Частота виділення і чутливість збудників мікобактеріозів та опортуністичних інфекцій органів дихання до відомих і новосинтезованих препаратів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім.Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

УДК 576.852.2:615.779.9

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ЧАСТОТА ВИДІЛЕННЯ І ЧУТЛИВІСТЬ ЗБУДНИКІВ МІКОБАКТЕРІОЗІВ ТА ОПОРТУНІСТИЧНИХ ІНФЕКЦІЙ ОРГАНІВ ДИХАННЯ ДО ВІДОМИХ І НОВОСИНТЕЗОВАНИХ ПРЕПАРАТІВ

03.00.07 - мікробіологія

СИБІРНИЙ АНДРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському науково-дослідному інституті епідеміології та гігієни МОЗ України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, член-кореспондент НАН України Мацелюх Богдан Павлович, завідувач відділу генетики мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Варбанець Людмила Дмитрівна, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України;

доктор медичних наук, член-кореспондент АМН України, професор Чернушенко Катерина Федорівна, завідувач лабораторії імунології Інституту фтизіатрії та пульмонології ім.Ф.Г.Яновського АМН України.

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім.Л.В.Громашевського МОЗ України

Захист відбудеться “19” листопада 2003р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології і вірусології ім Д.К.Заболотного НАН України (03143, м.Київ, вул.Заболотного, 154)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім Д.К.Заболотного НАН України

Автореферат розісланий “16” жовтня 2003р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

мікрофлора протитуберкульозний антибактеріальний флуореніліден

Актуальність проблеми.

Кінець XX і початок ХХІ століття характеризується широким діапазоном негативних екологічних впливів на організм людини, пандемією Сні дута іншими явищами, що ведуть до значних змін імунологічної реактивності населення та поширення захворювань, які викликаються умовнопатогенними мікроорганізмами.

В цих умовах зростає етіологічне значення опортуністичних інфекцій - захворювань, викликаних умовно- або слабопатогенними мікроорганізмами серед людей з пониженою імунологічною реактивністю Вони зумовлюють затяжні та хронічні запальні процеси з частими загостреннями та рецидивами, а також можливими летальними наслідками. Одними з них є бактеріози, що викликані мікобактеріями туберкульозу і атиповими мікобактеріями різних груп за класифікацією Ранйона та легеневі патології, зумовлені неспецифічною мікрофлорою органів дихання.

Сьогодні мікобактерії привертають все більшу увагу бактеріологів і клініцистів. Зростаюча роль атипових мікобактерій в патології людини певною мірою пов'язана з неоправданим застосуванням антибіотиків. У зв'язку з глобальною антибіотикорезистентністю збудників опортуністичних інфекцій значно знижується ефективність антибактеріальної терапії цих захворювань. Усі атипові мікобактерії характеризуються широким спектром медикаментозної стійкості і потенційною патогенністю для людини та тварин і в ослабленому організмі вони здатні викликати процеси, що дуже нагадують туберкульозні ураження. Оскільки серед мікобактеріозів переважають такі, що не піддаються лікуванню, виникає необхідність розробки нових терапевтичних підходів.

Проблемою є також інфекції, викликані M. bovis, M. avium та іншими атиповими мікобактеріями, які на фоні СНІДу перебігають як генералізована інфекція. В цих випадках ускладнена діагностика і лікування у зв'язку з їх множинною стійкістю до ліків. Слід зазначити, що до відкриття ВІЛ, Mycobacterium avium complex (MAC) в більшості випадків виділяли від хворих хронічними легеневими захворюваннями (емфізема) і бронхітами. З 1981 року, коли почалась реєстрація хворих СНІДом, MAC є у них одним з найбільш частих збудників опортуністичних інфекцій.

Встановлено, що респіраторні інфекції викликають Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella spp, Klebsiella pneumoniae, серед яких часто зустрічаються стійкі до антибіотиків штами.

Виходячи з цього, в сучасних умовах однією з найбільш актуальних проблем біології та медицини залишається пошук нових препаратів для підвищення ефективності лікування опортуністичних інфекцій.

До цього часу не проводились дослідження антибактеріальної дії вперше синтезованих вітчизняних препаратів групи флуоренілідену та нових комплексних антибіотиків руліду та аугментину на збудників мікобактеріозів. Не вивчався і вплив досліджуваних препаратів на біохімічні властивості та ультраструктуру мікобактерій.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота А.В. Сибірного виконана в рамках планових науково-дослідних робіт лабораторії імунодіагностики і відділу туберкульозу та неспецифічних захворювань органів дихання Львівського НДІ епідеміології та гігієни і є частиною наукових тем: “Вивчити туберкулостатичну дію вперше синтезованих препаратів групи флуорену та розробити схеми їх застосування для лікування туберкульозу”, № держреєстрації 0195U025270 та “Розробити нові методи діагностики та лікування мікобактеріозів”, № держреєстрації 0196U009405.

Мета дослідження: вивчити епідемічну ситуацію з мікобактеріозів та опортуністичних інфекцій органів дихання в західному регіоні України та дослідити дію нових препаратів на збудників цих інфекцій.

Задачі дослідження:

вивчити частоту висівання мікобактерій та неспецифічної мікрофлори від хворих;

визначити первинну стійкість та полірезистентність атипових мікобактерій до протитуберкульозних препаратів;

вивчити первинну стійкість та полірезистентність неспецифічної мікрофлори органів дихання до антибіотиків;

дослідити антибактеріальну дію новосинтезованих сполук групи флуоренілідену щодо мікобактерій та неспецифічної мікрофлори органів дихання;

вивчити чутливість мікобактерій до антибіотиків руліду та аугментіну;

дослідити вплив нових препаратів групи флуоренілідену на ферментативну активність мікобактерій;

вивчити ультраструктурні зміни мікобактерій під дією досліджуваних препаратів.

