Колагеназа і кератиназа стрептоміцетів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

03.00.07 - Мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Колагеназа і кератиназа стрептоміцетів

Іванко Олена Вікторівна

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач лабораторії вторинних метаболітів

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор, Костерін Сергій Олексійович, Інститут біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України, завідувач відділом біохімії м'язів

Провідна установа:

Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154).

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Важливим питанням сучасної біології, як з теоретичної, так і з практичної точки зору, є дослідження протеолітичних ферментів, які знаходять широке застосування в різних галузях промисловості і медицини. Протеази успішно застосовуються у виробництві миючих засобів, в м'ясопереробній промисловості, в сироварінні, для отримання білкових лізатів. Поряд з цим, показано, що препарати на основі протеаз з тромболітичною і протизапальною дією в декілька разів перевищують за ефективністю ті, що застосовуються для таких цілей в медицині. Таке широке застосування протеолітичних ферментів обумовлене їх високою активністю по відношенню до різних білкових субстратів. Так, за гідроліз таких важкорозчинних білків, як колаген і кератин, відповідають колагенази і кератинази, унікальна субстратна специфічність яких дозволяє використовувати дані ферменти як в науково-теоретичній роботі - для встановлення структури колагенів і кератинів, так і в практиці - в медицині, в косметології, в шкіряній промисловості, для утилізації відходів деяких виробництв.

На сьогодні відомий ряд продуцентів колагеназ і кератиназ різного походження. Мікробні джерела виділення цих ферментів, в порівнянні з протеазами тваринного і рослинного походження, мають такі переваги: більш доступні і дешеві, мають різні фізико-хімічні властивості і субстратну специфічність, що дозволяє використовувати в різних галузях і при різних умовах. В промисловому масштабі високоочищену колагеназу отримують лише з Сlostridium histolyticum, яка, на жаль, має вузьку область застосування - в біології клітин для дезинтеграції сполучної тканини. Крім того, виробництво її є небезпечним і трудомістким, оскільки пов'язано з використанням патогенного штаму (збудник газової гангрени) і з забезпеченням анаеробних умов культивування. Що стосується кератиназ, то промислових продуцентів мікробного походження високоспецифічних ферментів поки що не існує, а всі відомі препарати мають широку субстратну специфічність. В цілому, різноманіття властивостей колагеназ і кератиназ і можливості їх використання вивчені недостатньо, а в Україні, незважаючи на значні досягнення в області вивчення протеаз, потреби народного господарства в препаратах з різною специфічністю задовольняються тільки за рахунок ферментів закордонного виробництва. Тому пошук вітчизняних продуцентів колагенази і кератинази, вивчення їх фізико-хімічних властивостей і субстратної специфічності, розробка методів виділення і очищення ферментних препаратів, отриманих з різних джерел, є актуальною областю досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота включає дослідження, виконані згідно науково-дослідних робіт інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного за темами: “Вивчення залежності біологічної активності глікополімерів мікробної клітини від фізико-хімічних та структурних особливостей. Розробка нових стратегій використання глікополімерів” (1998-2002 рр., №держр. Реєстр. 0198V008078, шифр теми за планом інституту 2.30.5.2). “Підтримання і розвиток Української колекції мікроорганізмів” (2003 р., №держ. Реєстр. 0102W007446 від 11.02.2000 р.)

Мета та задачі дослідження. Метою досліджень було одержання високоефективних препаратів колагенази і кератинази, вивчення фізико-хімічних властивостей і субстратної специфічності для розробки основ їх практичного застосування.

Відповідно до поставленої мети задачами наших досліджень були:

пошук серед представників різних таксономічних груп мікроорганізмів високоефективних продуцентів колагенази і кератинази;

підвищення вихідної активності ферментів шляхом оптимізації умов культивування та відбором найбільш активних морфологічних варіантів в популяції;

вивчення впливу індукторів різної природи на синтез та активність ферментів;

розробка методів виділення і очистки ферментів;

вивчення фізико-хімічних властивостей і субстратної специфічності ферментних препаратів.

Об'єктами дослідження були позаклітинні ферменти колагеназа і кератиназа Streptomyces sp. 1349 і Streptomyces sp. 1382.

Предметом дослідження було вивчення умов біосинтезу, а також фізико-хімічних властивостей і субстратної специфічності колагенази і кератинази.

Матеріали та методи дослідження. Вирішення задач дослідження реалізовувалося комплексом засобів, який включав мікробіологічні, біохімічні, імунохімічні методи аналізу, методи ензимології та препаративної біохімії, а також статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів

1. Вперше виявлені штами-продуценти колагенази і кератинази Streptomyces sp. 1349 і Streptomyces sp. 1382, відповідно.

2. За рахунок відбору активних морфологічних варіантів і підбору оптимальних умов культивування вихідну активність Streptomyces sp. 1349 підвищено в 11 разів, а Streptomyces sp. 1382 - в 6-7 разів. Встановлено індукуючу дію соєвого борошна і хлориду амонію на біосинтез колагенази, і овечої шерсті і курячого пір'я на біосинтез кератинази штамами-продуцентами. Розроблено наукові засади отримання очищених ферментних препаратів.

3. Вперше встановлено, що Streptomyces sp. 1349 синтезує принаймні три ферменти з колагеназною активністю, два з яких є метало-, а один - сериновою протеазою. рН-оптимум дії знаходиться в нейтральній (6,0-7,5) і лужній (9,0-10,0) областях, температурні оптимуми при 37-40 і при 50-60⁰С. В даних оптимумах препарати стабільні. Молекулярні маси очищених ферментів складають 30-40 кД. Ферменти мають широку субстратну специфічність і гідролізують білки як фібрилярної (колаген, кератин, фібрин, еластин), так і глобулярної (казеїн, желатин) природи.

