Характеристика антифунгальної активності синтетичних порфіринів

Размещено на http://www.allbest.ru

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА «ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ»

РУСАКОВА МАРІЯ ЮРІЇВНА

УДК 615.322:615.282

ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИФУНГАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ СИНТЕТИЧНИХ ПОРФІРИНІВ

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків-2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Проблемної науково-дослідної лабораторії синтезу лікарських препаратів та на кафедрі мікробіології і вірусології Одеського національного університету імені І.І. Мечникова МОН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Філіпова Тетяна Олегівна, Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова, професор кафедри мікробіології і вірусології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Філімонова Наталія Ігорівна, Національний фармацевтичний університет МОЗ України, професор кафедри мікробіології, вірусології та імунології;

доктор біологічних наук, професор Руденко Адель Вікторівна, Інститут урології АМН України, завідуюча лабораторії мікробіології, вірусології та мікології.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України» (61057, Харків, вул. Пушкінська, 14-16).

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 С. В. Бруснік

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні роки пильний інтерес дослідників до вивчення представників мікроскопічних грибів, зокрема дріжджів та дріжджоподібних грибів, обумовлений декількома факторами.

Насамперед, це пов'язано із зростанням етіологічної ролі дріжджоподібних грибів як збудників мікозів людини; з різким послабленням імунної системи людини на тлі впровадження в практику нових досягнень медичної науки, а також зміною навколишнього середовища (Pfaller M.A., Diekema D.J., Messer S.A. et al., 2003). Різко змінилась не тільки частота виникнення мікозів, але й форма їх перебігу (Garber G., 2001). Також для мікозів, зокрема кандидозів, не існує задовільних методів лікування - існуючі офіциальні протигрибні препарати не завжди достатньо ефективні, що обумовлено виникненням резистентних штамів, токсичним впливом на весь організм людини (Marr K.A., Lyons C.N., Ha K. et al., 2001). От чому дуже актуальною є розробка нетоксичних фунгіцидних препаратів.

По-друге, вдосконалення методів дослідження мікроорганізмів відіграє величезну роль у використання дріжджоподібних грибів у якості об'єктів експериментальної біології та медицини. Для відповіді на фундаментальні питання про складні біологічні процеси необхідні прості моделі, отримані на яких дані було би легко інтерпретувати (Lovell W.W., 2000). У наші дні технічне вдосконалення культури тканин та інших тест-систем іn vіtro доводить, що застосування тварин не є єдино можливим вибором при дослідженні терапевтичних препаратів (Філіпова Т.О., Русакова М.Ю., Галкін Б.М., 2003). Два основних фактори даного процесу (тривалість та вартість) стимулюють розробку універсальних методів для первинного визначення біологічної активності сполук іn vіtro.

Фотодинамічна терапія є доволі ефективною для лікування злоякісних пухлин, але в теперішній час даний метод також починає використовуватися при деяких захворюваннях вірусної, бактеріальної та грибкової етіології (Bertoloni G., Rossi F., Valduga G. et al., 1992; Wainwright M., 2000). Одним з основних компонентів даного методу є фотосенсибілізатори (ФС) - біологічно активні речовини, які здатні поглинати енергію світлового випромінювання, після чого запускати процеси, що призводять до селективної загибелі клітин, з якими вони взаємодіють. Величезна кількість синтетичних сенсибілізаторів розробляється на основі порфіринів, що сприяє пошуку прискорених методів оцінки їх фотосенсибілізуючої активності (ФСА) (Красновский А.А., 2004; Dougherty T.J., 2002).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі мікробіології та вірусології Одеського національного університету імені І.І. Мечникова та пов'язана з тематичними планами науково-дослідной роботи держбюджетної теми “Комплексне вивчення механізмів дії природних та синтетичних порфіринів на клітини” (№ держреєстрації 0101U001594). Дисертантом проведено дослідження щодо розробки нової тест-системи для визначення біологічної активності нових сполук порфіринового ряду та проведене дослідження їх впливу на культури еукаріотичних клітин. Тему дисертаційної роботи було затверджено на засіданні Вченої ради біологічного факультету Одеського національного університету (протокол № 2 від 13.10.01 р.).

Мета та задачі дослідження. Мета роботи - вивчення антимікотичної активності нових фотосенсибілізаторів порфіринового ряду та порівняння їх ефективності в культурі пухлинних клітин.

Виходячи з мети даної роботи були поставлені наступні задачи:

1. Вивчити чутливість культур дріжджових клітин C.albicans, S.cerevisiae, R.bogoriensis до нових синтетичних ФС на основі порфіринів іn vіtro.

2. Встановити рівень темнової активності нових тетрапірольних сполук щодо дріжджових клітин.

3. Дослідити загальну характеристику надходження порфіринових сполук в клітини тест-культур in vitro та вплив на цей процес світлового опромінення.

4. Визначити характеристику інактивації клітин C.albicans ефективними ФС.

5. Вивчити рівень антифунгальної активності досліджуваних ФС щодо клінічних штамів дріжджоподібних грибів, які характеризуються підвищеною резистентністю до офіційних антимікотиків.

6. Охарактеризувати взаємодію ФС з пухлинними клітинами аденокарциноми Ерліха (АКЕ) іn vіtro.

7. Порівняти форми загибелі клітин C.albicans та АКЕ при опроміненні в присутності ефективних фотосенсибілізаторів.

Об'єкт дослідження - антифунгальна активність, темновий вплив та особливості взаємодії порфіринових фотосенсибілізаторів з еукаріотичними клітинами. дріжджовий пухлинний клітина фотосенсибілізатор

Предмет дослідження - чутливість дріжджоподібних грибів C.albicans, S.cerevisiae, R.bogoriensis, а також відповідних клінічних штамів, до синтетичних похідних мезо-заміщених порфіринів та їх металокомплексів.

Методи дослідження - біологічні, мікробіологічні, математичні.

Наукова новизна отриманих результатів.

