Склад бактерій в 10-км зоні ЧАЕС і їх стійкість до гамма-випромінювання та інших стресових факторів

Ґрунти дерново-підзолисті; глибина відбору 2 см.

Ці результати свідчать, що загальна чисельність хемоорганотрофних бактерій у зразках ґрунту 10-км зони ЧАЕС була на 1-2 порядки нижчою проти контрольних. Виняток складали тільки метилобактерії, чисельність яких була того ж порядку, що і в контрольних ґрунтах. Чисельність сульфатредукуючих, залізоредукуючих, целюлозоруйнуючих і нітріфікуючих бактерій у ґрунтах 10-км зони також була меншою на 1-3 порядки проти контрольних ґрунтів (табл. 1). Кількість домінуючих видів хемоорганотрофних бактерій у ґрунтах 10-км зони ЧАЕС була також нижчою, ніж у контрольних зразках. Наприклад, у зразку, який було відібрано біля мертвого лісу, відомого як "Рудий Ліс", домінувало тільки два види бактерій, у той час як у контрольних ґрунтах - 5-7. В усіх досліджених зразках 10-км зони ЧАЕС було виявлено різні види метилотрофних бактерій (Methylobacterium extorquens, M. mesophilicum і M. organophilum) та бацил (Bacillus cereus, B. subtilis, B. polymyxa). Також було ізольовано псевдомонади, міксобактерії, актинобактерії. Частота трапляння метилобактерій та бацил у зоні відчуження становила 1,0; стрептоміцетів - 0,9; нокардіє- та корінеформ - 0,8; псевдомонад - 0,3.

Одержані дані дозволили нам розрахувати індекси видової різноманітності хемоорганотрофних бактерій у ґрунтах зони ЧАЕС, які, як показано, в ґрунтах зони ЧАЕС були набагато нижчими, ніж у контрольних ґрунтах.

У деяких ґрунтових зразках 10-км зони спостерігався нетиповий розподіл бактерій за горизонтами. Показано, що на глибині 8-10 см загальне число бактерій у ґрунтах 10-км зони було вищим, ніж у поверхневому прошарку ґрунту. Одним із можливих пояснень цього може бути істотне зменшення радіоактивності ґрунту в більш глибоких горизонтах.

Загалом, мікробіологічний аналіз ґрунтів 10-км зони, проведений у 1995-1996 рр., засвідчив, що якісний та кількісний склад хемоорганотрофів та досліджених фізіологічних груп бактерій у них бідніший, ніж поза зоною. Тобто в ґрунтах зони ЧАЕС відбулося зменшення кількості ґрунтових бактерій, і навіть у 1995 р. спостерігався спад мікробної різноманітності. В результаті проведеної роботи було створено колекцію бактерій, ізольованих із 10-км зони ЧАЕС, яка налічує 90 штамів і представлена штамами метилобактерій, бацил, псевдомонад, а також коріне- та нокардієбактеріями.

2. Генетична мінливість метилотрофних бактерій, ізольованих із 10-км зони ЧАЕС. Вище показано що кількісний та якісний склад бактерій роду Methylobacterium у зразках ґрунтів 10-км зони ЧАЕС не відрізнявся істотно від такого зі зразків ґрунту з природним радіоактивним фоном. Ми припустили, що одним із механізмів, що забезпечує виживання бактерій в умовах підвищеного рівня радіації, може бути їх генетична мінливість. У зв'язку з цим ми дослідили швидкість виникнення мутантів у штамів Methylobacterium. За допомогою флуктуаційного тесту показано, що стійкі до формальдегіду (ForR) і стрептоміцину (StrR) мутанти мають спонтанну природу мутації. Встановлено, що швидкість виникнення ForR мутантів у деяких штамів Methylobacterium була високою і досягала >10-8 на одну генерацію однієї клітини. В той же час швидкість виникнення StrR мутантів була меншою і становила 10-10-10-9. Тобто однозначної відповіді, чи характеризуються досліджені штами Methylobacterium високою генетичною мінливістю, ми не одержали. Внаслідок цього ми вивчали також й інші механізми, які, на наш погляд, могли сприяти виживанню бактерій в екстремальних умовах зони відчуження. Це їхня стійкість насамперед до г-радіації та до інших стресових факторів.