4. Вперше показано, що Streptomyces sp. 1382 синтезує два ферменти з кератиназною активністю. Вони є високоспецифічними сериновими протеазами з оптимумом дії в лужній області рН 8,0 і 11,0 і при температурі 50-60⁰С, їх молекулярні маси складають приблизно 16-20 кД.

5.Вперше встановлено інгібуючу дію деяких комплексних сполук германію з оксиетилідендифосфонофою кислотою і органічними кислотами (янтарною, імінодіянтарною, лимонною), деяких похідних гуанідину і інгібіторів вірусного протеолізу, які використовуються в медичній практиці (АВ-2 і 70 слава), на колагеназну і кератиназну активність препаратів, отриманих з Streptomyces sp. 1349 і Streptomyces sp. 1382.

Практичне значення одержаних результатів. Розробка ефективних методів виділення і очистки колагенази і кератинази стрептоміцетів з метою одержання гомогенних препаратів ферментів, дослідження їх фізико-хімічних властивостей і субстратної специфічності дають можливість вирішити важливі та актуальні питання інженерної ензимології та біохімії протеолітичних ферментів мікроорганізмів з унікальною специфічністю щодо важкорозчинних білкових субстратів. Проведена робота може бути основою створення технологічного процесу отримання промислових ферментів колагенази і кератинази для задоволення потреб України в цих препаратах в шкіряній промисловості, в косметології, в медицині і в науково-практичній роботі. Дослідження властивостей згаданих ферментів, їх субстратної специфічності, механізму дії є вагомим внеском в роботу по встановленню еволюційних зв'язків мікроорганізмів.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто у відділі біохімії мікроорганізмів Інститу мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під керівництвом д.б.н., с.н.с. Л.Д. Варбанець.

Комплексоутворюючі похідні гуанідину та координаційні сполуки германію отримані від д.х.н., проф. І.І. Сейфулліної, к.х.н. С.В. Зубкова, аспірантів Е.Е. Марцинко, О.А. Батракової (Одеський Національний університет ім. І.І. Мечнікова). Інгібітори вірусного протеолізу були надані д.м.н С.Л. Рибалко (Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України). Штами мікроорганізмів для скринінгу продуцентів колагенази і кератинази були люб'язно надані співробітниками відділів промислових мікроорганізмів - к.б.н., с.н.с. С.С. Нагорною, фізіології та систематики мікроміцетів - к.б.н., н.с. Т.І. Редчиць, к.б.н., н.с. В.О. Захарченко, д.б.н., проф. Н.М. Ждановою, а також відділу загальної і грунтової мікробіології - к.б.н., с.н.с. О.В. Валагуровою (Інститут мікробіології і вірусології НАН України).

Апробація результатів дисертації. Основні результати і положення дисертації доповідались на конференції експериментальних робіт молодих науковців Інституту мікробіології та вірусології НАН України (Київ, 2001), XX Чугаєвській конференції по координаційній хімії (Ростов-на-Дону, 2001), Міжнародній науково-практичній школі для молодих вчених і спеціалістів "Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу" (Ужгород, 2001) та на VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових робіт, з них 4 статті у профільних журналах та 2 тези.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 161 сторінці машинописного тексту і складається з розділів "Вступ", "Огляд літератури", "Експериментальна частина", "Матеріали та методи досліджень", "Заключення", "Висновки", "Список використаних джерел", який містить 205 посилань, в тому числі 170 іноземних авторів. Робота містить 41 таблицю і 39 рисунків.

ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Огляд літератури

Огляд літератури складається з 2 підрозділів. В першому підрозділі дана загальна характеристика протеолітичних ферментів рослинного, тваринного і мікробного походження, подано сучасну класифікацію протеаз та уявлення щодо механізму їх дії. Другий підрозділ присвячено колагенолітичним і кератинолітичним ферментам мікроорганізмів, їх фізіологічній ролі, розповсюдженню серед представників різних таксономічних груп, фізико-хімічним властивостям, а також охарактеризовані традиційні та сучасні підходи щодо виділення та очистки досліджуваних ферментів, розглянуто їх субстратну специфічність, висвітлено деякі аспекти їх практичного застосування.

Розділ 2. Матеріали та методи досліджень

Об'єктами досліджень були позаклітинні ферменти колагеназа Streptomyces sp. 1349 і кератиназа Streptomyces sp. 1382.

Культивування стрептоміцетів здійснювали періодичним способом в умовах качалок (n=220 об/хв) при температурі 26-28оС протягом 4 діб на середовищі такого складу (г/л): мальтоза - 40,0; індуктор (шерсть, міздря) - 20,0; KH2PO4 - 0,5; NaCl - 0,5; ZnSO4x7H2O - 0,02; СаСl2 - 0,01; MnCl2x4H2O - 0,01; рН 7,2-7,4 (Валагурова и др., 1988).

Казеїнолітичну (загальну протеолітичну) активність визначали за методом Ансона в модифікації Петрової (1960). Активність виражали в одиницях, які відповідали кількості мікромолей тирозину, що вивільнився з казеїну при ферментативному гідролізі в умовах досліду.

Колагеназну активність визначали за поглинанням в УФ світлі при 280 нм продуктів гідролізу колагенвмісної сировини (Бондарчук и др., 1982) і в реакції з нінгідриновим реактивом продуктів розщеплення колагену (Moore et al., 1948).