1. Уперше встановлено чутливість C.albicans, S.cerevisiae та R. bogoriensis до двадцяти восьми мезо-заміщених сполук тетрапірольного ряду, які не мають світових аналогів.

2. Проведений спрямований відбір нових похідних з високим антифунгальним потенціалом за їх ФСА.

3. Уперше показано, що C.albicans та S.cerevisiae однаково чутливі до дії тих самих вільних основ та металокомплексів, у той час як клітинам R.bogoriensis притаманні деякі особливості.

4. Уперше встановлено, що пошкоджуюча дія сенсибілізаторів спостерігається не тільки одразу після їх взаємодії з клітинами C.albicans, але виявляється і у наступних поколіннях.

5. Уперше доведено, що однією з форм загибелі дріжджоподібних грибів за умов фотосенсибілізуючого впливу синтетичних порфіринів є апоптоз.

6. Показано, що клінічні штами C.albicans, S.cerevisiae та R.bogoriensis, характеризуються високою чутливістю до ефективних ФС, рівень якої не залежить від антибіотикорезистентності цих мікроорганізмів.

7. Уперше проведено порівняння ФСА сполук щодо дріжджоподібних грибів та АКЕ, яке свідчить про значну схожість чутливості пухлинних клітин та культур C.albicans і S.cerevisiae, а також процесу надходження та форми клітинної загибелі під впливом відповідних похідних.

Практичне значення отриманих результатів. Результати дослідження дозволили відібрати чотири найбільш ефективні синтетичні ФС з високим рівнем антифунгальної активності щодо C.albicans, S.cerevisiae та R. bogoriensis, перспективних для подальшого дослідження. Виявлені основні напрямки подальшої структурної модифікації даних сполук з метою отримання нових препаратів для фотохіміотерапії, зокрема поверхневих мікозів. Тотожність результатів дослідження сенсибілізуючої активності речовин щодо різних культур еукаріотичних клітин, зокрема дріжджових та пухлинних, дозволяє рекомендувати використання для вивчення фотодинамічних властивостей нових сенсибілізаторів тест-систему на основі C.albicans. Результати дослідження впроваджено у лабораторні заняття зі спеціальних практикумів на кафедрі мікробіології і вірусології ОНУ імені І. І. Мечникова.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно виконано аналіз даних літератури, представлені в роботі експериментальні дослідження, проаналізовано їх результати та обґрунтовано висновки. Постановка мети та задач дослідження, а також обговорення результатів проводилися разом з науковим керівником д.б.н, проф. Філіповою Т.О.

Автор висловлює подяку групі хіміків під керівництвом д.х.н., проф. Жиліної З.І., які є співавторами відповідних публікацій, за синтез досліджуваних сполук.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи були представленими на VI та Х Пущинській школі-конференції молодих вчених «Биология - наука ХХІ века» (Пущино, 2002 та 2006), ІХ Международній конференції по хімії порфіринів та їх аналогів (Суздаль, 2003), VI-ї конференції молодих онкологів України „Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ, 2003), Ювілейній науковій конференції студентів, аспирантів та молодих вчених, що присвячена 180-річчю із дня народження Л. С. Ценковського «Биоразнообразие, экология, эволюция, адаптация» (Одеса, 2003), International Weigl Сonference “Microorganisms in pathogenesis and their drug resistance” (Львів, 2003), IV українській науково-практичній конференції з клінічної фармакології (Вінниця, 2004), X з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції студентів, молодих вчених, лікарів та викладачів „Сучасні проблеми клінічної та теоретичної медицини” (Суми, 2005), ІІ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ біології” (Львів, 2006), 6-th Parnas Conference “Molecular Mechanism of Cellular Signalling” (Krakow, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових робіт: 8 статей у провідних фахових виданнях, а також 6 тез у збірниках праць з'їздів і конфенренцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 184 сторінках машинописного тексту, вона складається з розділів ”Вступ” “Огляд літератури”, “Матеріали та методи дослідження”, „Результати особистих досліджень”, “Аналіз та обговорення результатів досліджень”, “Висновки”, “Список використаних джерел” та „Додаток А”. Робота містить 43 таблиці та 26 рисунків. Бібліографія включає 214 джерел, в тому числі 165 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано сучасний стан використання синтетичних порфіринів в якості ФС у фотодинамічній терапії, зокрема для лікування грибкових захворювань. Наведено хімічну характеристику тетрапіролів (будова та основні властивості) та розглянуто механізми взаємодії еукаріотичних клітин з порфіринами, внаслідок чого розвивається їх загибель. Розглянуто перспективи використання дріжджоподібних грибів у якості тест-систем для визначення сенсибілізуючої активності синтетичних терапіролів.

Матеріали та методи дослідження. При проведенні досліджень в якості тест-об'єктів були використані штами дріжджів C.albіcans ATCC 18804, S.cerevіsіae УКМ Y 497 і R.bogorіensіs ATCC 18809, отримані з музею культур кафедри мікробіології і вірусології ОНУ ім. І.І. Мечникова, та 29 клінічних штамів C.albіcans, R.bogorіensіs і S.cerevіsіae, виділені співробітниками кліничної лабораторії Одеської обласної клінічної лікарні. Порівняння ФСА сполук було проведено на культурі клітин аденокарциноми Ерліха (Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, Київ).

Морфологічні та культуральні властивості тест-штамів дріжджоподібних грибів вивчали стандартними методами. Збереження тест-культур здійснювалося на скошеному МПА в пробірках при температурі 5 ⁰С за стандартною схемою (Перт С.Дж., 1988). Для експерименту використовувались добові культури, які вирощувались у пробірках на скошеному МПА при 37 ⁰С.