Об'єкт дослідження: музейні штами мікроорганізмів M.tuberculosis, M.bovis, M. avium, M. kansasii, M. fortuitum, M. scrofulaceum, E. coli, S. aureus, К. pneumoniaе; антибактеріальні препарати групи флуорену та комбіновані антибактеріальні препарати рулід і аугментін.

Предмет дослідження: антибактеріальна дія флуренізиду, групи його похідних, руліду та аугментину щодо різних груп мікобактерій, а також збудників опортуністичних інфекцій E. coli, S. aureus, К. pneumoniaе та вплив похідних флуорену на ферментативну активність M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. kansasii, M. fortuitum, M. scrofulaceum; частота виділення та антибіотикорезистентність мікобактерій та збудників опортуністичних інфекцій органів дихання, що виділяються від хворих на заході України.

Методи дослідження: бактеріологічні - для вивчення антибактеріальної дії досліджуваних речовин; біохімічні - для вивчення впливу досліджуваних речовин на ферментативну активність мікобактерій; електронно-мікроскопічні - для вивчення ультраструктурних змін у клітинах, статистичні - для оцінки достовірності результатів.

Наукова новизна одержаних результатів

Вперше проаналізовано висівання атипових мікобактерій та неспецифічної мікрофлори від хворих на туберкульоз легень і неспецифічні захворювання органів дихання за даними Львівського регіонального фтизіопульмонологічного центру, первинну стійкість культур цих мікроорганізмів до антибактеріальних та протитуберкульозних препаратів і динаміку виникнення полірезистентності цих збудників.

Вперше досліджено антибактеріальну дію нових вітчизняних препаратів групи флуоренілідену на збудників опортуністичних інфекцій органів дихання та дію нових комбінованих антибактеріальних препаратів руліду та аугментіну на атипові мікобактерії.

Вперше вивчено вплив нових препаратів групи флуоренілідену на ферментативну активність мікобактерій та ультраструктурні зміни в клітинах мікобактерій, що відбулися під дією досліджуваних речовин.

Практичне значення одержаних результатів

Результати проведеного аналізу частоти висівання атипових мікобактерій та неспецифічної флори, первинної стійкості та динаміки змін полірезистентності цих збудників дають можливість спрогнозувати в майбутньому зміни цих показників і розробити методи керування ними.

На основі дослідження антибактеріальної активності вперше синтезованих вітчизняних препаратів групи флуоренілідену та нових антибактеріальних комбінованих препаратів руліду та аугментину щодо атипових мікобактерій та збудників неспецифічних захворювань органів дихання, ці речовини запропоновані для подальшого доклінічного вивчення з метою зґясування можливості їх використання в практичній охороні здоров'я та ветеринарній медицині.

Визначений вплив досліджуваних речовин на ферментативну активність атипових мікобактерій буде враховуватись при встановленні механізму дії цих речовин на клітини мікроорганізмів

Впровадження результатів дослідження в практику. Матеріали даного дослідження отримали практичне застосування в лабораторіях Львівського науково-дослідного інституту епідеміології та гігієни, Львівського, Тернопільського, Рівненського, Закарпатського обласних протитуберкульозних диспансерів, Мукачівській обласній дитячій лікарні, а також в лекційному курсі біологічного факультету Львівського національного університету ім. І.Франка, кафедри фтизіатрії і пульмонології та кафедри мікробіології Львівського державного медичного університету, факультету удосконалення лікарів Львівського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто на базі лабораторії імунодіагностики та лабораторії бактеріології відділу туберкульозу та неспецифічних захворювань органів дихання Львівського НДІ епідеміології та гігієни. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з даної проблеми, проведено ретроспективний аналіз розповсюдження досліджуваних інфекцій на заході Україні, самостійно виконано мікробіологічні та біохімічні експерименти. Визначено методичні підходи при проведенні експериментальних досліджень, статистичній обробці даних, аналізі і порівнянні отриманих результатів, їх інтерпретації, а також у співставленні їх з літературними матеріалами. Виявлені закономірності сформульовані у висновках роботи, практичних рекомендаціях та опубліковані у наукових виданнях. Автор особисто готував всі матеріали результатів досліджень для опублікування у наукових виданнях та представлення на наукових конференціях, з'їздах. У плануванні основних напрямків досліджень та обговоренні отриманих результатів брав участь науковий керівник д.б.н., чл.-кор. НАНУ Б.П.Мацелюх; консультативну і практичну допомогу у проведенні електронно-мікроскопічних досліджень надав завідувач міжфакультетської лабораторії електронної мікроскопії Львівського національного університету ім.І.Франка к.б.н. О.Р.Кулачковський.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на засіданні обласної асоціації фтизіатрів та пульмонологів (Тернопіль, 1996), конференції професорсько-викладацького складу і аспірантів Львівської комерційної академії (Львів, 1996), міжнародному Україно-Австрійському симпозіумі "Сільське господарство, наука і практика" (Львів, 1996), обласній конференції фтизіатрів (Львів, 1997), VI та VII з'їздах Польського алергологічного товариства (Катовіце, 1997; Лодзь, 2000), на VIII та IX конференціях пульмонологів військової служби здоров'я Польщі (Закопане, 1998; Гдиня, 1999), на XXVI та XXVII з'їздах польського товариства фтизіопульмонологів (Познань, 1998; Забже, 2001), нараді-семінарі лікарів санаторіїв Ів.-Франківської області (Яремча, 1998), II з'їзді фтизіатрів і пульмонологів України (Київ, 1998), II науково-практичній конференції "Алергологія, астма, клінічна імунологія", (Лодзь, 1999) на VII науково-практичній конференції "Досягнення в патогенезі та лікуванні астми" (Варшава, 1999), на IV, VI та VII міжнародних медичних конгресах студентів і молодих учених (Тернопіль, 2000, 2002, 2003), ІІ зїзді мікробіологів України (Чернігів, 2000), міжнародній конференції “Мікроорганізми в патогенезі та їх антибіотикорезистентність (Львів, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 20 наукових робіт, у тому числі 8 журнальних статтей у фахових виданнях, 12 робіт у збірниках наукових праць, матеріалах з'їздів та конференцій.