3. Вивчення чутливості бактерій до стресових факторів. Вивчення якісного та кількісного складу ґрунтових бактерій у 10-км зоні ЧАЕС дозволило припустити, що виживання бактерій зумовлене їхньою резистентністю до іонізуючого випромінювання. Тому ми вивчали чутливість бактерій, які було виділено з екосистем 10-км зони ЧАЕС, до дії г-випромінювання, а також УФ, дегідратації та перекису водню. Вибір даних стресових факторів базувався на тому, що вони, впливаючи на бактеріальну клітину, викликають пошкодження різних клітинних структур та важливих макромолекул (насамперед ДНК).

Як свідчать результати, доза близько 5 кГр виявилася сублетальною (ЛД99,99) для двох штамів (M. mesophilicum 8-18 та M. extorquens 19ч), які було ізольовано з 10-км зони ЧАЕС. Для контрольних штамів Methylobacterium (19Sр і Ч8) сублетальними були дози -опромінювання 6,2 та 4,5 кГр, відповідно. Рівень резистентності штамів не залежав від того, були вони виділені з ґрунтів зони ЧАЕС чи поза зоною. В одних випадках штами, ізольовані з 10-км зони, були більш стійкі, проти контрольних, в інших - навпаки. Це ж саме можна стверджувати і щодо резистентності епіфітних та ґрунтових метилобактерій. Штами Bacillus виявилися найбільш резистентні до -випромінювання: значення ЛД99,99 було вищим за 10 кГр. Резистентність штамів Bacillus subtilis 17-16, 28-95 і 11А не залежала від місць їх природного існування. Аналогічні закономірності спостерігалися і стосовно штамів Bacillus cereus (штами 15-2, 18К із 10-км зони ЧАЕС та 5Д із контрольних зразків).

Менш стійкі до -опромінювання були Myxococcus sp. 24К (ЛД99,99 складала 2,4 кГр) та нокардієформи, як ті, що були ізольовані з ґрунтів 10-км зони ЧАЕС (штам 17-3), так і виділені з контрольних ґрунтів (штам 9-5Н): ЛД99,99 їх становила 1-2 кГр. Псевдомонади, ізольовані із 10-км зони ЧАЕС та з контрольних ґрунтів, були найбільш чутливі до -опромінювання.

Як видно, графіки залежності виживання штамів Methylobacterium та Bacillus від дози -опромінювання мають "плече" на початкових відрізках кривої. Порогові дози для штамів Methylobacterium становили 1,1-2,2 кГр, для штамів Bacillus - 1,5-2,0 кГр. Форму кривої виживання бактерій після дії - або УФ випромінювання (експоненціальна або сигмоїдна) пов'язують з активністю процесів репарації сублетальних променевих пошкоджень клітинних структур та ДНК. Чим більше "плече" у сигмоїдної кривої, тим вища доза опромінювання (порогова доза), до якої радіаційні сублетальні пошкодження можуть репаруватись, і, відповідно, вища радіорезистентність бактерій. Така інтерпретація кривих виживання і, зокрема, порогової дози, є загальноприйнятою і широко використовується у дослідженнях радіостійкості як еукаріот, так і прокаріот (Корогодін, 1986, Ярмоненко, 1984, Гродзинський, 2000). Високі порогові дози штамів Methylobacteriumш та Bacillus свідчать про наявність у них ефективних механізмів репарації сублетальних променевих пошкоджень. В той же час, криві виживання штамів Pseudomonas після -опромінювання характеризувались експоненціальним зниженням, що свідчить про недостатньо ефективну репараційну здатність цих бактерій.

Таким чином, усі досліджені штами Methylоbacterium та Bacillus subtilis і B. cereus були високорезистентні до -радіації. Дозові криві виживання цих бактерій розташовані компактно і вкладаються в досить вузькі межі (рис. 3). У цих межах рівень радіорезистентності у штамів Methylоbacterium та Bacillus subtilis і B. cereus не залежав від місць їх природного існування (тобто радіоактивно забруднена 10-км зона ЧАЕС чи контрольні регіони з фоновим рівнем радіації).

