Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК:634.8:632.28

ДІАГНОСТИКА ВІРУСНИХ ХВОРОБ

В ПРОЦЕСІ ОДЕРЖАННЯ ЗДОРОВОГО САДИВНОГО МАТЕРІАЛУ ВИНОГРАДУ

06.01.11-фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Щербина Алла Володимирівна

КИЇВ - 2004

АНОТАЦІЇ

Щербина А.В. Діагностика вірусних хвороб в процесі одержання здорового садивного матеріалу винограду. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 06.01.11 - фітопатологія. - Національний аграрний університет, Київ, 2004.

Вивчено ступінь ураження вірусами сортів і клонів сортів винограду. За допомогою імуноферментного аналізу показано, що найбільш розповсюдженим на тестованих сортах і клонах є вірус мармуровості винограду. На винограді також виявлено віруси коротковузля, перший та третій серотипи вірусу скручування листя винограду, однак рівень ураження дослідженого матеріалу цими вірусами незначний.

Показано, що клоновий добір разом із санітарною селекцією є ефективним методом зниження ступеня ураження садивного матеріалу винограду шкідливими вірусними хворобими.

Проведена оптимізація імуноферментного виявлення трьох вірусів винограду. Виявлено тканини та органи, які є найкращим матеріалом для детекції вірусів коротковузля, скручування листя та мармуровості винограду.

Садивний матеріал винограду, інтродукований зі США, було тестовано на неповіруси.

Розроблено метод виявлення латентної вірусної інфекції винограду за допомогою радіоактивно міченою длРНК зонду. Чутливість методу складає 1-10 нг вірусної РНК у зразку.

Вивчено розповсюдження видів нематод на клонодослідних ділянках. Встановлено видовий склад кокцид на виноградниках Одеської області. До основних видів відносяться Pulvinaria vitis, Parthenolecanium corni і Pseudococcus longispinous, який є переносником віруса скручування листя.

За допомогою методів термотерапії in vitro та культури меристеми проведено оздоровлення винограду від вірусної інфекції. Отримано здоровий садивний матеріал сортів Голубок та Рубір таїровський.

Ключові слова: санітарна селекція, виноград, імуноферментний аналіз, двоспіральна РНК, здоровий садивний матеріал.

Щербина А.В. Диагностика вирусных болезней винограда в процессе получения здорового посадочного материала винограда. -Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 06.01.11 - фитопатология. - Национальний аграрный университет, Киев, 2004.

Изучена степень поражения вирусами сортов и клонов винограда. При помощи иммуноферментного анализа покозано, что наиболее распространенным на тестированных сортах и клонах является вирус мраморности винограда, степень поражения которым может достигать 80 %. На винограде также выявлены вирусы короткоузлия, первый и третий серотип вируса скручивания листьев винограда, однако уровень поражения исследованного материала этими вирусами небольшой. Вирус А винограда, вызывающий бороздчатость древесины, на изученном материале не обнаружен.

Клоновый отбор в сочетании с санитарной селекцией является эффективным методом снижения степени поражения посадочного метериала винограда вредоносными вирусными болезнями. Применение санитарной селекции способствует повышению качества посадочного материала и увеличение его приживаемости. Это положение подтверждается значительно меньшей степенью поражения кустов клонов по сравнению с исходными сортами. В первую очередь это относится к полулатентным заболеваниям (мраморность винограда), которые не выявляются визуально и не влияют на агробиологические показатели растений, но значительно снижает выход привитых саженцев из школки.

Проведена оптимизация иммуноферментного выявления трех вирусов винограда. Определены ткани и органы, которые являются наилучшим материалом для детекции вирусов короткоузлия, скручивания листьев и мраморности винограда. Детекцию вируса короткоузлия лучше проводить в конце июня - начале июля в молодых побегах, усиках и листьях винограда. Вирус мраморности хорошо определяется в начале июня и после снижения температуры в конце сентября - начале октября. Вирус скручивания листьев целесообразно выявлять во второй половине вегетации в соскобах кортикального слоя молодых побегов, ягодах и листьях.

Тестирование посадочного материала, интродуцированного из США, на неповирусы, показало отсутствие в посадочном материале вируса кольцевой пятнистости томата и табака, вируса розеточной мозаики персика и вируса мозаики резухи. Полученные данные подтвердили санитарную безопасность интродукции новых сортов и клонов в Украину из региона, где встречаются вышеперечисленные вирусы.

Изучение дсРНК, ассоциированной с соконепереносимыми вирусными болезнями винограда (прижилковая мозаика, бороздчатость древесины и скручивание листьев винограда) дало возможность охарактеризовать ее по молекулярной массе. Как правило, во всех образцах дсРНК исследуемых заболеваний присутствовала высокомолекулярная линия (7,5 - 8 х 10⁶ Д).

Анализ электрофоретических профилей дсРНК был применен для предварительного тестирования клонов подвоев и привоев, при этом объективность данных анализа подтверждается последующими результатами ИФА.

На основе выделения дсРНК, ассоциированной со скручивания листьев, разработан метод выявления латентной вирусной инфекции винограда при помощи гибридизации с радиоактивно меченым зондом. Высокая чувствительность метода составляет (1 - 10 нг вирусной РНК в пробе) и простота выполнения анализа позволили применить его при тестировании кустов клонов винограда в процессе получения безвирусного исходного донорского материала клонов.

Изучен видовой состав нематод и плотность их популяции на участках клоноиспытания, при этом виды, которые способны переносить неповирусы (Xiphinema index и Xiphinema italiae), не были обнаружены.

Определен видовой состав кокцид на виноградниках Одесской области. К числу основных видов, которые встречаются на данных насаждениях, относятся Pulvinaria vitis, Parthenolecanium corni і Pseudococcus longispinous. Последний вид является переносчиком вируса скручивания листьев винограда, что подтверждено в опыте на вегетирующих растениях сорта Каберне Фран, являющегося индикатором скручивания листьев.

При помощи методов термотерапии in vitro и культуры меристемы проведено оздоровление винограда от скручивания листьев и мраморности винограда. Термотерапия продолжительностью от 6 до 15 недель дала возможность получить здоровый исходный материал сортов Голубок и Рубин таировский для дальнейшего размножения и получения сертифицированного посадочного материала.

