Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна

Ребрієв Андрій Вікторович

УДК 577.15:53.082.75:544.526:542.952.6

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Розробка біосенсорів на основі композицій мономер-олігомерного типу, що здатні фотополімеризуватись

03.00.20 - біотехнологія

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор Стародуб Микола Федорович, Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, завідувач відділу біохімії сенсорних і регуляторних систем.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Дмитренко Микола Петрович, Інститут екогігієни та токсикології ім. Л. І. Медведя МОЗ України, завідувач лабораторії біохімії;

доктор хімічних наук, професор Кальченко Віталій Іванович, Інститут органічної хімії НАН України, завідувач відділу хімії фосфоранів.

Провідна установа - Інститут біології клітини НАН України, м. Львів, відділ регуляторних систем клітини.

Захист відбудеться “ 24 ” лютого 2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (01601, м. Київ - 30, вул. Леонтовича 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О. В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича 9).

Автореферат розісланий “ 24 ” січня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Потреби сучасної медицини, екології і біотехнології вимагають створення нових аналітичних систем, що мають високу специфічність і чутливість і разом з тим є дешевими, компактними та простими у використанні. Розробка і впровадження таких пристроїв дасть можливість успішно сприяти діагностиці і лікуванню захворювань, вирішувати проблеми контролю і регуляції біотехнологічних процесів, а також моніторингу навколишнього середовища. Серед таких пристроїв велику увагу приділяють біосенсорам - приладам нового покоління, що поєднують у собі біологічний селективний елемент із фізичним перетворювачем. Протягом останніх років промислове виробництво біосенсорів у світі зробило гігантський стрибок. Так, якщо в 1993 році ринок біосенсорів складав 150 млн. доларів, то в 1997 р. він досяг більш ніж 1 млрд. [Weetal, 1996, Turner, 1998].

Основна проблема при створенні біосенсорів полягає в розробці ефективних методів іммобілізації біологічного матеріалу на поверхні перетворювача. Як перспективні перетворювачі для біосенсорів можна виділити іоночутливі польові транзистори (ІЧПТ). Однак на шляху їх широкого використання виникають труднощі, пов'язані з відсутністю розроблених методів для іммобілізації біологічного матеріалу на поверхні ІЧПТ, що поряд з необхідним рівнем збереження біологічної активності дозволяли б здійснювати даний процес одночасно з виготовленням самих ІЧПТ. Застосування рідких композицій, здатних до фотополімеризації (РФПК) на основі мономер-олігомерних сполук як вихідного матеріалу іммобілізаційного матриксу дозволяє одержувати селективні мембрани біосенсорів при кімнатній температурі, без використання деструктуючих температурних і хімічних факторів, з регульованими фізико-хімічними і механічними властивостями формованого полімеру. У той же час виготовлення біологічно активних мембран зазначеним способом забезпечує високу відтворюваність і відповідає технології фотолітографії, яка широко застосовується в мікроелектронній промисловості.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилася в рамках наукової тематики відділу біохімії сенсорних і регуляторних систем Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна: "Створення наукових основ експресної доклінічної біохімічної діагностики і моніторингу довкілля з використанням селективних взаємодій біомолекул та біосенсорної технології", № держреєстрації 01974004371.

Мета та завдання дослідження. Головною метою дисертаційної роботи було створення високоефективних і простих у виготовленні електрохімічних біосенсорів з використанням як іммобілізаційного матриксу рідких композицій мономер-олігомерного типу, здатних до фотополімеризації. Для досягнення мети було поставлено наступні задачі: 1) Вивчити властивості композицій мономер-олігомерного типу, здатних до фотополімеризації, з метою використання їх як іммобілізаційної матриці біосенсорів; 2) Розробити склад РФПК, що задовольняє загальним вимогам: простота процесу іммобілізації, індиферентність складових композиції по відношенню до іммобілізованого біологічного матеріалу, однорідність одержуваної біологічної мембрани з достатньою адгезійною міцністю її до поверхні перетворювача; 3) Вивчити вплив процесу фотоіммобілізації на активність ферментів і оптимізувати даний процес; 4) Розробити на основі РФПК електрохімічні ензимосенсори для визначення глюкози і сечовини, вивчити їх основні властивості.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено новий ефективний склад РФПК і на її основі запропоновано простий і швидкий метод іммобілізації ферментів на поверхні затвора ІЧПТ. Вивчено вплив процесу фотоіммобілізації на активність ферментів та підібрано способи оптимізації цього процесу. Застосовуючи запропоновану РФПК як іммобілізаційний матрикс, розроблено ензимні біосенсори для експресного визначення сечовини та глюкози в розчинах. Продемонстрована можливість тривалого функціонування таких біосенсорів і їх роботи в реальних умовах. Зроблено висновок про можливість рекомендації розробленої РФПК для сполучення технології виготовлення біоактивної мембрани з технологією виробництва трансдюсерів, зокрема, ІЧПТ. В цьому полягає новизна та актуальність проведеної роботи.