Кератиназну активність визначали за поглинанням в УФ світлі при 280 нм продуктів гідролізу шерсті або пера (Noval et al., 1959) та колориметрично (?=590) - за зростанням вільних аміногруп в реакції з нінгідрином (Moore et al., 1948).

Еластазну активність визначали по розщепленню конго-рот еластину (Колтукова и др., 1983). Фібринолітичну і желатиназну активність визначали за накопиченням вільних амінокислот після гідролізу відповідних білкових субстратів за Moore et al. (1948).

Білок визначали за методом Lowry et al. (1951), вміст нуклеїнових кислот за методом Спірина (1958), вміст нейтральних цукрів за методом Dubois et al. (1956). Вміст амінокислот та гексозамінів визначали на аналізаторі амінокислот "Hitachi KLA-5" (Японія).

Дослідження гетерогенності популяції проводили з моноспоровими суспензіями культур штамів-продуцентів, отриманими загальноприйнятим способом (Кузнецов, 1972). Моноспорову суспензію розсівали на 14 агаризованих середовищ: Чапек з глюкозою, Чапек з крохмалем, Сабуро, глюкозо-пептонне, Гаузе I, крохмало-аміачне, мінеральне середовище Красильнікова №1 (СР1), пептонно-сольове, желатина, агаризоване ферментаційне середовище, соєвий, вівсяний, картопляний і сусло-агар. Окремі колонії культивували на рідкому поживному середовищі і визначали їх колагеназну і кератиназну активності.

Для виділення та очистки колагенази і кератинази застосовували осадження (NH4)2SO4 при різних ступенях насичення (від 30 до 90%), хроматографію на нейтральних (Toyopearl HW-50, “Toyo Soda”, Японія) та заряджених (Toyopearl DEAE-650(М), “Toyo Soda”, Японія) TSK-гелях. Гомогенність ферментних препаратів визначали в системі ДСН-ПААГ за Laemmli (1970) і методом високоефективної рідинної хроматографії.

Дослідження впливу координаційних сполук германію, похідних гуанідину і деяких інгібіторів вірусного протеолізу на колагеназну і кератиназну активність проводили на комплексних препаратах ферментів, отриманих після висолювання сульфатом амонію, вносячи досліджувані речовини в реакційне середовище в концентраціях 0,1 та 0,01 % і інкубуючи протягом 90 хв.

Серологічну спорідненість між ферментними препаратами Streptomyces sp. 1349 та Clostridium histolyticum ("Merk") вивчали, застосовуючи метод подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні (1962).

Результати дослідів обробляли статистично з використанням критерію Ст'юдента.

Розділ 3. Скринінг продуцентів колагенази і кератинази

В результаті скринінгу, який проводився серед 364 штамів мікроорганізмів різних таксономічних груп (176 штамів 24 родів мікроміцетів, 43 штама 2 родів дріжжів, 40 штамів бацил і 105 штамів стрептоміцетів), встановлено, що найбільша кількість активних штамів зустрічається серед представників стрептоміцетів (10,5%) (табл.1). Відібрано 2 штами стрептоміцетів - Streptomyces sp. 1349 і Streptomyces sp. 1382, рівень синтезу якими, відповідно, колагенази і кератинази був найвищим і досягав 2 Е/мл культуральної рідини. Дослідження специфічності дії культуральних рідин відібраних штамів показало, що вони проявляють ряд протеолітичних активностей, але найвищий рівень активності спостерігався по відношенню до колагену і кератину. Показано, що комплексний ферментний препарат Streptomyces sp. 1349, отриманий шляхом осадження сульфатом амонія 90% насичення, має два оптимуми колагеназної активності при рН 6,0 і 9,0 та при температурі 37-40 і 50-60⁰С, що можна пояснити або наявністю кількох ізоформ колагенази, або кількох активних центрів на одній молекулі. Ферментний препарат, виділений зі Streptomyces sp. 1382, має рН оптимум кератиназної активності в лужній обасті при рН 11,0 і термооптимум при 50-60⁰С. Комплексні ферментні препарати відрізняються стабільністю в досліджених діапазонах рН і температури.

Таблиця 1

Скринінг продуцентів колагенази і кератинази серед представників різних таксономічних груп

Розділ 4. Дослідження гетерогенності популяції штамів-продуцентів

Широкий спектр протеаз, які синтезуються стрептоміцетами, дозволяє отримувати з цього природнього джерела велику кількість різноманітних за своїми властивостями та специфічністю дії ферментів, а також їх ізоформ. Виходячи з цього існує реальна можливість регуляції їх біосинтетичної активності фізіологічними факторами. Для збільшення біосинтетичних властивостей штамів-продуцентів існує декілька шляхів, одним з яких є відбір в популяції штаму морфологічних варіантів з різною активністю досліджуваних ферментів. Вивчення популяцій штамів-продуцентів Streptomyces sp. 1349 і Streptomyces sp. 1382 показало, що вони гетерогенні за морфологічними ознаками. При дослідженні колагеназної активності колоній Streptomyces sp. 1349, які відносяться до різних типів (рис. 1), встановлено, що варіанти I-го типу мають підвищений на 35,7% рівень активності, в той час як активність варіантів II-го і III-го типів знижена на 19,1 і 16,7% відповідно, а IV-го залишається на тому ж рівні, порівнюючи з активністю дикого типу (табл. 2). Серед представників І (основного) типу було знайдено варіанти з рівнем активності, який перевищує активність вихідної популяції на 100-131%. Вони відносилися до типу Ia і мали уповільнений ріст (на 14 добу діаметр колоній не перевищував 2-3 мм). Серед цих варіантів для подальшої роботи був відібраний один, активність якого перевищувала контрольну в 2,3 рази.