Ключевые слова: санитарная селекция, виноград, иммуноферментный анализ, двуспиральная РНК, здоровый посадочный материал.

Scherbina A.V. Diagnostics of virus diseases in the process of healthy grapevine planting material production (obtaining). - Manuscript.

The dissertation for candidate degree by speciality 06.01.11 - Phytopathology. - National Agrarian University, Kyiv, 2004.

The level of virus infection on grapevine cultivars and clones is studied. The high level of grapevine fleck virus infection is showed. The amount of grapevine fanleaf and leafroll virus infection is not so high.

It has been demonstrated that clonal selection together with sanitary selection is a very effective method to decrease the level of virus infection.

The optimization of ELISA-test for three grapevine viruses is done. The best tissues and organs for reliable ELISA detection is estimated.

Planting material from USA is tested for nepoviruses.

DsRNA from grapevine affected by vein mosaic, rugose wood and grapevine leafroll is characterized.

The method of grapevine latent infection detection by hybridization with radioactive labeled probe (dsRNA associated with leafroll) was elaborated. The sensivity of this method is near 1 - 10 ng of virus RNA per sample.

The distribution of nematode species on clonal assays plots is studied.

It has been established that the main species of coccides in Odessa region vineyards is Pulvinaria vitis, Parthenolecanium corni and Pseudococcus longispinus. The last one (as is shown by our experiments) can transmit grapevine leafroll virus.

By thermotherapy and meristeme culture methods the healthy initial material of Golubok and Tairov's Rubi is obtained.

Key words: sanitary selection, enzyme-linked immunosorbent assay, double-stranded RNA, healthy planting material.

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті виноградарства і виноробства ім. В.Є. Таїрова УААН

Науковий керівник - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Мілкус Борис Наумович, Розсадницький комплекс ЗАТ “Одеський коньячний завод”, завідуючий лабораторією вірусології та мікробіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, академік УААН Бойко Анатолій Леонідович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри вірусології

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Таранухо Микола Павлович, Інститут садівництва УААН, старший науковий співробітник лабораторії вірусології

Провідна установа - Харківський національний аграрний університет імені В.В. Докучаєва, кафедра фітопатології, Міністерство аграрної політики України, м. Харків

Захист відбудеться “24” грудня 2004 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої ради Д 26.004.02 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус №3, аудиторія 65

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус №4, кімната 41

Автореферат розісланий “19” листопада 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Мороз М.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В Україні нині виявлено 44 різних вірусних і вірусоподібних захворювань винограду. До числа найбільш шкідливих належать коротковузля, скручування листя, борознистість деревини і мармуровість винограду (Мілкус Б.Н., 1983; Milkus B.N., Schterenberg P.M., et. al., 1978).

В останні роки в країні докладаються зусилля з метою відродження системи отримання винограду, вільного від цих захворювань, на основі клонів різних сортів, а також виробництва садивного матеріалу, який відповідав би показникам сертифікації.

Актуальність роботи визначається необхідністю застосування комплексу методів, які дозволяли б виявляти латентне ураження вірусними хворобами в тканинах винограду, гарантуючи високу чутливість одночасно зі швидкістю проведення аналізу.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до робочої програми лабораторії вірусології і мікробіології Інституту виноградарства і виноробства ім. В.Е. Таїрова УААН і згідно з завданнями № 1.04. “Провести перевірку кущів клонів винограду на наявність вірусних інфекцій та бактеріального раку винограду, виділити для розмноження здорові клони. Провести оздоровлення клонів, уражених вірусами та бактеріальним раком” і № 4 “Розробити та застосувати комплекс молекулярно-біологічних та біотехнологічних методів діагностики вірусних і бактеріальних хвороб винограду з метою одержання здорового садивного матеріалу цінних сортів та клонів винограду” (номер державної реєстрації 0198U002660).

Мета і завдання досліджень - розробка комплексу методів діагностики вірусних хвороб винограду, а також отримання вихідного матеріалу, вільного від шкідливої вірусної інфекції.

Дослідження спрямовані на вирішення таких завдань:

оптимізувати метод ІФА для ідентифікації вірусів коротковузля, скручування листя та мармуровості винограду; встановити оптимальний тип матеріалу та період проведення діагностики;

розробити молекулярно-біологічні методи діагностики вірусних хвороб винограду на основі аналізу длРНК і гібридизації з длРНК зондами;

провести тестування сортів винограду і кущів клонів на наявність латентної вірусної інфекції за допомогою імуноферментного аналізу, аналізу длРНК, а також щеплення на сорти-індикатори. Виділити здорові клони для подальшого розмноження;

встановити видовий склад переносників вірусної інфекції (нематод і кокцид) на виноградниках Одеської та Херсонської областей; дослідити можливість переносу вірусу скручування листя кокцидами;

одержати здоровий садивний матеріал винограду за допомогою термотерапії і культури меристем.

Об'єкт досліджень - найбільш шкідливі вірусні захворювання винограду, розповсюджені в Україні: коротковузля, скручування листя (І і ІІІ серотипи), борознистість деревини і мармуровість винограду та їх переносники. вірус виноград гібридизація хвороба

Предмет досліджень. Виявлення й ідентифікація збудників вірусних захворювань винограду, визначення оптимального матеріалу для проведення цiлорiчного аналізу, виявлення періоду вегетації, найсприятливішого для проведення діагностики окремих вірусів, дослiдження переносникiв вiрусної iнфекцiї, видiлення здорових кущів клонiв винограду.

Методи дослідження. Візуальна санітарна селекція. Щеплення на сорти-індикатори. Імуноферментний аналіз для виявлення вірусів коротковузля, скручування листя, вірусу А і вірусу мармуровості винограду. Аналіз електрофоретичних спектрів двоспіральної РНК, асоційованої з переліченими захворюваннями. Метод крапкової гібридизації нуклеїнових кислот збудника з длРНК зондом. Термотерапія сортів винограду для одержання здорового матеріалу.

Наукова новизна одержаних результатів. На пiдставi проведених досліджень відпрацьовано і вперше застосовано в Україні для одержання здорового матеріалу клонів винограду методи імуноферментного виявлення вірусу мармуровості та вірусу А винограду. Визначено ступінь ураження вірусом мармуровості сортів і кущів клонів винограду.