Структура дисертації. Матеріали дисертації викладено на 128 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали і методи”, пятьох підрозділів власних досліджень, підсумків, висновків і списку літератури, що включає 184 джерела, з котрих 58 - україно- та російськомовні. До складу роботи входять 18 таблиць, 15 рисунків та 11 фотографій.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. У роботі використані культури мікроорганізмів Mycobacterium tuberculosis Н₃₇Rv, M. bovis 8, атипові мікобактерії - представники І (фотохромогени), ІІ (скотохромогени), ІІІ (непігментні), ІV - (швидкоростучі) груп за класифікацією Ранйона: M. avium 10, M. scrofulaceum 526, M. kansasii Joss, M. fortuitum 23 та музейні культури К. pneumoniaе 43, E. coli О₅₅К₅₉, S. aureus 209, отримані з лабораторії мікробіології Державного інституту стандартизації і контролю біологічних медичних препаратів ім. Л.А.Тарасевича та НДІ туберкульозу АН РФ, відповідно.

Вивчали частоту висівання атипових мікобактерій та первинну стійкість до протитуберкульозних препаратів 4531 штамів мікобактерій, виділених від вперше виявлених хворих на туберкульоз легень, а також динаміку висівання неспецифічної мікрофлори і стійкість до антибіотиків 4303 штамів опортуністичних мікроорганізмів, виділених від хворих з легеневою патологією за 1986-1997 рр. за матеріалами Львівського регіонального фтизіопульмонологічного центру та лабораторії бактеріології Львівського НДІ епідеміології та гігієни.

Використані нові сполуки - похідні флуренізиду: ЛІ-74, ЛІ-15, ЛІ-75, ІЧ-95.6, МІ-41а, МІ-61а, МІ-61б, МІ-62 (шифр хіміка), синтезовані на кафедрі фармацевтичної хімії факультету вдосконалення лікарів і провізорів Львівського медичного університету, а також флуренізиду та ізоніазиду.

Антибактеріальна дія новосинтезованих протитуберкульозних препаратів вивчалася за допомогою методу двократних серійних розведень на твердому поживному середовищі Левенштейна - Йенсена.

Вивчали зміну активності нітратредуктази, каталази, пероксидази мікобактерій методом S.Wirtanen [1960] та дегідрогеназ сукцинатдегідрогенази, глутаматдегідрогенази, глюкозодегідрогенази, алкогольдегідрогенази за методикою З.Н. Попової [1963] в культурах мікобактерій після дії на них досліджуваних препаратів.

Електронно-мікроскопічні дослідження проводили за Рейнольдсом [Reynolds, 1963].

Статистична обробка результатів досліджень проводилась за методами варіаційної та кореляційної статистики [Е.Я. Беліцкая, 1972, М.П. Деркач, 1977, М.С. Двойріна, 1993].

Результати власних досліджень та їх обговорення.

Аналіз динаміки виділення мікобактерій та неспецифічної флори протягом 12 років від пацієнтів Львівського регіонального фтизіопульмонологічного центру показав, що за цей період збільшилась частота виділення мікобактерій з патологічного матеріалу хворих і зросла частка атипових мікобактерій (табл. 1). Якщо у 1986 році атипові мікобактерії не висівались зовсім, то у 1988 і 1990 роках число обстежених, що виділяли атипові мікобактерії, становило 1,9±0,7 % і 2,3±0,8 %, відповідно, а у 1991 та 1995 роках -3,5±0,9 % і 3,1±0,8 % відповідно, від усіх хворих, що виділяли мікобактерії. З 1991 року динаміка висівання атипових мікобактерій відповідає збільшенню числа вперше виявлених туберкульозних хворих. Спостерігається тенденція до збільшення частоти виділення від хворих атипових мікобактерій, починаючи з початку проведення досліджень, зокрема, у 1991 році, 1995-1997 роках - в середньому у 4,5 рази (p<0,001).

Встановлена хвилеподібна динаміка висівання атипових мікобактерій за проаналізований період часу характерна постійним зростанням що, можливо, обумовлено особливостями екологічних впливів та іншого роду чинників на території західної України. В середньому за 12 років кількість хворих, від яких виділялись атипові мікобактерії, склала 1,9±0,2 % від всіх хворих на туберкульоз (р<0,001). При цьому найчастіше виділені мікобактерії ідентифікували як M. fortuitum, M. kansasii, рідше - M. scrofulaceum і M. vacce.

Що стосується неспецифічної мікрофлори при захворюваннях органів дихання, то за період з 1988 по 1997 роки було виділено 4303 штами мікроорганізмів, в тому числі стафілококів - 723 штами, нейсерій - 1013 штамів, ентеробактерій - 790 штамів, стрептококів - 1203 штами, синегнійної палички - 126 штамів, протея - 55 штамів, грибів роду кандіда - 340 штамів, неідентифікованих грампозитивних паличок - 29 штамів, причому з часом виділялось більше стафілококів та ентеробактерій, зменшувалась кількість стрептококів.

Таблиця 1

Частота виділення туберкульозних і атипових мікобактерій

вперше виявленими хворими за 1987 - 1997 рр.