Аналіз гетерогенності популяції Streptomyces sp. 1382 також дозволив виявити чотири типи колоній. Варіанти кожного типу відрізнялися за ступенем споруляції, складчастості і наявності кратера. Колір повітряного і субстратного міцелію мало відрізнявся у I-IV типів. Колонії не утворювали розчинного пігмента. Серед варіантів різних типів не вдалося виявити штами, кератиназна активність яких перевищувала б активність вихідного варіанту (контролю).

Розділ 5. Вивчення впливу умов культивування штамів-продуцентів на синтез колагенази і кератинази

Іншим шляхом активації синтезу ферментів є оптимізація поживного середовища за джерелами вуглецевого та азотного живлення, а також підбір умов культивування. Оптимізацію здійснювали, використовуючи як базове мінеральне середовище (у г/л): KH2PO4 - 0,5; NaCl - 0,5; ZnSO4x7H2O - 0,02; СаСl2 - 0,01; MnCl2x4H2O - 0,01; рН 7,2-7,4 (Валагурова и др., 1988). Було показано, що всі досліджені джерела вуглецю і азоту (в тій чи в іншій мірі) позитивно впливали на ріст культур, але лише соєве борошно в комбінації з хлоридом амонію (рис. 2) сприяло синтезу колагенази Streptomyces sp. 1349, а нативний кератин курячого пір'я або овечої шерсті (як єдине джерело вуглецю і азоту) був оптимальним компонентом середовища для синтеза кератинази культурою Streptomyces sp. 1382 (рис. 3). Таким, чином нами був визначений склад поживного середовища (в г/л): соєве борошно- 5,0; NH4Cl - 10,0; KH2PO4 - 0,5; NaCl - 0,5; ZnSO4x7H2O - 0,02; СаСl2 - 0,01; MnCl2x4H2O - 0,01; рН 6,0-7,0, при культивуванні на якому активність колагенази у культуральній рідині Streptomyces sp. 1349 досягла рівня 6,0 Е/мл. Дослідження умов біосинтезу позаклітинної колагенази показало, що оптимальними параметрами культивування штама-продуцента є температура 20-25о С, рН 6,0-7,0, Кs=2,64 мг О2/лгод, 3% посівного матеріала, швидкість обертання качалки 220 об/хв протягом 3-4 діб.

Було показано індуцибельну природу кератинолітичного ферменту, який синтезується Streptomyces sp. 1382, а також експериментальним шляхом підібрано склад поживного середовища для синтезу фермента (в г/л): нативний кератин - 25,0; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,5; ZnSO₄x7H₂O - 0,02; СаСl₂ - 0,01; MnCl₂x4H₂O - 0,01. Встановлено, що вихідне рН культуральної рідини має суттєве значення для біосинтезу кератинази - фермент краще синтезується при вихідному рН 6,0. Для максимального синтезу кератинази сприяє температура 28⁰С, швидкість обертання качалки 220 об/хв, К_s=16,76 мг О₂/лгод і 5% інокулюму, який вноситься в культуральну рідину.

Розділ 6. Виділення та очистка колагенази streptomyces sp. 1349 і кератинази sreptomyces sp. 1382

Для вивчення фізико-хімічних властивостей колагенази і кератинази, дослідження субстратної специфічності і компонентного складу, необхідно було виділити їх у гомогенному стані. Очистку колагенази і кератинази здійснювали:

1) фракціонуванням сульфатом амонія;

Внаслідок іонобмінної хроматографії 90% висолу культуральної рідини Streptomyces sp. 1349 на TSK DEAE 650(M) гелі було одержано три фракції з колагеназною активністю. Найвищою активність була у фракції 2 і перевищувала активність фракцій 1 і 3 в 3 рази (рис. 4). Гомогенність цих фракцій була підтверджена даними високоефективної рідинної хроматографії (ВРХ) і електрофорезом в ПААГ в системі ДСН. Молекулярна маса очищених ферментних препаратів колагеназ становила близько 40 (фракція 1) і 30 кД (фракції 2 і 3). В результаті іонобмінної хроматографії 80% висолу культуральної рідини Streptomyces sp. 1382 на TSK DEAE 650(M) і подальшої гель-фільтрації на TSK HW-50 гелях, було отримано 2 фракції з кератиназною активністю, гомогенність яких підтверджено даними ВРХ і електрофорезом в ПААГ в системі ДСН (рис. 5). Молекулярна маса очищених препаратів кератиназ становила близько 15-20 кД. Наявність декількох ферментів схожої специфічності дії характерна для стрептоміцетів і є наслідком пристосування їх до умов існування. Значення активностей отриманих препаратів колагенази приблизно в 2 рази перевищують активність колагенази C. histolyticum, яку випускає фірма “Merk”, а препарати кератинази знаходяться на рівні відомих з літератури продуцентів.

Розділ 7. Характеристика препаратів колагенази streptomyces sp. 1349 і кератинази sreptomyces sp. 1382

Дослідження амінокислотного складу отриманих препаратів колагенази показало високий вміст заряджених амінокислотних залишків - 60,5, 69,7 і 63% відповідно для колагеназ 1, 2 і 3, відсоток гідрофобних амінокислот складає для фракцій 1 і 3 близько 15-18%, а для фракції 2 до 25 % від загальної кількості. Колагеназа 1 характеризувалася також наявністю незначної кількості проліну і цистеїну. Вивчення амінокислотного складу отриманих препаратів кератинази показало, що кератинази 1 і 2 характеризуються високим вмістом заряджених і полярних (до 75-80%) амінокислот, а вміст гідрофобних амінокислот складає 20-25%. Вони дещо схожі між собою за вмістом таких амінокислот як глутамінова і аспарагінова кислота, треонін, серин, гліцин, аланін, лейцин і гістидин.

