Виявлення та діагностика карантинних бактеріозів: опіку плодових та бурої гнилі картоплі

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК: 582.28+632:634.4

ВИЯВЛЕННЯ ТА ДІАГНОСТИКА КАРАНТИННИХ БАКТЕРІОЗІВ: ОПІКУ ПЛОДОВИХ ТА БУРОЇ ГНИЛІ КАРТОПЛІ

06.01.11 - фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

БОКШАН ОЛЬГА ЯРОСЛАВІВНА

КИІВ - 2004



Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Закарпатському територіальному відділі карантину рослин Інституту захисту рослин Української академії аграрних наук

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України, Гвоздяк Ростислав Ілліч, Інститут мікробіології та вірусології НАН України, завідувач відділу фітопатогенних бактерій

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, професор Слюсаренко Олександр Миколайович, Одеський національний університет ім. Мечнікова, професор кафедри ботаніки

кандидат біологічних наук, Шевченко Жанна Петрівна Уманський державний аграрний університет, завідувач кафедри захисту рослин

Провідна установа - Харківський національний аграрний університет ім. В.В.Докучаєва, кафедра фітопатології, Міністерства аграрної політики України, м. Харків

Захист відбудеться „ 26” листопада 2004 року о 12 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус №3, аудиторія 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус № 4, к.41

Автореферат розісланий „ 25” жовтня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мороз М.С



Бокшан О.Я. Виявлення та діагностика карантинних бактеріозів: опіку плодових та бурої гнилі картоплі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 06.01.11 - фітопатологія. Національний аграрний університет, Київ, 2004. бактеріальний опік плодовий сортовий

Дисертація присвячена вивченню карантинних бактеріозів плодових культур та картоплі, методам їх виявлення та діагностування.

Вперше в Закарпатській області (2003 р.) виявлено та ідентифіковано збудника бактеріального опіку плодових - E.amylovora. Встановлено, що в умовах Закарпатської та Чернівецької областях протікання захворювання відрізняється від класичного його опису відсутністю молочно-білого ексудату та характером виразок на гілках. Найбільший ризик прояву захворювання припадає на період інтенсивного росту дерев. Встановлена різна сортова чутливість до збудника опіку плодових у груші та яблуні. Для прогнозування появи та розвитку опіку плодових запропоновано використовувати модель Maryblyt.

Запропоновано схему імунізації кролів для одержання високоспецифічних імунних сироваток, параметри створення еритроцитарного діагностикума до E.amylovora, схеми прискореної діагностики E.amylovora та R. solanacearum, створення паперових індикаторних дисків для ензим-індикації фітопатогенних бактерій.

Ключові слова: бактеріальний опік, бура гниль, ензим-індикація, серодіагностика, моделі прогнозу.



Бокшан О.Я. Выявление и диагностика карантинных бактериозов: ожога плодовых и бурой гнили картофеля. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 06.01.11 - фитопатология. Национальный аграрный университет, Киев, 2004.

Диссертация посвящена изучению карантинных бактериозов плодовых культур и картофеля, методам выявления и диагностики.

Впервые в Закарпатской области (2003 г.) выявлено и диагностировано возбудителя бактериального ожога плодовых - E.amylovora. Установлено, что в условиях Закарпатской и Черновицкой областях развитие заболевания отличается от классического его описания отсутствием молочно-белого экссудата и характером язв на ветках. На пораженных заболеванием ветках выявлено два типа язв: с четко выраженной границей между здоровой и пораженной тканью и с расплывчатыми краями. Первый тип язв был характерным для более устойчивых сортов. Симптомы бактериального ожога плодовых проявлялись в основном в период интенсивного роста деревьев. Проявление заболевания на цветках лимитируется температурным режимом и осадками.

Установлена различная восприимчивость сортов к возбудителю ожога плодовых у груши и яблони, что необходимо учитывать при провидении обследовательских мероприятий.

Для прогнозирования появления и развития ожога плодовых рекомендуется использовать модель Maryblyt, которая обеспечивает своевременный химический контроль болезни.

Природа возбудителя E.amylovora установлена с использованием классического бактериологического метода, серологических методов и молекулярных исследований при помощи полимеразой цепной реакции.

Предложена схема иммунизации кролей для получения высокоспецифических сывороток, параметры наработки эритроцитарного диагностикума к E.amylovora. При сравнении различных методов серодиагностики E.amylovora установлено, что наиболее чувствительным является реакция непрямой гемагглютинации.

Подобраны методы для проведения ускоренной диагностики E.amylovora и R. solanacearum, которые позволяют сделать заключение о фитосанитарном состоянии подкарантинного материала в течение 1-3-х дней. Для биохимического тестирования фитопатогенных бактерий предложена методика микрометода с использованием бумажных индикаторных дисков, которая разрешает получить ответ через 3 -8 часов.

Ключевые слова: бактериальный ожог, бурая гниль, энзим-индикация, серодиагностика, модели прогнозирования.



Bokshan O. Interception and diagnostics of quarantine bacterioses: fire blight and potato brown rot. - the Manuscript.

The dissertation thesis for candidate degree in biological sciences on speciality 06.01.11 - phytopathology. National Agrarian University, Kyiv, 2004.

The dissertation is devoted to studying of quarantine bacterioses of fruit trees and a potato, methods of Interception and diagnostics.

For the first time in Transcarpathian region (2003) is intercepted and diagnosed the causal agent of a fire blight - E.amylovora. It is established, that in conditions of Transcarpathian region development of disease differs from its classical description by absence of exudate and character of cankers on branches. The greatest risk of exhibiting of symptoms of fire blight in conditions of Ukraine gets to the season of intensive growth of trees. The various sensibilities of varieties to the causal agent of fire blight at a pear and an apple are established. For forecasting of fire blight appearance and development it is recommended to use Maryblyt model.

