Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ГЛУТАТІОНЗАЛЕЖНА АНТИОКСИДАНТНА СИСТЕМА І ТОЛЕРАНТНІСТЬ ПРОРОСТКІВ КУКУРУДЗИ, СОЇ Й ГОРОХУ ЗА ДІЇ КАДМІЮ ТА НІКЕЛЮ

СИЩИКОВ ДМИТРО ВАЛЕРІЙОВИЧ

УДК 581.2 : 632.15

03.00.12 - фізіологія рослин

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізіології рослин і біології ґрунтів Криворізького ботанічного саду НАН України

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

ГРИШКО Віталій Миколайович

Криворізький ботанічний сад НАН України,

завідувач відділу фізіології рослин і біології ґрунтів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ТКАЧУК Катерина Семенівна

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, провідний науковий співробітник

доктор біологічних наук, професор

ДОЛГОВА Лідія Григорівна

Дніпропетровський Національний університет, кафедра фізіології рослин і екології

Провідна установа: Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

НАН України

Захист відбудеться “ 15 ” січня 2004 р. о 10 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д.26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м.Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м.Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

Автореферат розісланий “ 12 ” грудня 2003р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Труханов В.А.

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

глутатіон метал проростки забруднення

Актуальність теми. Сучасне загострення екологічної ситуації є однією з найважливіших проблем, що обумовлює необхідність вивчення механізмів адаптації та резистентності рослинних організмів до важких металів, як найнебезпечніших забруднювачів (Усманов, 2001). Високий рівень їх надходження спричиняє істотні порушення обміну речовин та пригнічення ростових процесів, що приводить до зниження продуктивності рослин (Bishnoi, 1993; Moral, 1994). На сьогодні вплив кадмію на перебіг фізіолого-біохімічних процесів у рослинних організмів вже частково з'ясований. Водночас акумуляція і фізіологічна роль нікелю у рослин та їх толерантність до нього практично не вивчені (Sanita di Toppi, 1999; Baccouch, 1998).

Розкриття механізмів формування адаптаційних реакцій не можливе без вивчення антиоксидантних систем, зокрема глутатіонзалежної, яка приймає активну участь в біохімічних процесах захисту рослинної клітини при стресовому впливі різноманітних абіотичних факторів (Guo, 1995; Марченко, 1996, 1999; Das, 1997; Мильнікова, 2001). Особливу роль в ній відіграє глутатіон - попередник фітохелатинів, які здатні зв'язувати значну кількість металів (передусім кадмію), що надходять у тканини рослин (Rauser, 1995, 2000). Залишаються і надалі актуальними дослідження особливостей функціонування глутатіонзалежної антиоксидантної ферментативної системи, яка обумовлює толерантність рослин за дії важких металів, зокрема кадмію та нікелю.

В екологічній фізіології при визначенні толерантності рослин до дії різних чинників запропоновано використання інтегральних показників: індексу ростового інгібування (Leita, 1993) та толерантності (Lenka, 1993). Але необхідно встановити найінформативніші показники впливу кадмію та нікелю на початкові етапи росту. Проведення досліджень в цьому напрямку є актуальним для відбору толерантних видів до важких металів.

Вищевикладене обумовило вибір мети дисертаційної роботи, а саме вивчення функціонування антиоксидантної системи циклу глутатіону і толерантності рослин до дії кадмію та нікелю.

Зв'язок роботи з науковими темами. Робота виконана у відділі фізіології рослин і біології ґрунтів Криворізького ботанічного саду НАН України під час навчання в аспірантурі протягом 1999-2002 рр. як складова частина науково-дослідної теми “Адаптація рослин до дії техногенного забруднення навколишнього середовища підприємствами металургійного комплексу та біологічні процеси оптимізації їх мінерального живлення” (№ державної реєстрації 0100U002730) (2000-2004 рр.).

Мета і задачі досліджень. Метою досліджень було визначення особливостей функціонування антиоксидантної ферментативної системи циклу глутатіону і толерантності кукурудзи, сої й гороху за дії різних сполук кадмію та нікелю. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

встановити видоспецифічність поглинання важких металів проростками;

з'ясувати залежність накопичення відновленої форми глутатіону та зміни активності глутатіонзалежних ферментів у рослин за різного рівня забруднення важкими металами;

встановити найінформативніші ростові показники до стресової дії кадмію та нікелю;

визначити толерантність проростків до дії кадмію та нікелю.

Об'єкт дослідження - процеси акумуляції мікроелементів, функціонування глутатіонзалежної антиоксидантної системи, ріст і толерантність проростків гороху посівного, сої культурної і кукурудзи звичайної за дії солей кадмію і нікелю.

Предмет дослідження - виявлення впливу сполук кадмію і нікелю на вміст відновленої форми глутатіону у вегетативних органах, функціонування антиоксидантної глутатіонзалежної ферментативної системи, ріст рослин та визначення толерантності проростків до дії різних солей важких металів.

Методи досліджень - системний підхід у дослідженні з використанням фізіолого-біохімічних методів: спектрофотометрія, центрифугування, фотоколориметрія, біометричні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. В умовах модельного досліду виявлена видоспецифічність акумуляції кадмію, нікелю і відновленої форми глутатіону у вегетативних органах проростків гороху, сої й кукурудзи. Вперше показано, що для сої і кукурудзи підвищена акумуляція кадмію спостерігається за дії сульфату, порівняно із хлоридом. В листках проростків гороху й кукурудзи більше нікелю акумулюється на середовищі із сульфатом, порівняно із нітратом.

Встановлено, що акумуляція іонів кадмію вегетативними органами кукурудзи і сої індукує підвищення темпів накопичення відновленої форми глутатіону, у той час як у гороху запуск механізмів його синтезу відмічається переважно за високого рівня накопичення кадмію. Дія нікелю призводить до зменшення вмісту глутатіону у проростків, що свідчить про інтенсивне його використання у процесах антиоксидантного захисту.