Вивчення специфічності очищених препаратів колагеназ показало, що всі три фракції мали схожу субстратну специфічність і були активні по відношенню як до фібрилярних, так і глобулярних білків, таких як колаген, кератин, желатин, казеїн, фібрин, еластин. Своєю широкою специфічністю дії колагенази Streptomyces sp. 1349 відрізнялися від описаної в літературі колагенази C. histolyticum, яка активна лише по відношенню до нативної структури колагену і деяких синтетичних поліпептидних послідовностей. В лізатах колагену, обробленого ферментами Streptomyces sp. 1349, не було знайдено залишків гліцину, який є основною амінокислотою, що вивільняється під час гідролізу колагена клостридіальними колагеназами. Можна припустити, що це зумовлено різною специфічністю дії цих колагеназ щодо типу зв'язку в білковому субстраті. Це припущення було підтверджено результатами подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні. Отримані нами препарати колагеназ стрептоміцета не взаємодіяли з сироваткою, отриманою до вискоочищеної колагенази C. histolyticum фірми “Merk”.

Кератинази Streptomyces sp. 1382 характеризувалися вузькою специфічністю дії і гідролізували лише нативний кератин курячого пір'я і овечої шерсті, причому кератин пера утилізувався інтенсивніше, що можливо пов'язано зі структурою субстратів. Фракція 1, крім кератиназної активності, проявляла фібринолітичну активність, яка була в 13 разів нижчою, ніж кератиназна. Фракція 2 проявляла тільки кератиназну активність. Дослідження лізатів кератину пера фракціями кератиназ 1 і 2 показало відмінність в складі амінокислот, які вивільняються після гідролізу, що може бути обумовлено різною специфічністю дії ферментів. В лізаті кератину ферментною фракцією 1 було також знайдено 3,8% цистеїну, що може свідчити про її здатність розривати дисульфідні зв'язки в молекулі кератину. Такий механізм гідролізу дуже рідко зустрічається серед мікробних кератиназ, оскільки він передбачає розрив не тільки пептидного зв'язку, але і дисульфідного.

Отримані очищені препарати колагеназ і кератиназ відрізнялися за оптимальними умовами дії. Колагенази 1 і 3 мали два рН- (рН 6,0-7,0 і 10,0-11,0) і термооптимуми (37-40 і 50-60⁰С) дії (рис. 6, 8), що можна пояснити наявністю кількох ізоформ колагеназ, які доступними нам методами розділити поки не вдалося. Колагеназа 2, навпаки мала один оптимум дії при рН 9,0 і температурі 50-60⁰С. Кератинази мали оптимум рН при 8,0 (кератиназа 1) і 10,0-11,0 (кератиназа 2) і були максимально активні при температурі 50-60⁰С (рис. 7, 9). Колагенази і кератинази характеризувалися високою стабільністю в досліджуваних діапазонах рН і температури, що можливо обумовлено наявністю досить великої кількості гідрофобних амінокислотних залишків (15-25%).

Для вивчення активних центрів ферментів і дослідження їх каталітичної дії були використані різні специфічні хімічні реагенти, а також катіони металів і аніони. Встановлено, що активність колагеназ 1 і 3 Streptomyces sp. 1349 пригнічується хелатуючими агентами - ЕДТА, о-фенантроліном і азидом натрію, тобто вони є металозалежним ферментами. Активність же колагенази 2 і двох кератиназ пригнічується фенілметилсульфонілфторидом (ФМСФ), що може свідчити про присутність в їх активному центрі серину та належністю до протеаз серинового типу (табл. 3).

Це припущення підтверджується також зниженням активності у присутності інгібітора трипсина, виділеного з сої, і даними амінокислотного аналізу, згідно якому в складі колагенази 2 і кератиназ 1 і 2 міститься 10,1; 7,7; 7,9% залишків серину, відповідно.

В складі колагенази 1 поблизу активного центру мають знаходитися залишки цистеїну, оскільки активність інгібується тіоловими агентами - п-хлормеркурійбензоатом і дитіотреїтолом (п-ХМБ і ДТТ), що підтверджують дані амінокислотного складу (наявність 1,2% цистеїну).

Активність колагеназ 1 і 2 пригнічували всі двовалентні катіони, крім марганцю і барію, які, як і катіони амонію і срібла, мали стабілізуючу дію на колагенази, що суперечить літературним даним щодо стабілізуючої дії двовалентних катіонів металів на інші мікробні колагенази, а стабілізуючий ефект амонію, срібла і барію на колагенази відмічено нами вперше. Активність колагенази 3 пригнічували іони ртуті, а стабілізували катіони амонію і срібла.

Було показано, що активність кератинази 1 пригнічується катіоном амонію і срібла, двовалентними катіонами ртуті, міді, свинцю і заліза. Активність кератинази 2 інгібують катіони срібла, ртуті і міді. Вираженої стабілізуючої дії на кератиназну активність не виявив жоден з досліджених катіонів металів.