Результати виживання бактерій після УФ опромінювання свідчать, що штами Methylobacterium та Bacillus були резистентні до більш високих доз УФ опромінювання, ніж інші бактерії (рис. 4, табл. 3). Значення ЛД99,99 для штамів Methylobacterium становило 280-380 Дж/м2. Досліджені штами Methylobacterium були резистентні до УФ опромінювання незалежно від рівня радіоактивності в місцях їх існування (екосистеми ЧАЕС чи контрольні регіони). Величина ЛД90 для колекційних штамів та ізолятів із зони варіювала від 120 до 165 Дж/м2.

Також стійкі до УФ опромінювання були всі штами Bacillus cereus та Bacillus subtilis, ізольовані з ґрунтів 10-км зони ЧАЕС, та колекційні штами. Рівень їх резистентності не залежав від того, чи були вони виділені з ґрунтів зони ЧАЕС чи поза зоною. Менш стійкі до УФ були представники корінеформ. Дуже чутливі до УФ були псевдомонади.

Порогові дози УФ для штамів Methylobacterium становили від 70 до 105 Дж/м2, для штамів Bacillus - 30-45 Дж/м2, що свідчить про високу здатність цих бактерій до репарації променевих сублетальних ушкоджень. У той же час для штамів Pseudomonas та нокардієформ порогову дозу неможливо було розрахувати, оскільки дозові криві виживання мали експоненціальний характер. Відсутність “плеча” свідчить про низьку репараційну спроможність цих бактерій.

Крім стійкості до г- та УФ випромінювання, ми вивчали також резистентність бактерій і до інших стресових факторів, таких як дегідратація та перекис водню. Дані літератури свідчать, що екстремально радіорезистентні бактерії, наприклад Deinococcus radiodurans, характеризуються високою стійкістю і до дегідратації. Як тільки що було показано, деякі досліджені нами бактерії були резистентні до г-випромінювання. У зв'язку з цим ми припустили, що вони мають бути стійкі і до дегідратації. Стійкими до дії цього чинника ми вважали бактерії, виживання яких після дегідратації знижувалося в межах одного порядку (від 100% до 10%) (Mattimore, Battista, 1996). Проведені нами дослідження показали, що штами Methylobacterium та Bacillus резистентні до дії дегідратації незалежно від місць їх природного існування: зона відчуження ЧАЕС чи контрольні регіони. Рівень їх виживання після дегідратації складав 50-90 % від вихідної кількості бактерій. Стійкі до дії дегідратації були також Myxococcus sp. 24К, виживання якого після дії цього чинника складало 33%, та представники актинобактерій (нокардієформи та корінеформи), виживання яких складало 10-14%. Більш ніж 99% клітин виявилися нежиттєздатними після дегідратації у штамів Pseudomonas sp.

Відомо, що іонізуюче опромінювання діє на організми через продукти радіолізу води, які представлені вільними радикалами, активними формами кисню і токсичними перекисними сполуками. Ми припустили, що бактерії, які перебували під впливом радіації в зоні відчуження, мають бути стійкі до перекису водню. Дійсно, всі досліджені види Methylobacterium, а також бацили, були стійкі до дії цього чинника. Деякі актинобактерії після 5-хв експозиції з 0,1М Н2О2 мали таку ж резистентність. Для псевдомонад концентрація 0,1М Н2О2 була летальною.

Таким чином, порівняльний аналіз показав, що бактерії, стійкі до дії -випромінювання, були також резистентні й до дії УФ, дегідратації та перекису водню. Рівень резистентності штамів одних і тих самих видів бактерій до -радіації, а також до інших стресових факторів, не залежав від місця їх природного існування. Резистентність бактерій до різних стресових факторів передбачає наявність у них активних систем репарації сублетальних пошкоджень клітинних структур та важливих макромолекул (насамперед ДНК). Усе це дає змогу стверджувати, що стійкість бактерій до таких чинників - це функціонально пов'язані властивості.