Вперше вивчений вплив сполук цих важких металів на активність одного з ключових ферментів антиоксидантної системи рослинної клітини - глутатіонпероксидази. Встановлено переважне посилення інтенсивності її функціонування у вегетативних органах проростків за умов дії нікелю, у той час як вплив кадмію призводив до неоднозначних змін ензиматичної активності: підвищення активності глутатіонпероксидази в листках сої і коренях гороху, та її гальмування в листках гороху і кукурудзи та в коренях сої і кукурудзи.

Оцінка ступеня негативного ефекту сполук кадмію і нікелю показала, що він залежить від аніону солі, концентрації токсиканту та виду рослин. Сульфат кадмію здійснював більший токсичний ефект на проростки, ніж хлорид. Видоспецифічність токсичного впливу сульфату нікелю більшою мірою відмічена у гороху і сої, водночас нітрату нікелю - у кукурудзи. Виявлено, що підвищення концентрації кадмію у середовищі вирощування призводить до найбільшого пригнічення розвитку проростків гороху, для яких також виявлена найменша толерантність за розрахованими значеннями індексу толерантності та кореневого індексу. Для кукурудзи за цими показниками відзначена найбільша толерантність до токсичного впливу кадмію. Встановлено, що за умов максимального накопичення нікелю найвища стійкість відзначена для проростків кукурудзи, тоді як найбільше пригнічення ростових процесів гороху і сої зафіксовано за дії нітрату та сульфату нікелю відповідно.

Практичне значення отриманих результатів. Результати роботи поглиблюють існуючі уявлення щодо функціонування антиоксидантної системи циклу глутатіону за умов дії кадмію і нікелю. Модифікований метод визначення вмісту відновленої форми глутатіону з реактивом Елмана використовується в навчальному процесі при виконанні дипломних робіт у Дніпропетровському Національному університеті на кафедрі біофізики і біохімії та на кафедрі ботаніки і екології Запорізького державного університету. Результати досліджень стійкості рослин передані до Управління екології і природних ресурсів у Дніпропетровській області де використовуються для моніторингу стану навколишнього середовища.

Особистий внесок здобувача полягає в оволодінні методами досліджень, опрацюванні даних літератури, підготовці і проведенні експериментів, розробці планів досліджень, обґрунтуванні та статистичній обробці результатів, підготовці до друку наукових робіт. Результати, які викладені у дисертації, отримані здобувачем самостійно.

Апробація результатів дисертації. Отримані автором матеріали доповідались і обговорювались на наукових конференціях: “Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке” (Сыктывкар, 2001), “Plants under environmental stress” (Moscow, 2001), ХІ з'їзд Українського ботанічного товариства (Харків, 2001), “Ботанические сады: состояние и перспективы сохранения, изучения, использования биоразнообразия растительного мира” (Минск, 2002), “Еколого-біологічні дослідження на природних та антропогенно-змінених територіях” (Кривий Ріг, 2002), VIIІ з'їзд Українського біохімічного товариства (Чернівці, 2002), “Проблеми сучасної екології” (Запоріжжя, 2002), “Восстановление нарушенных природных экосистем” (Донецк, 2002), “Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты” (Сыктывкар, 2002), “Промышленная ботаника: состояние и перспективы развития” (Донецк, 2003), “Регуляция роста, развития и продуктивности растений” (Минск, 2003).

Публікації. Основний зміст роботи відображений у 18 наукових публікаціях, з них - 7 статей у фахових наукових виданнях.

Обсяг та структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 163 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, семи розділів, висновків, переліку літератури, що включає 211 найменувань, серед яких 158 праць зарубіжних авторів. Робота містить 32 таблиці та 12 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі подано огляд літератури, в якому розглядаються механізми поглинання рослинами іонів кадмію і нікелю, їх фізіологічна роль та фітотоксична дія. Узагальнено дані стосовно функцій відновленої форми глутатіону в рослинах, його участі в процесах детоксикації важких металів. На підставі аналізу літературних даних показана роль ферментів глутатіонзалежної антиоксидантної системи у функціонуванні рослинного організму в умовах дії різних стресових факторів.

ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ. Об'єктами досліджень були проростки гороху посівного Pisum sativum L. сорту Норд, сої культурної Glycine max (L.) Merr. сорту Аметист і кукурудзи звичайної Zea mays L. гібриду Дніпровський 310 в умовах дії хлориду та сульфату кадмію і нітрату та сульфату нікелю в концентраціях 10-5 і 10-6М для Cd2+та 10-4, 210-5 і 10-5М для Ni2+.

Визначення морфометричних показників росту проводили відповідно до загальноприйнятих методів (Доспехов, 1985; Большой практикум по физиологии растений, 1978). Індекс толерантності (ІТ) розраховували за Lenka (1993), індекс ростового інгібування (ІРІ) - за Leita (1993), кореневий індекс (КІ) - за Wilkinson (1978).

Вміст кадмію і нікелю у рослинному матеріалі визначали з використанням методичних вказівок по визначенню важких металів у ґрунтах сільськогосподарських угідь і продукції рослинництва (1989). Мінералізацію рослинних проб виконували методом сухого озолення за ДСТ 26657-85. Кислотну екстракцію проводили азотною кислотою (розведеною 1:1). Концентрація важких металів визначалась на атомно-адсорбційному спектрофотометрі С-115 (Україна). Показники внутрішньотканинного забруднення рослин розраховували за Ільїним (1979).

Концентрацію відновленої форми глутатіону вимірювали за модифікованим нами (Гришко, Сыщиков, 2002) методом Beutler (1963). Активність глутатіонредуктази визначали згідно Carlberg (1985) в нашій модифікації (Гришко, Сыщиков, 1999), глутатіонпероксидази - за Гуревич (1992) модифікованому нами для рослинних організмів (Гришко, Сыщиков, 1999). Вміст білка в гомогенатах рослинних тканин визначали за Greenberg (1982).