Показано можливість цілорічного виявлення вірусу коротковузля винограду. Встановлено оптимальний тип матеріалу і час вiдбору зразкiв для детекцiї вірусів коротковузля, скручування листя і мармуровості винограду.

Для тестування садивного матеріалу, ввезеного в Україну з-за кордону, відпрацьовано та вперше застосовано методи імуноферментної детекції вiрусiв з родини Comoviridae, роду Nepovirus (вірус розеткової мозаїки бруньок персика, вірус кільцевої плямистості томату, вірус кільцевої плямистості тютюну i вірус мозаїки резухи).

Розроблено молекулярно-біологічні методи виявлення вірусу скручування листя винограду.

Вперше в Україні показана роль кокцид у переносі вірусу скручування листя винограду.

Методом термотерапії i культури меристеми отримано здоровий садивний матеріал сортів Голубок, Рубін Таїровський та селекційних форм І-55/8, L-4-9-18.

Практичне значення одержаних результатів. Одержано для подальшої роботи i розмноження здорового вихiдного матерiалу 39 клонiв прищепних сортiв і 22 клони підщепних сортів.

Розроблені методи серологічної діагностики найбільш шкідливих вірусів винограду застосовуються при проведенні санітарної селекції в процесі клонового добору, а також при наступному контролі садивного матеріалу винограду на етапах розмноження (шкілки, маточники).

Молекулярно-біологічні методи використовуються у вищевказаних процесах для здійснення попередньої експрес-діагностики з метою встановлення санітарного стану матеріалу.

Методи діагностики неповiрусiв застосовуються для контролю садивного матеріалу винограду, ввезеного в Україну з-за кордону.

Методами термотерапії i культури меристеми отримано вихiдний матеріал двох сортiв та двох форм винограду, вільний від вірусів мармуровості і скручування листя.

Особистий внесок здобувача. Iнформацiйний пошук та аналiз даних лiтератури за темою дисертацiї, експериментальні дослідження, аналіз отриманих результатів і їхнє узагальнення виконані дисертантом особисто. Проведено експерименти щодо діагностики вищеперелічених вірусних хвороб винограду, розподілу вірусних часток у різних органах і тканинах рослини, виявлення переносників вірусу скручування листя та оздоровлення садивного матеріалу.

Апробація результатів дисертацiї. Основні положення роботи викладені й обговорені на вчених Радах ІВіВ УААН ім. В.Є. Таїрова у 1996-1999 роках, на наукових конференціях "Науково-технічний прогрес у виноградарстві" (Кишинів, Молдавський аграрний університет, 1998 рік ) і Міжнародній науково-практичній конференції “Імунітет і фітосанітарна селекція в системі інтегрованого захисту виноградних насаджень” (Молдова, Кишинів, 2001 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових праць, з них 3 - в журналах, 2 - в збірниках наукових праць, 2 - в матеріалах наукових конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 131 сторінці комп'ютерного набору, містить 17 таблиць, 19 рисунків, з них 16 фотознімків. Список використаних джерел включає 214 найменувань, у тому числі 200 іноземних.

Робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалу та методів досліджень, чотирьох розділів експериментальної частини, висновків, списку використаної літератури.

Висловлюю щиру подяку фахівцям лабораторії молекулярної біології селекційно-генетичного інституту (м.Одеса) за допомогу у розробці молекулярно-біологічних методів діагностики вірусних хвороб винограду.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

На підставі узагальнення даних літератури показана історія вивчення вірусних захворювань винограду, створення методів їхнього виявлення й ідентифікації. Описано симптоми вірусних хвороб винограду, їхня поширеність в основних виноградарських країнах Європи. Наведено дані щодо вивчення переносників вiрусів винограду, а також методи одержання здорового садивного матеріалу та їх ефективність.

МЕТОДИКА, МІСЦЕ ТА УМОВИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Візуальну санітарну селекцію та дослідження видового складу переносників вірусів проводили впродовж 1995 - 1999 років на дослідних і виробничих полях Інституту виноградарства і виноробства ім. В.Є. Таїрова УААН та виноградних господарств Одеської та Херсонської областей.

Санітарну селекцію проводили на 48 клонах 20 прищепних сортів і на 22 клонах 6 підщепних сортів винограду.

Візуальний огляд рослин проводили двічі на рік, наприкінці травня - у червні і в серпні - вересні.

Тестування методом зеленого щеплення для виявлення прихованого ураження вірусною інфекцією здiйснювали на сортах-індикаторах. Коротковузля, борознистість деревини та мармуровість виявляли на індикаторі Рупестрiс дю Ло; скручування листя - на сорті Каберне Фран; ямчатість деревини - на індикаторі Кобера 5 ББ.

Діагностику вірусних хвороб винограду проводили за допомогою діагностичних наборів фірми "Agritest" (Італія) методами DAS - ELISA (подвійний сендвiч-метод) і непрямим методом (DASI - ELISA). Для ІФА відбирали листя верхнього ярусу з кількох (2-3) точок кущу влiтку і зскрібки кортикального шару лози в період спокою.

Попередню детекцію вірусної інфекції здійснювали шляхом аналізу електрофоретичних профілів длРНК та за допомогою молекулярної гібридизації з радіоактивно міченим длРНК зондом.

Нематод із зразків грунту виділяли методом декантації-проціджування за О.А. Метлицьким (1975), визначаючи їх видовий склад за Є.С. Кірьяновою, Е.А. Кралль (1969) та О.П. Стегареску (1980).

Експерименти щодо переносу вірусу скручування листя кокцидами здійснювали на сорті-індикаторі Каберне Фран за методикою Е. Tanne (1988).

Термотерапію в культурі in vitro проводили на сортах Овiдiопольський, Iллiчiвський раннiй, Голубок, Рубін таїровський та селекційних формах І-55/8 та L-4-9-18 за методикою R. Galzy (1964).

Статистичну обробку даних провадили з використанням t-критерію Стьюдента і критерію Фішера (Лакін Г.Ф., 1990).

ВІЗУАЛЬНА САНІТАРНА СЕЛЕКЦІЯ

Під час проведення санітарної селекції на кущах сортів та клонів винограду відзначали відсутність симптомів коротковузля, інфекційного хлорозу, облямування жилок, скручування листя, мозаїки жилок, борознистості та ямчатості деревини.