Практичне значення одержаних результатів. На основі отриманих даних можна стверджувати, що новий спосіб іммобілізації біологічного матеріалу на поверхні перетворювача біосенсору характеризується багатьма перевагами порівняно з відомими, існуючими та використовуваними на сьогодні. Простота, дешевизна та ефективність способу іммобілізації біологічного матеріалу на поверхні перетворювача сенсора дозволяє рекомендувати його для впровадження та застосування. Розроблений спосіб дає можливість швидкого та дешевого одночасного формування селективної мембрани біосенсору з виготовленням перетворювача.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Головну ідею роботи та напрям досліджень було запропоновано науковим керівником, а її практичне втілення належить здобувачу. Робота проводилася в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України у відділі біохімії сенсорних і регуляторних систем під керівництвом д.б.н., проф. Стародуба Н. Ф. та у відділі хімії та біохімії ферментів за консультативною допомогою д.х.н., проф. Маслюка А. Ф. Автором дисертаційної роботи особисто здійснено аналіз літератури, проведено біохімічні дослідження, статистичну обробку даних, підготовлено до публікації статті за матеріалами отриманих результатів. Разом з керівником здійснювалося представлення експериментального матеріалу на наукових семінарах та конференціях. Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків, написання та подання статей до друку проведено також спільно з науковим керівником. Текст дисертаційної роботи написано здобувачем особисто.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи було представлено:

- на конференціях молодих вчених Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАНУ, 2000 та 2002 роки.

- NATO Advanced Study Institute “Disease markers in exhaled breath: basic mechanisms and clinical applications”. June 22 - july 1, 2001, Knossos royal village, Crete, Greece.

- NATO advanced research workshop “Nanostructured materials and coatings for biomedical and sensor applications”. 4-8 August 2002, Kiev, Ukraine.

- Seventh World Congress on Biosensors. 15-17 May, 2002, Kyoto, Japan.

- 53^rd Annual Mеeting of the International Society of Electrochemistry "Electrochemistry in Molecular and Microscopic Dimensions". 15-20 September 2002, Dusseldorf, Germany.

- на VIII Українському біохімічному з'їзді, 1-3 жовтня 2002, Чернівці.

- на межінститутських семінарах "Сучасні проблеми біотехнології, біосенсорики і біомедичної оптики"

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 5 статей і 6 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 117 сторінках друкованого тексту. Робота складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріали і методи, результати й обговорення), висновків, списку використаних джерел, що налічує 124 посилань. Робота проілюстрована 26 рисунками, 7 таблицями.

Матеріали та методи досліджень

У роботі використано ІЧПТ, виготовлені в Інституті біокібернетики і біомедицини ПАН, Варшава. Затвор ІЧПТ був покритий нітридом кремнію. На одному чіпі розташовано два окремо працюючих ІЧПТ, відгук яких дорівнював 45-48 мВ/рН. Зміни напруги на затворі польових транзисторів фіксували за допомогою приладу APEK AL 154, виготовленого в Інституті біокібернетики і біомедицини ПАН, Варшава. Прилад забезпечував одночасний вимір з двох ІЧПТ (одного чіпу) і за допомогою послідовного інтерфейсу RS-232 сполучався з комп'ютером.

Як джерело УФ-опромінення використовували лампи ЛУФ-80-04 з інтенсивністю світлового потоку 2,6 Вт/м2 (л = 320 - 400 нм) та ДРТ-120 з інтенсивністю світлового потоку 12,5 Вт/м2 (л = 320 - 400 нм). Інтенсивність світлового потоку вимірювали приладом ДАУ-81.

На поверхню одного затвора ІЧПТ і область, що прилягає до нього, наносили приблизно 0,25 мкл суміші РФПК та ферменту. На поверхню затвора іншого (контрольного) ІЧПТ наносили суміш композиції із сироватковим альбуміном бика. Чіп поміщали у вакуум (0,1-0,2 мм рт. ст.) на 10 хвилин для видалення з композиції розчиненого кисню. Далі композицію опромінювали УФ-світлом у необхідній для полімеризації дозі.

В роботі використовували в-глюкозооксидазу (ГОД), (EC 1.1.3.4) з Penicillium vitale (активністю 160 МО/мг, “Sigma”), пероксидазу хрону (ПХ), (EC 1.11.1.7), типу VI (активністю 275 МО/мг, “Sigma”), уреазу (EC 3.5.1.5), тип IX з бобів (активністю 200 МО/мг, “Sigma”)

Для потенціометричної реєстрації сечовини використовували хімічну реакцію гідролізу її уреазою. Утворення карбонату амонію приводило до зростання рН на поверхні затвора ІЧПТ, що обумовлювало формування відповіді, величина якої була пропорційна кількості сечовини. Перед початком аналізу записували базову лінію сенсорного сигналу при відсутності сечовини в досліджуваному розчині. Зразок обсягом 1,5 мл, що піддавався аналізу, постійно перемішували і вимір проводили в буферному розчині при 28 °C. Концентрацію сечовини змінювали в межах від 0,01 до 50 мМ шляхом додавання її концентрованого розчину у вимірювальну комірку. Після кожного виміру сенсорний чіп ретельно відмивали 1 мМ натрій-фосфатним буфером.