Статистичну обробку експериментальних даних виконана загальноприйнятими методами (Доспехов, 1985; Румшиский, 1971).

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ. Видоспецифічність накопичення кадмію та нікелю вегетативними органами проростків деяких сільськогосподарських рослин

Встановлено, що практично в усіх варіантах дослідів процеси акумуляції іонів кадмію та нікелю кореневою системою рослин відбувалися з більшою інтенсивністю, ніж листками (табл. 1). На початковому етапі стресового впливу найбільше кадмію акумулювалось у вегетативних органах проростків кукурудзи, а найменше - у гороху.

На 10 добу експерименту концентрація кадмію в коренях досліджених видів рослин коливалась від 46 до 61 мкг/г сухої речовини при використанні високої концентрації сполук кадмію та від 30 до 47 мкг/г сухої речовини за низького вмісту токсиканту у середовищі вирощування. У надземній частині найменша концентрація цього металу відмічена для проростків гороху, тоді як темпи його накопичення листками сої та кукурудзи знаходились практично на одному рівні.

Темпи накопичення нікелю кореневою системою і надземною частиною проростків гороху найменші, про що свідчать значення показника внутрішньотканинного забруднення 3,8 і 2,6 відповідно. Для кукурудзи встановлені найвищі значення цього показника (5,4 і 8,1 відповідно), тоді як у сої акумуляція металу надземною частиною відбувалась меншими темпами (5,4).

Таблиця 1

Вміст кадмію і нікелю у вегетативних органах 10-добових проростків гороху та кукурудзи, мкг/г сухої речовини

Варіант	Листок	Корінь
	M m	V, %	tst	M m	V, %	tst
Горох
Контроль	1,6 0,18	21,7		10,8 0,51	9,4
CdSO4 10-6M	8,2 0,49	12,1	12,37	46,5 0,09	0,4	69,02
CdSO4 10-5M	15,6 1,59	20,4	8,73	60,9 0,31	1,0	83,96
CdCl2 10-6M	6,1 0,14	4,8	19,17	37,5 1,46	7,8	17,26
CdCl2 10-5M	17,1 0,63	7,3	23,77	59,0 0,67	2,3	57,24
Контроль	22,2 0,36	3,2		66,3 6,04	18,2
NiSO4 10-5M	133,1 2,14	3,2	51,15	195,9 11,45	11,7	10,01
NiSO4 10-4M	111,6 2,76	4,9	32,16	221,1 5,66	5,1	18,72
Ni(NO3)2 10-5M	141,5 1,68	2,4	69,3	192,3 5,87	6,1	14,97
Ni(NO3)2 10-4M	118,7 0,1	0,2	260,28	237,6 5,44	4,6	21,07
Кукурудза
Контроль	3,7 0,24	12,8		13,9 0,81	11,7
CdSO4 10-6M	15,6 1,04	13,3	11,1	36,5 0,51	2,8	23,64
CdSO4 10-5M	35,1 1,07	6,1	28,56	49,7 1,46	5,9	21,39
CdCl2 10-6M	13,5 1,07	15,9	8,88	33,0 1,39	8,4	11,9
CdCl2 10-5M	35,3 0,71	4,0	42,27	45,9 0,18	0,8	38,48
Контроль	27,1 0,81	6,0		50,1 2,23	8,9
NiSO4 10-5M	87,1 5,17	11,9	11,48	209,0 2,44	2,3	48,14
NiSO4 210-5M	133,1 6,87	10,3	15,32	242,1 16,47	13,6	11,56
Ni(NO3)2 10-5M	60,0 4,26	14,2	7,6	209,7 1,29	1,2	61,91
Ni(NO3)2 210-5M	122,1 4,28	7,0	21,84	259,2 8,74	6,7	23,18

Накопичення кадмію вегетативними органами проростків має видоспецифічний характер і залежить від аніону. Отримані дані свідчать, що вирощування рослин сої на середовищі із сульфатом кадмію призводить до інтенсифікації процесів накопичення цього металу як в кореневій системі, так і в листках рослин. Так, при вирощуванні рослин на середовищі із низьким вмістом сульфату кадмію його концентрація в листках і кореневій системі становила 16,4 й 36,4 мкг/г сухої речовини на 6 добу експерименту та 27,8 і 40,3 мкг/г сухої речовини на 10 добу відповідно, тоді як при використанні хлориду кадмію - 9,7 і 24,7 та 19,3 і 29,6 мкг/г сухої речовини відповідно (рис. 1).

При підвищенні концентрації солей кадмію у середовищі вирощування спостерігалась аналогічна тенденція накопичення іонів цього металу, але темпи акумуляції збільшувались. Поряд з цим, у проростків кукурудзи ефект впливу аніону солі на накопичення металу спостерігався лише за умов дії низької концентрації сполук кадмію на початковому етапі стресового впливу.

Темпи накопичення іонів нікелю листками проростків також знаходяться в залежності від аніону: збільшуються при використанні сірчанокислої солі, порівняно із азотнокислим нікелем. Так, дія низької концентрації нітрату та сульфату нікелю призводила до накопичення в листках 6-добових проростків гороху 81,6 і 104,7, а високої 77,1 і 94,7 мкг нікелю/г сухої речовини. Необхідно зазначити, що у рослин кукурудзи аналогічна тенденція відзначена і за тривалішого часу стресового впливу, але тільки у варіантах дослідів із використанням низької концентрації сполук нікелю у середовищі вирощування. Можливо, аніони сульфату інтенсифікують процеси транспорту нікелю і кадмію крізь плазматичну мембрану та подальший їх внутрішньотканинний транспорт.