4. Дія стресових факторів на різноманітність бактерій у ґрунтах. Вивчення дії стресових факторів на чисті культури бактерій дозволило припустити, що і в природних умовах під дією цих чинників (наприклад, періодична засуха, УФ тощо) також буде зменшуватись кількість бактерій або навіть зникнуть деякі види, як це мало місце в зоні ЧАЕС під дією радіації. Тому ми вивчали дію дегідратації та УФ на спектр бактеріальних видів у ґрунтових зразках. Крім того, як показано вище, досліджені нами радіорезистентні бактерії виявилися стійкими до дегідратації. У кінцевому рахунку в цьому досліді нас цікавила обернена закономірність, чи будуть бактерії, резистентні до дегідратації, стійкими до г-опромінювання. З'ясовано, що до дегідратації ґрунтового зразка загальна кількість бактерій на ГКА коливалась у межах 0,7107-1,3108 КУО/г ґрунту, а метилобактерій на середовищі з метанолом - 2102-3104 КУО/г ґрунту. В середньому в одному зразку виявляли 4-5 родів бактерій. Як приклад у таблиці 5 наведено спектр бактеріальних таксонів, виявлених в одному зі зразків. У зразках ґрунту до дегідратації переважали Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Enterobacter, корінебактерії. Після дегідратації на два-три порядки знизилась загальна кількість бактерій та зменшилась кількість видів, які переважали до дії цього чинника: не вижили представники родів Pseudomonas та Enterobacter.

У той же час у ґрунтових зразках було виявлено інші бактерії, яких не було знайдено до дегідратації (Myxococcus sp., корінеформи, нокардієформи, один із видів Bacillus), і практично не змінилась чисельність метилобактерій.

Після дегідратації зразків ґрунту також різко зросла частка (вміст у відсотках) деяких малочисельних видів бактерій, наприклад Methylobacterium еxtorquens, Bacillus cereus. Більше того, частка Myxococcus sp. і одного з видів Bacillus, яких зовсім не було знайдено в ґрунті до дегідратації, після дії цього чинника становила 21% і 29%, відповідно. Після УФ опромінювання ґрунтових зразків одержано аналогічні результати щодо змін якісного та кількісного складу бактерій.

Далі у чистих культур бактерій, які вижили після дегідратації ґрунтових зразків, визначали стійкість до г-опромінювання. Одержані результати показали, що штами Methylobacterium extorquens, M. mesophilicum, Bacillus subtilis, B. cereus, які було ізольовано після дегідратації ґрунтових зразків, характеризувались високою резистентністю до г-опромінювання (ЛД99,99 складала 5-10 кГр). Менш стійкими до г-опромінювання були міксобактерії та нокардієформи (ЛД99,99 складала 1-3 кГр).

Таким чином, аналіз впливу дегідратації та УФ опромінювання на різноманітність бактерій в ґрунтах показав, що після дії цих чинників (і) знизилась загальна чисельність бактерій; (іі) значно зменшилась частка тих видів бактерій, які переважали в ґрунтовому мікробному ценозі; (ііі) збільшувалось відносне багатство актинобактерій та бацил.

Разом з тим після дегідратації та УФ опромінювання у ґрунтах було виявлено види бактерій, яких не було знайдено до дії цих чинників. Більше того, деякі з них після дегідратації або УФ опромінювання ґрунту ставали домінантними. Виявлення таких “прихованих” видів дозволяє повніше оцінити мікробну різноманітність. Крім того, дегідратація дає можливість виявити радіорезистентні бактерії.

генетичний бактеріальний радіація

Висновки

1. У 10-км зоні ЧАЕС загальна чисельність ґрунтових бактерій на 1-3 порядки нижча, а кількість їх видів на 30-40 % менша проти ґрунтів поза зоною. Отже, після катастрофи на ЧАЕС у зоні відчуження відбувся спад мікробної різноманітності. Частота, з якою трапляються в 10-км зоні ЧАЕС метилобактерії та бацили, становила 1,0; стрептоміцети - 0,9; нокардіє- та корінєформи - 0,8; псевдомонади - 0,3.