Рік	Кількість виділених від хворих штамів	% АМБ від МБ
	неспецифічної мікрофлори	мікобактерій	атипових мікобактерій
1987	-	349	2	0,6±0,1
1988	183	361	7	1,9±0,7
1989	718	340	2	0,6±0,3
1990	517	307	7	2,3±0,8
1991	464	367	13	3,5±0,9
1992	844	380	5	1,3±0,6
1993	158	401	7	1,8±0,6
1994	334	415	10	2,4±0,7
1995	357	384	12	3,1±0,8
1996	447	464	8	2,2±0,6
1997	284	427	11	2,6±0,7
Всього	4303	4195	84	1,9±0,2

Примітки: МБ - мікобактерії; АМБ - атипові мікобактерії; “-“ - не визначалось

Максимальну кількість штамів було виділено в 1989 (718) та у 1992 (844) роках, а мінімальну - у 1988 (183) та 1993 (158) роках. Серед виділених мікроорганізмів переважали нейсерії, стрептококи, стафілококи та ентеробактерії.

Нами встановлено, що із зростанням кількості атипових мікобактерій постійно збільшується кількість їх антибіотикорезистентних штамів. За останні роки достовірно (р<0,01) збільшилась кількість штамів атипових мікобактерій, полірезистентних до основних протитуберкульозних препаратів і, особливо, співвідношення кількості стійких штамів до загальної кількості виділених атипових мікобактерій, що, безумовно, негативно впливає на ефективність лікування мікобактеріозів. Поширення стійкості до одних препаратів супроводжується скороченням її до інших. З 1990 року констатовано різке збільшення кількості штамів атипових мікобактерій, стійких до всіх протитуберкульозних препаратів.

Щодо множинної стійкості мікобактерій, то всі вони були стійкими до двох чи більше протитуберкульозних препаратів одночасно. Максимум полірезистентних штамів було виділено у 1993-1994 рр. та у 1997 році. Серед них - стійкі одночасно до 3, 4, 5, 6, 7 і навіть 8 основних протитуберкульозних препаратів.

Нами було проаналізовано, до яких концентрацій основних протитуберкульозних препаратів штами атипових мікобактерій виявляли стійкість (табл.2). Встановлено, що штами атипових мікобактерій були стійкими до невисоких (1-5 мкг/мл) концентрацій етамбутолу, ПАСК і до високих (переважно 25-50 мкг/мл) концентрацій ізоніазиду рифампіцину, стрептоміцину.

Таблиця 2

Кількість штамів атипових мікобактерій, стійких до вказаних концентрацій протитуберкульозних препаратів

Препарати	К о н ц е н т р а ц і ї п р е п а р а т і в (мкг/мл)	Всього штамів
	1	2	5	10	25	50
	абс	%	абс	%	абс	%	абс	%	абс	%	абс	%
Стрептоміцин	-	-	-	-	-	-	10	26,3	-	-	28	74,7	38
Ізоніазид	16	36,4	1	2,3	5	11,4	-	-	22	50,0	-	-	44
ПАСК	-	-	-	-	46	100	-	-	-	-	-	-	46
Етамбутол	-	-	5	17,9	22	78,6	-	-	-	-	1	3,6	28
Рифампіцин	-	-	-	-	-	-	1	2,6	6	15,8	31	81,6	38

Примітки: “ - “ відсутні штами, стійкі до саме цієї концентрації; абс - абсолютне чисто штамів

На основі аналізу первинної стійкості неспецифічної мікрофлори, виділеної від хворих на туберкульоз та неспецифічні захворювання органів дихання, визначено чутливість культур стафілококів (S. epidermidis і S. aureus), нейсерій, ентеробактерій, стрептококів (S. pyogenes, S. pneumoniae), псевдомонад (P. aeruginosa), протея та неідентифікованих грампозитивних паличок, а також грибів роду кандіда до одного, двох, трьох, чотирьох і більше препаратів одночасно (табл. 3). В основному виділялися полірезистентні штами ентеробактерій, епідермічного стафілокока, синегнійної палички, протея. В той же час нейсерії, кандіди і стрептококи в більшості виявляють чутливість до антибіотиків, хоча серед всіх досліджуваних збудників зустрічаються стійкі і полірезистентні штами, а серед ентеробактерій, нейсерій, стафілококів спостерігається виражена тенденція до збільшення полірезистентності та зменшення чутливості до антибіотиків протягом досліджуваного періоду часу.

Таблиця 3

Резистентність неспецифічної мікрофлори органів дихання до антибіотиків

Мікроорганізми	Кількість штамів мікроорганізмів
	S	R1	R2	R3	R4	Всього
Стрептококи	714	349	85	48	37	1233
Нейсерії	334	328	133	100	175	1070
Ентеробактерії	32	81	92	124	478	807
Стафілококи	108	140	96	108	272	616
Псевдомонади	2	1	5	1	146	155
Протей	2	2	4	3	57	68
Г +	11	2	5	6	12	36
Кандіди	0	0	0	0	402	402

Примітки: S - чутливі до антибіотиків; R1 - резистентні до 1 антибіотика; R2 - резистентні до 2 антибіотиків; R3 - резистентні до 3 антибіотиків; R4 - резистентні до 4 і більше антибіотиків одночасно; Г + - неідентифіковані грампозитивні палички

Вивчення впливу ізоніазиду, флуренізиду та вперше синтезованих протитуберкульозних препаратів - похідних флуренізиду на збудників опортуністичних інфекцій органів дихання показали, що досліджувані новосинтезовані препарати ЛІ-15, ЛІ-75, ІЧ-95.6 мають бактерицидну активність до M. tuberculosis. Препарат ЛІ-74 виявив бактеріостатичну активність до M. tuberculosis. Препарат ЛІ-15 виявив також бактеріостатичну активність до M. avium, M. fortuitum i M. kansasii, ЛІ-74 - до M. avium, M. fortuitum i M. scrofulaceum, МІ-61б - до M. fortuitum i M. scrofulaceum. Всі інші досліджувані препарати мали бактеріостатичну дію лише до M. fortuitum (табл.4).