Дослідження були проведені для 28 синтетичних ФС: симетрично заміщених вільних основ хлоринів та порфіринів, деяких асиметричних похідних, а також їх металокомплексів (залізо-(Fe), цинк-(Zn), нікель-(Ni), олово-(Sn), германій (Ge) вмісних), отриманих у ПНДЛ-5 ОНУ ім. І. І. Мечникова (табл. 1, рис. 1). У якості речовин порівняння використовували протопорфірин ІX (І) (для вільних основ), гемін (Fe-I) (для металокомплексів) та Photofrin^® (Pf). Ефективність досліджуваних сполук у порівнянні з Pf визначалася за значеннями концентрацій досліджуваних похідних, які інгібували розвиток 50 % клітин тест-культур (ІК₅₀). Визначення ІК₅₀ проводили за методом Спірмена-Кербера (Першин Г.Н., 1971).

В усіх експериментах активацію досліджуваних речовин здійснювали за допомогою лампи розжарювання денного світла потужністю 500 Вт, інтенсивність опромінення становила 20 Дж/см² на рівні зразка.

Таблиця 1

Досліджувані в роботі сенсибілізатори

№	Cтруктура
	макрокільце	мезо-радикали
I	Протопорфірин IX	-
II*	Хлорин тозилат	R1=R2=R3=R4= феніл
III*		R1=R2=R3=R4= N-метил-6-хінолінил
IV	Порфірин йодид	R1=R2=R3=R4= феніл
V		R1=R2=R3=R4= 4-N-метилпіридил
VI	Порфірин тозилат	R1=R2=R3=R4= 4-N-метилпіридил
VII	Порфірин йодид	R1=R2=R3=R4= N-метил-6-хінолінил
VIII	Порфірин тозилат	R1=R2=R3= 4-N-метилпіридил; R4= н-ноніл
IX	Порфірин тозилат	R1=R2=R3=4-N-метилпіридил;R4=н-гексадецил

Визначення фотосенсибілізуючої активності сполук на клітинах дріжджів проводилася за умов попередньої інкубації тест-культур зі сполуками. Робоча концентрація мікроорганізмів становила 1•10⁶ клітин/мл. Інтенсивність росту дріжджів оцінювали на спектрофотометрі „Spekol-10” при довжині хвилі 520 нм через 24 та 48 годин після опромінення (Фрайкин Г.Я. с соавт., 2000).

Вивчення фотосенсибілізуючого впливу похідних з використанням клітин АКЕ здійснювалася аналогічним чином. Концентрація клітин АКЕ склала 1•10⁶ клітин/мл. По закінченню терміну інкубації (24 години) рівень життєздатності клітин визначали за допомогою нейтрального червоного, концентрацію якого визначали спектрофотометрично при 540 нм (Valdivieso-Garcia A. et al., 1993).

Вивчення темнової активності досліджуваних ФС проводилося на дріжджових культурах і з використанням клітин АКЕ за схемою, наведеної вище, за винятком активації сполук видимим світлом.

Кількість життєздатних клітин як дріжджових, так і пухлинних, розраховувалося за формулою: А_відн., % = А_Е/А_К•100, де А_Е- оптична щільність у пробі, що досліджувалася (клітини + речовина), А_К - оптична щільність у контрольній пробі.

Для кожного похідного експеримент повторювали двічі, кількість повторів у кожному ряді дорівнювала 4. За контроль використовувалась суспензія опромінених клітин, яка не містіть екзогенних ФС.

Вивчення процесу надходження сполук в клітини дріжджів та аденокарциноми Ерліха проводилося у фізіологічному розчині під час сумісної інкубації. Перший варіант здійснювався без світлової активації ФС; другий - культивування клітин та речовин відбувалось відповідно до схеми визначення фотосенсибілізуючої активності сполук; третій - додавання ФС проводилось після інкубації клітин у присутності 5•10^-3 M азиду натрію (Paardekooper M. et al., 1992). Визначення вмісту акумульованих ФС проводилося на спектрофотометрі Specord M40-VІ (Німеччина) за інтенсивністю поглинання при довжині хвилі, що відповідає смузі Соре, та каліброваних кривих, визначених для кожної сполуки.

Визначення характеру дії порфіринів в культурі C.albicans проводилося за допомогою препаратів фіксованих мікроколоній. Приготовлені препарати вивчалися в незабарвленому виді при збільшенні х100 (Квасников Е.И., Щеколова И.Ф., 1991).

Встановлення форми загибелі клітин C.albicans та АКЕ під впливом ФС здійснювалося за допомогою проточного цитофлуориметру Facscan (Becton Dickinson, CA, USA) з використанням АV-ФІТЦ та пропідіум йодиду. У випадку C.albicans перед взаємодією з АV-ФІТЦ проводилося видалення клітинної стінки (Coyle B. et al., 2004).

Визначення антибіотикочутливості кліничних штамів C. albіcans, S. cerevіsіae та R. bogorіensіs проводилося за стандартним тестом Кірбі-Бауера з використанням дисків з антимікотиками (Pfaller M.A. et al., 2003).

Статистичну обробку отриманих результатів здійснювали відповідно до алгоритмів, застосовуючи програму Exel-2000.

Результати досліджень. Чутливість культур C.albicans, S.cerevisiae та R.bogoriensis до дії основ та металокомплексів порфіринів. У роботі було вивчено фотодинамічну та темнову активність 28 синтетичних вільних основ, а також металокомплексів, порфіринів та хлоринів щодо C.albicans, S.cerevisiae та R.bogoriensis. Відповідно до наданої на тест-культури дії сполуки були розподілені на кілька груп:

· які пригнічують життєздатність тест-культур,

· що стимулюють розвиток мікроорганізмів,

· які не були ефективними ФС в даних тест-культурах.

Перспективними для подальшого вивчення виявилися ті з них, які здійснювали пригнічення розвитку дріжджів після опромінення через 24 та 48 годин - ФС з високим антигрибковим потенціалом: симетрично заміщені комплекси Fe-VI, Zn-VI, а також асиметрична вільна основа IX та її цинковий комплекс Zn-IX. Ці сполуки були ефективними до всіх видів дріжджоподібних грибів, які використовувалися в роботі, та здійснювали в середньому 2-кратне зниження оптичної щільності культур як через 24 години, так і на другу добу (рис. 2). При цьому, було відмічено, що ефективність комплексів залежить від їх структури та є більш високою, ніж у відповідних вільних основ.

