Цитогенетичний аналіз ембріонів ссавців при дії різних факторів кріоконсервування

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК 591.31:615.832.96]:576.312.33/.38

ЦИТОГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ ЕМБРІОНІВ ССАВЦІВ ПРИ ДІЇ РІЗНИХ ФАКТОРІВ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ

03.00.19 - кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Хроменкова Ольга Борисівна

Харків - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Жегунов Геннадій Федорович, Харківська державна зооветеринарна академія МАП України, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Розанов Леонід Федорович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник відділу низькотемпературного консервування

кандидат біологічних наук Лісіна Катерина Геннадіївна, Харківський біотехнологічний центр УААН, старший науковий співробітник лабораторії кріоконсервування статевих клітин і ембріонів

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України, Науково-дослідний лабораторний центр, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “6” липня 2004 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015 м. Харків, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015 м. Харків, вул. Переяславська, 23)

Автореферат розісланий 5 червня 2004 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент НАН України А.М. Гольцев

кріопротектор ембріон доумплатнтаційний заморожування

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Застосування біотехнологій у охороні природи і сільському господарстві для збереження різноманітності тварин та у медицині для лікування безплідності вимагає більш глибокого вивчення впливу кріоконсервування на структуру та розвиток ембріональних клітин ссавців.

На сьогодні накопичені певні теоретичні знання та розроблені експериментальні методи для прискореного відтворення цінних тварин [Амстиславский С.Я. и соавт., 1991; Fahning M. et al, 1992], порятунку зникаючих порід свійських тварин і диких видів ссавців [Амстиславский С.Я. и соавт., 1997; Ротт Н.Н., 1996], для підтримки колекцій ліній лабораторних тварин [Boubelik M., Cerna Z., 1993], а також для лікування різних форм безплідності [Trounson A., 1986; Грищенко В.И. и соавт., 1990; Петрушко М.П., 2000]. Досягнуто значних успіхів у кріобіології систем репродукції: розроблено методи тимчасового зберігання гамет і ембріонів різних видів ссавців в умовах гіпотермії, кріоконсервування з різними швидкостями [Whitingham D. et al., 1972; Rall W., Fahy G., 1985; Trounson A. et al., 1987, Zenzes M.T. et al., 2001] з використанням різних кріопротекторів [Emiliani S. et al., 2000; Otsuka J. et al., 2002; El-Toukhy T. et al., 2003] і довгострокового зберігання в рідкому азоті. Незважаючи на здатність до дроблення деконсервованих ембріонів в умовах in vitro, частота настання вагітності залишається низькою. У зв'язку з цим постає необхідність у подальших дослідженнях безпеки чинників кріоконсервування і маніпуляцій, що проводять з доімплантаційними ембріонами у рамках програм з кріоконсервування.

Для експериментів на ссавцях і розробки нових методів кріоконсервування основною моделлю, як правило, є доімплантаційні ембріони лабораторних тварин, зокрема, ембріони миші. Це пов'язано як з обмеженнями, що накладаються на дослідження з ембріонами людини, так і з високою вартістю ембріонів сільськогосподарських тварин.

Незважаючи на великий експериментальний матеріал і успішне застосування різних методів кріоконсервування ембріонів лабораторних і сільськогосподарських тварин та ембріонів людини, не існує універсальних схем заморожування - відтавання. Як правило, параметри кріоконсервування підбираються емпірично і можуть варіювати в широких межах. З іншого боку, відомо, що тривалість обробки ембріонів і маніпуляції з ними до кріоконсервування можуть позначитися на морфофункціональній збереженості клітин [Dulioust E. et al., 1995; Амстиславский С.Я. и соавт., 1998; Iwarsson E., 1999]. Це вимагає проведення цитогенетичного й ультраструктурного аналізу, що дозволить вирішити такі теоретичні і практичні задачі: оцінити вплив чинників кріоконсервування на генетичний апарат ембріонів, виявити можливі геномні і хромосомні аномалії, патології мітозу, визначити збереженість клітинних органел після кріоконсервування. Останнє особливо актуально у зв'язку з тим, що кількість кріобанків постійно збільшується, а, отже, зростає ймовірність можливих, у тому числі й небажаних, наслідків.

У зв'язку з надзвичайною важливістю цього питання є необхідним проведення цитогенетичних досліджень ембріонів ссавців після дії факторів кріоконсервування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках комплексної НДР Харківського державного медичного університету (№ держ. реєстрації 0102U001871).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - визначення ступеня пошкоджуючого впливу та генетичної безпеки окремих етапів процесу кріоконсервування ембріонів миші ранніх стадій розвитку.

Для досягнення даної мети були вирішені такі задачі:

Вивчити вплив експозиції в неізотонічних розчинах кріопротектора і повного циклу кріоконсервування на рівень життєздатності ембріонів миші в умовах in vitro.

Оцінити вплив експозиції у розчинах кріопротектора на осмотичну стійкість, мітотичний режим та хромосомний набір ембріонів миші.

Дослідити морфологічні зміни у доімплантаційних ембріонах миші після кріоконсервування з використанням процедур повільного програмного та швидкого заморожування за даними світлової та електронної мікроскопії.

Визначити особливості цитогенетичної дії факторів кріоконсервування за такими параметрами як мітотичний індекс, рівень патологічних мітозів та рівень геномних аномалій в ембріонах миші.

Об'єкт дослідження - вплив кріоконсервування з використанням методів повільного програмного і швидкого заморожування на морфологічну цілісність, мітотичний режим та стан хромосомного набору ембріонів миші.

Предмет дослідження - доімплантаційні ембріони миші на стадіях 2-8 бластомерів.

