Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет

ім. В.Н. Каразіна

УДК 57.05: 577.121: 591.3: 636.082.474

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Особливості становлення антиоксидантного захисту

та вплив Мікотоксинів на організм птиці в онтогенезі

Шаповалов Сергій Олегович

Харків - 2003

Робота виконана в Інституті птахівництва Української академії аграрних наук

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук Іонов Ігор Анатолійович, Інститут птахівництва УААН, завідувач відділу біохімії, фізіології та живлення птиці

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Смолянінов Борис Вікторович, Одеський державний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, завідувач кафедри фізіології та біохімії сільськогосподарських тварин, м. Одеса

кандидат біологічних наук Кукленко Тетяна Василівна, Харківський державний університет харчування і торгівлі Міністерства освіти і науки України, старший викладач кафедри охорони праці та екології, м. Харків

Провідна установа: Донецький національний університет (кафедра фізіології людини і тварин), Міністерство освіти і науки України, м. Донецьк

Захист відбудеться 25.12.2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою:

61077, м. Харків, пл. Свободи, 4

Автореферат дисертації розісланий 25.11.2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Падалко В.І.

Анотації

Шаповалов С.О. Особливості становлення антиоксидантного захисту та вплив мікотоксинів на організм птиці в онтогенезі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - фізіологія людини і тварин. - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2003.

Дисертація присвячена вивченню особливостей формування антиоксидантної системи у птиці різних видів в ембріогенезі та ранньому постнатальному онтогенезі, визначенню тканинних, видових особливостей становлення антиоксидантної системи сільськогосподарської птиці в онтогенезі, впливу кормових мікотоксинів на її функціонування, а також пошуку шляхів підвищення антиоксидантного статусу організму.

Показано, що на заключних етапах ембріогенезу перед виводом молодняку птиці відбувається збільшення активності більшості АО-ферментів і накопичення основного жиророзчинного антиоксиданту клітини - альфа-токоферолу. антиоксидантний птиця онтогенез

Встановлено, що мікотоксини є активатором перекисних процесів. Встановлено кореляційний звязок при мікотоксикозах курей між рівнем продуктів ПОЛ в організмі птиці та активністю антиоксидантних ферментів і вмістом вітамінів А, Е, С та каротиноїдів.

Ключові слова: птиця, онтогенез, вітаміни, антиоксидантні ферменти, перекисне окиснення ліпідів, мікотоксини, мікроелементи.

Шаповалов С.О. Особенности становления антиоксидантной защиты и влияние микотоксинов на организм птицы в онтогенезе. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2003.

Диссертация посвящена изучению особенностей формирования антиоксидантной системы у птиц различных видов в эмбриогенезе и раннем постнатальном онтогенезе, определению тканевых, видовых и возрастных особенностей становления антиоксидантной системы сельскохозяйственной птицы в онтогенезе, влиянию микотоксинов на ее функционирование, а также поиск путей повышения антиоксидантного статуса организма. Показано, что на заключительных этапах эмбриогенеза перед выводом молодняка птицы происходит увеличение активности большинства АО-ферментов и накопление основного жирорастворимого антиоксиданта клетки -токоферола.

Установлено, что микотоксины являются активатором перекисных процессов. Установлено корреляционную связь при микотоксикозах кур между уровнем продуктов ПОЛ в организме птицы и активностью антиоксидантных ферментов и содержанием витаминов А, Е, С и каротиноидов.

Ключевые слова: птица, онтогенез, витамины, антиоксидантные ферменты, перекисное окисление липидов, микотоксины, микроэлементы.

S.O. Shapovalov. The peculiarities of formation of the antioxidant protection and the effect of micotoxins on its development in birds ontogenesis. - Manuscript.

Thesis for the Ph. D. Degree by specialty 03.00.13 - human and animal physiology .- Karazin's Kharkov National University, Kharkov, 2003.

The thesis concerns the study of peculiarities of formation of the antioxidant system in birds in embryogeny, early postnatal ontogenesis, determination of tissue, species and age peculiarities of formation of the antioxidant system in poultry in ontogenesis, the effect of feed micotoxins on its functioning and also the looking-for of ways of increasing the antioxidant status of the organism.

It is shown that at the final stages of embryogeny befor hatching poultry youngster the increase of the activity of the main fat - dissolvent antioxidant of a cell of -tocoferole take place. It is shown that the content of vitamin E in a liver of poultry embryos during.

The embryonal development increases gradually and reaches its maximum at notching youngster and reaches the level of adult birds. The level of vitamin A in the liver of all species of poultry in embryogeny and postnatal ontogenesis increases constantly. It has been established the high content of vitamin C in the brain of chickens embryos, the level of which is 5-7 times more than its concentration in the liver at the moment of hatching. It has been discovered the tissue specificity of the activity of antioxidants enzymes in embryogeny in different species of birds: the activity of catalase, glutationperoxidase and SOD in embryogeny increases till the moment of hatching in the liver and other studied tissues besides the brain; the activity of catalase and glutationperoxidase was 2-9 times more in the liver in comparison with the brain; the activity catalase in the liver and brain embryos to the lunge type of respiration, and the activity of superoxiddysmutase in the brain of embryos of peroxide processes.

It has been established the correlation connection between the level of products of POL in the organism of birds and the activity of antioxidant enzymes and the content of vitamins A, E, C and carotenoids under micotoxicoses of hens. Toxicoses, caused by T-2 toxin (6-10 mg/kg), zearalenone (1,6 mg/kg), aurofuzarin (26,4 mg/kg), are activators of POL processes in erythrocytes, cells of the liver and brain. Under the reduce of the level of native antioxidants (vitamin A, E, C - in the lever) The increase of POL products and the activity of antioxidant enzymes, the activation of hemolitic processes and conformation changes of membranes of erythrocytes take place.