В разі біосенсора на глюкозу використовували реакцію окислювання глюкози киснем за участю ГОД, яке приводило до утворення глюконової кислоти, що фіксувалося ІЧПТ. За відповідь біосенсорів приймалася різниця між відгуком ІЧПТ з іммобілізованим на його затворі ферментом та контрольним.

Концентрацію сечовини та активність уреази контролювали за допомогою стандартного колориметричного методу з використанням реактиву Несслера. Активність ГОД та ПХ визначали о-фенілендіаміновим методом. фотоіммобілізація мономер ензимосенсор

РФПК, яку використовували при вимірюванні залишкової активності ферментів, мала наступний склад: N-вінілпіролідон (ВП, 98 мас.%) та фотоініціатор (ФІ) - 2-гідрокси-2-метил-1-фенілпропан-1-он (2 мас.%). В 50 мкл РФПК вводили 20 мкл розчину ферменту. Суміш ретельно перемішували та піддавали вакуумному висушуванню (0,1 - 0,2 мм рт. ст.) з метою видалення води. Концентрація ферментів у розчині складала: 1 мг уреази /10 мл води; 1 мг ГОД /10 мл води, 1 мг ПХ/50 мл води. Потім РФПК опромінювали УФ-променями. Отриману порцію фотополімеру, що містить фермент, розчиняли в 2 мл 10 мМ фосфатного буферного розчину, рН якого при визначенні активності ГОД, уреази та ПХ дорівнювала 5,5; 7,0 і 6,0 відповідно.

Результати досліджень та обговорення

1. Підбір РФПК

Було взято ГОД як один з найбільш часто використовуваних у біосенсориці і відомий своєю стійкістю фермент. Співвідношення кількості ферменту і РФПК складало 3 : 100 (мас.).

Як ефективні захисні матеріали, клеї, покриття і герметики широко використовуються поліуретани. Перераховані властивості, притаманні цьому класу полімерних матеріалів, роблять можливим їх застосування як високо адгезійного компонента в різних за функціональним призначенням композиціях, в тому числі для біосенсорики. У перших серіях досліджень композиції включали олігоуретан ОУМ-1000Т і олігокарбонатметакрилат ОКМ-2. Присутність у композиції ОКМ-2 обумовлює утворення тривимірної просторової полімерної матриці, що підвищує стійкість полімеру до динамічних навантажень. Композиції на основі перерахованих реагентів не дозволили одержати полімерну мембрану біосенсора, оскільки їх висока в'язкість і гідрофобність перешкоджали рівномірному розподілу ферменту в суміші, а пізніше висока в'язкість не давала можливості сформувати рівномірний тонкий шар РФПК на поверхні затвора ІЧПТ. Разом з тим, отримані полімери в даній серії дослідів мали достатню адгезію до поверхні перетворювача (мембрана трималася на затворі при перебуванні біосенсора в буферному розчині протягом декількох місяців). При збільшенні вмісту ОУМ в'язкість композиції збільшувалася. Відповідь на 10 мМ глюкозу отримано не було, можливо, через те, що полімер формував досить товсту мембрану, а також мав високу ступінь зшивки.

Необхідно відзначити, що часто полімеризація РФПК проводиться в анаеробних умовах, оскільки кисень є інгібітором полімеризації. Нами полімеризація РФПК здійснювалася у вакуумі.

У наступній серії дослідів основним компонентом РФПК було обрано бутилметакрилат (БМА), мономер з малою в'язкістю. Необхідного результату було досягнуто тільки при введенні до складу композиції ВП. Оптимальним варіантом РФПК для ферментного сенсора виявилася композиція, що складається з 78 мас.% ВП (основний гідрофільний матрикс), 10 мас.% ОКМ-2 (поперечнозв'язуючий компонент), 10 мас.% ОУМ-2000Т (поперечнозв'язуючий та збільшуючий адгезію полімеру компонент) та 2 мас.% ФІ. Дана композиція й отриманий на її основі полімер мали необхідне співвідношення гідрофільно-гідрофобних властивостей, однорідність при перебуванні в її складі ферменту, і до того ж утворений полімер мав достатню адгезію до поверхні перетворювача біосенсора.

Застосовуючи вказану вище РФПК та іммобілізуючи ГОД на поверхні трансдюсера, отримано біосенсор на глюкозу, який мав характеристики: область лінійної відповіді 0,1 - 10 мМ, нахил кривої 30 мВ/рС, час відповіді 10 - 15 хв.

Таким чином, отримана РФПК, що завдяки своїм властивостям забезпечує простоту виготовлення іммобілізаційного середовища та процес іммобілізації біоматеріалу, який може бути продовженням технологічних стадій фотолітографічного виробництва напівпровідникових структур. Одержаний біосенсор на основі РФПК має характеристики, необхідні для використання в лабораторній, клінічній, харчовій та біотехнологічній практиці.