2. У ґрунтах 10-км зони ЧАЕС кількісно переважали види бактерій, які були резистентними до г-опромінювання. У видів Methylobacterium extorquens, M. mesophilicum, Bacillus subtilis та B. сereus рівень -резистентності штамів не залежав від місць їх природного існування.

3. Резистентні до г-опромінювання штами Methylobacterium extorquens, Methylobacterium mesophilicum, Bacillus subtilis, B. сereus були також стійкими і до УФ опромінювання, дегідратації, перекису водню, що свідчить на користь гіпотези про неспецифічну резистентність клітин, а саме про те, що бактерії, резистентні до г-опромінювання, мають бути стійкими й до інших стресових факторів.

4. Серед представників Methylobacterium, ізольованих з різних екосистем (зони ЧАЕС та поза зоною, з ґрунтів чи філосфери рослин), не було знайдено штамів, чутливих до -опромінювання, до УФ, перекису водню, дегідратації. Внаслідок цього можна стверджувати, що стійкість до даних чинників - це специфічна ознака роду Methylobacterium.

5. Серед бацил, ізольованих із зони ЧАЕС та поза зоною, виявлено види, резистентні до -, УФ опромінювання, перекису водню, дегідратації (Bacillus subtilis, B. сereus), а також види, чутливі до цих чинників (B. polymyxa). Резистентність до цих факторів у актинобактерій була нижчою у порівнянні з Bacillus subtilis, B. сereus та метилобактеріями і коливалася в широких межах у різних штамів. Серед псевдомонад виявлено тільки чутливі до цих факторів штами.

6. Аналіз дозових кривих виживання після дії - та УФ опромінювання штамів Methylobacterium, Bacillus subtilis, B. cereus свідчить про наявність у них активних систем репарації сублетальних променевих ушкоджень, що й визначило їх високу радіорезистентність, а також дозволило вижити на радіаційно забруднених територіях ЧАЕС.

7. Дегідратація або УФ опромінювання ґрунтів призводить до зниження загальної чисельності ґрунтових бактерій та до зменшення кількості видів, які домінували. В результаті відбувається перерозподіл процентного співвідношення видів, а також виявляються види, яких не було знайдено до дії цих чинників, що дозволяє більш повно оцінити мікробну різноманітність.

8. Дегідратація ґрунтових зразків дає можливість виявити радіорезистентні бактерії.

Література

1. Романовская В.А., Соколов И.Г., Малашенко Ю.Р., Рокитко П.В. Мутабильность эпифитных и почвенных бактерий рода Methylobacterium и их резистентнось к ультрафиолетовому и ионизирующему излучению//Микробиология. - 1998. - Т. 67, № 1. - С. 106 - 115.

2. Романовская В.А., Соколов И.Г., Рокитко П.В., Чорная Н.А. Экологические последствия радиоактивного загрязнения для почвенных бактерий в 10-км зоне ЧАЭС // Микробиология. - 1998. - Т. 67, № 2. - С. 274 - 280.

3. Романовская В.А., Рокитко П.В., Малашенко Ю.Р., Криштаб Т.П., Чорная Н.А. Чувствительность к стрессовым факторам почвенных бактерий, изолированных из зоны отчуждения ЧАЭС// Микробиология. - 1999. - Т. 68, № 4. - С. 534 - 539.

4. Романовская В.А., Рокитко П.В., Малашенко Ю.Р., Криштаб Т.П., Чорная Н.А. Облучение почвенных образцов ультрафиолетом как модель действия стрессовых факторов на разнообразие бактерий в почвенных экосистемах// Микробиология. - 1999. - Т. 68, № 4. - С. 540 - 546.

5. Романовская В.А. Рокитко П.В. Малашенко Ю.Р. Уникальные свойства высокорадиоустойчивых бактерий // Микробиол. журнал. - 2000. - Т. 62, № 1. - С. 40 - 63.

6. Романовская В.А., Рокитко П.В., Михеев А.Н., Гуща Н.И., Малашенко Ю.Р., Черная Н.А. Влияние -излучения и дегидратации на выживаемость бактерий, изолированных из зоны отчуждения Чернобыльской АЭС // Микробиология. - 2002. - Т. 71, № 5. - С. 705 - 712.

Размещено на Allbest.ru