It is corroborated experimentally that among studied mycotoxins T-2 toxin change greatly biochemical indices of the organism of hens. It is shown that in embryos of hens and day-old youngster, obtained from hens which got T-2 toxin, the high intensity of POL processes take place and the increase of the level of malonic dialdehyd by 13-22 percent in day-old youngster points to this, the decrease of the activity of key antioxidant enzymes during embryogeny takes place too; the level of the activity of SOD was lower from 4 to 20 per cent during all embryogeny the level of the activity of glutationperoxidase was lower from 7 to 32 per cent and at the moment of notching it increased trustworthy by 15 per cent, the activity of catalase was less by 4-11 per cent during all embryogeny. The methodology of estimation of antioxidant properties of different forms of vitamins A, E, carotenoids, microelements and investigation of processes of peroxide oxidation of lipids under the action of T-2 toxin in condition in vitro on cells of the embryonic brain has been worked out. It was observed that vitamins E, A, carotenoides in vitro as under indecent putting as at the presence of T-2 toxin. It was determined the minimum concentration of T-2 toxin. It was determined the minimum concentration of T-2 toxin (5x10-6M) that could initiative POL in cell of the embryos brain in condition in vitro. It is shown that lutein and zeaxantin had the high antioxidant activity of carotin. The optimum doses of putting investigating biologically active substances in conditions in vitro were determined. It was determined the minimum concentration of T-2 toxin that could actives processes of lipoperoxidation The possibility of increasing doses of vitamins E, C and selenium on the phone of T-2 toxicosis of hens. It is shown that under T-2 toxicosis putting 5-times concentration of vitamins E, C and 2-times concentration of selenium (150 mg/kg, 250 mg/kg, 0,2 mg/kg of feeds) is accompanied by the decrease of negative action of T-2 toxin as on a background of T-2 toxin as after its exclusion, the stabilization of cell pull of glutation in tissues, the decrease of accumulation of POL products, the improvement of hematologic indices and the level of vitamins in the liver. It was established that putting the microelement composition of preparations "Biotam" caused the optimization of the antioxidant status of the bird's organism as independently as on a background of t-2 toxicosis development, provided integrity of cells membranes, confirmed the competence of microelements as a factor of resistance of the organism, the preparation may be used with the prophylactic purpose. It increases productive and reproductive indices. Using probiotics under T-2 toxicosis furthers the considerable improvement of biochemical indices of the chicken's organism. The obtained results deepen and widen the conception of mechanisms of toxical action of mycotoxins as stimulators of POL, that came to the organisms of poultry by the alimentary way and may be the base for the working out of a diagram of detoxication, grounded by science, using different feed additives.

Key words: poultry, ontogenesis, vitamins, antioxidant enzymes, peroxide oxidation of lipids, mycotoxins, microelements.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Проблема підвищення адаптивності організму і регуляції гомеостазу залишається однією з головних в сучасній біології. Інтенсивність вільнорадикальних процесів в організмі і вплив на них різних факторів свідчить про те, що їх роль знаходить найбільший прояв у тих біологічних системах, де швидкість метаболізму найбільш висока. Показано, що зсув балансу антиоксиданти-прооксиданти у бік останніх відбувається на різних, так званих, "критичних" етапах онтогенезу тварин, зокрема птиці [Яремко Р. М, 1999], під впливом різних факторів: ксенобіотиків [Гірін С.В., 1999], мікотоксинів [Schuster A., та ін. 1987], важких металів [Каліман П.А., та ін. 1998], канцерогенів [Барсуков, та ін. 1998], оксидативного стресу, інфекційних та запальних процесів [Аносов, та ін. 1989], а також старінні [Harman D., 1994].

У зв'язку з цим, розкриття сутності функціональних змін антиоксидантного захисту в організмі та пошук способів впливу на клітинний гомеостаз є важливою проблемою. Основним шляхом попередження порушень фізіологічних процесів є забезпечення високої активності системи антиоксидантного захисту організму [Іонов І.А., 1997]. Функціонування антиоксидантної системи поряд із системами детоксикації, репарації, імунною системою, закріплено генетично і має кілька шляхів реалізації, зокрема підвищенню активності антиоксидантної системи сприяє застосування природних антиоксидантів - вітамінів А, Е, С та каротиноїдів [Іонов І.А., та ін; 2000, Surai P.F., та ін. 2000], мікроелементів [Крючина Є.А., 2000], а також пробіотиків - кормових добавок живих мікроорганізмів, здатних знижувати негативну дію ксенобіотиків та ендогенних метаболітів, що активують процеси окиснення [Тараканов, 2000].

З огляду на темпи забруднення навколишнього середовища ксенобіотиками, в тому числі мікотоксинами, більшість з яких негативно впливають на метаболізм, підвищуючи рівень продуктів перекісного окиснення ліпідів у тканинах, проведення досліджень є актуальними. Також велике практичне значення має підтримка високого рівня антиоксидантного захисту організму в ембріональному періоду його розвитку та ранньому постнатальному онтогенезі, коли відбувається закладання захисних систем організму. Підвищена інтенсивність вільнорадикального окиснення ліпідів відразу ж позначається на продуктивності птиці, і в першу чергу відтворних якостях [Aydemir T. та ін., 2000]. Крім того, підвищення активності перекисного окиснення ліпідів є пусковим механізмом дії більшості мікотоксинів [Schuster A., та ін., 1987]. Доцільними є дослідження антиоксидантної системи основних видів сільськогосподарської птиці (курей, індиків, качок, гусей, перепелів), які відрізняються як живленням та інтенсивністю розвитку, так і протіканням різних фізіологічних процесів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є складовою частиною досліджень, виконаних згідно до плану науково-дослідних робіт лабораторії фізіології та біохімії Інституту птахівництва УААН протягом 1995-2001 р. у межах виконання теми 01.03.01. "Вивчити особливості розвитку антиоксидантної системи в сільськогосподарської птиці в ембріогенезі та ранньому постнатальному онтогенезі" № державної реєстрації 0197V009424.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було визначення видових та тканинних особливостей становлення антиоксидантної системи сільськогосподарської птиці (курей, індиків, качок, гусей, перепелів) в онтогенезі, вплив мікотоксинів присутніх в кормі на її функціонування, а також пошук шляхів підвищення антиоксидантного захисту організму.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

вивчити вікову і тканинну динаміку вмісту вітамінів А та Е в ембріогенезі та ранньому постнатальному онтогенезі курей, індиків, качок, гусей, перепелів;

вивчити динаміку активності антиоксидантних ферментів в ембріогенезі та у дорослої сільськогосподарської птиці різних видів;

виявити особливості процесів перекисного окиснення ліпідів у тканинах птиці різних видів;

вивчити вплив мікотоксинів на антиоксидантну систему ембріонів і дорослих курей;

визначити можливість зниження токсичної дії мікотоксинів в організмі курей завдяки підвищенню антиоксидантного потенціалу їх організму.