2. Оптимізація умов іммобілізації ферментів у фотополімерній мембрані

Пошук нових методів іммобілізації біологічного матеріалу й оптимізація умов для вже розроблених підходів є дуже важливою задачею як для біосенсоріки, так і для біотехнології взагалі. Дотепер виконана велика кількість досліджень у цьому напрямку, але вони, як правило, спеціально не розглядають ступінь зниження активності біологічного матеріалу в процесі іммобілізації. Для оцінки стану біологічних структур користуються непрямими методами, такими як вимірювання величини відгуку сенсора, швидкості утворення різних речовин і т.д. Слід зазначити, що при іммобілізації майже завжди береться надлишок біологічного матеріалу. Разом з тим, збільшення активності ферментів при підборі оптимальних умов для цього процесу, чи її зниження при функціонуванні і збереженні биочіпів непропорційно відбивається на ефективності роботи вимірювального пристрою (інтенсивності його відгуку, тривалості роботи та ін.). До того ж, у більшості випадків біологічний матеріал іммобілізують багатошарово і при цьому його внутрішні шари функціонують з меншою продуктивністю через дифузійні обмеження.

Метою подальшої роботи було визначення абсолютного рівня залишкової активності іммобілізованих ферментів, а також основних факторів, що впливають на цей рівень, для з'ясування оптимальних умов включення ферментів у фотополімерну мембрану. Ферменти включали в РФПК на основі ВП. Одержуваний полімер був водорозчинним, завдяки чому можна вивчати активність іммобілізованих ферментів у вільному стані.

При змішуванні РФПК з розчином буфера погіршується гомогеність суміші та механічні властивості одержуваного полімеру, як правило, через присутність іонів солей. Тому необхідно було з'ясувати можливість усунення цього ефекту заміною буферних розчинів дистильованою водою при приготуванні фотополімеризаційної суміші. Насамперед, треба було встановити вплив такої заміни на збереження активності ферментів в полімері. Це дало підставу для того, щоб виключити в наступних експериментах використання буфера при введенні ферменту у РФПК. Було також встановлено, що опромінення розчину ГОД (у 10 мМ натрій-фосфатному буфері, рН 5,5 протягом часу, що відповідає тому, який за звичай задається при проведенні полімеризації, тобто 11 і 4 хв. для різних за величиною потужності УФ-джерел - ЛУФ і ДРТ) вірогідно не позначається на зміні активності досліджуваного ферменту.

Необхідно було вивчити вплив на активність ГОД ще одного компонента РФПК - ФІ. Але оскільки останній нерозчинний у воді, тому використовували 2 % розчин (мас.) його в гліцеролі. Виявилось, що при введенні водного розчину ГОД у дану композицію помітної зміни ферментної активності не спостерігається. У той же час УФ-опромінення даної суміші (джерело - ЛУФ) призводить до вірогідного (p < 0,005) зниження ферментної активності, що складає 76,7 % від початкового рівня.

Разом з тим, встановлено, що при використанні ЛУФ і ДРТ з метою фотоіммобілізації залишкова активність складає відповідно для ПХ 41,5% і 44%, а для уреази - 21% і 16,5%. Умови проведення експерименту були такими, як і при іммобілізації ГОД.

На відміну від ГОД і ПХ уреаза виявляє себе як найменш стійкий фермент. Падіння його активності обумовлено, в основному, внаслідок окислення SH-групи, що присутня в активному центрі. Даний фермент був надалі використаний для відпрацьовування оптимальних умов іммобілізації. Необхідно було з'ясувати вплив УФ-опромінення різної довжини хвилі на величину залишкової активності ензиму. З цією метою відтинали короткохвильову ділянку до л = 300 нм за допомогою фільтра (скло). При використанні скла (товщиною 3 мм) активність іммобілізованої уреази після опромінення ЛУФ практично не змінюється. За аналогічних умов при опроміненні лампою ДРТ активність ферменту вірогідно збільшувалася (p < 0,001), досягаючи приблизно тієї величини, що була зареєстрована за допомогою ЛУФ-опромінення. Цей факт, швидше за все, обумовлений тим, що короткохвильовий спектр (220 - 280 нм) лампи ДРТ, що має велику енергію, впливає на фермент. У той же час при опроміненні ЛУФ з л_макс. 300 - 400 нм, коли майже цілком відсутнє випромінювання в області 220 - 280 нм, застосування фільтра не впливає на активність ферменту. При цьому потужність УФ-опромінення лампою ДРТ в діапазоні 220 - 280 нм дорівнювала 12 Вт/м², що складає 60% від енергії діапазону 300 - 400 нм.

У наступній серії експериментів вивчали залежність залишкової активності уреази від часу впливу на композицію променів ЛУФ. Було обрано наступний часовий діапазон: 220, 330, 440, 660 і 990 сек. Встановлено, що активність ферменту найбільше зменшується після його опромінення протягом 300 - 420 сек. Як правило, кінетика процесу фототверднення полімерної маси носить S-образний характер. Щоб виміряти ступінь полімеризації проводили спектроскопічне дослідження опроміненої РФПК з різними інтервалами часу. Вимірювання робили на
ІК-спектрофотометрі SP-300S Philips. Про ступінь перетворення судили по площі піка спектра з максимумом 1640 см^-1, який відповідає подвійному вуглець-вуглецевому зв'язку ВП, що кількісно зменшується в композиції при полімеризації відносно кількісно не змінюваної карбонільної групи ВП, яка має максимальний пік при 1700 см^-1.

