленко О. П. Порівняльне вивчення просторової структури тРНК^Ser і тРНК^Leu із Thermus thermophilus і ділянок їхнього контакту з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2003.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню просторової структури прокаріотичних тРНК^Ser і тРНК^Leu у розчині, а також ділянок контакту цих тРНК з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами, що важливо для вивчення структурних основ функціонування тРНК ІІ класу. В результаті проведеної роботи визначено нуклеотидні послідовності тРНК^Ser(GCU), тРНК^Ser(GGA) і тРНК^Leu(CAG) із T.thermophilus. Методами хімічної модифікації встановлено фосфатні залишки і азотисті основи, що беруть участь у формуванні просторової структури цих тРНК. Показано різну орієнтацію довгої варіабельної гілки стосовно "тіла" молекули, а також відмінності в організації корових триплетних взаємодій в тРНК^Ser і тРНК^Leu. Методом хімічної модифікації визначено ділянки контакту тРНК^Ser і тРНК^Leu з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами. Показано, що серил-тРНК синтетаза взаємодіє з тРНК^Ser боку варіабельної гілки, яка є основною ділянкою контакту. Лейцил-тРНК синтетаза взаємодіє з тРНК^Leu з боку D-гілки та утворює контакти з фосфатами нуклеотидів-учасників корових триплетних взаємодій, що дозволило висунути припущення про важливу роль знайдених відмінностей в побудові корових частин тРНК^Ser і тРНК^Leu для впізнавання лейцил-тРНК синтетазою.

Ключові слова: тРНК^Ser, тРНК^Leu, просторова структура, довга варіабельна гілка, корові триплетні взаємодії, РНК-білкові взаємодії, методи хімічної модифікації.

Коваленко О.П. Сравнительное изучение пространственной структуры тРНК^Ser и тРНК^Leu из Thermus thermophilus и участков их взаимодействия с гомологичными аминоацил-тРНК синтетазами. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2003.

В диссертационной работе проведено исследование элементов пространственной структуры прокариотических тРНК^Ser и тРНК^Leu в растворе, а также определены участки взаимодействия этих тРНК с гомологичными аминоацил-тРНК синтетазами, что имеет важное значение для определения структурных основ функционирования тРНК с длинной вариабельной петлёй.

В результате проведенной работы методом быстрого гель-секвенирования были определены нуклеотидные последовательности изоакцепторных тРНК^Ser(GCU) и тРНК^Ser(GGA), а также тРНК^Leu(CAG) из бактерии - экстремального термофила T.thermophilus. Установлено, что в изоакцепторных тРНК^Ser нуклеотидные последовательности акцепторного стебля, Т- и D- веток совпадают, а в последовательностях антикодоновой и вариабельной веток гомология незначительна. В тРНК^Ser D - петля имеет структуру б =1,в =3, а между вариабельным стеблем и нуклеотидом в положении 48 нет не спаренных нуклеотидных остатков. D - петля тРНК^Leu имеет структуру б = 2, в = 2, а между вариабельным стеблем и нуклеотидом в положении 48 есть один неспаренный нуклеотидный остаток. Указанные особенности являются характерными для прокариотических тРНК^Ser и тРНК^Leu и, как было показано ранее, играют важную роль при формировании пространственной структуры этих тРНК.

Методами химической модификации, с использованием в качестве модифицирующих агентов етилнитрозомочевины, диметилсульфата и диэтилпирокарбоната, была определена реакционная способность остатков фосфорной кислоты и азотистых оснований, входящих в состав тРНК^Ser(GCU) и тРНК^Ser(GGA). Анализ полученных результатов свидетельствует об одинаковой пространственной структуре изоакцепторных тРНК^Ser, не смотря на отличия в их нуклеотидных последовательностях. Полученная нами информация о реакционной способности фосфатных групп и азотистых оснований в тРНК^Ser T.thermophilus хорошо согласуется с данными рентгеноструктурного анализа о структуре тРНК^Ser T.thermophilus. На основании этого был сделан вывод об общем соответствии пространственной структуры тРНК^Ser в растворе и в кристалле.

Реакционную способность фосфатов и азотистых оснований в тРНК^Leu T.thermophilus определяли теми же методами и в тех же условиях, что и в тРНК^Ser. Впервые показано, что в растворе тРНК^Leu имеет каноническую L- форму. Длинная вариабельная ветвь экспонирована в раствор. Укладка Т - петли каноническая. В коре молекулы можно предположить наличие триплетных взаимодействий : (8-14)-21, (15 - 48) - 20а и 9 - (13 - 22). Два последних, по-видимому, являются характерной особенностью тРНК, имеющих длинную вариабельную ветвь.