Обєкт дослідження: кури, качки, гуси, індики, перепели та їх ембріони, кров, печінка, мозок та інші внутрішні органи.

Предмет дослідження: показники системи ПОЛ (перекисного окиснення ліпідів), А-, Е- та С-вітамінної забезпеченості організму птиці в динаміці.

Методи досліджень: спектрофотометричні, гематологічні - були проведені на аналізаторі "Sysmex" (Японія); стійкість еритроцитів до гемолізу вивчали на автоматичній установці "Kinetic Shapemeter SH-01" (Німеччина);

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виконано порівняльне вивчення динаміки активності антиоксидантних ферментів в ембріогенезі різних видів сільськогосподарської птиці, а також вмісту продуктів ПОЛ і жиророзчинних вітамінів. Показано, що на заключних етапах ембріогенезу, тобто перед виводом молодняку птиці, відбувається збільшення активності більшості антиоксидантних ферментів і накопичення основного жиророзчинного антиоксиданту клітини - -токоферолу.

У результаті проведених досліджень встановлено, що токсини, які вивчалися, є активатором перекисних процесів. Виявлено кореляційний звязок при мікотоксикозах курей між рівнем продуктів ПОЛ в організмі птиці та активністю антиоксидантних ферментів і вмістом вітамінів А, Е, С та каротиноїдів. Розроблено методику оцінки антиоксидантних властивостей різних форм вітамінів А, Е, каротиноїдів, мікроелементів та дослідження процесів ПОЛ при дії Т-2 токсину в умовах in vitro на клітинах ембріонального мозку курей. Встановлена мінімальна концентрація Т-2 токсину, яка здатна активувати процеси ліпопероксидації. Дані, які висвітлюють одночасно інтенсивність ПОЛ і показники антиоксидантної системи крові курей у динаміці аліментарного мікотоксикозу, отримані вперше. Визначено спроможність підвищених доз вітамінів Е, С та селену на фоні Т-2 токсикозу курей запобігати активації ПОЛ та їх різну біологічну активність щодо окремих ланок антиоксидантної системи крові та інших тканин. Вперше здобуто нові дані про те, що за допомогою мікроелементних композицій - препарату "Біотам" як профілактичного засобу, так і в умовах розвитку Т-2 токсикозу, в значній мірі підвищується антиоксидантний статус організму птиці, стабілізується стан клітинних мембран. Використання пробіотиків при Т-2 токсикозі сприяє значному поліпшенню біохімічних показників організму курей.

Теоретичне і практичне значення роботи. Встановлені характерні зміни стану показників про-антиоксидантної рівноваги та функціонального стану печінки при дії різних мікотоксинів, дають підстави використовувати їх як критерії оцінки ступеню розвитку токсикозу та детоксикаційної можливості вітамінних і мікроелементних препаратів. Одержані результати розширюють розуміння механізмів токсичної дії мікотоксинів як стимуляторів ПОЛ, що надійшли аліментарним шляхом до організму сільськогосподарської птиці, і можуть бути основою для розробки науково обґрунтованих схем детоксикації за допомогою різних кормових добавок. На основі одержаних результатів рекомендується використовувати при вільнорадикальних порушеннях, викликаних мікотоксинами, а зокрема Т-2 токсином, введення підвищених доз вітаміну Е, С, селену, мікроелементної композиції та пробіотиків: молочнокислих бактерій - Lactobacilus sp. та дріжджів Saccharomyces cerevisiae у вигляді добавок до раціону.

Особистий внесок здобувача. У закінченій дисертаційній роботі особисто здобувачеві належать: проведення порівняльного вивчення динаміки активності антиоксидантних ферментів, вмісту продуктів ПОЛ і жиророзчинних вітамінів в ембріогенезі і ранньому постнатальному онтогенезі різних видів сільськогосподарської птиці; пошук критеріїв для поглиблення оцінки мікотоксикозів за умов аліментарного надходження токсинів.

Дослідження гемолізу еритроцитів проводилися спільно з к.б.н. Узленковою Н.Є. (Інститут медичної радіології АМНУ, м. Харків), препарат "Біотам" розроблено разом з д.х.н. Григор'євою А.С. та к.х.н. Канахович Н.Ф. (Інститут фармакології та токсикології АМНУ, м. Київ), що знайшло відображення в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. За основними положеннями дисертаційної роботи зроблено доповіді на Міжнародній конференції "Біологічні основи живлення сільськогосподарських тварин" (Львів-1998); Міжнародній конференції "Проблеми виробництва екологічно чистої продукції" (Житомир-2000); Науково-практичній конференції молодих вчених "Актуальні проблеми фармакології та токсикології" (Київ-2000); ІІІ та IV-й Українській конференції по птахівництву з міжнародною участю (Алушта - 2001, 2003).

Результати наукових досліджень доповідалися на засіданнях вченої ради в Інституті птахівництва УААН (1998-2001 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковано в 19-ти друкованих працях у наукових виданнях: 10-ти статтях та 9-ти матеріалах і тезах.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація містить 152 сторінки машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, чотирьох розділів, у яких представлені результати експериментальної роботи та їх обговорення, загального висновку, висновків і списку використаних джерел, у якому приведено 250 робіт вітчизняних і зарубіжних дослідників. Робота ілюстрована 15-ма рисунками і містить 43 таблиці.

Основний зміст роботи

Схема досліджень. Проведено експерименти на ембріонах і дорослій птиці: курях породи род-айленд, індичках білої широкогрудої породи, гусаках великої сірої породи, качках української сірої породи, японських перепелах.. Відбір проб проводили в ключові дні розвитку ембріонів: замикання алантоїсу, перехід живлення ембріона з білкового типу на жовтковий, перехід ембріону на легеневий тип дихання, а також перенос яєць на вивід в залежності від їхнього виду.