Таблиця 4

Мінімальні діючі концентрації досліджуваних речовин на мікобактерії (в мкг/мл)

Препарати	M.tuberculosis	M.avium	M.kansasii	M.fortuitum	M.scrofulaceum
	БЦ	БС	БЦ	БС	БЦ	БС	БЦ	БС	БЦ	БС
Ізоніазид	0,31	-	10,0	0,62	-	2,5	-	1,25	-	1,25
Флуренізид	0,31	-	-	2,5	-	40,0	-	2,5	-	-
ЛІ-15	2,5	0,31	-	20,0	-	20,0	-	0,62	-	-
ЛІ-74	-	0,31	-	5,0	-	-	-	0,62	-	20,0
ЛІ-75	0,62	0,31	-	-	-	-	-	0,62	-	-
ІЧ-95.6	0,31	-	-	-	-	-	-	0,62	-	-
МІ-41а	-	-	-	-	-	-	-	0,62	-	-
МІ-61а	-	-	-	-	-	-	-	1,25	-	20,0
МІ-61б	-	-	-	-	-	-	-	1,25	-	-
МІ-62	-	-	-	-	-	-	-	0,62	-	-

Примітки: БЦ - бактерицидна дія; БС - бактеріостатична дія; “-“ - відсутність дії

Таким чином, новосинтезовані препарати виявили переважно нижчу активність щодо мікобактерій, ніж флуренізид та ізоніазид, за виключенням їх дії на M. fortuitum та дії препарату ЛІ-15 на M. kansasii.

Цінність новосинтезованих речовин полягає в тому, що вони можуть діяти на штами мікобактерій, стійкі до інших препаратів, або застосовуватись в комплексі з протитуберкульозними препаратами, а також як такі, що мають вибіркову дію на певні види мікобактерій.

Що стосується антибактеріальної дії досліджуваних речовин на неспецифічну мікрофлору органів дихання, то встановлено, що бактеріостатичну дію по відношенню до E. coli та K. pneumoniae виявили препарати МІ-61а та ЛІ-75 в концентраціях 50 мкг/мл. Бактерицидну дію по відношенню до цих збудників виявили препарати МІ-61а та ЛІ-75, а також препарат ЛІ-15 до E. coli у концентраціях 100 мкг/мл. Щодо S. aureus, виявлено бактеріостатичну дію препарата МІ-61а в концентрації 100 мкг/мл та бактерицидну дію препаратів ЛІ-15 та ІЧ-95.6 в концентраціях 100 мкг/мл (табл. 5).

Таблиця 5

Антибактеріальна дія досліджуваних речовин на

E. coli, K. pneumoniae, S. aureus (в мкг/мл)

Препарати	E. coli	K. pneumoniae	S. aureus
	БЦ	БС	БЦ	БС	БЦ	БС
Флуренізид	-	-	-	-	-	-
ЛІ-15	100	-	-	-	100	-
ЛІ-74	-	-	-	-	-	-
ЛІ-75	100	50	100	50	-	-
ІЧ-95.6	-	-	-	-	100	-
МІ-41а	-	-	-	-	-	-
МІ-61а	100	50	100	50	-	100
МІ-61б	-	-	-	-	-	-
МІ-62	-	-	-	-	-	-
Канаміцин	100	50	100	50	-	-
Пеніцилін	-	-	-	-	100	-

Примітки: БЦ - бактерицидна дія; БС - бактеріостатична дія; “-“ - дії не виявлено.

Разом з тим, встановлено бактеріостатичну дію канаміцину сульфату в концентрації 50 мкг/мл та бактерицидну дію в концентрації 100 мкг/мл на ентеробактерії, а також бактерицидну дію пеніциліну на стафілококи в концентрації 100 мкг/мл.

Антибіотик продовженої дії рулід (напівсинтетичний макролід) виявив бактерицидну дію по відношенню до M. scrofulaceum, M. kansasii, M. fortuitum, M. tuberculosis i M. bovis та бактеріостатичну дію щодо M. avium (табл. 6).

Аугментин - комбінований хіміотерапевтичний препарат, який містить антибіотик пеніцилінової групи з широким спектром дії амоксицилін і клавулінову кислоту - інгібітор -лактимаз - виявив бактерицидну дію відносно M. tuberculosis i M. bovis, M. scrofulaceum в концентрації 12 мкг/мл, а також в концентрації 50 мкг/мл на M. fortuitum. В концентрації 25 і 12 мкг/мл аугментин виявив бактеріостатичну дію на M. fortuitum. На M. kansasii аугментин виявив бактеріостатичну дію - в концентрації 12 мкг/мл затримував ріст на 4 дні, а в концентрації 25 і 50 мкг/мл - на 8 та 11 днів відповідно. M. avium не виявив жодної чутливості до аугментину в будь-якій концентрації (табл. 6). Подібна активність була встановлена при дії на мікобактерії препаратів групи хінолінів [B.Burjanova, V.Dornetzguber, 1987; L.S.Young et al., 1987].