У результаті проведених досліджень встановлено, що на клонах підщепних та прищепних сортів не виявлено симптомів вищезазначених захворювань. Лише в окремих випадках відмічено проявлення симптомів, подібних до ознак вірусних хвороб, однак викликані іншими причинами (нестатком мікроелементів тощо).

Найчастіше симптоми вірусних захворювань відмічали на селекційній ділянці та маточних насадженнях. Так, коротковузля (укорочені міжвузля, зміна форми листків, фасціація пагонів) відзначали на кущах сорту 40 років Жовтня (візуальне ураження сорту - 0,3 %). Ознаки захворювання, подібні до симптомів інфекційного хлорозу винограду, відзначені на сорті Голубок (відсоток ураження- 0,5%). На білоягідних сортах Мускат жемчужний, Мускат янтарний і Сухолиманський білий спостерігали симптоми мозаїки жилок (відсоток ураження- відповідно 1,5%; 0,8%; 0,8%). Симптоми скручування листя порівняно з іншими вірусними хворобами винограду зустрічаються відносно часто, проте подальша перевірка за допомогою імуноферментного аналізу показала, що в ряді випадків вони викликані не вірусом скручування листя, а нестатком мікроелементів, або є сортовою ознакою. На сорті Овiдiопольський відмічено ранню появу симптомів, подібних до прояву скручування листя (візуальне ураження сорту - 60 %). Подібне явище спостерігалось також на сорті Іршаї Олівер - 0,2 %.

Відсутність кущів із симптомами вірусної інфекції на клонодослідній ділянці пояснюється тим, що клоновий матеріал перед закладанням проходив як регулярну візуальну санітарну селекцію двічі на рік, так і лабораторне тестування на приховане ураження вірусною інфекцією. Значна ураженість вірусними патогенами селекційного матеріалу і насаджень маточника пояснюється тим, що візуальна санітарна селекція, як і лабораторне тестування, на них не проводилось.

ТЕСТУВАННЯ СОРТІВ ВИНОГРАДУ ТА КУЩІВ КЛОНІВ НА НАЯВНІСТЬ ВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ

Щеплення на сорти-індикатори. Серед 9 сортiв, протестованих за допомогою щеплення на сорти-iндикатори, коротковузля було виявлено лише на сорті 40 рокiв Жовтня (1 хворий кущ з 10 тестованих) (табл. 1).

Симптоми коротковузля на індикаторі проявлялися через 25 - 30 днів. В окремих випадках вони спостерігалися на другий - третій рік.

Таблиця 1 - Результати тестування сортів винограду методом зеленого щеплення на сорти-індикатори (1996-1998 рр.)

Сорт	Захворювання та індикатор
	Коротковуз-ля	Мармуро-вість	Скручування листя	Борознистість деревини
	Рупестріс дю Ло	Каберне Фран	Рупестріс дю Ло, Кобера 5 ББ
Мускат одеський	-	+/2	-	-
Овідіопольський	-	+/7	-	-
Голубок	-	+/7	-	-
Рубін таїровський	-	+/4	+/1	-
Іллічівський ранній	-	+/6	-	-
40 років Жовтня	+/1	-	+/1	-
Сухолиманський білий	-	+/9	-	-
Іршаї Олівер	-	+/1	+/1	-
Кокур білий	-	-	+/1	-

n=10

Примітка. “+” - позитивний результат при тестуванні (хворі кущі сорту);

“-“ - негативний результат при тестуванні (здорові кущі сорту); n-кількість кущів кожного сорту. Число після скісної лінії вказує на кількість уражених кущів.

Передача скручування листя в рік щеплення на індикатори не відбувалася, хоча на прищепі й зберігалися симптоми скручування листя. Відомо, що перенос скручування листя на індикатори проходить на другий або навіть третій рік після щеплення. Ми спостерігали на індикаторі симптоми захворювання лише на другий рік.

Було встановлено, що серед сортiв, що вивчалися, скручуванням листя були уражені Рубін таїровський, 40 років Жовтня, Іршаї Олівер, Кокур білий (по одному хворому кущу з 10 тестованих).

Результати тестування показали, що одним із найбільш розповсюджених вірусних захворювань є мармуровість (табл. 1). Характерні симптоми мармуровості проявлялися головним чином, у рік проведення щеплення. Серед дев'яти тестованих сортів мармуровість була виявлена на семи. Цією хворобою уражені кущі ряду сортів (Мускат одеський, Рубін таїровський, Іршаї Олівер - від 1 до 4 хворих кущів з 10 тестованих). Найбільшу кількість кущів, уражених вірусом мармуровості, було виявлено на сортах Сухолиманський білий (9 хворих з 10 тестованих), Овідіопольський, Голубок (по 7 хворих кущів) та Іллічівський ранній - 6 кущів.

Тестування на індикаторах Рупестрiс дю Ло та Кобера 5ББ показало відсутність ураження тестованих сортів винограду борознистістю та ямчатiстю деревини .

Імуноферментный аналіз. Оптимізація добору проб. Лабораторне тестування сортів та клонів підщеп і прищеп винограду проводили методом імуноферментного аналізу (ІФА) на наявність вірусів коротковузля, скручування листя (I і III серотипи), мармуровості i вірусу А винограду.

Результати проведеного тестування свідчать (табл. 2), що дані ІФА, отримані за тестування сортів на приховане ураження названими вірусами, цілком збігаються з результатами тестування, одержаними методом індексації щепленням.

Результати ІФА дозволяють розширити відомості про ураження вірусами, отриманими за допомогою індексації щепленням. Так, ІФА дає можливість виявити, яким саме серотипом вірусу уражено тестований матеріал. Наприклад, при тестуванні методом щеплення сортів Рубін таїровський, 40 років Жовтня, Іршаї Олівер, Кокур білий індексація на сорті Каберне Фран показала наявність латентного ураження вірусом скручування листя винограду. Лабораторна перевірка методом ІФА свідчить про ураження сортів Рубін таїровський, 40 років Жовтня - першим серотипом скручування листя та сортів Іршаї Олівер, Кокур білий - третім серотипом (по 1 хворому кущу з 10 тестованих).