Сравнение реакционной способности фосфатных груп в тРНК^Ser и тРНК^Leu выявило, что наиболее существенные отличия характерны для фосфатов нуклеотидов, расположенных на стыках антикодонового и вариабельного (Р45), а также вариабельного и Т - стеблей (Р47q, Р49), что свидетельствует о разных способах взаимодействия длинной вариабельной ветви с "телом" молекулы в этих тРНК. Наиболее вероятное следствие этих отличий - разная ориентация вариабельных ветвей в тРНК^Ser и тРНК^Leu.

При сравнении уровней модификации азотистых оснований было обнаружено, что основания нуклеотидов 15 и 21, входящие в состав триплетов (15-48)-20а и (8-14)-21, имеют разную реакционную способность в тРНК^Ser и тРНК^Leu T.thermophilus. Это указывает на отличия в пространственной структуре коровых частей изучаемых тРНК.

Методом химической модификации етилнитрозомочевиной проведен сравнительный анализ участков взаимодействия тРНК^Ser и тРНК^Leu с гомологичными аминоацил-тРНК синтетазами. Показано, что в обеих изоакцепторных тРНК^Ser участки контакта с гомологичным ферментом идентичны и локализованы преимущественно в вариабельном стебле, а также с 3' - стороны акцепторного стебля, Т - стебле и Т - петле. Расположение участков взаимодействия указывает на то, что серил-тРНК синтетаза подходит к тРНК^Ser со стороны вариабельной ветви. Полученные результаты хорошо совпадают с данными рентгеноструктурного анализа комплекса тРНК^Ser - серил-тРНК синтетаза из T.thermophilus. Найденные нами отличия в ориентации вариабельных ветвей в тРНК^Ser и тРНК^Leu, по-видимому, имеют важное значение для предотвращения взаимодействия серил-тРНК синтетазы с тРНК^Leu и ошибочного аминоацилирования последней серином.

Установлено, что тРНК^Leu T.thermophilus контактирует с лейцил-тРНК синтетазой в области D - петли, D - стебля, с 3' -стороны антикодонового и 3' - стороны вариабельного стебля, т. е. фермент взаимодействует с тРНК со стороны D - ветви. Контакт в вариабельным стеблем, по-видимому, имеет лишь дополнительное значение для дискриминации тРНК^Leu от других тРНК ІІ класса. Взаимодействие лейцил-тРНК синтетазы с фосфатами нуклеотидов, образующих в пространственной структуре тРНК^Leu триплеты, позволяет предположить важную роль найденных нами отличий в структуре коровых частей тРНК^Ser и тРНК^Leu в процессах специфичного узнавания и дискриминации лейцил-тРНК синтетазой.

Клюючевые слова: тРНК^Ser, тРНК^Leu, пространственная структура, длинная вариабельная ветвь, коровые триплеты, РНК-белковые взаимодействия, методы химической модификации.

Kovalenko O.P. A comparative study on the tertiary structure of Thermus thermophilus tRNA^Ser and tRNA^Leu and the sites of their interaction with cognate aminoacyl-tRNA synthtases. - Manuscript.

Thesis for Philosophy Doctor (Ph.D.) degree in Biology, speciality 03.00.03 - Molecular Biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

Thesis is devoted to investigation of thertiary structure of procaryotic tRNA^Ser and tRNA^Leu and the interaction sites of these tRNAs with cognate aminoacyl-tRNA synthetases in solution. This is important for understanding the structural basis of class II tRNAs function. Sequiences of tRNA^Ser(GCU), tRNA^Ser(GGA), and tRNA^Leu(CAG) from T.thermophilus have been determined. The phosphates and the bases, wich paticipate in the tertiary folding of these tRNAs have been determined by the chemical modification methods. A different orientation of the long variable arm in a tRNA^Ser and tRNA^Leu has been shown and the differences in the core triplets structure have been shown too. The interaction sites of tRNA^Ser and tRNA^Leu with their cognate aminoacyl-tRNA synthetases have been determined by the chemical footprinting method. Seryl-tRNA synthetase approaches the tRNA^Ser from the variable arm side and variable arm was found as the main contact area with enzyme. On the other hand, tRNA^Leu is contacted by leucyl-tRNA synthetase along the D-arm side. Enzyme interacts with the tertiary core triplets, wich suggests the important role of the observed differences in the tRNA^Ser and tRNA^Leu tertiary core structures for recognition by leucyl-tRNA synthetase.

Key words: tRNA^Ser, tRNA^Leu, tertiary structure, long variable arm, tertiary core triplets, protein-RNA interactions, chemical probes.