Накопичення відновленої форми глутатіону у рослин в умовах різного рівня стресової дії важких металів

Акумуляція кадмію органами проростків обумовлює посилення процесів накопичення глутатіону. Останній приймає безпосередню участь як у детоксикації гідропероксидів, що утворюються в результаті процесів перекисного окислення ліпідів, так і у хелатуванні кадмію (Hendry, 1992; Костишин, Марченко, 2001) Нами встановлено, що в кореневій системи проростків збільшення вмісту цього трипептиду відбувається з різною інтенсивністю. Так, накопичення коренями 10-добових проростків гороху 37-45 мкг кадмію/г сухої речовини призводило до підвищення вмісту антиоксиданту на 1,6-2,1 мМ (в 1,7-2 рази), тоді як за концентрації токсиканту 60 мкг/г сухої речовини акумуляція глутатіону перевищувала значення контрольних показників на 5,1-5,5 мМ (більш ніж в 3,4 рази) (табл. 2). Серед досліджених видів кукурудза має більшу антиоксидантну ємність, оскільки підвищення концентрації глутатіону як за абсолютними значеннями (на 8,8-11,9 мМ), так і за відносними (в 2,8-3,4 рази) перевищувало аналогічне збільшення у гороху і сої (рис. 2). Проведений кореляційний аналіз показав значну силу зв'язку між концентрацією антиоксиданту та вмістом важкого металу (r = +0,8 - 0,99).

Таблиця 2

Концентрація відновленої форми глутатіону у вегетативних органах 10-добових проростків гороху та сої, мМ/г сирої речовини

Варіант	Горох	Соя
	Листок	Корінь	Листок	Корінь
Контроль	5,64 0,115	2,11 0,08	8,53 0,124	4,25 0,156
CdSO4 10-6M	5,09 0,129*	4,2 0,173*	12,26 0,114*	5,58 0,051*
CdSO4 10-5M	5,85 0,31	7,2 0,084*	15,15 0,23*	10,95 0,121*
CdCl2 10-6M	4,98 0,177*	3,7 0,059*	10,84 0,057*	5,63 0,061*
CdCl2 10-5M	5,79 0,105	7,62 0,122*	12,59 0,288*	8,07 0,114*
NiSO4 10-5M	5,39 0,053	2,38 0,055*	5,06 0,143*	2,17 0,067*
NiSO4 10-4M	3,17 0,103*	2,83 0,272*	6,43 0,212*	4,53 0,09
Ni(NO3)2 10-5M	5,85 0,26	2,35 0,021*	4,86 0,054*	2,04 0,104*
Ni(NO3)2 10-4M	3,66 0,126*	2,99 0,117*	5,78 0,204*	4,64 0,07

Примітка. Тут і в табл. 3: * - різниця статистично достовірна, p<0,05

В листках гороху нами відмічена тенденція щодо стабілізації значень вмісту відновленої форми глутатіону на рівні контролю за умов дії високої концентрації сполук кадмію та зменшення його вмісту за низької (табл. 2). Спостерігається використання наявної в клітинах відновленої форми глутатіону, тоді як підвищення концентрації токсиканту у середовищі вирощування призводить до інтенсифікації процесів синтезу цього антиоксиданту. Поряд з цим, в асиміляційному апараті кукурудзи та сої відмічене зростання концентрації глутатіону при підвищенні вмісту кадмію (табл. 2, рис. 2).

Для вегетативних органів 10-добових проростків сої у варіантах дослідів з низькою концентрацією токсиканту нами зафіксована специфічність впливу аніону на рівень відновленої форми глутатіону, який підвищувався істотніше за використання сірчанокислої солі. Так, за дії сульфату кадмію вміст цього трипептиду збільшувався в 2,6 рази в листках і коренях водночас при використанні хлориду - перевищував контрольні показники лише в 1,9 рази (табл. 2). Отримані дані узгоджуються із значеннями концентрації іонів кадмію, яка зростає суттєвіше при внесенні у середовище вирощування сірчанокислої солі (рис. 1).

За дії сполук нікелю в листках проростків використовується лише внутрішньоклітинний фонд антиоксиданту, тоді як в кореневій системі можливо “запускаються” процеси його синтезу лише при дії високої концентрації металу. Так, в листках гороху під впливом низької концентрації сполук нікелю вміст глутатіону не відрізняється від контролю, тоді як за дії високої - зменшується на 35-40% (табл. 2). У кукурудзи та сої зафіксована інтенсифікація процесів антиоксидантного захисту, свідченням чого може бути зменшення вмісту глутатіону вже за дії низької концентрації сполук нікелю (табл. 2, рис. 2). Проведений нами кореляційний аналіз залежності зміни концентрації антиоксиданту від вмісту сполук нікелю показав наявність стійкої зворотної кореляційної залежності між цим показниками як для листків (r = -0,5 - 0,95), так і для кореневої системи проростків (r = -0,68 - 0,92).

В кореневій системі гороху підвищення вмісту сполук нікелю у середовищі вирощування призводить до статистично достовірного збільшення концентрації відновленої форми глутатіону на 10% і більш ніж на 40% у варіантах дослідів із низьким та високим вмістом токсиканту (табл. 2). У рослин кукурудзи і сої відбувається використання внутрішньоклітинного резерву глутатіону що підтверджується даними вмісту цього трипептиду. За дії низької та високої концентрації нікелю у кукурудзи кількість антиоксиданту статистично достовірно не відрізняється від контролю.

Отримані нами експериментальні дані не дали можливості встановити більший ефект жодного з аніонів солей нікелю на зміну значень концентрації відновленої форми глутатіону у вегетативних органах проростків рослин як на початковому етапі стресового впливу, так і за тривалішої їх дії.