Таблиця 2 - Тестування сортів винограду на латентну вірусну інфекцію методом ІФА (1996-1999 рр.)

Сорт	Результати тестування ІФА
	GFLV	GLRaV I	GLRaV III	GFkV	GVA
Мускат одеський	-	-	-	+/2	-
Овідіопольський	-	-	-	+/7	-
Голубок	-	-	-	+/7	-
Рубін таїровський	-	-	+/1	+/4	-
Іллічівський ранній	-	-	-	+/6	-
40 років Жовтня	+/1	-	+/1	-	-
Сухолиманський білий	-	-	-	+/9	-
Іршаї Олівер	-	+/1	-	+/1	-
Кокур білий	-	+/1	-	-	-

n=10

Примітка. GFLV - вірус коротковузля винограду, GLRaV I - перший серотип вірусу скручування листя винограду; GLRaV III - третій серотип вірусу скручування листя винограду; GFkV - вірус мармуровості винограду, GVA - вірус А винограду. “+” - позитивний результат при тестуванні (хворі кущі сорту); “-“ - негативний результат при тестуванні (здорові кущі сорту); n-кількість кущів кожного сорту. Число після скісної лінії вказує на кількість уражених кущів.

При тестуванні кущів клонів технічних сортів винограду (табл. 3) вірус коротковузля виявлено на семи кущах клону 1076 сорту Каберне Совіньйон.

Приховане ураження першим серотипом вірусу скручування листя було виявлено на одному кущі клону 14174 сорту Рислінг рейнський та третім серотипом на одному кущі клону 425 сорту Фетяска (тобто складає 10 відсотків уражених рослин на клон відповідно).

Значно більша прихована ураженість вірусом мармуровості. Вона виявлена на одному кущі клону 441 сорту Каберне Совіньйон, двох кущах клону 5110 та двох кущах клону 244 сорту Сухолиманський білий, 15 кущах сорту Рислінг рейнський (клони 2071,14174 та 14161, на яких уражено відповідно 4, 5 та 6 кущів), трьох кущах клону 6054 сорту Ркацителі та двох кущах клону 425 сорту Фетяска. Вірус А на клонах технічних сортів не виявлено.

Таблиця 3 - Тестування кущів клонів технічних сортів винограду на латентну вірусну інфекцію методом ІФА (1996-1999 рр.)

Сорт	Номер клону	Кількість кущів (усього перевірено/з них хворих)
		GFLV	GLRaV I	GLRaV III	GFkV	GVA
Каберне Совіньйон	441 1076	22/- 29/7	16/- 21/-	11/- 10/-	22/1 29/-	11/- 10/-
Сухолиманський білий	1632 5110 244	32/- 39/- 22/-	20/- 39/- 22/-	19/- 38/- 21/-	31/- 39/2 22/2	31/- 38/- 21/-
Рислінг рейнський	6846 2071 14174 14161	11/- 13/- 13/- 17/-	10/- 13/- 10/1 17/-	10/- 13/- 10/- 17/-	10/- 13/5 13/4 17/6	11/- 13/- 10/- 17/-
Іршаї Олівер	3524 1881	8/- 7/-	7/- 7/-	7/- 7/-	7/- 7/-	8/- 7/-
Ркацителі	6054 5081 2222 5145	13/- 13/- 4/- 9/-	13/- 13/- 4/- 9/-	13/- 13/- 4/- 9/-	13/3 13/- 4/- 9/-	13/- 13/- 4/- 9/-
Фетяска	425	14/-	12/-	12/1	13/2	13/-
Трамінер рожевий	3360 441 1494	22/- 4/- 1/-	14/- 1/- 1/-	14/- 1/- 1/-	14/- 1/- 1/-	15/- 1/- 1/-
Марсельский чорний ранній	1294	13/-	13/-	12/-	13/-	12/-
Шардоне	4536 4876	4/- 4/-	4/- 4/-	4/- 4/-	4/- 4/-	4/- 4/-
Совіньйон зелений	3873	7/-	7/-	7/-	7/-	7/-
Голубок	1685 662 36103	10/- 9/- 7/-	5/- 3/- 2/-	5/- 3/- 2/-	10/- 9/- 7/-	5/- 3/- 2/-

Скорочення див. у примітка до табл.2.

Таким чином, на клонах технічних сортів найчастіше зустрічається вірус мармуровості винограду. Найбільш сильно ним уражені кущі клонів сорту Рислінг рейнський (вірус відзначено на трьох клонах з чотирьох тестованих, причому кількість хворих кущів на клон сягає від 4 до 6, тобто складає приблизно 10-35 відсотків уражених рослин на клон). Відносно високий ступінь прихованого ураження виявлено також на кущах клонів сорту Сухолиманський білий (до двох уражених рослин на клон, тобто 5-10 відсотків).

Клони, уражені вірусами коротковузля та скручуваня листя, вилучені з процесу подальшого розмноження.

На кущах клонів столових сортів приховане ураження вірусами коротковузля, І і ІІІ серотипами вірусу скручування листя, мармуровості та вірусом А винограду не виявлено (табл. 4).

Таблиця 4 - Тестування кущів клонів столових сортів винограду на латентну вірусну інфекцію методом ІФА (1996-1999 рр.)

Сорт	Кіль-кість клонів	Кількість кущів (усього перевірено/з них хворих)
		GFLV	GLRaV I	GLRaV III	GFkV	GVA
Мускат таїровський	1	51/-	15/-	7/-	51/-	43/-
Мускат гамбурзький	5	51/-	44/-	42/-	51/-	49/-
Одеський сувенір	4	28/-	28/-	28/-	28/-	28/-
Мускат Аддо	3	12/-	12/-	12/-	12/-	12/-
Восторг	3	12/-	12/-	12/-	12/-	12/-
Оригінал	2	9/-	9/-	9/-	9/-	9/-
Зорька	1	6/-	6/-	6/-	6/-	6/-
Мускат жемчужний	1	2/-	2/-	2/-	2/-	2/-
Мускат янтарний	2	8/-	8/-	8/-	8/-	8/-

Скорочення див. у примітка до табл.2.

Вірусні хвороби не виявлені також на тестованих кущах клонів підщепних сортів винограду (табл. 5).