Таблиця 6

Антибактеріальна дія руліду та аугментину на мікобактерій

Види мікобактерій	Аугментин	Рулід
	50 мкг/мл	25 мкг/мл	12 мкг/мл	15 мкг/мл	7 мкг/мл
M. tuberculosis	БЦ	БЦ	БЦ	БЦ	БЦ
M. bovis	БЦ	БЦ	БЦ	БЦ	БЦ
M. avium	-	-	-	БС	БС
M. kansasii	БС	БС	БС	БЦ	БС
M. fortuitum	БЦ	БС	БС	БЦ	БС
M. scrofulaceum	БЦ	БЦ	БЦ	БЦ	БЦ

Примітки: БЦ - бактерицидна дія; БС - бактеріостатична дія; “-“ - відсутність дії

Нами вивчено зміни активності каталази, пероксидази, нітратредуктази, ряду дегідрогеназ мікобактерій туберкульозу M. tuberculosis, M. bovis та атипових мікобактерій різних груп за класифікацією Ранйона: M. avium, M. scrofulaceum, M kansasii, M. fortuitum під впливом флуренізиду, ізоніазиду і новосинтезованих речовин - похідних флуорену: ЛІ-15, ЛІ-74, ЛІ-75, ІЧ-95.6, МІ-41а, МІ-61а, МІ-61б, МІ-62 у концентраціях 40 та 20 мкг/мл (табл. 7).

Властивість мікобактерій адаптуватись до анаеробних умов пов'язана з активністю нітратредуктази - ферменту, що дозволяє у відсутності кисню нітратне дихання, яке сприяє збільшенню вірулентності та антибіотикорезистентності мікобактерій.

Після дії всіх досліджуваних препаратів на мікобактерії редукція нітратів у них залишилась без змін, за виключенням дії препарату ІЧ-95.6, що приводила до пригнічення редукції нітратів у M. tuberculosis, та дії препаратів ЛІ-15, флуренізиду, ізоніазиду на M. bovis, яка спричиняла проявлення нітратредуктазної активності у дослідних зразках цих мікобактерій. Аналогічні результати отримані Голишевською [Golyshevskaia, 1996].

Таблиця 7. Вплив похідних флуорену на ферментативну активність мікобактерій

Речовини

М. tuberculosis

М. bovis

M. avium

M. scrofulaceum

M. fortuitum

M. kansasii

нтр

пер

кат

нтр

пер

кат

нтр

пер

кат

нтр

пер

кат

нтр

пер

кат

нтр

пер

кат

ЛI-15

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

-

+

+

-

+

ЛI-74

+

-

-

-

-

-

-

-

+

+

-

+

+

+

+

+

-

+

ЛI-75

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

+

-

+

+

-

+

IЧ-95.6

-

-

-

-

-

+

-

-

-

+

-

+

+

-

+

+

-

+

Флуренізид

+

-

-

+

+

+

-

-

+

+

-

+

+

+

+

+

-

+

Ізоніазид

+

-

-

+

+

-

-

-

+

-

+

+

-

+

+

-

+

Контроль

+

+

+

-

+

+

-

-

+

+

-

+

+

-

+

+

-

+

Дегідрогенази

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

ЛІ-15

+

+

+

-

-

-

+

+

+

+

-

+

+

-

-

-

+

+

+

+

+

-

+

-

ЛІ-74

+

+

+

+

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

ЛІ-75

+

+

+

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

+

+

-

+

+

+

+

-

-

-

-

ІЧ-95.6

+

+

+

+

+

-

+

+

-

+

+

-

+

-

+

-

+

+

+

-

-

+

+

-

Флуренізид

+

+

+

-

-

-

-

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

Ізоніазид

+

+

+

+

+

-

+

-

+

+

+

+

+

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

Контроль

+

+

+

+

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Примітки: 1 - глутаматдегідрогеназа; 2 - глюкозодегідрогеназа; ; 3 - алкогольдегідрогеназа;

4 - сукцинатдегідрогеназа; нтр - нітратредуктаза; пер - пероксидаза; кат - каталаза; + - позитивна реакція;

+ - слабопозитивна реакція; “-“ - відсутня реакція

Размещено на http://www.allbest.ru/

Відносно високий рівень стійкості мікобактерій до бактерицидної дії органічних пероксидів та пероксиду водню спричиняється мікобактеріальною каталазою та пероксидазою.

Відомо, що втрата патогенності мікобактерій знаходиться у прямій залежності від втрати каталазної активності. Крім того, відсутність активності цього ферменту у мікобактерій може бути показником зниженої їх вірулентності.

Нами встановлено, що втрата каталазної активності у M. tuberculosis та M. scrofulaceum спостерігалось після дії всіх досліджуваних препаратів, у M. bovis - під впливом препаратів ЛІ-15, ЛІ-74, ЛІ-75, у M. avium під впливом препаратів ЛІ-15, ЛІ-75, ІЧ-95.6.

Визначення пероксидазної активності є більш чутливим тестом ніж каталазної, для виявлення стійкості мікобактерій туберкульозу до ізоніазиду. Всі штами, що мали навіть мінімальну ступінь стійкості, виявилися пероксидазонегативними.

Після дії всіх досліджуваних препаратів на мікобактерії встановлено, що у M. tuberculosis реакція на виявлення пероксидазної активності стала негативною, так само як у M. bovis після дії препаратів ЛІ-15, ЛІ-74, ЛІ-75. Речовини ЛІ-74 та ІЧ-95.6 сприяли прояву активності цього фермента у мікобактерій M. fortuitum. Серед всіх інших досліджуваних штамів мікобактерій вище названі речовини не впливають на зміну їх пероксидазної активності.

Дегідрогенази мікобактерій на сьогодні досліджені менше у порівнянні з іншими ферментами. Є лише поодинокі роботи про вплив на їх активність антибактеріальних речовин.