Активність глутатіонредуктази і глутатіонпероксидази у проростків за дії солей кадмію та нікелю

Нами встановлено дві тенденції щодо зміни активності глутатіонзалежних ферментів у вегетативних органах проростків, які обумовлюються як вмістом токсикантів, так і відновленої форми глутатіону. Так, в коренях кукурудзи високий вміст кадмію спричиняє підвищення концентрації відновленої форми глутатіону (рис. 2), якої скоріш за все вистачає для детоксикації інтермедіатів стресового впливу. Тому активність ферментів окислення-відновлення глутатіону не перевищує значення контролю. Аналогічна тенденція зміни активності антиоксидантних ферментів зафіксована і для сої.

В кореневій системі гороху встановлено збільшення ферментативної активності у всіх варіантах дослідів (рис. 3). У 10-добових проростків за дії низької та високої концентрації солей кадмію активність глутатіонпероксидази підвищувалась в середньому на 50 і 70%, а перевищення показників контролю для глутатіонредуктази становило 24 і 40% відповідно. Отримані результати узгоджуються з меншою інтенсивністю накопичення антиоксиданту у гороху (табл. 2), що обумовлює підвищення активності глутатіонзалежних ферментів і сприяє інтенсифікації процесів реутилізації глутатіону.

В листках гороху та кукурудзи низький вміст кадмію у середовищі вирощування обумовлював підвищення активності глутатіонзалежних ферментів як на початковому етапі стресового впливу, так і з подовженням тривалості дії токсиканту (рис. 4). Так, у 6-добових проростків кукурудзи активність глутатіонредуктази і глутатіонпероксидази зростала в 1,4-1,5 разів, а у 10-добових - в 1,6 рази.

Підвищення вмісту сполук кадмію у середовищі вирощування призводило до уповільнення процесів реутилізації глутатіону, про що свідчить зменшення активності антиоксидантних ферментів. Для 6- та 10-добових проростків кукурудзи встановлено зниження активності глутатіонпероксидази в середньому на 20 і 40% відповідно. Отримані експериментальні дані підтверджуються розрахованими негативними коефіцієнтами кореляції між активністю цього ферменту та вмістом кадмію (r = -0,58 - 0,64). Таким чином можливо припустити, що глутатіону було достатньо як для утворення фітохелатинів, так і відновлення гідропероксидів.

За дії сполук нікелю в листках кукурудзи і сої відмічено посилення функціонування антиоксидантних ферментів. Так у 10-добових проростків кукурудзи активність глутатіонредуктази та глутатіонпероксидази збільшувалась на 15-25% і на 30-45% при низькому і високому вмісті токсиканту у середовищі вирощування відповідно (табл. 3). Оскільки в листках цих видів використовується лише внутрішньоклітинний фонд глутатіону (табл. 2, рис. 2), то на нашу думку вищенаведені зміни активності ферментів обумовлюються високою швидкістю процесів реутилізації антиоксиданту.

В листках проростків гороху дія високої концентрації нікелю призводить до інгібування активності обох глутатіонзалежних ферментів, як на початковому етапі стресового впливу, так і з подовженням тривалості дії токсиканту. Отримані дані підтверджуються суттєвим зменшенням вмісту глутатіону в аналогічних варіантах дослідів (табл. 2). Поряд з цим, за низького рівня накопичення нікелю тканинами встановлено інтенсифікацію функціонування ферментів окислення-відновлення глутатіону.

Аналіз отриманих експериментальних даних дозволив встановити, що в кореневій системі гороху та сої активність антиоксидантних ферментів збільшується за дії обох концентрації токсиканту. Приймаючи до уваги можливу відсутність синтезу глутатіону, логічно зробити припущення щодо обмеженості його пулу. Таким чином інтенсифікація функціонування ферментів, скоріш за все, обумовлена високою швидкістю реутилізації антиоксиданту. Це також підтверджується розрахованими коефіцієнтами кореляції між активністю ферментів і вмістом глутатіону ( = +0,73 - 0,88).

Таблиця 3

Активність глутатіонредуктази і глутатіонпероксидази у вегетативних органах 10-добових проростків гороху та кукурудзи за дії сполук нікелю, мкМ НАДН/мг білка за 5 хв

Варіант	Листок	Корінь
	ГР	ГПО	ГР	ГПО
Горох
Контроль	6,02 0,149	3,77 0,135	11,7 0,164	7,01 0,169
NiSO4 10-5M	8,35 0,156*	5,13 0,132*	14,01 0,256*	8,72 0,108*
NiSO4 10-4M	3,31 0,108*	2,64 0,076*	15,9 0,528*	10,03 0,264*
Ni(NO3)2 10-5M	8,08 0,176*	4,93 0,196*	13,85 0,273*	8,32 0,477*
Ni(NO3)2 10-4M	3,13 0,117*	2,75 0,053*	15,26 0,308*	9,72 0,335*
Кукурудза
Контроль	7,05 0,2	7,94 0,109	8,12 0,063	9,44 0,098
NiSO4 10-5M	8,36 0,279*	9,95 0,123*	7,37 0,135*	8,36 0,023*
NiSO4 210-5M	9,64 0,125*	11,7 0,356*	6,67 0,192*	7,01 0,157*
Ni(NO3)2 10-5M	8,07 0,257*	9,88 0,18*	7,49 0,25*	8,52 0,21*
Ni(NO3)2 210-5M	9,31 0,263*	11,45 0,349*	6,85 0,046*	7,32 0,083*

Для кореневої системи проростків кукурудзи спостерігається тенденція щодо зменшення активності глутатіонредуктази і глутатіонпероксидази на 10-25% (табл. 3). Низька ефективність функціонування цих ферментів в умовах високого рівня накопичення нікелю узгоджується з достатнім вмістом відновленої форми глутатіону для детоксикації інтермедиатів стресового впливу (рис. 2).

Поряд з цим, нами не встановлено ефекту аніонів солей кадмію і нікелю на зміну активності глутатіонредуктази і глутатіонпероксидази у вегетативних органах проростків.