При вивченні впливу різних аніонів на колагеназну активність Streptomyces sp. 1349 показана інгібуюча дія нітрату, карбонату, сульфату, арсеніту, фосфату , тетраборату і оксалату. Інгібуючий вплив сульфіту на фракцію 2 колагенази підтвердив припущення про наявність SH-груп поблизу активного центра фермента. Показано інгібуючий вплив на кератинази Streptomyces sp. 1382 арсеніту і борату, який не відмічався для кератиназ інших мікроорганізмів. Таким чином, в результаті вивчення ферментних препаратів колагенази і кератинази, показано їх відмінність за амінокислотним складом і оптимальними умовами дії, молекулярною масою, субстратною специфічністю, чутливістю до групоспецифічних реагентів.

Розділ 8. Вплив хімічних речовин на колагеназну і кератиназну активність комплексних ферментних препаратів

На даний момент є актуальним питання пошуку інгібіторів протеолітичних ферментів, зокрема колагеназ і кератиназ. Ця проблема постає у зв'язку з тим, що більшість продуцентів є патогенними штамами, а їх колагенолітичні і кератинолітичні ферменти вважають одними з головних факторів вірулентності. Як інгібітори, а потім потенційні антибактеріальні і протиінфекційні препарати, використовуються різні сполуки - сік алоє, противірусні препарати, антибіотики, хімічно синтезовані речовини - оскільки передбачити дію тієї чи іншої речовини на активність фермента неможливо. В наших дослідженнях ми використовували координаційні сполуки германію і їх комплексоутворюючі компоненти, оскільки нами було показано, що вони пригнічують біосинтез колагенази, а також похідні гуанідину і деякі противірусні препарати. Показано інгібуючий вплив на КА і КерА координаційних сполук германію і їх комплексоутворюючих складових, що пояснюється, можливо, наявністю відкритих фосфонових, карбоксильних, гідрокси- і аміногруп, які здатні зв'язуватися з молекулами ферментів або з їх активними центрами. Серед гуанідинових похідних лише гуанідин солянокислий, гуанідин карбонат і аміногуанідин карбонат інгібували активність колагенази і кератинази. Активність колагенази також пригнічували 6-азацитидин і 70 слава, а кератинази - похідне адамантану - АВ-2, які характеризуються високою противірусною активністю і використовуються як терапевтичні препарати при лікуванні вірусних інфекцій, зокрема СНІДу.

Таким чином, нами вперше було показано інгібуючу дію перерахованих сполук на колагеназну і кератиназну активність Streptomyces sp. 1349 i Streptomyces sp. 1382, що може бути використано при створенні високоефективних засобів для лікування захворювань шкіри, які спричиняються колагеназами і кератиназами мікроорганізмів, а також в інших галузях народного господарства.

біосинтез ферментний колагеназа кератиназа

ВИСНОВКИ

В результаті скринінгу серед 364 культур різних таксономічних груп (24 роди мікроміцетів, 2 родів дріжджів, по 1 роду стрептоміцетів і бацил) відібрано два активні продуценти колагенази і кератинази - Streptomyces sp.1349 i Streptomyces sp. 1382, відповідно, рівень активності яких досягав 2 Е/мл культуральної рідини.

Оптимізацією умов культивування і відбором активного морфологічного варіанту підвищено вихідну активність колагенази Streptomyces sp. 1349 майже в 11 разів. Показано, що оптимальними джерелами вуглецю і азоту є соєве борошно і хлорид амонію відповідно.

Шляхом підбору оптимальних джерел вуглецю і азоту підвищено вихідну активність кератинази культури Streptomyces sp. 1382 в 6-7 разів. Показано, що фермент індуцибельний і синтезується на поживному середовищі з овечою шерстю або курячим пір'ям в концентрації 2,5% як єдиним джерелом вуглецю і азоту.

Розроблено методи виділення і очистки ферментів з культуральної рідини штамів-продуцентів, які включають фракціонування сульфатом амонія, аніонобмінну хроматографію (для колагенази) і іонобмінну хроматографію і гель-фільтрацію (для кератинази). Отримано три препарати колагеназ і два - кератиназ, гомогенність яких підтверджено даними високоефективної рідинної хроматографії і електрофореза в ПААГ в системі ДСН.

Встановлено, що очищені ферментні препарати колагеназ і кератиназ відрізняються між собою за молекулярними масами: 30-40 і 15-20 кД, відповідно, амінокислотним складом, відношенням до специфічних реагентів, оптимальними умовами дії, а також за специфічністю дії.

Вперше показано, що виділені з культуральної рідини Streptomyces sp. 1349 колагенази 1 і 3 є металопротеазами, а колагеназа 2 відноситься до протеаз серинового типу. Ферменти мають широку субстратну специфічність і активні щодо нативних фібрилярних і глобулярних білків: колагену, еластину, кератину, фібрину, желатину і казеїну. В молекулах ферментів переважають заряджені амінокислоти, а вміст гідрофобних складає 15-25%. Оптимальними умовами дії є нейтральні і лужні значення рН 6,0-7,0 і 9,0-11,0, а також температура 37-40 і 50-60⁰С.

Встановлено, що колагенази Streptomyces sp. 1349 відрізняються від комерційного препарату колагенази Clostridium histolyticum (“Merk”) як за специфічністю дії, так і за cкладом амінокислот. Показано відсутність в них загальних антигенних детермінант.

Встановлено, що очищені кератинази Streptomyces sp. 1382 є сериновими протеазами, які мають вузьку субстратну специфічність і гідролізують кератин (фракція 2), або кератин та фібрин (фракція 1). Молекули ферментів характеризуються високим вмістом заряджених амінокислотних залишків і містять до 25% гідрофобних амінокислот. Оптимуми дії кератиназ знаходяться при рН 8,0 і 11,0 та 50-60⁰С.