Сполуки, які впливали на клітини C.albіcans, також були ефективними і для S.cerevіsіae, що свідчить про подібність відповідних реакцій дріжджів. Що стосується R.bogorіensіs, то вплив досліджених похідних різко відрізнявся від такого для попередніх культур, а також визначений рівень дії був значно меншим. Цей факт, очевидно, обумовлений наявністю в них розходжень за морфо-фізіологічними властивостями, та, насамперед, істотної кількості каротиноїдів, які можуть відігравати захисну роль (Коновалов С.А., 1990). Наявність даних речовин сприяє захисту компонентів клітини від фотоокиснення, запобігаючи тим самим летальної дії ФС, та підвищує виживаність мікроорганізмів у середовищі (Фрайкин Г.Я. с соавт., 2000).

В даний час в клініці застосовується ФС, розроблений на основі порфіринових сполук, - Photofrin^® - який характеризується ІК₅₀ = 5 мкг/мл для C.albicans, ІК₅₀ = 5,3 мкг/мл - S.cerevisiae, ІК₅₀ = 6,2 мкг/мл - R.bogoriensis. Додаткове порівняння даного параметру з аналогічними значеннями досліджуваних похідних дозволило провести більш доцільний відбір сполук, сенсибілізуючі властивості яких перевищили такі у вже запровадженого ФС (табл. 2).

Таблиця 2

ІК₅₀ ефективних фотосенсибілізаторів in vitro

Похідне	ІК50, мкг/мл
	Candida albicans	Saccharomyces cerevisiae	Rhodotorula bogoriensis
Photofrin®	5,0	5,3	6,2
IX	0,71	0,55	0,24
Zn-VI	0,64	0,70	0,36
Zn-IX	0,90	0,85	4,25

Всі ФС, які були відібрані для подальшого вивчення, характеризувались ІК₅₀ меньшою за таку у Photofrin^®. Цей показник для більшості досліджуваних основ та комплексів був схожим в культурах C.albicans та S.cerevisiae, але відрізнявся для R.bogoriensis.

Подальший відбір сполук проводився за другим критерієм - низьким значенням темнової активності, тобто відсутністю токсичних властивостей в умовах без опромінення. В роботі було встановлено, що ефективні ФС характеризуються відсутністю впливу на розвиток еукаріотичних клітин без попередньої світлової активації молекул.

Таким чином, серед усіх похідних були відібраними сполуки з високими значеннями фотосенсибілізуючої антифунгальної активності та відсутністю впливу на розвиток тест-культур за темнових умов - 5,10,15-три(4-N-метил-піридил)-20-н-гексадецилпорфірин (IX) та його цинковий комплекс (Zn-IX), а також мезо-тетракіс(4-N-метилпіридил)-порфірин заліза (Fe-VI) та цинка (Zn-VI).

Особливості взаємодії фотосенсибілізаторів з клітинами дріжджів: надходження порфіринів в клітини C.albicans, S.cerevisiae та R.bogoriensis. Дослідження показали, що активне зв'язування більшості похідних відбувалося за перші 10 хвилин спільної інкубації, та максимальний внутрішньоклітинний вміст досягався протягом 30 хвилин. Інтенсивність надходження суттєво залежала від параметрів культивування мікроорганізмів: при опроміненні світлом видимої області та без нього. Так, світловий вплив сприяв підвищенню внутрішньоклітинного вмісту в 1,5-2 рази (сполуки ІХ) та більш ніж у 3-5 разів (Zn-VI та Zn-IX) у порівнянні з темновими умовами спільної інкубації (рис. 3). Очевидно, світло викликало первинні зміни бар'єрних структур клітин, що надалі прискорювало проходження досліджуваних похідних крізь них.

Рис. 3. Накопичення досліджуваних сполук клітинами дріжджоподібних культур:

1 - C.albicans; 2 - S.cerevisiae; 3 - R.bogoriensis;

вісь ординат - кількість досліджуваної сполуки в клітинах дріжджів, мкг/10⁶ клітин;

* - Р < 0,05 порівняно з відповідним варіантом темнової інкубації.

На відміну від впливу фізичного фактору (світла) на характеристику надходження сенсибілізаторів до клітин C.albicans, S.cerevisiae та R.bogoriensis азид натрію не викликав суттєвих змін в інтенсивності цього процесу. Дана сполука є інгібітором енергетично залежних внутрішньоклітинних процесів, чим сприяє блокуванню активного мембранного транспорту. Наявність цієї речовини в середовищі інкубації дріжджоподібних грибів з досліджуваними фотосенсибілізаторами не викликала істотних змін в інтенсивності поглинання даних похідних. Цей факт свідчить, очевидно, про те, що їх проникнення здійснювалося за рахунок пасивної дифузії, без яких-небудь енергетичних витрат.

Отримана характеристика процесу надходження ефективних сенсибілізаторів до клітин дріжджоподібних грибів C.albicans, S.cerevisiae та R.bogoriensis обґрунтовує доцільність використання - в подальших дослідах на тваринах при визначенні антифунгальної дії порфіринів щодо поверхневих мікозів - одночасного впливу ФС і світла. Це може сприяти не тільки підвищенню ефективності, але і прискоренню процесу лікування. Морфологічна характеристика розвитку С.albicans на щільному середовищі під дією досліджуваних порфіринів. Це дослідження показало, що здатністю викликати незворотню затримку розвитку клітин, характеризувалися тільки комплекси, що досліджувалися зокрема Zn-VI та Zn-IX. На відміну від них вільна основа IX сприяла гальмуванню розвитку C.albicans, який згодом відновлювався (рис. 4). Таким чином, металокомплекси синтетичних прфіринів мають фунгіцидну фотосенсибілізуючу дію, у той час, як вільні основи чинять фунгістатичний вплив. Також було вперше встановлено, що фотосенсибілізуючий вплив досліджуваних сполук реалізується не тільки в материнських клітинах, до яких безпосередньо надходять ці похідні, а також в їх нащадках, що утворюються після відповідного процесу розмноження.