Дегідрогенази відіграють роль у проникненні клітин мікобактерій у клітини альвеолярного епітелію, спричиняють АТР-індуковане руйнування клітин макрофагів. Некроз клітин легеневого епітелію, спричинений вірулентними мікобактеріями, пов'язаний з високою активністю дегідрогеназ. Вивчення активності дегідрогеназ може служити додатковим критерієм при вивченні вірулентності різних мікобактерій, а розуміння їх властивостей могло б стати ключем у відкритті нових відбірних ліків проти патогенних мікобактерій

Наші дослідження показали, що глутаматдегідрогеназа присутня у всіх досліджуваних мікобактерій, крім M. bovis. Її активність пригнічувалася у M. avium під дією ізоніазиду, ІЧ-95.6, у M. scrofulaceum - флуренізидом, ЛІ-75, у M. kansasii - флуренізидом, у M. fortuitum - ЛІ-75, ІЧ-95.6. У M. bovis глутаматдегідрогеназна активність активізувалася ізоніазидом, ІЧ-95.6. У M. tuberculosis активність дегідрогенази не змінювалася.

Глюкозодегідрогеназа відсутня у M. bovis, стабільно зберігається активність під дією досліджуваних речовин у M. tuberculosis, M. kansasii, M. avium, пригнічується у M. scrofulaceum ізоніазидом, флуренізидом, ІЧ-95.6, ЛІ-75, ЛІ-15, у M. fortuitum - ЛІ-75.

Алкогольдегідрогеназа не виявлена у M. bovis, активізувалася у цього штаму під дією ізоніазиду, ІЧ-95.6, ЛІ-15. Присутня в контролі у всіх інших досліджуваних штамів, алкогольдегідрогеназа пригнічувалася у M. avium флуренізидом, ЛІ-75, ЛІ-15, у M. scrofulaceum - ізоніазидом, флуренізидом, ЛІ-75, ЛІ-74, ЛІ-15, у M. fortuitum - ЛІ-75.

Сукцинатдегідрогеназа присутня у всіх досліджуваних штамів мікобактерій, пригнічувалася у M. bovis ізоніазидом, ЛІ-75, у M. tuberculosis - флуренізидом, ЛІ-75, ЛІ-15, у M. avium - флуренізидом, ІЧ-95.6, ЛІ-75, у M. skrofulaceum - ізоніазидом, флуренізидом, ІЧ-95.6, ЛІ-75, ЛІ-74, ЛІ-15, у M. kansasii - ІЧ-95.6, у M. fortuitum - МІ-62, МІ-61б, МІ-41а, ІЧ-95.6, ЛІ-75, ЛІ-15.

Одержані нами дані підтверджують результати інших авторів [Zaborina, 1999; Hsu, 1999; Duine, 1999; Dobos, 2000].

Таким чином, у результаті проведених досліджень виявлено певні особливості змін ферментативної активності мікобактерій при дії на них новосинтезованих речовин. Так, всі препарати пригнічують активність каталази M. scrofulaceum, пероксидази та каталази M. tuberculosis. Препарати ЛІ-15, ЛІ-74, ІЧ-95.6 пригнічують активність пероксидази, а ЛІ-15, ЛІ-74, ЛІ-75 - каталази M. bovis. Препарати ЛІ-15, ЛІ-75, ІЧ-95.6, ізоніазид пригнічують каталазну активність M. avium. Вплив нових речовин на активність нітратредуктази атипових мікобактерій не виявлено. Вона пригнічується препаратом ІЧ-95.6 у M. tuberculosis, а під дією препаратів флуренізиду та ізоніазиду нітратредуктазна активність спостерігалась у штама M. bоvis.

Оскільки наявність каталазної активності розглядають в основному як показник патогенності мікобактерій, можна припустити, що дія вказаних препаратів приводить до зниження патогенності культур мікобактерій M. tuberculosis, M. bovis та M. avium. У інших збудників мікобактеріозів каталазна активність під впливом досліджуваних речовин не змінювалась.

Дегідрогеназна активність найчастіше пригнічується у досліджуваних штамів мікобактерій під дією речовин ЛІ-15, ЛІ-75, ІЧ-95.6, флуренізиду. Найбільшу тенденцію до зниження активності дегідрогеназ виявив штам M. skrofulaceum. У культурі M. bovis з'являлась активність глутаматдегідрогенази та алкогольдегідрогенази після дії речовин ЛІ-15, ІЧ-95.6, ізоніазиду. На наш погляд це можливо за рахунок пошкодження ними клітинної стінки бактерій, що полегшує вихід ферментів за межі клітини.

Ультраструктурні зміни клітин мікобактерій після дії на них досліджуваних препаратів спостерігалися у всіх дослідних зразках. Основними серед них були дезорганізація нуклеоїду та цитоплазми, утворення цитоплазматичних вакуолей та внутрішньоклітинних ліпідоподібних включень, а також руйнування клітинної стінки, що проявлялось зміною форми клітин на сфероїдну та на безформну масу, зникнення периплазматичного простору, поява у зразках клітин нададрібних розмірів та неповністю поділених клітин. Значної різниці між характером змін структури клітин при використанні різних антибактеріальних речовин не виявлено.

Частіше ультраструктурні зміни спостерігались після 72 годин експозиції культур з антибактеріальними речовинами. При застосуванні вищих концентрацій цих речовин ультраструктурні зміни були більш суттєвими.

Отримані нами результати в цілому збігаються з даними аналогічних досліджень, проведених іншими дослідниками. На думку більшості авторів дезорганізація нуклеоїду вказує на інгібування синтезу ДНК в клітині. Деструкція зовнішньої оболонки клітини, як і збільшення або відсутність периплазматичного простору, зміна форми клітин та неповний їх поділ можуть свідчити про інгібування синтезу елементів клітинної оболонки. Дезорганізація цитоплазми, поява в клітинах цитоплазматичних вакуолей та ліпідоподібних включень вказують на порушення внутрішньоклітинного метаболізму, початок процесів автолізу клітин мікобактерій внаслідок дії на них досліджуваних речовин.