The scheme of an immunization of rabbits for obtaining of highly specific serums, parameters of an erythrocital diagnosticum to E.amylovora operating time, schemes of accelerated diagnostics E.amylovora and R. solanacearum, preparation of paper indicatory disks for enzyme-indication of phytopathogenic bacteria is proposed.

Key words: fire blight, brown rot, enzyme-indication, serodiagnosis, models of forecast.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Важливе значення в запобіганні збитків в сільському господарстві від шкідливих організмів мають карантинні заходи.

Для кожної країни спеціальними законодавчими актами затверджено перелік організмів, які мають карантинне значення.

Серед 11 видів карантинних для України бактеріальних хвороб найбільш економічно небезпечними є збудники бактеріального опіку плодових - Erwinia amylovora ( Burrill) Winslow et al та бурої гнилі картоплі - Ralstonia solanacearum (Smith), які є об'єктами зовнішнього карантину більшості країн світу. Плодові культури в нашій країні займають чільне місце в сільськогосподарському виробництві в різних регіонах, а картопля, як відомо, для українців є другим хлібом. Шкідливість цих хвороб надто значна, тому увага до них має бути постійною. Так, у 1976 році в штаті Каліфорнія втрати врожаю плодових культур внаслідок ураження опіком плодових оцінено в 4,7 млн. доларів, в штаті Мічиган (1991 р.) - 3,8 млн. доларів. У Єгипті втрати врожаю від опіку плодових в 1985 році досягали 95%. За підрахунками ФАО, світові втрати потенційно можливого урожаю картоплі від хвороб щорічно складають 88,9 млн. тонн, тобто 11,6% її валового збору, що в 2 рази перевищує втрати урожаю зернових культур, овочів і цукрового буряка. Ареал цих хвороб зростає з кожним роком. В той час як ефективних методів захисту від бактеріозів не існує.

Карантинні заходи, які спрямовані на попередження проникнення та локалізацію бактеріозів є надзвичайно важливими, а відтак методи виявлення та діагностики збудників цих хвороб повинні бути швидкими та високочутливими. При карантинній експертизі рослинного матеріалу висновок про його фітосанітарний стан необхідно давати в стислі строки (1-2 доби). Це потребує створення прискорених високочутливих методів ідентифікації. Значимість вирішення цієї проблеми і обумовила вибір теми дисертаційної роботи, її структуру та актуальність дослідження.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках робочих програм Закарпатського територіального відділу карантину рослин Інституту захисту рослин УААН за завданням 06.- „Удосконалити методи виявлення карантинних шкідників, хвороб та бур'янів, систему спостережень за ними, способи локалізації та знищення (номер державної реєстрації 01970012340) (1996-2000 рр.), за завданням 06.- “Удосконалити методи виявлення, локалізації та ліквідації вогнищ карантинних шкідників, хвороб і бур'янів” (номер державної реєстрації 0101V003711) ( 2000-2005 рр.).

Мета роботи: підібрати найбільш чутливі і раціональні методи виявлення та ідентифікації збудників опіку плодових та бурої гнилі картоплі з урахуванням технічного забезпечення карантинних лабораторій.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

- провести моніторинг плодових насаджень на наявність бактеріального опіку в Закарпатській та Чернівецькій областях України;

- встановити найбільш оптимальні строки появи бактеріального опіку на плодових культурах;

- на основі вивчення існуючих методик ідентифікації E. аmylovora та власних досліджень підібрати найбільш раціональну схему діагностики бактеріального опіку плодових під час проведення карантинної експертизи;

- на базі існуючих в країнах з широким розповсюдженням опіку плодових моделей прогнозування ризику появи та розвитку цієї хвороби підібрати модель, яка б забезпечувала прогнозування ризику появи та розвитку його на території Закарпатської області;

- узагальнити існуючі методи діагностики R. solanacearum та підібрати раціональну схему діагностики бактеріальної бурої гнилі картоплі для карантинної експертизи.

Об'єкти дослідження. Збудники карантинних бактеріозів плодових культур та картоплі, бактерії Erwinia аmylovora 9057, Ralstonia solanacearum 9049, Erwinia carotovora 8982, Corynebacterium sepedonicum 7757, Pseudomonas fluorescens 8573.

Предмет дослідження. Виявлення, прогнозування появи та розвитку опіку плодових, методи прискореної діагностики Erwinia аmylovora та Ralstonia solanacearum.

Методи дослідження. При виконанні поставлених завдань використовували загальноприйняті мікробіологічні, біохімічні та серологічні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше в Закарпатській області (2003р.) виявлено та ідентифіковано збудника бактеріального опіку плодових E. аmylovora. Встановлено, що в цих умовах перебіг хвороби дещо відрізняється від класичного її опису, зокрема виділення молочно-білого ексудату не спостерігається. Найбільший ризик прояву хвороби припадає на період інтенсивного росту дерев.

Вперше підібрано адаптовану до умов Закарпатської області модель прогнозу ризику появи та розвитку бактеріального опіку плодових, яка передбачає визначення інфекційного дня, інкубаційного періоду та появи симптомів як на квітках, так і на інших частинах рослин, і забезпечує своєчасний хімічний контроль хвороби.

Модифіковано методику ідентифікації бактерій E. аmylovora без виділення збудника шляхом проведення реакції кільцепреципітації, яка забезпечує більш високу чутливість виявлення збудника опіку плодових.