Особливості росту і розвитку рослин за дії сполук кадмію та нікелю

Результуючими фізіолого-біохімічних реакцій рослин на дію токсичних сполук є зміни ростових процесів (Бессонова, 1991; Коршиков, 1995; Гришко, 2002), але вплив різних сполук кадмію та нікелю на останні із з'ясуванням найбільш інформативних неоцінений. Нами доведено, що найбільший токсичний ефект на ріст проростків викликали високі концентрації солей кадмію. Разом з цим необхідно відмітити, що за умов дії цього металу більшою мірою пригнічується розвиток кореневої системи проростків, ніж надземної частини не залежно від концентрації токсиканту та часу його експозиції. На початковому етапі стресового впливу високою концентрацією солей кадмію довжина головного кореня і кількість бокових коренів проростків сої зменшувались на 60%, тоді як розміри листової пластинки - на 35%. У 10-добових рослин гороху у аналогічних варіантах дослідів значення параметрів кореневої системи знижувались в середньому в 7 і 10,5 разів, а показників, що характеризують ріст та розвиток надземної частини проростків на 50-70%.

При оцінці ступеня негативного ефекту різних сполук кадмію нами встановлена видоспецифічність адаптивної реакції рослин. Так, для проростків гороху і сої більший токсичний ефект у ряді випадків викликав сульфат кадмію, тоді як дія хлориду призводила або до меншого зниження значень досліджуваних показників, або до їх статистично достовірного збільшення (рис. 5).

Поряд з цим для проростків кукурудзи у варіантах дослідів з використанням низької концентрації більшу токсичність виявив хлорид кадмію, тоді як при збільшенні концентрації іонів кадмію у середовищі вирощування - сульфат.

Встановлено, що на відміну від кадмію, дія сполук нікелю викликала більше пригнічення росту і розвитку кореневої системи, порівняно з надземною частиною, але не у всіх видів. Так, зазначений ефект спостерігався у гороху тільки у варіантах дослідів з високою концентрацією солей нікелю, а у кукурудзи - в усіх варіантах (рис. 6). В ряді випадків, дія низької концентрації сполук нікелю призводила до статистично достовірної стимуляції росту (на 14-30%) деяких органів проростків: стебла і головного кореня у гороху, епікотиля й головного кореня у сої та листків у кукурудзи. Однак, загальною тенденцією було пригнічення розвитку рослин.

Необхідно відзначити, що для представників класу дводольних (горох, соя) найбільше пригнічення ряду ростових показників виявлено нами при вирощуванні рослин на середовищі із високою концентрацією сульфату нікелю. Так, довжина і ширина листової пластинки проростків гороху за дії сірчанокислої солі зменшувались в 3,4 і 4,2 рази, тоді як із використанням нітрату нікелю - в 2,2 і 2,8 разів. На відміну від цього, вирощування проростків сої на середовищі із сульфатом призводило до більшого пригнічення розвитку гіпокотиля та епікотиля.

У рослин кукурудзи зі збільшенням часу стресового впливу нітрат нікелю порівняно із сульфатом спричиняв значно більший негативний ефект на показники, що характеризують ріст та розвиток кореневої системи, незалежно від концентрації. Так, при вирощуванні рослин на середовищі із низькою концентрацією азотнокислого нікелю зменшення їх значень знаходилось у межах 38-48%, тоді як за умов дії сульфату становило 25-36%.

Визначення видоспецифічності ступеня стійкості проростків до дії сполук кадмію та нікелю. Встановлено, що проростки гороху зазнають найбільшого пригнічення підвищеними концентраціями кадмію. Розраховані значення ІТ для гороху були найнижчими і становили в середньому 44 та 79% за високого і низького вмісту сполук кадмію у середовищі вирощування. В даних варіантах дослідів зафіксовано найбільші значення показників внутрішньотканинного забруднення (9,75 і 10,69 за високої концентрації токсиканту та 3,81 і 5,07 - за низької). Найбільша толерантність до токсичного впливу відмічена для рослин кукурудзи. Так, ІРІ становив 24 та 33% за умов використання високої концентрації токсиканту. Отримані дані узгоджуються зі значеннями показників внутрішньотканинного забруднення, концентрації антиоксидантів і активності глутатіонзалежних ферментів. Внесення в середовище вирощування солей нікелю призводило до неоднозначних змін значень розрахованих показників толерантності проростків, які залежали від аніону солі, концентрації токсиканта та виду рослин. Так, у варіантах дослідів із високим вмістом сполук нікелю найбільший ІРІ зафіксовано для сої (в середньому 56%), водночас проростки кукурудзи практично не зазнавали токсичного впливу (8-23%). Аналогічна тенденція простежується і для даних ІТ та КІ паростків, розраховані значення яких дозволяють встановити найвищий ступінь стійкості рослин кукурудзи до дії високої концентрації сполук нікелю в середньому 84% та 0,69 відповідно.

ВИСНОВКИ

1. Акумуляція іонів кадмію та нікелю кореневою системою гороху, сої і кукурудзи відбуваються з більшою інтенсивністю, ніж листками. Найменше поглинання як кадмію, так і нікелю встановлено для гороху.

2. Рівень накопичення важких металів проростками залежить від аніону. Сульфат кадмію та нікелю призводить до інтенсифікації процесів акумуляції металів порівняно із хлоридом та нітратом.

3. Акумуляція іонів кадмію вегетативними органами кукурудзи і сої індукує підвищення темпів накопичення відновленої форми глутатіону, у той час як у гороху підвищення його рівня відмічається переважно за високого рівня накопичення кадмію. Дія нікелю призводить до зменшення вмісту глутатіону у вегетативних органах проростків, що свідчить про інтенсивне його використання у процесах антиоксидантного захисту.