Таблиця 5 - Тестування кущів клонів підщеп винограду на латентну вірусну інфекцію методом ІФА (1996 - 1999 рр.)

Обєкт дослідження	Кількість клонів	Кількість кущів (усього перевірено/з них хворих)
		GFLV	GLRaV I	GLRaV III	GFkV	GVA
Рiпарiя х Рупестрiс 101-14	6	101/-	52/-	42/-	68/-	47/-
Берландiєрi х Рiпарiя СО 4	5	55/-	46/-	31/-	58/-	40/-
Берландiєрi х Рiпарiя Кобера 5 ББ	4	28/-	28/-	28/-	28/-	28/-
Шасла х Берландiєрі 41 Б	3	21/-	21/-	21/-	21/-	21/-
Берландiєрi х Рiпарiя Кречунел 2	2	14/-	14/-	14/-	14/-	14/-
Рiпарiя Глуар де Монпельє	2	14/-	14/-	14/-	14/-	14/-

Скорочення див. у примітка до табл.2.

Нами встановлено, що шкідливі вірусні хвороби зустрічаються на кущах клонiв значно рідше, ніж латентні, типу мармуровості. Це можна пояснити тим, що коротковузля і скручування листя впливають на агробіологічні показники виноградного куща, зокрема, на його врожай і кондиції якості. Тому клони, що не проявляють візуально симптомів коротковузля, можуть бути відбраковані на підставі санiтарної або агробіологічної оцінки. Мармуровість є захворюванням, яке знижує тільки показники приживлюваності, але не впливає на агробіологічні параметри. Крiм того, захворювання вiзуально не проявляється нi на прищепних, нi на пiдщепних сортах (за винятком сорту Рупестрiс дю Ло). Тому санiтарна селекцiя та агробіологічнi спостереження не призводять до вибраковування рослин, iнфiкованих мармуровiстю.

Цілком можливо, що високий ступінь ураження (3 - 7 хворих кущів на клон) свідчить про те, що існує висока ймовірність ураження всіх рослин клону, бо вони мають спільне походження від однієї рослини. Те, що на інших тестованих кущах клону хвороба не виявлена, може бути наслідком того, що концентрація вірусних часток у рослині ще не є достатньою для виявлення хвороби методом ІФА, або ж вірус не був виявлений через нерівномірний розподіл його в тканинах. Якщо були лише один чи два уражених кущі на клон, це може бути пов'язано з вторинним ураженням вірусом, що насамперед стосується вірусу скручування листя, який передається кокцидами в польових умовах, та вiрусу коротковузля, який переноситься нематодами. У тому разі, коли виявляли одну - дві уражені рослини на клон, провадили додаткове тестування в той же сезон вегетації; якщо позитивний результат отримували знову, тестування повторювали наступного року.

Отже, клоновий добір разом із візуальною санітарною селекцією, як правило, сприяє вилученню основної кількості рослин, уражених шкідливою вірусною інфекцією (коротковузля, скручування листя). Що стосується латентних захворювань (мармуровість винограду), то ступінь ураження ними знижується меншою мірою через відсутність прояву візуальних симптомів та помітного впливу на агробіологічні показники рослини винограду.

З метою оптимізації часу добору проб для ІФА і вибору оптимального матеріалу для тестування, нами проведено дослідження щодо виявлення коротковузля винограду, мармуровості та скручування листя в різних органах і тканинах рослини. При вивченні використовували листя, жилки, черешки, молоді пагони, вусики, ягоди, а також зскрібки кортикального шару. Тестування найбільш шкідливого вірусу - вірусу коротковузля винограду - проводили в різний термін добору матеріалу.

Нами встановлено, що найкращим матеріалом для детекції вірусу коротковузля є молоді пагони, вусики і листя. Найменшу варіацію значень IФA при цьому відзначено на молодих пагонах і вусиках. Були вивчені також терміни оптимальної детекції цього вірусу. Показано, що значення IФA поступово збільшуються з червня до липня; на початку липня, коли підвищується температура, показники IФA-тесту поступово зменшуються. Для виявлення вірусу мармуровості найкращим матеріалом є зскрібки кортикального шару молодих пагонів і ягоди. Установлено, що вірус мармуровості можна виявити не тільки на початку літа, але і восени, після зниження температури (вересень-жовтень). Для детекції вірусу скручування листя винограду також краще використовувати зскрібки кортикального шару, зелені ягоди і листки.

Таким чином, оптимізація детекції трьох вірусів винограду показала, що для аналізу краще відбирати молоді зростаючі тканини, в яких найбільш інтенсивно відбувається реплікація вірусної РНК, забезпечуючи тим самим максимальну концентрацію вірусних часток. При виявленні вірусів, обмежених флоемою (мармуровість і скручування листя винограду), краще використовувати зскрібки кортикального шару. При визначенні оптимального джерела рослинної тканини для цієї ж мети, також необхідно брати до уваги нерівномірність розподілу вірусних часток у рослині винограду.

Виявлення неповірусів винограду методом ІФА. Серед неповiрусiв велику шкоду винограду наносять вірус кільцевої плямистості томату (TomRSV), вірус розеткової мозаїки бруньок персика (PRMV), вірус мозаїки резухи (ArMV) і (TRSV) вiрус кiльцевої плямистостi тютюну. Два з них (TomRSV і ArMV) належать до вірусів, що викликають комплекс симптомів, інфекційного виродження, подібні із симптомами, якi спричинюються вірусом коротковузля винограду.

Перелiчені віруси виявлені в США повсюдно і викликають серйозні захворювання винограду в північно-східній частині країни (Ramsdel et.al., 1995, Uymoto et.al., 1977).

Детекцiя вірусів важлива за оцінення нових сортів і клонів, у розмноженні, розсадництві, при проведенні сертифікації і імпорті садивного матеріалу.

Нами проведено тестування на наявність латентного ураження перелiченими вище вірусами 68 зразкiв, iнтродукованих на Україну з Дослідницького Центру Південно-Західного Університету (штат Міссурі, США), де вони пройшли перше тестуваня на ці віруси з вибраковкою хворого матеріалу. Тестування здійснювали методом DAS-ELISA. Для тестування в березні використовували зскрібки кортикального шару чубуків винограду у стадiї спокою. Повторне тестування проводили, досліджуючи листки, відібрані в червні. Встановлено, що всі сорти, отримані із США, вільні від даних вірусів.