Вперше підібрано параметри одержання еритроцитарного діагностикума для ідентифікації E. аmylovora з використанням методики непрямої гемаглютинації з чистою культурою та соком патологічного матеріалу, що забезпечує більш високу чутливість серодіагностики.

Запропонована схема попереднього діагностування збудника бурої гнилі картоплі R. solanacearum, яка дає змогу диференціювати збудників гнилей картоплі протягом доби.

Адаптована щодо фітопатогенних бактерій методика виявлення протеолітичної активності бактерій з використанням фотоплівки, яка забезпечує скорочення тривалості визначення цієї ознаки.

Для прискореної ензим-індикації фітопатогенних бактерій вперше розроблена методика приготування паперових індикаторних дисків (ПІД), використання яких забезпечує уніфікацію процесу, зменшення витрат на матеріали та часу отримання результатів.

Практичне значення одержаних результатів. Визначені критичні періоди появи та розвитку бактеріального опіку плодових можуть бути використані при проведенні моніторингу плодових культур службою карантину рослин України.

Підібрані моделі для прогнозування появи та розвитку опіку плодових можуть бути застосовані для визначення термінів превентивної обробки плодових культур хімічними засобами захисту рослин у вогнищах захворювання.

Підібрані схеми ідентифікації збудників опіку плодових та бурої гнилі картоплі забезпечують скорочення тривалості бактеріологічної експертизи і можуть бути використані в лабораторіях з карантину та захисту рослин.

Приготування імунної сироватки до E. аmylovora за підібраною схемою імунізації кролів забезпечує її високу специфічність і чутливість і може застосовуватись в лабораторіях з карантину рослин та інших установах.

Паперові індикаторні диски для ензим-індикації можуть бути використані при ідентифікації фітопатогенних бактерій.

На основі власних досліджень та даних літератури підготовлені тимчасові методичні вказівки „Виявлення, діагностика та локалізація бактеріального опіку плодових E. amylovora, які опубліковані в 2000 р. разом з Укрголовдержкарантином та передані для обласних інспекцій з карантину рослин та прикордонних пунктів.

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів та їх узагальнення виконані дисертантом особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені та обговоренні на наукових конференціях: “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва (Харків, Інститут рослинництва ім. В.Я.Юр'єва УААН, 1999), на міжнародному регіональному семінарі “Охорона довкілля: сучасні дослідження в екології і мікробіології” (Ужгород, 1997), міжнародному симпозіумі „Екологічні проблеми в захисті рослин і сучасному сільському господарстві” (Братислава, Словаччина, 1996); міжнародній науково-практичній конференції “Спільні агроеколого-економічні проблеми Карпатського регіону” (В.Бакта, 1999); міжнародному симпозіумі „Інтегрований захист плодових культур і винограду” (Ужгород, 2000); міжнародний симпозіум (Познань, Польща, 2001); міжнародний симпозіум (Чопак, Угорщина, 2002). В цілому дисертація заслухана і обговорена на розширеному засіданні Закарпатського територіального відділу карантину рослин ІЗР УААН, на засіданні відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології та вірусології НАНУ, на засіданні вченої ради Інституту захисту рослин УААН в 2004 році.

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано в 6 статтях у фахових наукових журналах, в 9 матеріалах та тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку використаної літератури, який містить 161 найменування першоджерел, в тому числі 100 іноземних.

Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках машинописного тексту. Робота містить 36 таблиць і 31 рисунок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В огляді літератури, який складається з 3-х підрозділів, висвітлено географію, цикл розвитку, симптоми, біологію та методи ідентифікації опіку плодових та бурої гнилі картоплі. Описано моделі прогнозу появи та розвитку опіку плодових. Приведені дані про ензим-індикацію та серологічні методи досліджень бактерій.

Моніторинг плодових насаджень на виявлення бактеріального опіку проводили в Закарпатській області (Ужгородський, Берегівський, Виноградівський, Іршавський райони) та Чернівецькій області (Придністровська науково - дослідна станція Інституту садівництва УААН, Сторожинецький, Кіцманський райони) згідно існуючих методик (Воронкова, 1974). Визначення ступеню ураження бактеріальним опіком різних сортів груші та яблуні в плодових насадженнях Придністровської науково-дослідної станції Інституту садівництва УААН та в приватних садах Закарпатської області проводили за загальноприйнятою методикою (Дементьева, 1970). Мікробіологічний аналіз зразків патологічного матеріалу, вивчення патогенних, фізіологічних та серологічних властивостей ізолятів проводили у відповідності із методами діагностики збудників бактеріозів (Гвоздяк, Матвеева та ін., 1987; Бельтюкова та ін., 1968; Кирай та ін., 1974). Як контроль при проведенні бактеріологічного аналізу, використовували колекційний штам E.amylovora 9057 отриманий з колекції живих культур відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології та вірусології НАНУ.

Імунні сироватки до E.amylovora, які використовували в серологічних реакціях, були отримані нами шляхом імунізації кролів бактеріями E.amylovora штам 9057 за різними схемами імунізації (Бельтюкова, 1968; Schroder, 1978; ). Абсорбцію родоспецифічних антитіл імунної до E.amylovora сироватки проводили шляхом додавання до неї однакового об'єму суміші культур E.carоtovora і P. agglomerans у фізіологічному розчині з наступним відділенням аглютинату шляхом центрифугування.

Для прогнозування появи та розвитку опіку плодових використовували моделі Maryblyt model, Cougarblight - версія 2000 (Celsius), Billing's integrated system та Billing's original system, дані метеорологічних умов Ужгородського та Берегівського районів за 2001-2003 рр., проводили спостереження за фенологічним станом дерев яблуні сортів Айдаред, Джонатан, Старкримсон, Голденспур.