Рис. 4. Характеристика розвитку C.albicans під дією фотосенсибілізаторів:

вісь абсцис - концентрація сполук, мкМ;

вісь ординат - форма мікроколонії, % відносно загальної кількості мікроколоній;

к - контроль.

Тобто процеси, які спочатку ініціюються сенсибілізаторами, не обмежуються тільки фотоокисленням клітинних мембран, але, мабуть, можуть викликати зміни на генетичному рівні, що призводить до порушення розмноження дріжджів та наступної загибелі клітин через декілька поколінь. Таке припущення підтверджується ще й тим фактом, що сполуки на основі порфіринів мають здатність до інтеркаляції - вбудовуванню до молекул ДНК завдяки планарної структури молекул.

Визначення ролі апоптозу в клітинах С.albicans під впливом ефективних фотосенсибілізаторів. Дослідження механізмів загибелі C.albicans на клітинному рівні проводилося за допомогою проточної цитофлуорометрії з використанням анексину V-ФІТЦ та пропидіум йодиду. Одним з основних механізмів даного процесу виявився апоптоз, під час якого відбувалося переміщення фосфатидилсеріна з внутрішньої сторони цитоплазматичної мембрани на зовнішню. В роботі встановлено, що внаслідок впливу Zn-IX кількість клітин в апоптичному стані зростає майже у 10 разів в порівнянні з контролем та становить 20 % від загальної кількості дріжджів у суспензії. При цьому приблизно 12 % складають вже загиблі клітини (рис. 5).

Тобто ці значення на 5-7 % перевищували такі для Photofrin^® та в 2-2,5 разів були більшими, ніж у випадку вільної основи IX. Також було встановлено, що інтенсивність розвитку апоптозу за умов попереднього опромінення не залежала від часу, обумовлюючи однаковий рівень апоптичних клітин в суспензіях через 4 та 24 години, відповідно.

Рис. 5. Рівень апоптозу в клітинах C.albicans:

вісь абсцисс - варіанти (К- - неопромінений контроль; К+ - опромінений контроль; Pf - Фотофрін).

Характеристика взаємодії мікроорганізмів із сенсибілізаторами свідчить про те, що в культурі C.albicans існують дріжджові клітини із здатністю до безпосереднього реагування на вплив сполук, а також ті, відповідна реакція яких розвивається з перебігом часу.

Антифунгальна дія ефективних фотосенсибілізаторів щодо клінічних ізолятів дріжджоподібних грибів. Вивчення антифунгальної активності ефективних ФС було також проведено щодо клінічних штамів дріжджоподібних грибів, таких як C.albicans, S.cerevisiae та Rhodotorula spp., які характеризувалися різним ступенем резистентності до антимікотиків (амфотерицину В, ністатину, клотримазолу, флуконазолу та ітраконазолу).

При цьому серед ізолятів C.albicans нечутливими до вільної основи гексадецил-піридилпорфірину (IX), та симетричного залізокомплексу (Fe-VI) були лише 9 % та 13 % штамів, відповідно. Що стосується Rhodotorula spp., то тільки один ізолят характеризувався чутливістю до Fe-VI, що відповідало 33 %. До відібраних S. cerevisiae ефективні ФС проявили 100 % активності (табл. 3).

Таблиця 3

Активність фотосенсибілізаторів щодо клінічних ізолятів дріжджоподібних грибів in vitro

Види дріжджів	Кількість досліджених штамів	Кількість штамів, чутливих до відповідних ФС, %
		IX	Fe-VI	Zn-VI	Zn-IX
C. albicans	23	91	87	100	100
Rhodotorula spp.	3	100	33	100	100
S. cerevisiae	3	100	100	100	100

Найбільший інгібуючий вплив, який відповідав істотному пригніченню розвитку всіх клінічних штамів дріжджоподібних грибів, був зафіксований для Zn-VI та Zn-IX.

Чутливість культури аденокарциноми Ерліха до фотосенсибілізаторів. Порівняння результатів, отриманих за допомогою культур дріжджів, з пухлинними клітинами, зокрема АКЕ, проводилося під час послідовного вивчення сенсибілізуючих, а потім темнових властивостей досліджуваних сполук.

Характерною особливістю ФСА виявилось те, що для більшості досліджуваних сполук не було зафіксоване залежності рівня ефекту від їх концентрації. При визначенні сенсибілізуючих властивостей комплексів було встановлено, що більшість з них характеризувалась більш значною активністю в порівнянні з відповідними основами. Наприклад, максимальний інгібуючий вплив, який був наданий сполукою IX, дорівнював 48 % у порівнянні з контролем, у той час як для Zn-ІX - перевищував 75 % (рис. 6).

Слід підкреслити, що фотосенсибілізуюча активність досліджуваних сполук щодо клітин аденокарциноми Еріха за усіма характеристиками тотожня такої щодо дріжджів C.albicans та S.cerevisiae. Це дає можливість використовувати дріжджові клітини в якості тест-об'єктів за первинного відбору фотосенсибілізаторів. Перевагами такої експериментальної моделі є швидкість та низька вартість даних досліджень.

У випадку визначення рівня активності сполук в темнових умовах для більшості з них не було встановлено значного впливу на культуру аденокарциноми Ерліха, що зробило їх перспективними для наступних досліджень.

Размещено на http://www.allbest.ru

Рис. 6. Чутливість культури аденокарциноми Ерліху до дії фотосенсибілізаторів in vitro:

вісь абсцис - концентрація сполук, мкМ;

вісь ординат - кількість життєздатних клітин в суспензії, % відносно контролю;

* - Р < 0,05 порівняно з контролем.