Вперше показано інгібуючу дію деяких комплексних сполук германію, солей гуанідину і похідних адамантану на колагеназну і кератиназну активність Streptomyces sp. 1349 і Streptomyces sp. 1382, що дозволить розробити наукові засади використання даних сполук в терапії захворювань, які викликаються мікроорганізмами, одним з головних вірулентних факторів яких є колагеназа і кератиназа.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Основні результати досліджень опубліковані в 6 наукових працях, з них 4 статті у профільних журналах та 2 тези.

1. Іванко О.В., Варбанець Л.Д., Валагурова О.В., Нагорна С.С., Редчиць Т.І., Жданова Н.М. Скринінг продуцентів колагенази і кератинази // Мікробіол. журн. - 2002. - Т. 64, №1. - С. 31-36.

2. Сейфуллина И.И., Марцинко Е.Э., Батракова О.А., Борзова Н.В., Иванко Е.В., Варбанец Л.Д. Влияние координационных соединений германия на синтез и активность ферментов // Мікробіол. журн. - 2002. - Т. 64, №4. - С. 3-11.

3. Іванко О.В., Варбанець Л.Д., Валагурова О.В. Дослідження колагеназної активності Streptomyces sp. 1349 // Мікробіол. журн. - 2002. - Т. 64, №6. - С. 21-27.

4. Іванко О.В., Варбанець Л.Д. Здатність мікроорганізмів різних таксономічних груп гідролізувати залишки колаген- і кератинвмісної сировини // Науковий вісник Ужгородського університету. - Серія "Біологія". - №10. - Ужгород, 2001. - С. 138-140.

5. Сейфуллина И.И., Марцинко Е.Э., Батракова О.Л., Борзова Н.В., Иванко Е.В., Варбанец Л.Д. Координационные соединения германия как эффекторы синтеза и активности ферментов // Материалы XX международной Чугаевской конференции по координационной химии (Ростов-на-Дону, 25-29 июня 2001 г.). - Тез. Докл.: Ростов-на-Дону, 2001. - С. 401.

6. Іванко О.В., Варбанець Л.Д. Колагеназа Streptomyces sp. 1349 // Укр. біохім. журн. Матеріали VIII Українського біохімічного з'їзду (Чернівці, 2002). - 2002. - Т. 74, №4б. - С. 158.

АНОТАЦІЯ

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2003.

Дисертація присвячена виділенню та дослідженню колагенази і кератинази стрептоміцетів. Проведено скринінг серед 364 штамів - представників різних таксономічних груп (мікроміцети, дріжджі, бацили і стрептоміцети) на здатність синтезувати колагеназу і кератиназу, в результаті чого відібрано два ефективні продуценти ферментів Streptomyces sp. 1349 і Streptomyces sp. 1382. Дослідження гетерогенності популяцій штамів-продуцентів дало можливість відібрати серед колоній дикого типу продуцента колагенази морфологічний варіант, активність якого була в 2,3 рази вище вихідної і зберігалася протягом двох років. Встановлено, що хлорид амонію і соєве борошно здатні активувати біосинтез колагенази культурою Streptomyces sp. 1349 в 5-6 разів, а овеча шерсть або куряче пір'я як єдине джерело вуглецю і азоту в середовищі підвищують вихід кератинази у Streptomyces sp. 1382 майже в 7 разів. Із культуральних рідин продуцентів виділено і очищено до гомогенного стану високоактивні препарати колагенази і кератинази. Показано, що колагенолітичну дію мають принаймні три протеази, дві з яких є металопротеазами, а одна відноситься до протеаз серинового типу. За кератиназну активність Streptomyces sp. 1382 відповідають дві протеази серинового типу. Були досліджені фізико-хімічні властивості очищених ферментів, специфічність їх дії. Встановлено, що препарати відрізняються за молекулярними масами, компонентним складом, оптимальними умовами дії, чутливістю до катіонів металів і аніонів. Колагенази проявляли широку специфічність дії щодо білкових субстратів різної природи. Навпаки, кератинази гідролізують лише нативний кератин шерсті або пір'я, а також один з ферментів проявляє фібринолітичну активність. Встановлено, що колагенази Streptomyces sp. 1349 не мають серологічної спорідненості з ферментом, виділеним з Clostridium histolyticum ("Merk"). Вперше було показано інгібуючу дію деяких координаційних сполук германію, похідних гуанідину і інгібіторів вірусного протеолізу на колагеназну і кератиназну активність Streptomyces sp. 1349 i Streptomyces sp. 1382, що може бути використано при створенні високоефективних препаратів для лікування захворювань шкіри, які спричиняються колагеназами і кератиназами мікроорганізмів, а також в інших галузях народного господарства.

Ключові слова: колагеназа, кератиназа, Streptomyces sp., очистка, фізико-хімічні властивості, субстратна специфічність.