Відомо, що для збереження активного центру уреази під час іммобілізації використовують блокування його аналогами субстратів, що не розщеплюються, наприклад, тіосечовиною. Разом з тим, вводячи тіосечовину в суміш і аналізуючи активність ферменту зазначеним вище способом, встановити її вплив неможливо, оскільки вона постійно присутня в розчині. Щоб уникнути цього, використовували підхід, який полягає в тім, що спочатку готували РФПК, яка складається з 10 мас.% ОУМ-2000Т, 88 мас.% ВП і 2 мас.% ФІ. ОУМ-2000Т виконує у даній композиції роль зшиваючого реагенту. Розчин ферменту вводили до цієї РФПК, а після полімеризації суміші одержували міцні еластичні плівки товщиною 0,1 - 0,15 мм. Плівки відмивали від тіосечовини. В контрольних плівках тіосечовина була відсутня. Активність уреази розраховували на одиницю поверхні плівки, активність ферменту в контрольних плівках приймали за 100%.

Подальші дослідження по з'ясуванню залежності активності уреази від часу збереження РФПК і фотополімеру (при - 4 °С) показали, що активність уреази знижується на 15% (p < 0,05) при збереженні в композиції протягом двох місяців, далі плавно продовжує знижуватися, і потім, через шість місяців зменшення складає менше половини (47%) щодо активності у вихідній композиції (p < 0,005). У той же час при збереженні уреази у фотополімерному матриксі (ПВП) помітного зниження активності протягом двох місяців не спостерігалося. Лише після 6 місяців відзначається вірогідне (p < 0,01) зниження її активності, що складало приблизно 30%. Збереження ГОД протягом шести місяців у ПВП-матриксі призводить до зниження її активності приблизно на 23%, p < 0,005.

У наступній серії експериментів вивчали вплив низьких температур на залишкову активність ГОД. Необхідна температура досягалася за допомогою рідкого азоту.

Таким чином, нами запропоновано спосіб визначення абсолютної активності ферментів у процесі іммобілізації в полімерному матриксі, показана зміна активності ферментів (ГОД, ПХ, уреази) при фотоіммобілізації, вивчені динаміка зміни активності ферментів у процесі фотополімеризації при впливі УФ-опромінення та стабільність активності ферментів при збереженні, підібрані умови для збільшення активності ферментів при іммобілізації та зберіганні.

3. Ензимний сенсор для визначення сечовини

З використанням розробленої РФПК для іммобілізації уреази створено біосенсор для визначення сечовини. При її додаванні в досліджувану комірку помітні зміни (падіння напруги на затворі польового транзистора) виявляються лише через 0,5 - 3 хв. З підвищенням концентрації сечовини час відповіді сенсора зменшується. Так, наприклад, тривалість аналізу 0,1 мМ розчину сечовини складає 10 хв., а при 1 мМ концентрації субстрату - 4 хв.

Показано, що найбільший відгук спостерігається при наявності в ній 3% уреази (мас.). Існує лінійна залежність між вмістом ферменту в композиції і відгуком сенсора. З характеру цієї залежності можна було б зробити висновок, що при подальшому збільшенні вмісту ферменту в композиції відгук біосенсора міг бути більшим, а відповідно і вища його чутливість. Однак, наші спроби подальшого збільшення рівня вмісту ферменту в композиції призводили до різкого погіршення як її гомогеності, так і міцності одержуваного з неї полімеру з іммобілізованим ензимом.

Відомо, що робота потенціометричних біосенсорів залежить від буферної ємності розчину. Розроблений біосенсор мав найбільший відгук в 1 мМ натрій-фосфатному буфері). Однак, навіть в 10 мМ буфері відгук уреазного сенсора був досить істотним, якщо в розчині був присутній субстрат у концентрації не нижче, ніж 0,5 мМ. Варто звернути увагу, що концентрація сечовини в сироватці крові здорових людей складає 2,50 - 8,33 мМ, і вона зростає до 50 - 83 мМ у випадку розвитку ниркової недостатності в результаті різних захворювань. Отже ензимосенсор на основі запропонованої біоактивної мембрани може бути успішно використаний для виміру концентрації сечовини в крові без її додаткового розведення.

При підвищенні температури від 28 до 41 єС величина відгуку сенсора зростає на 15%. Аналогічні дані були отримані й іншими авторами [Солдаткін А.П., Бубряк О.А., Стародуб Н.Ф. та ін., 1993], коли вони використовували як трансдюсер ІЧПТ, а чутлива мембрана була на основі комплексу білка з ферментом, зшитих глутаровим альдегідом.