Аналіз електрофореграмм длРНК. Попередню діагностику клонів підщеп i прищеп здійснювали також методом дослідження длРНК.

Нами була виділена й охарактеризована длРНК із винограду, ураженого основними вірусними хворобами.

Проведені дослідження длРНК, асоційованої із соконепереносними вірусними хворобами винограду.

Отримана длРНК із різних сортів винограду, уражених мозаїкою жилок, скручуванням листя і борознистістю деревини винограду. Очищені препарати длРНК були отримані шляхом хроматографії на целюлозі СF-11 і досліджені електрофоретично.

Проведено порівняльний аналіз длРНК, виділеної з рослин, уражених борознистістю деревини, скручуванням листя винограду і трьох компонентів длРНК, асоційованої з мозаїкою жилок.

Молекулярну масу досліджуваних ліній длРНК визначали шляхом порівняння з маркерами молекулярної маси - ДНК-рестриктами лС1R EcoRI і лС1R EcoRV. Присутність длРНК у водяній і фенольній фазах визначали обробкою препаратів РНК-азою А в буферах з низькою концентрацією солей. Специфічність перевіряли методом гібридизації із зондом, що являє собою радіоактивно мічену длРНК, асоційовану з мозаїкою жилок винограду.

Показано, що всі типи високомолекулярної длРНК із різних джерел є стійкими до дії РНК-ази А в 2хSSC буфері (буфері з високою іонною силою) і руйнуються під її впливом у буфері 0,1хSSC (буфер з низькою іонною силою). Цей факт підтверджує двоспіральну природу длРНК.

Отримані й охарактеризовані нами зразки длРНК, асоційованої з різними вірусними захворюваннями винограду, були використані при тестуванні кущів клонів підщеп винограду як маркери молекулярної маси, поряд із ДНК-рестриктами лС1R EcoRI і лС1R EcoRV.

Вищевикладені дані стали основою для розробки і використання методу аналізу електрофоретичних профілів длРНК при тестуванні кущів клонів винограду на наявність латентної вірусної інфекції. Позитивними контролями були рослини, уражені коротковузлям, скручуванням листя, мозаїкою жилок, борознистістю деревини винограду (за даними перевірки методом IФA).

Результати тестування методом аналізу електрофореграм длРНК відповідали даним дот-гібридизації. Наступну ідентифікацію вірусних хвороб винограду проводили методом імуноферментного аналізу.

У таблиці 6 показані результати порівняння трьох методів діагностики вірусних хвороб винограду, що підтверджують можливiсть застосування методу аналізу спектрів длРНК для попередньої діагностики клонів і сортів винограду.

Однак цей метод не дає можливості обробляти велику кількість зразків, а крім того вимагає великих витрат матеріалу і реактивів, тому застосування його для широкомасштабного тестування обмежене.

Таблиця 6 - Порівняння методів детекції та ідентифікації вірусних хвороб винограду на прищепних і підщепних сортах (1995-1997 рр.)

Сорт,клон	Адреса (кущ)	Попереднiй скринiнг	Iдентифiкацiя GFLV, GFkV, GLRaV I і ІІІ методом IФА
		дот-гiбридизацiї	аналiзу длРНК (кiлькiсть лiнiй длРНК)
Сорти пiдщеп
РхР 101-14 49-2-3	I-14-48	-	-	-
РхР 101-14 49-2-3	I-14-47	-	-	-
РхР 101-14 49-2-3	I-14-46	-	-	-
РхР 101-14 49-2-3	I-15-1	+	1	GFLV
РхР 101-14 49-2-3	I-15-5	+	1	GFLV
РхР 101-14 49-2-3	I-14-49	+	1	GFLV
РхР 101-14 832	I-9-45	+	1	GFLV
РхР 101-14 832	I-9-41	+	1	GFLV
РхР 101-14 672	I-10-11	+	2	GFLV
РхР 101-14 672	I-10-9	+	1	GFLV
Сорти прищеп
Рислiнг рейнський 14174	II-28-9	+	1	GFkV
Рислiнг рейнський 14174	II-28-111	+	1	GFkV
Каберне Совіньйон 1473	II-3-55	+	1	GFkV
Рислiнг рейнський 14174	II-28-9	+	3	GLRaV I
Фетяска 425	II-30-51	+	3	GLRaV III

Примітка. Дот-гібридизація (гібридизація з зондом длРНК вірусу скручування листя). РхР - РіпаріахРупестріс "-" - негативна відповідь у дот-гібридизації або ІФА, "+" - позитивна відповідь у дот-гібридизації.

Нами було тестовано 50 зразків сортів і клонів підщеп за допомогою методу аналізу длРНК, серед яких виявлено 11, уражених вірусною інфекцією.

Різниця між результатами тестування клонів підщеп сорту 101-14 (табл. 5 і 6) пов'язана з тим, що гібридизація і порівняльне тестування методом ІФА проводили на клонодослідній ділянці першого вегетаційного покоління (табл. 7), на якому, очевидно, з часом відбулось повторне зараження вірусом коротковузля. У таблиці 5 представлені результати тестування клонів 101-14, другого вегетаційного покоління, закладених матеріалом, відібраним з П1 до його зараження коротковузлям.

Метод не дозволяє проводити ідентифікацію вірусних хвороб і може бути використаний тільки за тестування клонів підщеп винограду, для яких бажаною є відсутність не лише найбільш шкідливих вірусних захворювань винограду, але і латентних і напівлатентних, таких як мозаїка жилок, мармуровість, некроз жилок винограду.

Таким чином дані, отримані за допомогою розробленого нами методу виявлення латентної вірусної інфекції в тканинах винограду шляхом аналізу длРНК, відповідають даним, отриманим методами дот-гібридизації і IФA-тесту і свідчать про те, що розроблений метод може застосовуватися з метою тестування при виробництві сертифікованого садивного матеріалу завдяки його перевазі.