Моніторинг гнилі картоплі в сховищах та на посадках проводили протягом 2000-2002 рр. в Закарпатській області в Ужгородському, Мукачівському, Перечинському та Воловецькому районах згідно існуючих методик. Ідентифікацію збудників проводили за методиками як це описано в роботах: Кирай та ін (1974); French (1995).

Вивчення характеристики збудників гнилей картоплі проводили на колекційних штамах R.solanacearum 9049, 9080, 9081, E.carotovora 8982, C.sepedonicum 7757, P.fluorescens 8573, які були отримані з відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. академіка Д.К.Заболотного НАНУ.

Вивчення культуральних властивостей R. solanacearum, E.carotovora, C.sepedonicum та P.fluorescens проводили на картопляному середовищі, середовищі Кельмана з 2,3,5 тетразолій хлоридом, середовищі Кінга В (Бельтюкова, 1968).

Вивчення спектру рослин, здатних уражуватись бактеріями R. solanacearum, проводили шляхом штучного інфікування листків та пагонів картоплі, томатів, перцю, тютюну, баклажанів бактеріальною суспензією 10⁸ кл/мл методом ін'єкції та нанесенням суспензії на пошкоджені місця. Облік ураженості рослин проводили за шкалою, запропонованою Aley та ін. (1994).

Диференціацію бактеріозів картоплі без виділення збудника проводили на основі реакції з КОН та тестів на уреазу (Cowan, 1974) і оксидазу (Lloyd,1978). Вивчення протеолітичної активності бактерій за допомогою фотоплівки проводили за методикою, описаною Кузнєцовою (1989).

Для прискорення ензим-індикації фітопатогенних бактерій виготовляли з фільтрувального паперу індикаторні диски діаметром 0,5 мм, які насичували розчином цукрів та багатоатомних спиртів різних концентрацій (1%, 5% та 10%) і вносили в стерильні (0,4% та 0,04%) розчини індикатора при температурі 18⁰С та 25⁰С протягом 0,5, 1 та 24 годин. Оцінку біохімічної активності бактерій за допомогою паперових індикаторних дисків проводили мікрометодом. У пробірку з 0,3 мл стерильного фізіологічного розчину (рН 7,2-7,4) вносили петлю добової агарової культури мікроба, а потім додавали відповідний паперовий індикаторний диск. Облік проводили через 2, 3 та 24 години інкубації при температурі 28⁰ С за характером зміни кольору індикатора. Контролем були диски, занурені в стерильний фізіологічний розчин без внесення бактерій та класичний метод вивчення біохімічної активності за допомогою кольорового ряду.

При вивченні способу засвоєння глюкози за допомогою паперових індикаторних дисків в дві пробірки з 0,3 мл фізіологічного розчину (рН 7,2) та петлею добової культури вносили диски і одну пробірку заливали стерильним вазеліновим маслом. Обліки проводили через 3-5 годин інкубації при температурі 28⁰С. Контролем були аналогічні пробірки без внесення маси культури бактерій, а також пробірки з 1% агаром з глюкозою та індикатором і ідентичною культурою, одна з яких заливалась мінеральним маслом. Інкубацію проводили протягом 3 діб при температурі 28⁰С.

Каталазну активність у бактерій визначали за методикою, запропонованою Варвашевич з співавторами (1989).

Постановку реакції кільцепреципітації без виділення бактерій в чисту культуру здійснювали за методикою Ізраїльського (1967), але кількість досліджуваного матеріалу було збільшено в 10 раз і додавали 0,5% сахарози в фізіологічному розчині, ставили в термостат на 3 год. при 28⁰С.

Реакцію непрямої гемаглютинації здійснювали за методом Рицаря з виготовленим нами еритроцитарним діагностикумом (Бокшан, 2002).

Реакцію непрямої гемаглютинації без виділення збудника в чисту культуру здійснювали з екстрактом патологічного матеріалу, підготовленого так, як і для постановки реакції кільцепреципітації.

Моніторинг плодових культур на виявлення бактеріального опіку в Закарпатській та Чернівецькій областях України. Протягом 8 років (1996-2003 рр.) проведено вибірковий моніторинг плодових садів на виявлення опіку плодових в 20 населених пунктах Закарпатської та 10 населених пунктах Чернівецької областей. Вперше в Чернівецькій області бактеріальний опік плодових був виявлений в 1997 році, а в Закарпатській області - в 2003 році. До цього часу на території України ця хвороба не реєструвалася.

Спостереження за симптомами хвороби показали відсутність характерного молочно-білого ексудату, але інші ознаки (гачкоподібний згин верхівок молодих пагонів, зміна кольору листя на груші до чорного, а на яблуні до коричневого, розтріскування кори з відшаруванням епідермісу, муміфікація плодів груші та яблуні) вказували на подібність захворювання до бактеріального опіку плодових. Хвороба на груші охоплювала всю верхівкову частину дерева і поступово спускалась на нижні гілки, а на деревах яблуні спостерігали лише часткове ураження окремих скелетних гілок.

В період цвітіння плодових культур симптомів прояву хвороби як в Чернівецькій так і в Закарпатській областях не спостерігали. Перші симптоми захворювання проявлялись на молодих пагонах. Спалах хвороби припадав на кінець червня - початок липня, коли відбувався інтенсивний ріст рослин.

За період моніторингу в Чернівецькій області з 281 зразка було виділено 146 патогенних ізолятів, із яких E .amylovora складала 81 ізолят. В Закарпатській області було відібрано і проаналізовано 1144 зразків, з яких виділено 289 патогенних ізолятів, із них 79 ізолятів E .amylovora, які виявлені лише в 2003 році, інші патогенні ізоляти (210) ідентифіковані як P. syringae і виділялись щорічно. При обстеженні насаджень яблуні та груші в Придністровській дослідній станції Інституту садівництва УААН спостерігали різну сортову чутливість рослин до збудника опіку плодових.