Відомо, що оптимум рН для уреази знаходиться при 7,4. Тому вивчення залежності величини відгуку біосенсора від рН проводилося в діапазоні від 5,5 до 8,5 з інтервалом 0,5 з використанням полімікс-буфер (містить по 2,5 мМ лимонної кислоти, трис-(оксиметил)-амінометану, бури і дегідрофосфату калію). В нашому випадку максимум відгуку досягається при рН, рівному 6 - 6,5. Властивості іммобілізованої уреази, напевно, відрізняються від тих, які характерні для вільного ферменту.

Для біологічних рідин характерна присутність ряду солей у різних концентраціях, тому важливо було з'ясувати залежність відгуку біосенсора від іонної сили розчину. Виявилося, що підвищення концентрації NaCl в аналізованому розчині веде до зменшення відгуку біосенсора на 1 мМ сечовину (у 10 мМ натрій-фосфатному буфері, рН 7,0). При концентрації NaCl 300 мМ падіння відгуку складає біля 50%, а при наступному збільшенні концентрації до 500 мМ подальшого його зниження практично не спостерігається. Присутність у розчині хлориду амонію інгібувало відгук біосенсора в більшій мірі порівняно з випадком наявності в ньому хлориду натрію за умов однакових концентрацій.

Для перевірки роботи біосенсора в реальних умовах використовували сироватку крові людини, і виміри проводили як за його допомогою, так і стандартного колориметричного методу з використанням реактиву Несслера. Зразок сироватки попередньо десятикратно розводили 10 мМ натрій-фосфатним буфером (рН 7,3). Виявлено досить високий рівень збігу результатів аналізу обома використаними методами. Але для поодиноких вимірів розходження в результатах аналізів цими методами коливалися в межах 15-20%.

При розробці біосенсорів завжди особливий інтерес викликає питання про можливий час його функціонування. В нашому випадку інтенсивність відгуку розробленого уреазного біосенсора плавно знижувалася протягом 40 днів. Причому за цей час зниження інтенсивності відгуку склало 20%. Це свідчить про можливість значного продовження часу функціонування сенсора.

У складі запропонованої композиції фермент знаходиться, мабуть, у стабілізованому стані. На користь висловленого припущення свідчать дані по вивченню відгуків біосенсору, мембрани якого були отримані зі свіжо виготовленої композиції і з композиції, приготовленої за 46 днів раніше, яка зберігалась протягом цього часу в темному місці при 2 °С. Встановлено, що розходження в інтенсивності відгуків біосенсорів, що використовують ці мембрани, відсутні. Ці дані свідчать про можливість тривалого збереження готової композиції без значного зменшення активності ферменту. Крім того, цей факт вказує на перспективність застосування композиції в умовах промислового виготовлення сенсорів з іммобілізованою уреазою. Нам уявляється, що заздалегідь приготовлена композиція, здатна до фотополімеризації, може тривалий час використовуватися в процесі фотолітографічного формування біологічно активної мембрани біосенсорів. Причому цей процес може бути технологічним продовженням виготовлення ІЧПТ, застосовуючи основні підходи інтегральної електронної технології.

Таким чином, розроблено простий і швидкий метод іммобілізації ферментів на поверхні затвора ІЧПТ. На основі запропонованої біоактивної мембрани створені ензимні біосенсори для експресного визначення сечовини та глюкози в розчинах. Продемонстровано можливості тривалого функціонування біосенсорів і їх роботи в реальних умовах. Зроблено висновок про можливість рекомендації розробленої композиції для поєднання технологій виготовлення біоактивної мембрани та виробництва трансдюсерів, зокрема, ІЧПТ.

Висновки

1. Розроблено та детально вивчено властивості композицій мономер-олігомерного типу (на основі N-вінілпіролідону, олігокарбонатметакрилату, олігоуретанметакрилату та ін.), здатних до фотополімеризації, з метою використання їх як іммобілізаційного матриксу біосенсорів.

2. Показано, що розроблена композиція має ряд властивостей, завдяки яким процес іммобілізації біологічного матеріалу (ферментів) на поверхні перетворювача біосенсора (іон-чутливих польових транзисторів) можна робити одностадійно, і даний процес може служити продовженням технологічного процесу фотолітографічного виробництва напівпровідників.

3. Показано, що ферменти довгостроково (до 6 місяців) зберігають активність при перебуванні як у складі розробленої композиції, здатної до фотополімеризації, так і в полімерній мембрані, отриманій з даної композиції.

4. Вивчено ступінь збереження активності ферментів в-глюкозооксидази, пероксидази та уреази у процесі іммобілізації в фотополімерний матрикс. Вона складає відповідно 35, 42, та 20 %.

5. Підібрано умови (низька температура, фільтрація УФ-опромінення, наявність конкурентних інгібіторів), що збільшують залишкову активність іммобілізованих ферментів

6. Розроблено біосенсори на глюкозу і сечовину, які мають такі функціональні характеристики: область лінійного відгуку 0,1 - 10 мМ і 0,05 - 20 мМ, нахил кривої 30 мВ/рС і 38 мВ/рС, час відгуку 10 - 15 хв. і 5 - 10 хв. відповідно.