За умов вивчення особливостей впливу різних мікотоксинів: Т-2 токсину, зеараленону й аурофузарину на антиоксидантну систему курей-несучок при аліментарному їх надходженні до організму було сформовано 4 групи курей. Контрольна 1-а група одержувала стандартний комбікорм. У раціони дослідних груп курей-несучок мікотоксини були введені за наступною схемою: кури 2-ї групи одержували Т-2 токсин (10 мг/кг корму); кури 3-ї групи - аурофузарин (880 мг/кг корму), кури 4-ї групи - зеараленон (1,6 мг/кг корму).

Проведення на фоні розвитку Т-2 токсикозу порівняльних випробувань різних пробіотиків, зокрема культури Lactobacillus sp. і дріжджів Saccharomyces cerevisiae. 1 група - контроль; кури 2, 3, 4-ї груп одержували Т-2 токсин у кількості 6 мг/кг корму; кури 3-ї групи одержували культуру Lactobacillus sp.; кури 4-ї групи - дріжджі в кількості 20 млрд. клітин на голову.

Вивчення впливу підвищених доз вітамінів Е, С та Se (селеніт натрію). Було сформовано 5 груп курей за наступною схемою: 1-а група - контроль; кури 2-ї, 3-ї, 4-ї, 5-ї - одержували Т-2 токсин у кількості 6 мг/кг корму; 3-ї, 4-ї, 5-ї групи одержували Se у кількості 0,2 мг/кг корму; 3-ї групи - вітаміну С - 150 і вітаміну Е - 30 мг/кг корму; 4-ї групи -вітаміну С - 250 і вітаміну Е - 50 мг/кг корму; 5-ї групи - вітаміну С - 250 і вітаміну Е - 50 мг/кг корму, перші два тижні на фоні Т-2 токсикозу, а потім один тиждень без токсину.

Визначення впливу мікроелементних композицій в умовах ураження організму курей Т-2 токсином проводилося за наступною схемою: 1-а група - контроль; кури 2-ї, 4-ї, 5-ї груп одержували Т-2 токсин у кількості 6 мг/кг корму; кури 3-ї та 4-ї груп - препарат "Біотам" у кількості 20 мг/кг маси тіла; кури 5-ї групи - 100 мг/кг маси тіла.

Вивчення особливостей впливу нового препарату "Біотам-2" на антиоксидантну систему курей-несучок при Т-2 токсикозі, а також його вплив на продуктивні і відтворні якості курей. за наступною схемою: 1 група - контроль; кури 2-ї, 4-ї і 5-ї груп одержували Т-2 токсин у кількості 6 мг/кг корму; кури 3-ї і 4-ї груп - препарат "Біотам-2" у кількості 20 мг/кг маси тіла; кури 5-ї групи - препарат "Біотам-2" у кількості 20 мг/кг маси тіла протягом одного тижня до введення токсину і наступні три тижні на фоні Т-2 токсикозу.

Методи досліджень. Визначення вітамінів А, Е, С проводили як описано в роботі Сурая П.Ф., Іонова І.А. (1990), каротиноїдів (Frigg M. et al., 1992). Активність супероксиддисмутази (Чевари С. та ін., 1991), каталази (Королюк М.А. та ін., 1988), глутатіонпероксидази (Надіров Н.К. та ін., 1987), глутатіонредуктази (Панченко Л.Ф. та ін., 1975), глутатіонтрансферази (Younes M. et al., 1992), визначення вмісту дієнових кон'югатів (Стальная М.Д., 1977), малонового діальдегіду (Ohkawa H., 1979) глутатіону (Штурман Ц.М., 1979). Гематологічні показники були визначені на аналізаторі "Sysmex" (Японія). Гемоліз еритроцитів вивчали на установці Kinetic Shapemeter SH-01 (Німеччина).

Статистичну обробку проводили з використанням t-критерію Ст'юдента (Лакин Г.Ф., 1990) та непараметричного критерію U-Вілкоксона-Манна-Уітні (Глубер Е.В., Генкин А.А., 1973).

Результати досліджень

Динаміка вмісту вітамінів А, Е, С в організмі ембріонів різних видів птиці.

При вивченні видових особливостей вмісту вітаміну Е у печінці ембріонів сільськогосподарської птиці було відзначено, що його концентрація протягом ембріонального розвитку поступово зростає і досягає свого максимуму на виводі молодняку у першу добу життя (рис. 1).

Найвищою вона була у гусаків та перепелів. Показано, що динаміка накопичення цього природного антиоксиданту в ембріогенезі та ранньому постнатальному онтогенезі аналогічна всім вивченим видам птиці. Забезпечення адекватної антиоксидантної здатності, зокрема високої концентрації вітаміну Е в печінці на різних стадіях розвитку ембріонів, необхідно для захисту підвищеного рівня ненасиченості в ліпідах ембріонів. Збільшення концентрації вітаміну Е в ембріональних тканинах, що досягає максимальних величин до моменту виводу молодняку, розглядається в якості еволюційно-закріпленого пристосувального механізму захисту від кисневого стресу в момент виводу. Зміна ембріональної гіпоксії на відносну гіпероксію є еволюційно детермінованою і не в змозі викликати різке порушення гомеостазу. Вивчення динаміки накопичення вітаміну А в ембріогенезі і ранньому постнатальному онтогенезі сільськогосподарських видів птиці показало, що концентрація вітаміну А в печінці ембріонів гусаків і індиків була в 2-2,5 рази більше ембріонів курей і також постійно збільшується в процесі інкубації. Жовток курячих яєць не містить вітаміну С і C-вітамінна забезпеченість курей у процесі ембріонального розвитку підтримується за рахунок синтезу АК жовтковою мембраною. При вивченні динаміки накопичування та розподілу аскорбінової кислоти курчат в ембріогенезі було відзначено значне збільшення рівня вітаміну С у мозку курчат протягом 11-19-ї діб інкубації: з 130,5 до 665,4 мкг/г, згодом ця величина дещо знижувалася до рівня 603,2 мкг/г на 21-у добу інкубації, а у добових курчат становила 577,3 мкг/г (рис. 2). Особливої уваги заслуговують високі концентрації АК в мозку курчат у процесі їх ембріонального розвитку. Так, концентрація АК у даному органі переважала рівень цього вітаміну в ембріональній печінці курей у 3-5 разів. Максимальне підвищення концентрації АК у мозку виявлялося на 14-ту добу інкубації, що було аналогічно печінці. На момент виводу та до 9-ї доби постнатального розвитку концентрація вітаміну С в мозку зменшувалась, а в печінці збільшувалась. На 11-у добу розвитку вміст цього вітаміну в мозку та печінці був приблизно однаковим.