Характеристика виділених патогенних штамів бактерій. За період дослідження в Закарпатській області із ураженого матеріалу було виділено 521 ізолят, а в Чернівецькій -199 ізолятів бактерій, тобто в загальній кількості 720 ізолятів.

За здатністю утворювати на середовищі Кінга В флуоресцентний пігмент всі бактерії розділили на 2 групи: нефлуоресціюючі - 335 ізолятів і 385 ізолятів, які здатні були утворювати цей пігмент. Особливу увагу приділяли групі бактерій, які нездатні дифундувати в середовище жовто-зелений пігмент, що характерно для збудника опіку плодових. При культивуванні цієї групи бактерій на середовищах Кадо і Гаскет (Д₃) та Кроса і Гудмана виявили два типи колоній. Одна частина (160 ізолятів) на середовищі Кадо і Гаскет (Д₃) через 3 доби утворювали червоно-оранжеві колонії, на середовищі Кроса і Гудмана колонії мали посередині кратероподібні заглибини при розгляді їх під малим збільшенням мікроскопу, а при культивуванні на поживному агарі з 5% сахарози утворювали так звані леван-колонії, які мали куполоподібний вигляд. Друга частина нефлуоресціюючих бактерії утворювала червоно-оранжевий пігмент на середовищі Д₃ уже через 24 години, на середовищі Кроса і Гудмана колонії були без кратероподібних заглибин. При рості на середовищі Кінга через 48 годин спостерігали дисоціацію колоній на безпігменту та з жовтим пігментом, а з часом такого кольору набували всі колонії.

Патогенні властивості на незрілих плодах груші та реакція надчутливості на листках тютюну були виявлені лише у 160 ізолятів. Подальші вивчення непатогенних нефлуоресціюючих ізолятів показали їх належність до P. agglomerans. У флуоресціюючих бактерій патогенні властивості були виявлені лише у 210 із 385 ізолятів.

На основі даних літератури і встановлених культуральних, морфологічних, біохімічних та серологічних властивостей виділених патогенних штамів нефлуоресціюючі бактерії було ідентифіковано як E. amylovora, а флуоресціюючі - як P. syringae.

Для підтвердження належності виділених штамів до E. amylovora було проведено аналіз на молекулярному рівні шляхом постановки полімеразної ланцюгової реакції в Московській Центральній науково-дослідній лабораторії з карантину рослин.

Серологічні методи діагностики збудника опіку плодових Erwinia amylovora. Порівняно три схеми імунізації кролів антигенами E. amylovora.

Із 10 кролів, імунізацію яких проводили згідно схеми 1 (Бельтюкова), до кінця процедури вижило лише 2 кролі. При імунізації за схемою 2 (G.M.Schroder) також спостерігали загибель чотирьох із 10 тварин через 1 добу після третьої ін'єкції. При імунізації за схемою 3 (Бокшан, Садляк) загинув лише один кріль на 25 день від початку імунізації.

Для встановлення специфічності імунних до E. amylovora сироваток використовували штами бактерій E. amylovora, E.carotovora, P. agglomerans та P.syringae. Встановлено, що реакції аглютинації на склі та в пробірках виявилися менш специфічними в порівнянні з реакціями кільцепреципітації та гемаглютинації. При проведені реакції аглютинації на склі з клітинами E.carotovora та P.agglomerans спостерігали часткове їх склеювання. Позитивною була і реакція аглютинації в пробірці з клітинами бактерій E.carotovora та P.agglomerans в розведенні 1:50; 1:100. Проте в жодному випадку не спостерігали позитивних результатів при взаємодії з бактеріями P.syringae.

Для підвищення специфічності сироваток проводили абсорбцію імунної сироватки неспецифічних антитіл бактеріями E. carotovora та P. agglomerans. Абсорбована сироватка в реакціях аглютинації реагувала лише з бактеріями E. amylovora

Відмічено зниження титру сироватки при абсорбції двома видами бактерій в реакції аглютинації з бактеріями E. amylovora до 1:6400.

При порівнянні різних серологічних методів (аглютинація на склі, аглютинація в пробірках, реакція кільцепреципітації та реакція непрямої гемаглютинації) при різних навантаженнях бактерій E. amylovora було встановлено, що найбільш чутливою була реакція непрямої гемаглютинації.

Враховуючи високу чутливість реакції непрямої гемаглютинації, яка базується на феномені аглютинації еритроцитів, які несуть на своїй поверхні антитіла, нами підібрані параметри одержання антитільного еритроцитарного діагностикума для ідентифікації E. Amylovora.

Формалінізовані і танізовані еритроцити зберігались в холодильнику протягом 3-х тижнів. Сенсибілізацію еритроцитів необхідно здійснювати протягом 20 хв. при температурі 37⁰С безпосередньо перед постановкою реакції непрямої гемаглютинації, використовуючи 1 об'єм еритроцитів і 4 об'єми сироватки при рН 6,4.

Моделювання прогнозу ризику появи та розвитку бактеріального опіку плодових. В країнах широкого розповсюдження опіку плодових розроблено ряд моделей по сигналізації появи захворювання, що дозволяє вчасно застосовувати пестициди як проти патогена, так і проти комах-поширювачів.