7. Докладно вивчено властивості розробленого електрохімічного ензимного біосенсора на сечовину і показано, що він має характеристики, необхідні для використання в лабораторній, клінічній, харчовій і біотехнологічній практиці.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ребриев А. В., Ивашкевич С. П., Стародуб Н. Ф., Керча С. Ф., Маслюк А.Ф. Электрохимический сенсор на основе фотополимерных мембран для определения мочевины и др. // Укр. біохім. журн. - 2001. - Т. 73, №1. - С. 133-142.

2. Ребриев А. В. , Стародуб Н. Ф. Фотополимеры как иммобилизационный матрикс в биосенсорике // Укр. біохім. журн. - 2001. Т. 73, №6. - С. 5-17.

3. Ребриев А. В., Стародуб Н. Ф., Маслюк А. Ф. Оптимизация условий иммобилизации ферментов в фотополимерной мембране // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 3. - С. 82-87.

4. Ребриев А. В., Стародуб Н. Ф., Маслюк А. Ф. Жидкие фотополимеризующиеся композиции в качестве иммобилизационного матрикса биосенсоров // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, №4. - С. 91-96.

5. Starodub N. F., Rebriev A. V., Starodub V. M. Biosensors and express biochemical diagnostics of some diseases. // Proc. of the NATO ASI “Biosensors and Express Biochemical Diagnostics of Some Diseases”, Eds. N. Marczin and M. Yacoub. - IOS Press. - 2002. - P. 391-395.

6. Ребриев А. В. Ферментний сенсор на основе фотополимерних мембран для определения мочевины // Укр. біохім. журн. - 2000. - Т. 72, №6. - С. 141-142.

7. Ребриев А. В. Подбор жидких фотополимеризующихся композиций для иммобилизации ферментов // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, №4. - С. 127-128.

8. Ребрієв А. В. Оптимізація умов іммобілізації ферментів у фотополімерній мембрані // Укр. біохім. журн. - 2002. Т. 74, № 4б (додаток 2). - С. 194-195.

9. Starodub N., Rebrijev A., Maslyuk A. Photopolymerisable materils and enzymatic biosensors. // Abstract Book of NATO advanced research workshop "Nanostructured materials and coatings for biomedical and sensor applications". Kiev. - 2002. - P. 78.

10. Starodub N.F., Rebrijev A.V. Photopolymerisable membrane for electrochemical enzymatic sensors. // Abstract Book of the Seventh World Congress on Biosensors. - Kyoto (Japan). - 2002. - P. 2-3.66.

11. Starodub N. F., Rebriev A. V. Biosensors for diagnostics of some diseases. // Abstract Book of 53^rd Annual Meting of the International Society of Electrochemistry "Electrochemistry in Molecular and Microscopic Dimensions". Dusseldorf (Germany). - 2002. - P. 105.

АНОТАЦІЯ

Ребрієв А. В. Розробка біосенсорів на основі композицій мономер-олігомерного типу, що здатні фотополімеризуватись. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено розробці та дослідженню властивостей біосенсорів, що містять іммобілізаційний матрикс на основі композицій мономер-олігомерного типу, здатних до фотополімеризації.

Досліджено залишкову активність ферментів при іммобілізації їх в мембрані, виготовленій з композиції, здатної до фотополімеризації. Вивчено вплив УФ-опромінення та складових компонентів композиції на стабільність ферментів у ній та в іммобілізаційному матриксі. Охарактеризовано динаміку змін активності ферментів за іммобілізації, а також підібрано умови, що забезпечують максимальне збереження їх активності. Для створення ферментного сенсора оптимальним варіантом виявилася композиція, що включає N-вінілпіролідон, олігокарбонатметакрилат і олігоуретанакрилат.

Виготовлено на основі іммобілізованої в-глюкозооксидази та уреази біосенсори. Зроблено висновок, що запропоновані сенсори на основі іон-селективних польових транзисторів є перспективним для експресного аналізу рівня сечовини та глюкози в крові, а розроблений спосіб виготовлення мембрани з іммобілізованим ферментом може бути поєднаним з інтегральною технологією виготовлення напівпровідникових біосенсорних трансдюсерів.

Ключові слова: рідкі фотополімероздатні композиції, іон-чутливі польові транзистори, іммобілізація ферментів, біосенсор, в-глюкозооксидаза, уреаза, сечовина.

АННОТАЦИЯ

Ребриев А. В. Разработка биосенсоров на основе фотополимеризирующихся композиций мономер-олигомерного типа. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена разработке и исследованию свойств биосенсоров, содержащих иммобилизационный матрикс на основе жидких фотополимеризирующихся композиций (ФПК) мономер-олигомерного типа.

Исследована группа жидких фотополимеризующихся композиций: на основе олигоуретанакрилатов (ОУМ-1000Т и ОУМ-2000Т) и олигокарбонатметакрилата (ОКМ-2), бутилметакрилата, метакриловой кислоты, монометакрилового эфира этиленгликоля, N-винилпирролидона (ВП). Для создания ферментного сенсора оптимальным вариантом оказалась композиция, которая содержит ВП (основной гидрофильный матрикс), ОКМ-2 (поперечносшивающий компонент) и ОУМ-2000Т (поперечносшивающий и увеличивающий адгезию полимера компонент).