Тканинні особливості активності АО ферментів у ембріонів різних видів птиці.

Показано, що динаміка змін активності каталази і супероксиддисмутази в печінці ембріонів курей характеризується тенденцією до збільшенням її активності в процесі розвитку з різким і вірогідним (у 1,5-2,4 рази) збільшенням на останніх етапах ембріогенезу з піком на 20-добу розвитку ембріонів. Аналогічна динаміка була відзначена і для інших тканин, окрім мозку. За отриманими даними активність каталази мозку ембріонів курей з 14 по 20-ту добу розвитку поступово зменшувалась і залишалася на цьому рівні і у добових курчат. Згідно з наведеними даними, високу супероксиддисмутазну активність в органах і тканинах добових курчат слід розглядати як компенсаторний захист при переході від гіпоксії кінця ембріонального розвитку до відносної гіпероксії перших днів життя. У ранньому постнатальному онтогенезі супероксиддисмутазна і каталазна активність знижується, тоді як глутатіонпероксидазна активність збільшується. У наших дослідженнях було показано, що онтогенетичні особливості антиоксидантної системи ембріонів курей мають значні відмінності для печінки й мозку. Активність глутатіонпероксидази і каталази були відповідно вище в 2 і 9 разів в печінці порівняно з мозком. Активність глутатіонпероксидази збільшується в 2,6 рази з 14 по 21-у добу розвитку, і також збільшується у добових курчат на 14%, а активність СОД в мозку поступово знижується з 14 доби інкубації до виводу. В інших досліджених тканинах динаміка зміни активності СОД була аналогічною як у печінці. Динаміка змін активності каталази у печінці гусаків і особливо качок, як і ембріонів курей характеризується тенденцією до підвищення її активності в процесі розвитку з різким збільшенням на останніх етапах онтогенезу з піком при переході ембріону на легеневий тип дихання.

Аналогічна динаміка була відзначена і для інших тканин. У індиків такої закономірності не виявлено. Онтогенетичні особливості антиоксидантної системи ембріонів усіх вивчених видів мають значні відмінності для печінки й мозку. У мозку активність каталази протягом ембріогенезу поступово та повільно підвищувалась у всіх трьох видів птиці, а у добового молодняку відзначено зниження активності майже в 2 рази в порівнянні з ембріонами. Слід підкреслити, що активність каталази у печінці індиків і гусаків була в 6-7 разів більше, ніж у ембріонів курей. Це може бути пояснено значно меншим рівнем вітаміну Е, як природного антиоксиданту, у печінці індиків в порівнянні з курми.

Видові особливості розвитку ферментативної антиоксидантної системи ембріонів сільськогосподарської птиці.

При порівняльному аналізі активності досліджуваних ферментів у тканинах ембріонів різних видів птиці було показано, що практично в усіх видів птиці в печінці відзначається схожа динаміка їхніх змін. Так, активність каталази була найбільшою при переході ембріону на легеневий тип дихання. Менш виражено це було в ембріонів гусаків. Слід зазначити, що найбільша активність каталази (рис. 3) як при переході з білкового типу живлення на жовтковий, так і на виводі молодняку була у водоплавної птиці - качок і гусаків. Активність каталази у ембріонів перепелів була нижча активності ембріонів гусаків, качок, але вища, ніж у ембріонів курей. Протилежна тенденція спостерігається при порівнянні активності глутатіонпероксидази.

Показано, що при переході ембріону на легеневий тип дихання активність цього ферменту знижується більше, ніж у 2 рази, а при виводі - підвищується. Виняток складає показник активності GPx у ембріонів гусаків, де протягом усього досліджуваного періоду активність підвищується в 1,5 рази. Різна динаміка двох пероксидаз (каталази та GPx) у печінці, ймовірно, пояснюється тим, що GPx більш ефективно працює при низьких концентраціях перекисів, в той же час у захисті клітин від окисного стресу, викликаного високими концентраціями перекису водню, ключова роль належить каталазі. Таким чином, можна висловити припущення про те, що при переході ембріонів на легеневий тип дихання в печінці відбувається інтенсивне накопичення продуктів ліпопероксидації. Таким чином, відзначена в наших дослідженнях підвищена активність каталази та GPx і знижена активність СОД при формуванні антиоксидантної системи в ембріогенезі обумовлена специфічною функціональною активністю даної системи. Відзначено підвищення активності СОД у ембріонах перепелів на момент виводу. Особливої уваги заслуговує вивчення ферментативної активності антиоксидантної системи мозку в ембріогенезі. Так показано, що у мозку активність каталази переважає у ембріонів гусаків та качок у порівнянні із сухопутними видами, така ж закономірність була раніше описана й у печінці. У курей при переході ембріону на легеневий тип дихання активність каталази знижується і залишається на однаковому рівні аж до виводу. Активність GPx у мозку (рис.4) підвищується в усіх видів сільськогосподарської птиці. Можливо, це є особливістю обміну речовин, що властиве всій птиці в період ембріонального розвитку. При порівнянні активності СОД у мозку усіх видів сільськогосподарської птиці спостерігалася тенденція до зниження активності цього ферменту при переході ембріону на легеневий тип дихання і підвищення активності СОД на момент виводу.

Вплив Т-2 токсину, зеараленону, аурофузарину на інтенсивність ПОЛ та активність антиоксидантних ферментів курей. Практично всі три досліджувані мікотоксини виявили могутні прооксидантні властивості, що виражалися в достовірному збільшенні вмісту кінцевого продукту перекисного окислювання ліпідів - малонового діальдегіду (табл.1).