4. За дії кадмію та нікелю встановлено дві тенденції функціонування ферментативної системи циклу глутатіону. Підвищення активності глутатіонредуктази і глутатіонпероксидази у вегетативних органах, обумовлене посиленням процесів реутилізації глутатіону; уповільнення їх функціонування, свідчить про його достатній рівень для виконання антиоксидантних функцій.

5. За умов дії високої концентрації сполук кадмію та нікелю розвиток кореневої системи проростків пригнічується більшою мірою, ніж надземної частини. Найінформативнішими показниками стресового впливу є довжина головного кореня та кількість бокових коренів. Поряд з цим вплив низької концентрації нікелю, більшою мірою, ніж кадмію призводив до стимуляції росту листків у кукурудзи та головного кореня у гороху та сої.

6. Значення індексів ростового інгібування, толерантності та кореневого індексу свідчать, що найбільш стійкою культурою до дії кадмію та нікелю є кукурудза.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Гришко В.Н., Сыщиков Д.В. Оценка токсического эффекта различных солей Cd и Ni на биоморфометрические показатели сои // Вісник Дніпропетровського університету. Серія Біологія. Екологія. - 2001. - Вип. 9, Т. 1. - С. 101-105.

Гришко В.Н., Сыщиков Д.В. Метод определения восстановленной формы глутатиона в вегетативных органах растений // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 4б. - С. 123-124.

Гришко В.Н., Сыщиков Д.В. Толерантность кукурузы к различным солям кадмия и никеля и содержание антиоксидантов // Доповіді НАН України. - 2002. - №. 11. - С. 170-175.

Сыщиков Д.В., Гришко В.Н. Содержание глутатиона у проростков кукурузы при действии кадмия и никеля // Вісник Дніпропетровського університету. Серія Біологія. Екологія. - 2002. - Вип. 10, Т. 2. - С. 8-13.

Гришко В.Н., Сыщиков Д.В. Изучение влияния солей тяжелых металлов на ростовые показатели проростков гороха // Питання біоіндикації та екології. - Запоріжжя, 2002. - Вип. 7, № 2-3. - С. 157-164.

Гришко В.Н., Сыщиков Д.В. К методике определения содержания тиоловых групп (восстановленной формы глутатиона) в растениях // Вісник Дніпропетровського університету. Серія Біологія. Екологія. - 2002. - Вип. 10, Т. 1. - С. 190-193.

Сищиков Д.В., Гришко В.М. Глутатіонзалежна антиоксидантна система проростків гороху та кукурудзи за дії сполук нікелю // Укр. біохім. журн. - 2003. - Т. 75, № 4. - С. 131-138.

Сыщиков Д.В. Изменение концентрации восстановленной формы глутатиона у проростков гороха при действии на них ионов Cd и Ni // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 4б. - С. 140-141.

Сищиков Д.В. Визначення толерантності Glycine max (L.) Merr. до різних сполук нікелю // Матер. XI з'їзду Укр. бот. товариства (25-27 вересня 2001 р., Харків). - Харків. - 2001. - С. 359-360.

Syshchikov D.V. Content of the glutathione reduced form in maize shoots under conditions of heavy metals stress // Abst. Int. Symp. “Plant under environmental stress” (23-28 october 2001, Moscow). - Moscow. - 2001. - P. 284-285.

Сыщиков Д.В. Определение корневого индекса у проростков гороха при повышенных концентрациях кадмия и никеля // Тез. докл. міжнар. конф. “Проблеми сучасної екології” (24-26 червня 2002 р., Запоріжжя). - Запоріжжя. - 2002. - С. 32.

Сыщиков Д.В. Изменение индекса ростового ингибирования у некоторых сельськохозяйственных растений при действии соединений никеля // Матер. наук. конф. молодих вчених “Еколого-біологічні дослідження на природних та антропогенно-змінених територіях” (13-16 травня 2002 р., Кривий Ріг). - Кривий Ріг. - 2002. - С. 410-412.

Сыщиков Д.В. Изменение некоторых ростовых показателей у проростков сои под действием никеля // Тез. докл. межд. конф. “Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке” (1-6 октября 2001 г., Сыктывкар). - Сыктывкар. - 2001. - С. 337-338.

Сыщиков Д.В. Определение степени устойчивости проростков гороха и кукурузы к действию соединений кадмия // Тез. докл. межд. науч. конф., посвященной 70-летию со дня основания ЦБС (30-31 мая 2002 г., Минск). - Минск. - 2002. - С. 272-274.

Сыщиков Д.В. Определение степени устойчивости проростков сои к солям Cd и Ni по показателю корневого индекса // Тез. докл. межд. науч. конф. “Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты” (17-21 сентября 2002 г., Сыктывкар). - Сыктывкар. - 2002. - С. 224.

Сыщиков Д.В. Устойчивость некоторых сельскохозяйственных растений к действию различных соединений кадмия и никеля // Матер. I межд. конф. “Восстановление нарушенных природных экосистем” (24-27 сентября 2002г., Донецк). - Донецк. - 2002. - С. 390-393.

Сыщиков Д.В. Влияние никеля на изменение концентрации восстановленной формы глутатиона в вегетативных органах проростков гороха // Матер. IV межд. конф. “Промышленная ботаника: состояние и перспективы развития” (17-19 сентября 2003г., Донецк). - Донецк. - 2003. - С. 151-153.

Сыщиков Д.В. Использование морфометрических индексов для оценки устойчивости растений к действию кадмия // Матер. III межд. науч. конф. “Регуляция роста, развития и продуктивности растений” (2003 г., Минск). - Минск. - 2003. - С. 238-239.

Сищиков Д.В. Глутатіонзалежна антиоксидантна система і толерантність проростків кукурудзи, сої й гороху за дії кадмію та нікелю. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 - фізіологія рослин. - Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2003.

Дисертація присвячена дослідженню функціонування антиоксидантної глутатіонзалежної ферментної системи та толерантності проростків кукурудзи, сої й гороху за умов дії сульфату і хлориду кадмію, сульфату і нітрату нікелю.