В Україні моделі по прогнозуванню появи та розвитку бактеріального опіку плодових в умовах наших регіонів відсутні. Ми проаналізували чотири моделі прогнозування ризику появи та розвитку бактеріального опіку плодових (Maryblyt model, Cougarblight - версія 2000 (Celsius), Billing's integrated system та Billing's original system), які базуються на біотичних та абіотичних факторах. Найбільш оптимальною для прогнозування ризику появи та розвитку опіку плодових була модель Maryblyt, яка передбачає інфекційний день, інкубаційний період та появу симптомів як на квітках, так і на інших частинах рослин. Проведені розрахунки за даною моделлю показали, що в період цвітіння 2001-2002 рр. не було відповідних умов для інфікування та розвитку хвороби.

У Берегівському районі в 2001 році 110 градусо-годин >18⁰С, які необхідні були для накопичення патогена, досягли 29.04, але на даний період проникнення інфекції лімітувалось недостатнім зволоженням квітів. В 2002 році відповідна сума градусо-годин >18⁰С досягла 1 травня, але середньодобова температура складала лише 13,2⁰С, в той час як для інфікування необхідно 15,6⁰С. В 2003 році 110 градусо-годин >18⁰С досягла 29 квітня, середньодобова температура складала 17,9⁰С, напередодні випали опади 2,5 мм, отож цей день можна вважати сприятливим для проникнення інфекції. Для попередження захворювання в цей день необхідно було б провести хімічний захист рослин відповідними препаратами.

Згідно моделі Maryblyt для появи симптомів на квітках необхідно, щоб було 57 градусо-днів >12,7⁰C, тобто це так званий інкубаційний період, за проведеними спостереженнями в 2003 році він наступив 6 травня, коли цвітіння закінчилося. Тому симптомів опіку квіток не спостерігали.

При розрахунку прогнозу появи симптомів на зелених пагонах встановлено, що цей період в 2003 році припав на 25 травня. Фактично перші симптоми опіку плодових на яблуні в Берегівському районі було зафіксовано 28 травня, тобто прогнозовані розрахунки співпали з проявом хвороби.

Вибіркове обстеження бульб картоплі в сховищах та посадок картоплі проводили в Закарпатській області в трьох агрокліматичних зонах (низинній, передгірній та гірській), зокрема в Ужгородському, Мукачівському, Перечинському та Воловецькому районах протягом 2001-2002 рр.

При аналізі бульб картоплі (238 зразків) бурої гнилі картоплі (Ralstonia solanacearum) не було виявлено, проте виявлено незначне ураження кільцевою та мокрою гниллю. Ураженість бульб картоплі збудником кільцевої гнилі після зимівлі в 2002 році була невисокою. Зокрема, у Воловецькому районі вона становила 2,1%, Перечинському - 1,9%, Мукачівському - 1,3%, Ужгородському - 0,9%.

Подібність симптомів проявлення хвороб картоплі при ураженні їх бактеріями R. solanacearum, C .sepedonicum, E. carotovora вимагають проведення детальної діагностики збудників. Вивчення характеристики росту бактерій на середовищах Кельмана, картопляному та Кінга В дозволяє визначити родову їх належність. Колонії P. fluorescens на середовищі Кельмана були такого ж забарвлення, як і колекційні культури R. solanacearum, але відрізнялись тим, що в них забарвлення було рівномірним, без утворення світлої облямівки і мали округлу форму. Бактерії C. sepedonicum утворювали на другу добу культивування світлі колонії і лише через 5 днів спостерігалось утворення світло-червоного пігменту. Колонії бактерій E. carotovora залишались безбарвними протягом періоду досліджень. Для розділення бактерій R. solanacearum і P. fluorescens, можна використовувати середовище Кінга В, на якому P. fluorescens утворює флуоресцентний пігмент.

При вивченні біохімічних властивостей різних збудників гнилей картоплі встановлено, що E.carotovora здатна використовувати ті ж самі вуглеводи (мальтоза, лактоза, целобіоза) та багатоатомні спирти (маніт, сорбіт), що і R.solanacearum біовар 3. Збудник кільцевої гнилі C.sepedonicum за своїми біохімічними властивостями відрізняється від R.solanacearum біовару 4 лише тим, що нездатний використовувати дульцит. В той же час біовари R.solanacearum за біохімічними ознаками значно відрізняються один від одного. Таким чином, при вивченні біохімічних властивостей патогенів, виділених з рослин картоплі, слід завжди пам'ятати про наявність різних біоварів і для ідентифікації до виду включати інші тести.

Встановлено, що перші етапи диференціювання бактеріальних гнилей картоплі в польових умовах та в умовах прикордонних пунктів карантину рослин можна проводити без виділення збудника в чисту культуру.

При наявності Грам негативних та оксидазо- і уреазо- позитивних бактерій необхідно проводити виділення бактерій на напівселективному середовищі Кельмана та середовищі Кінга В з подальшим вивченням всіх характеристик (патогенність, біохімічні властивості та ін.).

Для вивчення біохімічних властивостей фітопатогенних бактерії нами підібрано набір відповідних вуглеводів та багатоатомних спиртів та умови імпрегнування ними паперових дисків.

Встановлено, що найбільш оптимальною була 10% концентрація вуглеводів та багатоатомних спиртів та термін просочування паперових дисків 30 хвилин.

На біохімічну активність бактерій при застосуванні паперових дисків впливає температура. Найбільш оптимальною була температура 28⁰С. Зміни рН середовища спостерігали через 3-5 годин. Як контроль біохімічної активності бактерій використовували ряди Гіса з такими ж речовинами, де біохімічна активність спостерігалась лише через 24 і більше годин. Таким чином встановлено, що при застосуванні мікрометоду з використанням паперових дисків біохімічну активність бактерій можна встановити набагато швидше, ніж класичним методом.