Таблиця 1 Вміст малонового діальдегіду в печінці курей у присутності різних токсинів на 30-ту добу введення, нМ /г

*- р 0,05; **- р 0,01; при U - 0,05; порівняно з контролем

Показано, що Т-2 токсин, аурофузарін і зеараленон викликають цілий ряд реакцій окисного стресу, під яким розуміють порушення тканинного балансу антиоксидантів і прооксидантів у бік останніх. Наслідком цього впливу є зниження або порушення функціонування захисних систем організму і розвиток окисного ушкодження тканини. Найбільший вплив на накопичення МДА було виявлено при Т-2 токсикозі, його концентрація була вище в 2 рази при нативних процесах ПОЛ і в 1,5 рази при стимуляції іонами Fe2+ і аскорбіновою кислотою.

Менш сильний вплив на процеси перекисного окиснення ліпідів, у порівнянні з Т-2 токсином, виявили аурофузарин і зеараленон. У проведених дослідженнях встановлено, що введення мікотоксинів у раціон курей активізує функціонування глутатіонової гілки антиоксидантного захисту організму, що виявляється у підвищенні активності ферментів при Т-2 токсикозі, зеараленон- і аурофузаринтоксикозі. Встановлено, що на 14-у добу введення токсинів (табл. 2) найбільша активність глутатіонзалежних ферментів відзначена при Т-2 токсикозі. Через 7 діб досліду зберігалася та сама тенденція, однак максимальна активність глутатіонпероксидази була в групі, що одержувала зеараленон. На 30-ій добі введення токсинів відзначається достовірне підвищення активності глутатіонпероксидази в 4 рази при Т-2 токсикозі і зеараленонтоксикозі. Слід зазначити, що з 14-ї до 30-ї доби введення токсинів, спостерігається достовірне постійне підвищення активності глутатіонпероксидази при Т-2 токсикозі. Активність глутатіонредуктази була найбільша в присутності у кормі Т-2 токсину.

Однак у групі, що одержувала зеараленон, на 30-у добу спостерігається зниження активності цього ферменту в порівнянні з 14-ю та 21-ю добами. Крім цього, встановлено підвищення активності глутатіонтрансферази. Відзначена більш висока активність цього ферменту в еритроцитах при зеараленонтоксикозі та Т-2 токсикозі. Однак, активність глутатіонтрансферази при зеараленонтоксикозі знижується на 30-у добу. Підвищення активності глутатіон-S-трансферази в присутності зеараленону та Т-2 токсину може бути використано як маркер при діагностиці цих мікотоксикозів.

Таблиця 2 Активність ферментів еритроцитів курей при мікотоксикозах

Встановлено, що у курей, які отримували з кормом досліджувані мікотоксини, рівень GSH в еритроцитах був вірогідно нижче контролю (табл. 3).

Таблиця 3 Вміст глутатіону в еритроцитах і печінці курей при мікотоксикозах

*- р 0,05; **- р 0,01; при U - 0,05; порівняно з контролем

Можливо, це пов'язано з активною витратою GSH у процесах антиокисного захисту, тому що відновлена форма глутатіону відіграє важливу роль у детоксикації різних токсинів в організмі. В проведених нами дослідженнях виявлено, що всі три досліджуваних мікотоксини викликають через місяць після початку введення значне зниження вмісту вітаміну А в печінці, що є основним місцем його депонування (табл. 4). Найбільш істотні зміни вмісту ретинолу в печінці були відзначені при Т-2- та аурофузаринтоксикозі, концентрація цього вітаміну не піднялася до початкового рівня навіть після 2-х тижневого виключення аурофузарину з корму. В той же час варто зазначити, що в перші 14 діб згодовування аурофузарину рівень вітаміну А не змінився, що, мабуть, пояснюється великими його запасами в печінці, а також захисною дією -токоферолу, рівень якого знизився у цій групі в цей період в 1,4 рази. Це свідчить про підвищену витрату вітаміну Е в якості антиоксиданту при активації процесів ПОЛ. Наступні відновні процеси в організмі призвели до того, що концентрація вітаміну Е поступово підвищувалася і через два тижні після зняття добавки аурофузарину практично досягла контрольного рівня. Після виключення токсинів з корму через 14 днів вміст вітамінів у печінці практично відновлювався, хоча при Т-2 токсикозі концентрація вітаміну Е залишалася все ж таки нижче контролю.

На прикладі мембран еритроцитів показано, що за умов дії аурофузарину, зеараленону та Т-2 токсину змінюються показники стійкості та проникності еритроцитарних мембран, їхні бар'єрні властивості й електричні характеристики за умов дії зовнішнього електричного поля.

Таблиця 4 Вміст вітамінів Е, А, С, каротиноїдів в печінці курей при введенні в корм мікотоксинів, мкг/г

*- р 0,05; **- р 0,01; при U - 0,05; порівняно з контролем

За тривалого введення аурофузарину, проникливість мембран еритроцитів різко збільшувалась, час гемолізу скорочувався відповідно в 1,4 та 1,1 рази (р 0,01). Незважаючи на відсутність вірогідних змін у кількості еритроцитів і вмісту гемоглобіну за умов досліду, відбувалися зміни морфометричного складу еритроцитів. Після дії токсину зростала неоднорідність популяції еритроцитів периферичної крові з переважанням макроформ на 14-ту і 21-у добу. Про це свідчать дані розподілу еритроцитів за об'ємом та діаметром (максимуми гістограм розподілу). Збільшення кількості макроцитів у крові може бути ознакою розвитку в організмі компенсаторної реакції еритропоезу на зміну фізіологічного стану організму за умов інтоксикації. Збільшувались також показники електричної сталості мембран еритроцитів в дослідній групі: сила струму та напруга пробою мембрани були значно вищі на 21-у добу введення аурофузарину. Вивчення функціонального стану мембран при дії низьких концентрацій зеараленону показало, що максимальні зміни проникності мембран і їхньої стійкості до дії гемолітика спостерігається на більш пізніх термінах вводу токсину. При зростанні концентрації гемолітика швидкість гемолізу зростала у цей термін в 1,5 рази. При цьому, показники електричної міцності мембран практично не змінилися.