АННОТАЦИЯ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена выделению и исследованию коллагеназы и кератиназы стрептомицетов. В результате скрининга среди 364 штаммов микроорганизмов - представителей разных таксономических групп (176 штаммов 24 родов микромицетов, 43 штамма 2-х родов дрожжей, 40 штаммов бацилл и 105 штаммов стрептомицетов) - было установлено, что исследуемые ферменты встречаются у всех групп микроорганизмов, но наибольшее количество активных штаммов обнаружено среди стрептомицетов (10,5%), из которых отобрали два перспективных продуцента коллагеназы и кератиназы - Streptomyces sp. 1349 и Streptomyces sp. 1382, соответственно - с максимальным уровнем ферментативной активности до 2Е/мл культуральной жидкости. Исследование специфичности действия культуральных жидкостей отобранных штаммов показало, что они активны в отношении ряда белковых субстратов как фибриллярной, так и глобулярной природы (коллаген, кератин, эластин, фибрин, желатин, казеин). Изучение физико-химических свойств показало, что коллагеназы Streptomyces sp. 1349 максимально активны при температуре 37-40 и 50-60⁰С, рН 6,0 и 9,0, а кератиназы Streptomyces sp. 1382 - при 50-60⁰С и рН 11,0. Из популяции дикого типа Streptomyces sp. 1349 отобран морфологический вариант, активность которого превышает исходную в 2,3 раза и сохраняется на протяжении двух лет экспериментальной работы. Исследование его трофических потребностей показало, что для максимального синтеза коллагеназы оптимальными являются соевая мука и хлорид аммония, использование которых ведет к увеличению её синтеза в культуральную жидкость почти в 5-6 раз. Исследования различных природных и синтетических субстратов позволило установить, что использование нативного кератина куриного пера или овечьей шерсти, как единственного источника углерода и азота в среде, дает повышение активности почти в 7 раз по сравнению с исходной. Очистку ферментов проводили из комплексных ферментных препаратов, полученных путем высаливания сульфатом аммония 80 и 90% насыщения. Очистку осуществляли методами ионобменной хроматографии и гель-фильтрации на TSk-гелях. В результате очистки из культуральной жидкости Streptomyces sp. 1349 получены три препарата коллагеназы, а из Streptomyces sp. 1382 - два препарата кератиназы, гомогенность которых была подтверждена данными высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофорезом в системе ДСН-ПААГ. Молекулярная масса коллагеназ составляет 30-40 кД, а кератиназ - 18-20 кД. Коллагеназы представлены двумя протеазами серинового типа и одной с металлом в активном центре, кератиназы относятся к сериновым протеазам. Ферменты отличаются по оптимальным значениям рН для проявления активности (нейтральная и щелочная область рН), компонентным составом (содержание гидрофобных и заряженных аминокислот), чувствительностью к катионам металлов и анионам, специфичностью и активностью по отношению к различным белковым субстратам (активность коллагеназ составляет 18, 35 и 54 Е/мг белка, а кератиназ - 562 и 2892 Е/белка). По специфичности действия коллагеназы относятся к протеазам широкой специфичности, в то время как кератиназы узкоспецифичны и гидролизуют нативный кератин и, в меньшей степени, фибрин. Коллагеназы Streptomyces sp. 1349 не имеют серологического сродства с металлозависимой коллагеназой из Clostridium histolyticum ("Merk"). Исследуемые колагеназы отличались по спектру аминокислот в гидролизатах коллагена. Так, ферменты стрептомицета не гидролизовали коллаген с освождением глицина - основной аминокислоты, которая образуется при гидролизе коллагена клостридиальными коллагеназами. Впервые было показано ингибирующее действие некоторых координационных соединений германия, производных гуанидина и ингибиторов вирусного протеолиза на коллагеназную и кератиназную активность Streptomyces sp. 1349 и Streptomyces sp. 1382, что может быть использовано при создании высокоэффективных препаратов для лечения заболеваний кожи, которые вызваны коллагеназами и кератиназами микроорганизмов.

Ключевые слова: коллагеназа, кератиназа, Streptomyces sp., очистка, физико-химические свойства, субстратная специфичность.

ABSTRACT

The dissertation is focused on purification and characterization of collagenase and keratinase of streptomycetes. As result of screening among 364 strains of microorganisms of different taxonomy groups (micromycetes, yeasts, bacilli and streptomycetes) it were found two producers of collagenase and keratinase - Streptomyces sp. 1349 and Streptomyces sp. 1382, respectively. The analysis of the heterogeneity of Streptomyces sp. 1349 population allowed to reveal the colony of basic type with activity that exceeds 2,3 times that of the a wild type. This level of activity is stable during some generations of culture. It has been shown that NH₄Cl and soybean meal increase the collagenolytic activity of Streptomyces sp. 1349 in 5,0-6,0 fold, and sheep's wool or chicken feathers (as the only source of N and C) increase keratinolytic activity of Streptomyces sp. 1382 in 7,0 fold. Three collagenases and two keratinases were obtained from culture liquids of strain-producers. It was found two collagenases are metalloproteases, and other collagenase and keratinases are serine proteases. Physical and chemical properties, specificity of action of purified enzymes were investigated. It has been shown that preparations of enzymes are differ in their molecular weights, composition of amino acids, optimal conditions of their action, sensitivity for cations of metals and anions. Collagenases are characterized by wide specificity to different protein substrates, while keratinases are able to hydrolyze only native keratin of wool or feathers. Also, one of keratinase has high fibrinolytic activity. It has been shown that collagenases of Streptomyces sp. 1349 have no serological affinity for enzyme for C. histolyticum ("Merk"). For the first time it has been shown that certain coordinating substances of germanium, guanidine derivatives and inhibitors of virus proteolysis inhibit collagenase and keratinase activities of Streptomyces sp. 1349 and Streptomyces sp. 1382, respectively. It could be used during creation of new effective drugs for treatment of skin disease caused by collagenases and keratinases of microorganisms.

Key words: collagenase, keratinase, Streptomyces sp., purification, physical and chemical properties, substrate specificity.

Размещено на Allbest.ru