Шляхом визначення типу утилізації бактеріями глюкози визначають їх родову належність. Зокрема бактерії роду Pseudomonas та Ralstonia здатні до кисневого використання глюкози, а бактерії роду Erwinia - до ферментативного. Тривалість класичного O/F- тесту складає не менше ніж 24 години. Постановка цього тесту за допомогою паперових індикаторних дисків дає змогу скоротити цей час до 3-х годин.

Встановлено, що використання засвіченої проявленої фотоплівки, яка вноситься в субстрат з мікроорганізмами, значно скорочує (більш ніж у 2 рази) час виявлення протеолітичної активності у фітопатогенних бактерій в порівнянні з класичним методом.

При вивченні каталазної активності бактерій за йод-крохмальним методом встановлена пряма залежність цієї ознаки від ступеня вірулентності штаму. За допомогою цієї методики каталазна активність була виявлена у всіх досліджуваних бактерій (E. amylovora, E.carоtovora, P.syringae, R.solanacearum). При вивченні каталазної активності у бактерій R. solanacearum було відмічено підвищення її у штамів, які декілька раз пасивувались на рослинах. Величина білих зон навколо внесених бактерій E.amylovora, виділених із патологічного матеріалу, була значно більшою, ніж навколо колекційного штаму цієї культури. Таким чином, даний метод є надійним і інформативним і дозволяє робити висновки про вірулентність досліджуваної культури.

Порівняльне вивчення прискорених методик виявлення E. amylovora показало, що найбільш чутливим є метод непрямої гемаглютинації.

Модифікована нами реакція кільцепреципітації дає змогу підвищити ймовірність виявлення E. amylovora з 88 до 98 відсотків.



ВИСНОВКИ

1. Вперше в Закарпатській (2003 р.) області виявлено та ідентифіковано збудника бактеріального опіку плодових E. аmylovora. Встановлено, що в умовах Закарпатської та Чернівецької областей перебіг хвороби дещо відрізняється від класичного її опису, зокрема виділення молочно-білого ексудату не спостерігається. Характер утворення виразок на гілках залежить від чутливості сорту.

2. Встановлено, що із трьох критичних періодів чутливості плодових культур до опіку плодових (цвітіння, інтенсивного росту, осіннього сокоруху) найбільший ризик прояву захворювання в умовах Закарпатської та Чернівецької областей припадає на період інтенсивного росту дерев.

3. Вперше в Україні проведено оцінку чутливості сортів яблуні та груші, які культивуються в Чернівецькій та Закарпатській областях до збудника бактеріального опіку плодових в природних умовах. При спостереженні протягом 4 років за 9 сортами груші (Киргизька зимова, Яблунівська, Олів'є де Серр, Ноябрська, Жак Тел'є, Кучерянка, Конференція, Старкримсон, Парижанка) в Чернівецькій області стійкість до бактеріального опіку виявлена лише у сорту Киргизька зимова. Сорти Конференція, Старкримсон, Парижанка виявились найбільш чутливими. У яблуні стійкими до бактеріального опіку плодових були сорти Мелба, Слава переможцям, Боскопська красуня, найбільш чутливими - Вагнера призове, Мантуанське, Ренет ландсберський.

4. В Закарпатській області бактеріальний опік плодових виявлено на сортах груші Конференція, Кучерянка, Кюре, Парижанка, яблуні - Айдаред, Джонатан.

5. Різну сортову чутливість плодових культур до цієї хвороби необхідно враховувати при проведенні моніторингу на виявлення бактеріального опіку плодових та при закладанні нових садів.

6. Прогнозування появи та розвитку бактеріального опіку плодових в умовах Закарпатської області можна здійснювати на основі моделі Maryblyt, яка передбачає інфекційний день, інкубаційний період та появу симптомів як на квітках, так і на інших частинах рослин і забезпечує своєчасний хімічний контроль хвороби.

7. На основі вивчення існуючих методик ідентифікації E. amylovora та власних досліджень розроблено схему прискореної діагностики збудника бактеріального опіку плодових, яка включає тест на патогенність на незрілих плодах груші, серологічні реакції (кільцепреципітації та пасивної гемаглютинації) без виділення збудника, характер росту виділених бактерій на середовищах Кінга В, Кадо і Гаскет, Кроса та Гудмана, розташування джгутиків у бактеріальної клітини та спосіб утилізації глюкози.

8. Підібрано схему імунізації кролів антигенами E. amylovora, яка забезпечує одержання високоспецифічної антисироватки.

9. Вперше підібрано параметри одержання еритроцитарного діагностикума для ідентифікації E. аmylovora з використанням методики непрямої гемаглютинації з чистою культурою та соком патологічного матеріалу.

10. В результаті вибіркового моніторингу картоплесховищ та посадок картоплі в Закарпатській області карантинного захворювання бурої гнилі картоплі (Ralstonia solanacearum) не виявлено.

11. Узагальнено існуючі методи діагностики Ralstonia solanacearum та запропоновано схему розділення збудників гнилей картоплі на основі вивчення тинкторіальних, культуральних та біохімічних властивостей.

12. Розроблена методика приготування паперових індикаторних дисків та методика їх використання для прискореної ензим-індикації фітопатогенних бактерій, що дозволяє вияснити біохімічну активність бактерій протягом 3-8 годин.

Практичні рекомендації

1. В опублікованих 2000 р. методичних вказівках “Виявлення, діагностика та локалізація бактеріального опіку плодових E.amylovora” та переданих для обласних інспекцій та прикордонних пунктів з карантину рослин рекомендовано обстеження плодових культур на виявлення опіку плодових проводити в три періоди: цвітіння, інтенсивного росту та період сокоруху. Попередню діагностику бактеріального опіку плодових проводити шляхом проведення реакції кільцепреципітації без виділення збудника з патологічного матеріалу.