Вплив Т-2 токсину та біологічно активних речовин в умовах in vitro.

Вивчення впливу Т-2 токсину на процеси ПОЛ показали, що Т-2 токсин не тільки в живому організмі, але й в умовах in vitro є активним стимулятором утворення кінцевого продукту ПОЛ - малонового діальдегіду. Встановлено, що концентрація Т-2 токсину в тканині мозку 5 10-6 викликає перекисне окиснення ліпідів, можливо ці концентрації є мінімальними, при яких спостерігається деструктивна дія Т-2 токсину, що виражається в порушенні фосфоліпідного матриксу біомембран клітин мозку. Максимальна концентрація МДА спостерігалася при концентрації Т-2 токсину 5 10-4 М. Стимулювання процесів ПОЛ Т-2 токсином показало, що він виявляє виражені прооксидантні властивості на рівні або вище ПОЛ при стимулюванні іонами Fe++ та аскорбінової кислоти. При дослідженні впливу на процеси ПОЛ різноманітних біологічно активних речовин (різних форм вітамінів Е, А, К, селену та каротиноїдів) було показано, що введення в середовище вітаміну Е знижувало ПОЛ у 2,5-3 рази. Аналогічну антиоксидантну дію виявили різні форми вітаміну А. Найбільш виражену антиоксидантну дію вітаміну Е було відзначено при використанні -токоферолу. Більш високі концентрації вітаміну Е в формі ацетату незначно знижують ПОЛ. У той же час навіть мінімальні концентрації спиртової форми вітаміну А знижують ПОЛ. Вітамін А-кислота знижує ПОЛ пропорційно до збільшення його концентрації в системі. Для порівняння дії Т-2 токсину, іонів Fe++ та аскорбату як ініціаторів ПОЛ та для зменшення негативної дії Т-2 токсину в систему були введені вітаміни Е та А. Як мінімальна так і максимальна концентрації вітаміну Е знижують ПОЛ у присутності в системі Т-2 токсину, а середні концентрації знижують окиснення у порівнянні з Т-2 токсином, але знаходяться вище рівня вільного процесу ПОЛ. Було показано, що вітамін А знижує ПОЛ у клітинах мозку як у формі кислоти, так і у формі спирту. Проте, спостерігається більш ефективне зниження ПОЛ при внесенні вітаміну А-кислоти. Крім того, було проведено порівняльне дослідження антиоксидантних властивостей деяких каротиноїдів в умовах in vitro. У наших дослідженнях було показано, що зеаксантин знижує ПОЛ у клітинах мозку найбільш ефективно, у порівнянні з іншими каротиноїдами. В цілому, лютеїн і зеаксантин, як два головних каротиноїди жовтка яєць і тканин птиці, виявили високу активність у їх антиоксидантному захисті.

Застосування пробіотиків при Т-2 токсикозі. Введення в комбікорм курей культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae призводить до деякого уповільнення процесу накопичення МДА, у випадку вільного окиснення ліпідів, тоді як при використанні інших стимуляторів окиснення, змін практично не було відзначено. Використання культур мікроорганізмів, як Lactobacillus sp., а в більшому ступені і дріжджів Saccharomyces cerevisiae, призвело до дворазового збільшення вмісту глутатіону, що свідчить про позитивний вплив даних пробіотиків на функціонування даної ділянки антиоксидантного захисту. Зниження запасів відновленого глутатіону істотно відбивається на активності всіх трьох досліджуваних глутатіонзалежних ферментів, що вірогідно підвищується при наявності в кормі Т-2 токсину і постійно росте протягом досліду. Особливо це наочно для глутатіонпероксидази, активність якої зросла з початку внесення токсину через три тижні в 3,6 рази. Це пояснюється, імовірно, тим, що підвищення концентрації органічних гідроперекисів при індукції процесів ПОЛ призводить до активації глутатіонпероксидазної реакції, що є основним джерелом окисленого глутатіону. У наших дослідженнях було показано, що використання культур дріжджів і Lactobacillus sp. призводило до зниження інтенсивності накопичення перекисних продуктів окиснення ліпідів, що нормалізувало активність глутатіонзалежних ферментів. Введення пробіотиків на фоні розвитку Т-2 токсикозу викликало достовірне збільшення міцності еритроцитарних мембран, найбільш виражено це проявилося після тритижневого використання дріжджів. Використання ж культури Lactobacillus sp. призводило до зниження інтенсивності гемолітичних процесів, викликаних Т-2 токсином, тільки на перших етапах її введення.