Изучалась остаточная активность ферментов при иммобилизации их в полимерные мембраны, изготовленные из ФПК на основе ВП. Установлено, что при иммобилизации при 20 °С остаточная активность в-глюкозооксидазы (ГОД) в мембране составляет примерно 35% ее исходного уровня, а пероксидазы хрена и уреазы бобов - около 42% и 20% соответственно. При иммобилизации ГОД при -50 °C активность ее достигает 50% от исходного уровня. Изучено влияние УФ-излучения и компонентов композиции на стабильность иммобилизованных ферментов. Показано практически полное отсутствие ингибирования активности ферментов компонентами ФПК и получаемым фотополимером. УФ-излучение ингибирует ферменты только в присутствии фотоинициатора. При содержании тиомочевины в фотополимеризующейся композиции 0,5 мас.% остаточная активность уреазы возрастает на 11 %. Изучение ИК-спектров ФПК в процессе полимеризации показало корреляцию падения активности иммобилизованного фермента со степенью полимеризации ФПК. Показано, что ферменты длительно (до 6 месяцев) сохраняют активность, находясь как в составе ФПК, так и в полимерной мембране, приготовленной из данной композиции.

На основе ион-селективных полевых транзисторов (ИСПТ) созданы энзимные биосенсоры с использованием в качестве иммобилизационного матрикса разработанную ФПК. Для иммобилизации ферментов непосредственно на поверхности затвора ИСПТ применен простой метод, который предусматривает полимеризацию разработанной композиции под действием УФ-излучения в вакууме.

Биосенсоры на основе иммобилизованой ГОД и уреазы имели такие характеристики: область линейного ответа 0,1 - 10 мМ и 0,05 - 20 мМ, наклон кривой 30 мВ/рС и 38 мВ/рС, время ответа 10 - 15 мин. и 5 - 10 мин. соответственно.

Исследовано влияние температуры, концентрации и рН буферного раствора, присутствия в среде солей на величину отклика биосенсора на мочевину. При повышении температуры от 28 до 41єС величина отклика биосенсора возрастает на 15%. Максимальный отклик биосенсора достигнут при рН, равном 6 - 6,5. При увеличении содержания хлорида натрия в растворе до 300 мМ ответ данного биосенсора плавно снижался, составляя при этой концентрации приблизительно половину от исходного. При дальнейшем увеличении концентрации хлорида натрия (до 500 мМ) не наблюдалось падения отклика. Присутствие в растворе хлорида аммония ингибировало ответ в немного большей степени, по сравнению с тем, что имело место в случае добавления хлорида натрия. Измерения концентрации мочевины в сыворотке крови человека с помощью разработанного сенсора и стандартного колориметрического метода свидетельствуют о достаточно высоком уровне совпадения результатов Интенсивность отклика разработанного энзимного сенсора плавно снижалась на протяжении 40 дней до уровня 80% от исходной. Изучение ответов биосенсоров, мембраны которых были получены из свежей композиции и из композиции, приготовленной заранее (46 дней), хранившейся при 2 °С, показало практически полное отсутствие расхождений в откликах. Сделан вывод, что предложенный биосенсор на основе ИСПТ является перспективным для експрессного анализа уровня мочевины в крови, а разработанный способ изготовления мембран с иммобилизованным ферментом может быть совмещен с интегральной технологией изготовления полупроводниковых биосенсорных трансдюсеров.

Ключевые слова: жидкие фотополимеризующиеся композиции, ион-селективные полевые транзисторы, иммобилизация ферментов, биосенсор, в-глюкозооксидаза, уреаза, мочевина.

SUMMARY

Rebriev A.V. THE Development of biosensors based on photopolimerizable compositions of monomer-oligomeric type. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.20 - Biotechnology. O. V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

Thesis was dedicated to the development and research of the properties of the biosensors contained immobilization matrix based on the photopolimerizable compositions of monomer-oligomeric type.

The residual activity of the enzymes immobilized in the matrix on the basis on 1-vinyl-2-pyrrolidinone as photopolymerizable composition is studied. It was investigated the influence of different sources of UV-radiation and different substances on the stability of the enzymes in the composition and in the immobilization matrix at storage. Dynamic of the changes of enzyme activities at the photoimmobilization was characterized, and also the requirements for providing of their maximal storage were selected.

It was shown that the optimal composition for enzyme biosensors should contain vinylpirrolidone, oligocarbonatemetacrylate and oligouretanemetacrylate. Biosensors based on the immobilized в-glucose oxidase and urease were obtained. The biosensor for detection of urea on the basis of the ISFET is promising for the express analysis of the level of urea in blood. The developed method of the preparation of membrane with entrapped enzyme can be combined with the integral technology of the production of semiconductor transducers.

Key words: photocurable oligomeric compositions, ion-selective field effect transistors, immobilization of enzymes, biosensor, в-glucose oxidase, urease, urea.

Размещено на Allbest.ru

...