Вивчення процесу надходження досліджуваних порфіринів у клітини аденокарциноми Ерліха. Дослідження надходження відібраних сполук крізь цитоплазматичну мембрану пухлинних клітин також виявило значну подібність цього процесу у дріжджів та АКЕ. Так, внутрішньоклітинний вміст основи ІХ та її комплексу Zn-ІX за умов відсутності опромінення відповідав: для пухлинних клітин приблизно 25 % від доданої у середовище кількості, а для дріжджових клітин - в середньому 20 %. Що стосується світового впливу, то після його дії в обох випадках визначалося практично двократне посилення зв'язування даних сполук. Незначні розбіжності, які спостерігалися під час порівняння взаємодії різних тест-культур із досліджуваними сполуками, очевидно, були пов'язані з різницією клітинних розмірів та наявністю у дріжджів клітинної стінки.

Вплив досліджуваних фотосенсибілізаторів на розвиток апоптозу в клітинах аденокарциноми Ерліха

Після світлового впливу в присутності досліджуваних сполук також, як і для C.albicans, спостерігалася інтенсифікація апоптичного процесу в пухлинних клітинах in vitro (рис. 7).

Визначене підвищення рівня загибелі аденокарциноми Ерліха практично дорівнювало тому, яке спостерігалося під дією Photofrin®. Але в присутності Zn-ІX відбувалося збільшення кількості апоптичних клітин на 10 % у порівнянні із застосованим препаратом Photofrin®.



Рис. 7. Рівень апоптозу в клітинах аденокарциноми Ерліха in vitro:

вісь абсцисс - варіанти (К- - неопромінений контроль; К+ - опромінений контроль; Pf - фотофрін).

ВИСНОВКИ

1. Вперше досліджено фотоіндуковану та темнову антифунгальну активність двадцяти восьми синтетичних мезо-заміщених похідних порфіринового ряду.

2. Клітини C.albicans, S.cerevisiae та R.bogoriensis виявляють високу чутливість до фотосенсибілізуючого впливу синтетичних порфіринів: симетричнозаміщеного 5,10,15,20-тетра(4-N-метилпіридил)порфірину та його комплексів із залізом та цинком і асиметричнозаміщеного 5,10,15-три(4-N-метилпіридил)-20-н-гексадецил-порфірину та його комплексу з цинком. Інгибування зросту культур даними сполуками становить більше 70 %. У темнових умовах жодна з досліджених сполук не пригнічує зростання дріжджових культур.

3. Металокомплекси порфіринів характеризуються більш високими значеннями антифунгальної фотосенсибілізуючої активності у порівнянні з вільними основами.

4. Накопичення клітинами дріжджів досліджуваних сполук посилюється під дією світла видимої області в середньому в 2-4 рази у порівнянні з темновими умовами.

5. Металокомплекси синтетичних порфіринів мають фунгіцидну фотосенсибілізуючу дію, у той час, як вільні основи чинять фунгістатичний вплив на C.albicans. Загибель частини дріжджових клітин відбувається одразу після опромінення в присутності фотосенсибілізаторів, а також спостерігається у наступних поколіннях.

6. Однією з форм загибелі клітин C.albicans є апоптоз. Його рівень зростає після опромінення в присутності цинкового комплексу 5,10,15-три(4-N-метилпіридил)-20-н-гексадецилпорфірину майже у 10 разів в порівнянні з контролем та становить 20 %.

7. Резистентні до антифунгальних препаратів клінічні штами C.albicans, S.cerevisiae та Rhodotorula spp. характеризуються високою чутливістю до фотосенсибілізуючого впливу досліджуваних порфіринів.

8. Фотосенсибілізуюча активність досліджуваних сполук щодо клітин аденокарциноми Ерліха за усіма параметрами аналогічна такої, що встановлена для дріжджів C. albicans та S. cerevisiae.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Порівняльна характеристика взаємодії мезо-фенілзаміщених тетрапіролів з еукаріотичними клітинами / Русакова М.Ю., Філіпова Т.О., Галкін Б.М., Іваниця В.О., Жиліна З.І., Ішков Ю.В., Водзінський С.В. // Одеський медичний журнал. - 2007. - №3(101). - С. 21-24. (Здобувачем проведено аналіз та інтерпретацію результатів дослідження фотоіндукованої та темнової дії синтетичних порфіринів та їх металокомплексів на C. аlbicans та аденокарциному Ерліха, статистичну та математичну обробку результатів та оформлення статті).

2. Характеристика фотосенсибілізуючої активності похідних піридилпорфірину в культурі Сandida albicans / Русакова М.Ю., Філіпова Т.О., Галкін Б.М., Жиліна З.І., Іваниця В.О., Ішков Ю.В., Водзінський С.В. // Одеський медичний журнал. - 2007. - №2(100). - С. 9-12. (Здобувачем проведено дослідження розвитку C. albicans в присутності синтетичних порфіринів, статистичну та математичну обробку результатів та оформлення статті).

3. Фотоінактивація клітин Candida albicans в присутності синтетичних порфіринів / Русакова М.Ю., Галкін Б.М., Філіпова Т.О., Жиліна З.І., Захаркіна Т.І., Кириченко Г.М. // Вісник ОНУ. Біологія. - 2005. - Т.10, №3. - С. 83-89. (Здобувачем проведено аналіз та інтерпретацію результатів дослідження фотоіндукованої дії синтетичних порфіринів та їх металокомплексів на C. albicans, оформлення статті).

4. Русакова М.Ю. Фотосенсибілізуюча активність нових синтетичних порфіринів щодо клітин Candida albicans // Вісник ОНУ. Біологія. - 2004. - Т.9, №5. - С. 183-187.