Використання підвищених доз вітамінів Е, С та селену при Т-2 токсикозі. В групі курей, що одержували Т-2 токсин, відзначено збільшення концентрації дієнових кон'югатів та МДА в еритроцитах, печінці і мозку. У групах, в яких додатково вводилися вітаміни, відзначено достовірне зниження продуктів ПОЛ, особливо воно виражено в мозку. У групі, що одержувала Т-2 токсин, активність ферментів збільшується в порівнянні з контролем, а в групах, де були введені вітаміни, відбувається зниження, при цьому чим вище доза вітамінів, що вводяться, тим помітніше відбувається зниження. Введення вітамінно-мінеральних добавок на фоні розвитку токсикозу значно стабілізує гематологічні показники крові. Було показано, що введення вітамінів на фоні Т-2 токсикозу сприяє підвищенню пулу відновленого і загального глутатіону до рівня контрольних значень. Для вивчення неферментативної гілки антиоксидантних процесів вивчали рівень вітамінів А, С та каротиноїдів у тканинах. Було показано, що при Т-2 токсикозі в печінці знижується рівень вітаміну А та каротиноїдів. У той же час спостерігається підвищення аскорбінової кислоти та її форм. Використання 5-ти кратної дози вітамінів Е, С сприяло підвищенню концентрації вітаміну А та каротиноїдів у печінці до рівня контрольних значень. Будь-яких закономірностей в рівні аскорбінової кислоти та її форм у печінці в 3-5 групах нами не було виявлено. Від 5-ти груп були зібрані яйця, що були закладені на інкубацію, для вивчення розвитку антиоксидантних процесів в ембріогенезі. Ці дослідження проводилися на ембріонах і добовому молодняку курей. У результаті проведених досліджень було показано, що у добового молодняку, отриманого від курей, що одержували Т-2 токсин, спостерігається активація процесів ПОЛ в печінці і мозку. У той же час у групах курей, де на фоні Т-2 токсикозу вводилися вітамінно-мінеральний комплекс, відзначається зниження рівня МДА як у печінці, так і в мозку, особливо це виражено в 5-й дослідній групі. Можна припустити, що кури, яким вводили підвищені дози вітамінів Е, С та селену, перед внесенням Т-2 токсину, мали підвищену резистентність організму до дії вільних радикалів, ініційованих Т-2 токсином, що відбилося на розвитку ембріонів. Активність глутатіонпероксидази як у мозку, так і в печінці ембріонів, що розвивалися з яєць курей, які одержували Т-2 токсин, була нижче від контролю. Звертає на себе увагу той факт, що в добовому віці у ембріонів дослідних груп активність цього ферменту вірогідно підвищується в печінці. У мозку ембріонів просліджується така ж тенденція, за винятком молодняку птиці від курей, що одержували Т-2 токсин, де активність вірогідно вище контролю й інших дослідних груп. Відзначено зниження активності каталази в печінці дослідних груп, що протягом усього досліду залишається нижче контрольних значень. Виражених змін активності антиоксидантних ферментів у ембріонів в групах курей, що одержували вітамінно-мінеральний комплекс на фоні Т-2 токсикозу, не виявлено. Рівень активності каталази в мозку ембріонів курей, що одержували Т-2 токсин, був нижче контролю, а в групі, що одержувала вітаміни і селен, активність ферменту була на рівні контролю. Така ж закономірність виявлялася у відношенні СОД у мозку і печінці. Показники активності ключових антиоксидантних ферментів дозволяють припустити, що існують різні механізми захисту тканин від ПОЛ в ембріогенезі. Можливо, сукупність цих факторів впливає на розвиток не тільки антиоксидантної системи, але і на розвиток інших систем, що виявляється в розвитку ембріональної патології і підвищеної смертності ембріонів курей при Т-2 токсикозі. Введення вітамінів Е, С і селену знижує рівень ембріональної смертності і сприяє більш стабільному розвитку ембріонів птиці.

Вплив мікроелементних композицій на антиоксидантний статус курей при Т-2 токсикозі. У результаті проведених досліджень встановлено, що на 21-у добу після введення Т-2 токсину, в печінці вірогідно підвищується вміст МДА на 37-52%, в мозку - на 16-23% і в еритроцитах - на 37-96% в порівнянні з контролем. При цьому найбільш чутливими відзначаються еритроцити. При спільному введенні Т-2 токсину і препарату "Біотам" відзначено значне зниження інтенсивності накопичення МДА: у гепатоцитах його вміст збільшився всього лише на 4-10%, у мозку - на 0,6…2,3% і в еритроцитах на 2,7…40% щодо контрольної групи, що було істотно нижче показників при введенні Т-2 токсину. Введення власне препарату "Біотам" в раціон курей призводило до зниження вмісту МДА в гепатоцитах на 9-19%, у тканинах мозку - він був на рівні контролю. Таким чином, препарат "Біотам" нівелював негативну дію Т-2 токсину на накопичення МДА в тканинах, виявляючи антиоксидантний ефект. З цією метою була вивчена динаміка вмісту МДА в еритроцитах при Т- 2 токсикозі і застосуванні препарату "Біотам". Протягом усього досліду при Т-2 токсикозі спостерігається підвищення вмісту МДА до 96 %, однак, на 14 добу помітно невелике зниження процесів ПОЛ до 14-22 %. Підтвердженням цього є дані про підвищений вміст дієнових кон'югатів у плазмі крові до рівня 17,58 1,07 мкг/ мл (р 0,01) в групі, що одержувала Т-2 токсин щодо контролю 9,35 1,18 мкг/ мл. Препарат "Біотам" при Т-2 токсикозі знижував рівень ПОЛ на 7-му добу на 15-25%, на 14-ту - на 17-30%, на 21-у - на 35-50%. При введенні 5-кратної дози препарату "Біотам" відзначено достовірне зниження ПОЛ до рівня контролю на 14-у добу досліду. Власне препарат "Біотам" сприяв підвищенню пулу відновленого глутатіону на 94%, а у випадку наявності у кормі Т-2 токсини підтримує його на рівні контролю. Особливо помітний захисний ефект "Біотаму" виявляється при введенні 5-кратної кількості цього препарату. При цьому звертає на себе увагу підвищення активності глутатіонтрансферази (GSH-S-T). Зменшення вмісту відновленого глутатіону і збільшення активності GSH- S-T свідчить про підвищення кон'югації трипептиду з алкіруючим агентом, що викликає утворення відповідних кон'югатів на ранніх термінах надходження токсину в організм. Можливо, зниження рівня відновленого глутатіону може бути пояснено й утворенням тіолових кон'югатів з різними формами Т-2 токсину. Не виключена можливість, крім ферментативного зв'язування, і прямої взаємодії відновленого глутатіону з Т-2 токсином. Посилення активності GSH- S-T пояснюється також тим, що фермент відіграє стабілізуючу роль у підтримці клітинного пулу відновленого глутатіону, що необоротно витрачається у процесі кон'югації з Т-2 токсином і вільними радикалами, які утворилися у результаті ліпорероксидації. У 4-5 групах, де вводився препарат "Біотам" разом з Т-2 токсином, відзначалося також підвищення активності цього ферменту, але вона була значно нижче, ніж у групі, що одержувала Т-2 токсин. При введенні препарату відзначалося підвищення відновленої форми глутатіону у всіх досліджуваних тканинах і нормалізація активності глутатіонзалежних ферментів в еритроцитах. При більш тривалому використанні препаратів, відбувалася нормалізація показників кислотного гемолізу. Таким чином, внесення препарату "Біотам" у раціон батьківського стада птиці, впливає на інтенсивність процесів ПОЛ тканин курей та їхніх ембріонів, і в кінцевому результаті на життєздатність курчат.