Показано, що процеси акумуляції кадмію і нікелю коренями відбуваються з більшою інтенсивністю, ніж листками. Дія сірчанокислих солей кадмію і нікелю в більшості випадків призводить до посилення акумуляції металів. Доведено, що акумуляція кадмію викликає збільшення темпів накопичення відновленої форми глутатіону, а нікелю - зменшення. Вперше встановлені дві тенденції функціонування глутатіонредуктази і глутатіонпероксидази за дії кадмію та нікелю, які обумовлені його вмістом і видоспецифічністю накопичення глутатіону. Розвиток кореневої системи проростків пригнічується більшою мірою, ніж надземної. Найменша толерантність до дії кадмію характерна для проростків гороху, а найбільша - для кукурудзи. Використання нікелю індукує неоднозначні зміни показників стійкості, які залежать від аніону солі, концентрації токсиканту і виду рослин.

Ключові слова: горох, соя, кукурудза, кадмій, нікель, глутатіон, глутатіонредуктаза, глутатіонпероксидаза, толерантність.

Сыщиков Д.В. Глутатионзависимая антиоксидантная система и толерантность проростков кукурузы, сои и гороха при действии кадмия и никеля. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 - физиология растений. - Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена исследованию функционирования антиоксидантной глутатионзависимой ферментативной системы проростков гороха, сои и кукурузы в условиях действия различных концентраций сульфата и хлорида кадмия и сульфата и нитрата никеля, а также изучению степени устойчивости проростков к негативному действию токсикантов.

Показано, что процессы аккумуляции ионов кадмия и никеля корневой системой растений происходят с большей интенсивностью, чем листьями. На начальном этапе стрессового влияния различных соединений кадмия уровень его накопления вегетативными органами проростков уменьшается в ряду: кукуруза > соя > горох. По уровню аккумуляции никеля листьями проростков виды располагаются в следующем порядке: соя > кукуруза > горох. Для сои и кукурузы установлена видоспецифичная зависимость повышенной аккумуляции кадмия при действии сульфата, по сравнению с хлоридом. В листьях проростков гороха и кукурузы больше никеля аккумулируется при выращивании на среде с сульфатом, по сравнению с нитратом.

Доказано, что аккумуляция ионов кадмия вегетативными органами кукурузы и сои приводит к повышению темпов накопления восстановленной формы глутатиона. В вегетативных органах гороха “запуск” механизмов его синтеза наблюдается преимущественно при высоком уровне накопления кадмия. Повышенное содержание ионов никеля в среде выращивания приводит к снижению концентрации антиоксиданта в вегетативных органах проростков.

Повышение активности ферментов наблюдается в листьях сои и корнях гороха. Снижение их активности отмечено в листьях гороха, кукурузы и в корневой системе сои и кукурузы. Под влиянием соединений никеля выявлена преимущественная тенденция повышения активности глутатионзависимых ферментов в вегетативных органах растений. Вместе с этим, не установлен эффект аниона солей кадмия и никеля на изменение активности глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы.

При действии соединений кадмия и никеля развитие корневой системы проростков угнетается в большей мере, чем надземной части. Наиболее чувствительными показателями стрессового влияния являются длина главного корня и количество боковых корней. При оценке степени отрицательного эффекта высокой концентрации различных соединений кадмия установлено, что его сульфат осуществлял больший токсический эффект на проростки, чем хлорид. Видоспецифичность токсического влияния сульфата никеля в большей степени проявляется у гороха и сои, тогда как нитрата никеля - у кукурузы. Наряду с этим влияние низких концентраций никеля, в большей мере, чем кадмия, приводит к стимуляции роста стебля и главного корня у гороха, эпикотиля и главного корня у сои и листьев у кукурузы.

Показано, что повышение концентрации кадмия в среде выращивания приводит к наибольшему угнетению проростков гороха, для которых также выявлена наименьшая степень устойчивости по рассчитанным значениям индекса толерантности и корневого индекса. Для кукурузы по этим показателям отмечена наибольшая толерантность к токсическому действию. Использование соединений никеля приводит к неоднозначным изменениям значений рассчитанных показателей устойчивости, зависящих от аниона соли, концентрации токсиканта и вида растений.

Ключевые слова: горох, соя, кукуруза, кадмий, никель, глутатион, глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, толерантность.

Syshchikov D.V. Glutathione dependent antioxidative system and tolerance of maize, soya and pea shoots at action of cadmium and nickel. - Manuscript.

Thesis for a Ph.D. degree (biology) on speciality 03.00.12 - plant physiology. - Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Science of Ukraine, Kiev, 2003.

The dissertation is devoted to research of pea, soya and maize shoots tolerance and functioning of glutathione dependent antioxidative enzymatic system at action of cadmium sulfate and chloride, nickel sulfate and nitrate.

Is shown that the processes of cadmium and nickel accumulation by roots occur to the greater intensity, than leaves. The action of cadmium and nickel sulfate salts in most cases results in intensifying metals accumulation. Is proved that the cadmium accumulation causes increased of glutathione reduced form accumulation rates, and nickel - downstroke. For the first time fixed two tendencies of glutathioneperoxidase and glutathionereductase functioning at action of cadmium maximal concentration, caused as by his contents, and species-specifitie of glutathione accumulation. At action of nickel is revealed the primary tendency of enzymatic activity increase. The development of shoot's root system is oppressed in the greater degree, than overground. The least tolerance to cadmium action is characteristic for pea shoots, and greatest tolerance - for corn. Use of nickel results in ambiguous changes of tolerance indexes which dependent on salt anion, toxicant concentration and plant specie.

Key words: pea, soya, maize, cadmium, nickel, glutathione, glutathionereductase, glutathioneperoxidase, tolerance.

Размещено на Allbest.ru

...