5. Застосування дріжджів Candida albicans і Rhodotorula bogoriensis для вивчення фотосенсибілізуючих властивостей синтетичних порфіринів / Філіпова Т.О., Русакова М.Ю., Галкін Б.М., Водзінський С.В. // Одеський медичний журнал. - 2004. - №2(82). - С. 30-32. (Здобувачем проведено дослідження чутливості C.albicans і R.bogoriensis до темнової та фотоіндукованої дії синтетичних порфіринів, статистичну та математичну обробку результатів та оформлення статті).

6. Взаимодействие микроорганизмов с природными и синтетическими порфиринами / Филиппова Т.О., Галкин Б.Н., Зинченко О.Ю., Русакова М.Ю., Жилина З.И., Водзинский С.В., Ишков Ю.В. // Вісник ОНУ. Біологія. - 2001. - Т.6, №4. - С. 317-322. (Здобувачем проведено експериментальні дослідження темнової та фотодинамічної дії природних та мезо-хінолінілзаміщених синтетичних порфіринів на клітини дріжджів).

7. Антимікробні властивості марганецьвмісних синтетичних порфіринів / Зінченко О.Ю., Русакова М.Ю., Філіпова Т.О., Галкін Б.М., Жиліна З.І. // Biomedical and Biosocial Antropology. - 2004. - №3. - С. 40-42. (Здобувачем проведено дослідження чутливості дріжджів до темнової та фотоіндукованої дії марганцевих комплексів синтетичних порфіринів, статистичну та математичну обробку результатів та оформлення статті).

8. The antimicrobial properties of new synthetic porphyrins / Philippova T.O., Galkin B.N., Zinchenko O.Yu., Rusakova M.Yu., Ivanitsa V.A., Zhilina Z.I., Vodzinskij S.V., Ishkov Yu.V. // J. Porphyrins Phthalocyanines. - 2003. - V.7, №11-12. - Р. 737-742. (Здобувачем проведено дослідження впливу олов'яних комплексів синтетичних порфіринів та хлоринів на рост прокаріотичних та еукаріотичних мікроорганізмів, статистичну та математичну обробку результатів та переклад статті).

9. Русакова М.Ю., Захаркина Т.И., Хмелевская О.Н. Изучение фотодинамической активности синтетических фотосенсибилизаторов in vitro // Биология - наука ХХІ века: Х Пущинська школа-конференція молодих вчених. Пущино, 17-21 квітня 2006 р. - Пущино, 2006. - Т.4. - С. 161. (Здобувачем проведений аналіз результатів, отриманих при вивченні взаємодії порфіринів з клітинами).

10. Русакова М.Ю., Захаркина Т.И. Особенности фотоиндуцированной деструкции дрожжевых клеток Candida albicans и Rhodotorula bogoriensis // Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация: Ювилейна наукова конференція студентів, аспирантів та молодих вчених, присвячена 180-річчю зі дня народження Л.С. Ценковського, 28 березня-1 квітня 2003 р. - Одеса, 2003. - С. 141. (Здобувачем проведено порівняння чутливості еукаріотичних клітин різних видів до дії синтетичних порфіринів).

11. Русакова М.Ю., Галкин Б.Н., Захаркина Т.И. Фотоинактивация клеток дрожжей разных видов в присутствии синтетических порфиринов // Химия порфиринов и их аналогов: ІХ Міжнародна конференція, 8-12 березня 2003 р. - Суздаль, 2003. - С. 327-328. (Здобувачем проведено вивчення чутливості клітин різних видів дріжджів до дії синтетичних порфіринів).

12. Протимікробні властивості олов'яних комплексів синтетичних порфіринів / Русакова М.Ю., Зінченко О.Ю., Водзінська Н.С., Захаркіна Т.І. // X з'їзд Товариства мікробіологів України, 15-17 вересня 2004 р. - Одеса, 2004. - С. 235. (Здобувачем проведено оцінку впливу комплексоутворення на антифунгальну активність порфіринів).

13. Синтетические мезо-тетразамещенные порфирины: профиль антимикробной активности / Филиппова Т.О., Галкин Б.Н., Русакова М.Ю., Зинченко О.Ю., Иваница В.А., Жилина З.И., Ишков Ю.В., Водзинский С.В. // Актуальні питання фармакології: IV Українська науково-практична конференція з клінічної фармакології, 7-8 жовтня 2004 р. - Вінниця, 2004. - С. 151. (Здобувачем проведено порівняння чутливості клітин різних видів до дії порфіринів, написання тез).

14. Русакова М.Ю., Захаркіна Т.І., Хмєлєвська О.М. Дослідження активності нових фотосенсибілізаторів в культурах еукаріотів // Пошук та розробка нових профілактичних і лікувальних протимікробних засобів, антисептиків, дезінфектантів та пробіотиків: тези доповідей науково-практичної конференції з міжнародною участю, 20-21 листопада 2006 р. - Харків, 2006. - С. 159-160. (Здобувачем проведено порівняння чутливості еукаріотичних клітин різних видів до дії порфіринів, написання тез).

АНОТАЦІЯ

Русакова М.Ю. Характеристика антифунгальної активності синтетичних порфіринів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. ДУ „Інститут мікробіології і імунології ім.І.І. Мечникова АМН України”. - Харків, 2008.

Дисертацію присвячено дослідженню чутливості дріжджоподібних грибів C.albicans, S.cerevisiae та R.bogoriensis щодо сенсибілізуючої активності широкого спектру нових синтетичних порфіринів.

Показано, що рівень ефективності речовин щодо перших двох видів культур характеризується значною подібністю, суттєво відрізняючись для R. bogoriensis. Інтенсивність накопичення сенсибілізаторів клітинами дріжджів залежить від умов спільної взаємодії, суттєво посилюючись під дією світла видимої області. Більшість сполук не впливає на розвиток дріжджів за відсутністю опромінення.

Необоротна затримка поділу клітин C.albicans обумовлюється дією комплексів порфіринів, а зокрема залізного та цинкового; у той час як вільна асиметрична основа спричиняє гальмування даного процесу, який з часом частково відновлюється.