Виявлення вірусу скручування листя винограду методом дот-гібридизації з радіоактивно міченим длРНК зондом. З метою визначення вірусу скручування листя винограду нами був розроблений метод з використанням дот-гібридизації з радіоактивно міченою длРНК, асоційованою з цим захворюванням. ДлРНК була виділена методом хроматографії на целюлозі CF-11 і очищена препаративним електрофорезом. Для препаративного виділення використовували длРНК, отриману з 50 - 60 г листя винограду, ураженого скручуванням листя.

Виділену й очищену длРНК радіоактивно мітили методом хімічної модифікації з використанням лужного розчину ¹²⁵I . Отриманий препарат використовували як зонд, відпрацьовуючи умови гібридизації - температуру і час проведення.

Детекцiю вірусу скручування листя проводили у фенольних екстрактах з листя винограду, ураженого цим захворюванням. Негативними контролями були екстракти листя, отриманi зі здорових рослин (за результатами тестування методом IФА).

Позитивну відповідь у дот-гібридизації дали всі зразки, інфіковані скручуванням листя винограду, негативну - здорові рослини.

Таким чином, отриманий нами метод є простим у виконанні, високочутливим і може бути застосований при тестуванні кущів клонів винограду в процесі отримання вихiдного донорського матеріалу кущів клонів.

ПЕРЕНОСНИКИ ВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ

Як відомо з численних літературних джерел, переносниками неповiрусiв є нематоди родів Xiphinema і Longidorus (Arias M.A., 1994; Goiro M.I., 1991).

Дослідженнями нашої лабораторії встановлено видовий склад нематод на виноградниках Одеської та Херсонської областей. Нематоди видів Xiphinema і Longidorus ми спостерігали повсюдно, однак, види нематод - переносникiв вірусної інфекції (Xiphinema index і Xiphinema italiae) були виявлені тільки на півдні Одеської областi (Болградський та Білгород-Дністровський райони) і на супiщаних ґрунтах Херсонської області (Білозерський район). Показано також, що на виноградниках Одеської області найбільш розповсюдженими видами нематод є X. vuittenezi і X. pachtaicum, що не є переносниками вірусів винограду.

На клонодослідній ділянці інституту ім. В.Є. Таїрова проводили добір 50 зразків ґрунту на глибині 30-40 см у ризосфері куща і між рядами винограднику на наявність потенційних нематод-переносників вірусів. Виявлено нематоди видiв X.vuittenezi і X.pachtaicum, що не переносять віруси. Щільність популяцій нематод становила 10-12 особин на 100 г ґрунту.

До шкідників винограду, що переносять вірусні захворювання, належать також щитівки або червці. Припущення про можливість переносу вірусу скручування листя кокцидами було зроблено ще в 1962 році (Dias H.F.). Пізніше iз винограду, ураженого борознистістю деревини, був виділений вірус A винограду і в експериментальних умовах показано, що цей вірус передається кокцидами Pseudococcus longispinus. Подальші дослідження підтвердили можливість переносу вірусів скручування листя i вірусу A кокцидами Planococcus ficus і Planococcus longispinus

З огляду на це було проведено обстеження виноградників трьох господарств Одеської області (ОПХ "Таїровський", радгоспи "Перемога" і "Лиманський") на наявність кокцид. У результаті цього виявлено три види кокцид: Pulvinaria vitis - виноградна подушечниця, Parthenolecanium corni - акацієва ложнощитiвка і Pseudococcus longispinus - виноградний червець.

Останній вид кокцид-Pseudococcus longispinus вивчався нами в якості переносників вірусу скручування листя винограду. Результати показали, що три з пяти тест-рослин сорту Каберне Фран, на яких живилися кокциди, дали позитивний результат в IФA. Однак роль кокцид у поширеннi вірусу скручування листя на виноградниках України невелика через те, що вони виявлені лише на окремих кущах двох сортів: Голубок і Сувенір. Крім того, поширюються вони дуже повільно.

Проведені нами дослідження підтверджують необхідність вивчення різних типів ґрунтів на наявність нематод-переносників перед закладенням маточних насаджень винограду, а також обгрунтування видового складу кокцид на виноградниках.

ОЗДОРОВЛЕННЯ ВИНОГРАДУ ВІД ВІРУСНИХ ХВОРОБ І ОДЕРЖАННЯ ЗДОРОВОГО САДИВНОГО МАТЕРІАЛУ ВИНОГРАДУ

Нами проведено оздоровлення рослин, уражених вірусом мармуровості і скручування листя методами термотерапії в культурі in vitro (табл. 7). Цей метод був застосований з метою оздоровлення сортів Овідіопольський, Іллічівський ранній, Голубок, Рубін таїровський та селекційних форм I-55/8, 4-9-18, попередньо протестованих методами індексації щепленням і ІФА на наявність вірусів скручування листя (GLRaV I і GLRaV III) і мармуровості (GFkV).

Тривалість термотерапії складала від 6 до 15 тижнів. У результаті термотерапії отриманий здоровий садивний матеріал сортів Голубок, Рубін таїровський та форм I-55/8, 4-9-18.

Результати, представлені в таблиці 7, показують, що оздоровлення від вірусу мармуровості відбувається уже через 6 тижнів термотерапії. В такий спосіб був отриманий здоровий матеріал сорту Голубок, Рубін таїровський і форм I-55/8, 4-9-18. У той же час сорти Овідіопольський та Іллічівський ранній, також уражені вірусом мармуровості, не вдалося оздоровити навіть за 15 тижнів.

Таблиця 7 - Результати оздоровлення винограду від вірусів за допомогою термотерапії (1997 р.)

Сорт (форма)	Захворювання	Тривалiсть термотерапії (тижнiв)	Результат тестування (ІФА)
Iллiчiвський раннiй	Мармуровiсть	6, 8, 12, 15	+
Овiдiопольський	Те ж	6, 8, 12, 15	+
I-55/8	-//-	6, 8, 12	-
Голубок	-//-	6, 8, 12	-
4-9-18	-//-	6, 8, 12	-
Рубiн таїровський	-//-	6, 8, 12	-
	Скручування	6, 8, 12 15	+ -

Примітка. "+" - позитивна реакція; "-" - негативна реакція.

Сорт Рубін таїровський, інфікований вірусами скручування листя і мармуровості, звільнено від вірусу мармуровості після 8 тижнів термотерапії; вірус скручування листя видалити з тканин винограду було складніше, цього вдалося досягнути лише через 15 ...