Отримані результати проведених нами досліджень дозволяють констатувати зростання за останнє десятиріччя частоти виявлення на території західного регіону України збудників опортуністичних інфекцій, в першу чергу атипових мікобактерій M. fortuitum, M. kansasii, M. scrofulaceum, M. vacce, M. marinum, а також представників неспецифічної мікрофлори родів Staphylococcus, Streptococcus, Neisseriae та родини Enterobacteriaceae.

Серед мікрофлори, що висівається від хворих на туберкульоз легень та неспецифічні захворювання органів дихання збільшилась питома вага штамів збудників опортуністичних інфекцій, стійких до одного, кількох і багатьох препаратів

Одночасно нами показана перспективність подальшого доклінічного дослідження нових протитуберкульозних препаратів руліду та аугментину, вітчизняного препарату флуренізиду та ряду його похідних для боротьби із збудниками опортуністичних інфекцій органів дихання.

ВИСНОВКИ

Аналіз динаміки виділення мікобактерій та неспецифічної мікрофлори протягом 12 років від пацієнтів з патологією органів дихання західного регіону України виявив збільшення частоти висівання нетуберкульозних мікобактерій, серед яких переважають швидкоростучі (M. fortuitum), скотохромогенні (M. marinum, M. vaccae) та фотохромогенні (M. kansasii) мікобактерії. Серед неспецифічної мікрофлори домінують нейсерії, пневмококи, епідермальний стафілокок, в-гемолітичні стрептококи, ентеробактерії та гриби роду Candida.

Встановлено зростання кількості атипових мікобактерій та неспецифічної мікрофлори, стійких до одного і багатьох антибіотиків.

Встановлено, що серед вперше синтезованих речовин - похідних флуорену найактивнішими антибактеріальними препаратами виявились ЛІ-15, ЛІ-74, ЛІ-75 та ІЧ-95.6 по відношенню до M. tuberculosis та M. fortuitum. Препарат ЛІ-15 пригнічує ріст M. avium i M. cansasіi, а препарат ЛІ-74 - ріст M. cansasii.

Виявлено бактеріостатичну дію препаратів МІ-61а та ЛІ-75 по відношенню до E. coli та K. pneumoniae і бактерицидну дію препаратів ЛІ-15 та ІЧ-95.6 щодо S. aureus.

Препарати рулід і аугментин проявили бактерицидну дію проти M. tuberculosis, M. bovis, M. scrofulaceum та бактеріостатичну по відношенню M. kansasii та M. fortuitum.

Показано, що під дією новосинтезованих препаратів зникає пероксидазна та каталазна активності у мікобактерій, а препарати ЛІ-15 та ІЧ-95.6 пригнічують активність дегідрогеназ у атипових мікобактерій.

Під впливом новосинтезованих речовин у клітинах мікобактерій відбуваються ультраструктурні зміни, які вказують на порушення внутрішньоклітинного метаболізму та інгібування синтезу клітинних компонентів.

Дослідження антибактеріальних властивостей нових препаратів по відношенню до збудників опортуністичних інфекцій органів дихання дозволяють рекомендувати їх для подальших доклінічних та клінічних досліджень з можливим наступним застосуванням для терапії опортуністичних інфекцій органів дихання.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Сибірний А.В. Вплив похідних флуорену на ферментативну активність мікобактерій //Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії, та сільського господарства.- 1997.- №3.- С.44-45.

Сибірний А.В. Стійкість атипових мікобактерій до протитуберкульозних препаратів //Мікробіологічний журнал.- 1998.- №2.- С.75-79.

Сибірний А.В. Бактеріостатична дія похідних флуоренілідену на мікобактерії //Мікробіологічний журнал.- 2002.- №1.- С.77-82.

Сибирный А.В. Частота высевания атипичных микобактерий у больных Львовского регионального фтизиопульмонологического центра //Пробл. туберкулёза.- 1997.- №6.- С.44-45.

Сибірна Р.І., Литвин Л.М., Сибірний А.В., Гречуха Н.Р., Юкало В.Є. Діагностика, особливості клінічної картини й перебігу мікобактеріозів //Лікарська справа.- 1999.- №1.- C.88-90.

Сибірна Р.І., Сибірний А.В. Нові підходи до проблеми мікобактеріозів //Інфекційні хвороби.- 2000.- №1.- С.11-14.

Сибірна Р.І., Сибірний А.В., Юкало В.Є. Дослідження терапевтичної активності флуренізиду при експериментальному туберкульозі //Фармацевтичний журнал.- 2000.- №2.- С.72-75.

Сибірна Р.І., Юкало В.Є., Сибірний А.В. Імунобіологічні дослідження при мікобактеріозі генітальної локалізації //Одеський медичний журнал.- 2001.- №1.- С.38-40.

R.I.Sybirna A.W.Sybirny Mykobakteriozy i problemy zwi№zane z ich leczeniem na Ukrainie //Pneumonol., alergol. Pol., 1995.- T.63, Supl. 1.- (XXV zjazd Polskiego towarzystwa Ftyziopulmonologicznego, Zakopane, 1995.- S.24.

Сибірний А.В. Динаміка висівання нетуберкульозних мікобактерій при мікобактеріозах В зб. "Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания" (Междунар. науч. конф., тез. докл.) Харьков, 1995.- С.272-273.

Сибірний А.В. Вплив флуренізиду на мікроорганізми //матеріали конференції професорсько-викладацького складу і аспірантів Львівської комерційної академії.- Львів, 1995.- С.200-201.

Р.І.Сибірна, Н.Я.Креймер, А.В.Сиб...