Встановлено, що однією з форм загибелі клітин після опромінення C. albicans є апоптоз, максимальне значення якого відповідає асиметричному порфірину цинка.

Інгібуюча дія ефективних сенсибілізаторів на відповідні клінічні штами не залежить від резистентності мікроорганізмів щодо офіційних антимікотиків.

Порівняння характеристики взаємодії фотосенсибілізаторів з дріжджовими клітинами C.albicans, S.cerevisiae та аденокарциномою Ерліха іn vіtro показало наявність значних подібностей як рівня, так і форми впливу.

Отримані дані свідчать про перспективність створення на основі досліджених речовин нових засобів антифунгальної фотодинамічної терапії.

Ключові слова: дріжджоподібні гриби, порфірини, сенсибілізатори, фотосенсибілізуюча активність, мікроколонії, апоптоз, аденокарцинома Ерліха.

АННОТАЦИЯ

Русакова М.Ю. Характеристика антифунгальной активности синтетических порфиринов - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. ГУ „Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины”. - Харьков, 2008.

Диссертация посвящена изучению чувствительности дрожжеподобных грибов C.albicans, S.cerevisiae и R.bogoriensis к фотосенсибилизирующему действию новых синтетических соединений порфиринового ряда. Данные микроорганизмы приобретают все большее медицинское значение как потенциальные инфекционные агенты, требующие разработки альтернативных методов лечения в связи с возросшей в последнее время у них резистентностью к антибиотикам. Порфирины, как свободные основания, так и металлокомплексы, являясь сенсибилизаторами, служат основой фотодинамической терапии - одного из способов борьбы с онкологическими патологиями, а также некоторых заболеваний бактериальной природы.

В результате исследования антифунгальных сенсибилизирующих свойств 28 мезо-замещенных порфириновых производных в дрожжевых культурах установлено, что соединения практически в одинаковой степени активны в отношении C.albicans и S.cerevisiae. Влияние веществ на культуру R. bogoriensis менее выражено, что обусловлено некоторыми морфофизиологическими особенностями данного вида микроорганизмов. Среди изученных соединений были выбраны те, для которых найденное значение концентрации, осуществлявшей ингибирование 50 % клеток микроорганизмов, оказалось ниже, чем для Photofrin^®. Последний является используемым в настоящее время в медицинской практике фотосенсибилизатором, действующим веществом которого являются порфириновые производные. Без предварительного светового воздействия дрожжевые клетки являются нечувствительными к действию большинства сенсибилизаторов.

Характеристика процесса накопления эффективных сенсибилизаторов дрожжеподобными грибами показывает, что интенсивность данного процесса зависит от условий совместной инкубации, существенно возрастая в результате действия света видимой области.

Наблюдаемая необратимая задержка деления C. albicans была отмечена только в присутствии комплексов - 4-N-метил-пиридилпорфирин железа и цинка. Под влиянием основания - (5,10,15-три(4-N-метилпиридил)-20-н-гексадецилпорфирин) происходит торможение данного процесса, который затем частично восстанавливается.

Кроме того, форма гибели значительного количества дрожжевых клеток, в частности C.albicans, соответствует процессу апоптоза. При облучении под влиянием 5,10,15-три(4-N-метилпиридил)-20-н-гексадецилпорфирин тозилата цинка данная форма развивается более чем у 30 % дрожжей от общего количества в суспензии, что практически в 2 раза превышает значение, полученное для вещества сравнения Photofrin^®.

Ингибирующее действие эффективных фотосенсибилизаторов на соответствующие клинические штаммы не зависит от резистнентности микроорганизмов к официальным антимикотикам.

Установлена также схожесть действия исследуемых фотосенсибилизаторов на клетки C.albicans и S.cerevisiae с культурой аденокарциномы Эрлиха.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности создания на основе исследованных соединений новых средств антифунгальной фотодинамической терапии.

Ключевые слова: дрожжеподобные грибы, фотосенсибилизаторы, фотосенсибилизирующая активность, порфирины, микроколонии, апоптоз, аденокарцинома Эрлиха.

SUMMARY

Rusakova M.Yu. Characteristics of antifungal activity of synthetic porphyrins. - Manuscript.

Thesis for scientific degree of the kandidat of biological sciences in speciality 03.00.07 - microbiology. State Establishment “Mechnikov institute of microbiology and immunology of the Ukrainian AMS”. - Kharkiv, 2008.

The susptibility of C.albicans, S.cerevisiae and R.bogoriensis yeasts to photosensitizing action of new synthetic porphyrin compounds. The activity level of substances with respect to the first two microorganisms' species is characterized by high similarity as opposed to differences in the case of R. bogoriensis. The uptake intensity of photosensitizers by yeast cells depends on joint interaction conditions and intensifies definitely under the visible light influence. The most of compounds don't effect on yeast cell development in the absence of light exposure.

The inconvertible (nonreversible) delay of C.albicans cell division is caused by porphyrin metal complexes, in particular (espesially) by iron and zink 4-N-methylpyridilporphyrins. Whereas a free base (5,10,15-tri(4-N-methylpyridil)-20-n-hexadecylporphyrin) provokes this process inhibition, which recoverypartly with time.

After light exposure one death form of C.albicans cells is apoptosis, which runs up to maximum value in the case of 5,10,15-tri(4-N-methylpyridil)-20-n-hexadecylporphyrin tosilate zink.

The inhibitory action of effective photosensitizers on corresponding clinical strains doesn't depend upon official antimycotic resistance of these microorganisms.

The interaction characteristic comparing of C.albicans and S.cerevisiae yeast cells with Ehrliсh adenocarcinoma in vitro is indicated that there are significant similarities both the level of influence and its type.

The obtained data are indicated about perspectives of new medicine creation based on researched compounds for antifungal photodynamic therapy.

Кey words: yeast fungi, photosensitizers, photosensitizing activity, porphyrins, microcolonies, apoptosis, Ehrlich's adenocarcinoma.

Размещено на Allbest.ru

...