2. Спеціалістам карантинних лабораторій пропонується скорочена схема ідентифікації E.amylovora, яка включає тест на патогенність на незрілих плодах груші, характер росту на середовищах Кінга В, Кадо і Гаскет, Кроса та Гудмана, розташування джгутиків в бактеріальній клітині, спосіб засвоєння глюкози та реакцію кільцепреципітації з імунною сироваткою.

3. Пропонується скорочена схема ідентифікації бактерій R.solanacearum, яка включає тест на патогенність на рослинах томатів чи картоплі, на оксидазу та уреазу, характер росту на середовищі Кельмана, Кінга В, вивчення біохімічних властивостей патогена мікрометодом з використанням паперових дисків, імпрегнованих відповідною речовиною.



СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Sadlyak A., Bokshan O., Shtejfan Z. The role of the accelerated methods of the pathogens in identification for plant protection // Proceeding environmental protection. Uzhgorod.- 1997.- vol.2. Р.219-220 (особистий внесок здобувача 60%. Проведено експерименти. Зроблено висновки).

2. Садляк А.М., Бокшан О., Лукач М. Бактеріальний опік - нова загроза ландшафтному різноманіттю Закарпаття // Зб. наук. праць Аграрний вісник Причорномор'я. Частина II: Агрономія. Одеса.- 1999.- Вип. 3 (6). - С. 175-176 (особистий внесок здобувача 60%).

3. Садляк А.М., Бокшан О., Кіш І.Б., Лукач М. Бактеріальний опік плодових - нова небезпека садів країни // Захист рослин. - 1999.- №6. - С.22 (особистий внесок 60%. Проведено лабораторні дослідження. Зроблено висновки).

4. Бокшан О. Я., Садляк А.М. Особливості розвитку опіку плодових в Умовах Чернівецької області // Зб. наук. статей міжнародного симпозіуму “Інтегрований захист плодових культур і винограду”. -Ужгород. - 2000. - С.27-31 (особистий внесок здобувача 60%. Проведено спостереження за розвитком захворювання в Чернівецькій області. Проведено лабораторні дослідження. Зроблено висновки).

5. Бокшан О.Я. Особливості приготування еритроцитарних діагностикумів до Erwinia amylovora // Зб. наук. статей міжнародного симпозіуму “Інтегрований захист плодових культур і винограду”. -Ужгород. - 2000. - С.25-26.

6. Бокшан О.Я. Особливості розвитку бактеріального опіку плодових в умовах України та його діагностика // Науковий вісник УжДУ. - Серія Біологія. - №8, 2000. С.7-8.

7. Bokzan O.,.Sadlak A. Udoskonalenie technologii uziskania monospecyficznych surowic metoda hemoaglutynacji do diagnostyki Erwinia amylovora //Ochrona Roslin..- №9/10/2001, s.39-40 (особистий внесок здобувача 90%. Підібрано схему одержання імунних до Erwinia amylovora сироваток та параметри одержання еритроцитарного діагностикума для ідентифікації E. аmylovora. Зроблено висновки).

8. Бокшан О., Садляк А. Некоторые ускоренные методы диагностики бактериозов при фитосанитарном контроле растительной продукции // Информ. бюллетень ВПРС МОББ. С-Петербург. - 2002.- С.136-137 (особистий внесок здобувача 90%. Проведено експерименти. Зроблено висновки).

9. Бокшан О.Я. Кільцева гниль картоплі // Захист рослин. - 2002.- №9. - С.21-22.

10. Бокшан О.Я., Садляк А.М. Бактериальный ожог плодовых // Защита и карантин растений. - 2003. -№3. - С.32 (особистий внесок здобувача 70% . Проведено експерименти. Зроблено висновки).

11. Бокшан О.Я., Садляк А.М. Диагностика бактериального ожога плодовых // Защита и карантин растений. - 2004. -№3. - С.46-47 (особистий внесок здобувача 90%. Проведено аналіз літератури, експерименти, зроблено висновки).

12. Садляк А.М., Бокшан О.Я., Лукач М.І. Деякі аспекти діагностики збудника опіку плодових (Erwinia amylovora ( Burrill) Winslow et al) //Тези доповідей міжнародної конференції, присвяченої 90-річчю від заснування Інституту рослинництва ім. В.Я.Юр'єва УААН “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва”. - Харків. - 1999. - С.436 (особистий внесок здобувача 70% . Проведено експерименти. Зроблено висновки).

13. Садляк А.М., Бокшан О.Я. Інтродукція стійких сортів - основний напрямок захисту плодових культур від бактеріального опіку (Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al) //Тези доповідей міжнародної конференції, присвяченої 90-річчю від заснування Інституту рослинництва ім. В.Я.Юр'єва УААН “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва”. - Харків. - 1999. - С.306 (особистий внесок здобувача 90%. Проведено аналіз літератури, експерименти, зроблено висновки).

14. Бокшан О. Выживаемость Erwinia amylovora в различных по формах язвах // Тезисы докладов симпозиума “Биоценотическая регуляция - основа современных систем интегрированной защиты сельскохозяйственных культур”. - Познань. - 2001. - С.61.

15. Бокшан О., Садляк А. Некоторые ускоренные методы диагностики бактериозов при фитосанитарном контроле растительной продукции // Тезисы докладов симпозиума “Биоценотическая регуляция - основа современных систем интегрированной защиты сельскохозяйственных культур”. - Познань. - 2001. - С.63 (особистий внесок здобувача 90%. Проведено аналіз літератури, експерименти, зроблено висновки).

Размещено на Allbest.ru

...