Методи дослідження. Методи кріоконсервування - метод повільного програмного заморожування і метод швидкого заморожування. Хірургічний метод виділення доімплантаційних ембріонів миші. Волюмометричний метод вивчення осмотичної поведінки ембріонів у розчинах кріопротектора. Метод культивування ембріонів в умовах in vitro у рідкому середовищі і газопроточному термостаті, морфологічний аналіз, світлова та електронна мікроскопія - для оцінки цитологічних змін і збереженості органел бластомерів ембріонів після експериментальних впливів. Цитогенетичний аналіз тотальних препаратів. Статистичні методи обробки результатів експериментів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльний аналіз впливу двох різних методичних підходів до кріоконсервування - процедур повільного програмного і швидкого заморожування - на ембріони миші ранніх стадій розвитку з використанням морфологічних і цитогенетичних параметрів у поєднанні з традиційною оцінкою здатності їх до дроблення в умовах in vitro.

Доведено, що можливість застосування процедури швидкого заморожування до ембріонів миші різних стадій розвитку визначається їх чутливістю до етапів додавання і видалення кріозахисних середовищ та температурного режиму експозиції.

Встановлена залежність між ступенем компактизації 8-клітинних ембріонів миші і рівнем їхньої життєздатності після повільного програмного заморожування.

Показано, що зниження рівня життєздатності 8-клітинних компактизованих ембріонів після повільного програмного заморожування супроводжується вірогідним підвищенням в 3 рази рівня патологічних мітозів.

Цитогенетичним дослідженням встановлено, що рівень анеуплоїдії в ембріонах миші не змінюється як після повільного програмного, так і після швидкого заморожування.

Практична цінність одержаних результатів. Результати експериментального дослідження впроваджено у науково-дослідну роботу Харківського біотехнологічного центру УААН.

Отримані результати дають підставу рекомендувати модифікований метод швидкого заморожування для довгострокового збереження доімплантаційних ембріонів миші як генетично безпечний метод.

Цитогенетичний аналіз можна використовувати для оцінки генетичної безпеки існуючих методів кріоконсервування і нових методів, що розробляються, оскільки він дозволяє виявляти генетичні порушення в ембріонах ссавців, індуковані чинниками кріоконсервування.

Дані про розвиток доімплантаційних ембріонів миші на різних стадіях дроблення після експериментальних впливів можуть бути використані в лекційних курсах генетики і цитології та біології розвитку ссавців.

Особистий внесок здобувача. Здобувач самостійно провів експерименти з кріоконсервування ембріонів миші, морфофункціональну оцінку ембріонів, цитологічний і цитогенетичний аналіз, культивування в умовах in vitro. Електронно-мікроскопічне дослідження ембріонів після кріоконсервування було виконано при консультативній і методичній допомозі співробітників відділу кріоцитології і кількісної морфології Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України д.б.н. О.С. Капрельянца і к.б.н. Л.М. Марченко. Здобувачем самостійно проведено аналіз джерел літератури, узагальнення і статистична обробка експериментальних даних, їх трактування й обговорення, сформульовані висновки. Викладені в дисертації результати отримані здобувачем особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати дисертаційної роботи доповідалися й обговорювалися на Міжнародному симпозіумі “Біоетика на порозі III тисячоліття” (Харків, 2000), 5-й Пущинській конференції молодих учених “Біологія - наука 21-го століття” (Пущино, 2001), 38-й щорічній зустрічі міжнародного товариства кріобіології CRYO 2001 (Единбург, 2001), Всеукраїнській науковій конференції “Успіхи і перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини” (Харків, 2001), III з'їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Сучасні аспекти хронобіології і хрономедицини” (Чернівці, 2002), конференції молодих учених Харківського державного медичного університету “Медицина третього тисячоріччя” (Харків, 2003), а також на щорічних конференціях молодих учених Інституту проблем кріобіології і кріомедицини (Харків, 2000, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових робіт, 6 з яких - статті у фахових наукових журналах ВАК.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, аналітичного огляду літератури, 3-х розділів власних досліджень, висновків та списку використаних літературних джерел, додатків. Роботу ілюстровано 13 таблицями, 36 рисунками. Список використаних джерел має 62 українсько- та російськомовних посилання та 150 англомовних джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Експерименти з кріоконсервування, дослідження рівня життєздатності, цитологічний та цитогенетичний аналіз проведено на доімплантаційних ембріонах лабораторної миші (Mus musculus) за правилами “Європейської конвенції захисту хребетних тварин, що використовуються з експериментальною і іншою науковою метою” (Страсбург, 1986).

Ембріони були отримані від самок лінії CBA і гібридних F₁(CBAC57Bl) віком 6-8 тижнів. Гормональну стимуляцію овуляції здійснювали внутрішньочеревним введенням самкам гонадотропіну сироватки жеребних кобил і (через 46-48 год) хоріонічного гонадотропіну людини (лХГ) у дозах 5 МО [Коваленко Т.А. і співав., 1999]. Забій вагітних самок здійснювали дислокацією шийних хребців. Ембріони різних стадій отримували через визначені інтервали часу після ін'єкції лХГ (2 бластомери через 42-46 год, 4 бластомери - 56-60 год, 8 бластомерів - 70-74 год) вимиванням з відпрепарованих яйцепроводів і рогів матки середовищем М-2 (37°C) [Пратт Х., 1990].

Кріоконсервування здійснювали з використанням двох методів: повільного програмного заморожування у скляних контейнерах за методом Ostashko F.I. et al. (1988), і швидкого заморожування - шляхом прямого занурення у рідкий азот, у пластикових соломинах (об'єм 100 мкл) за методом Исаченко В.В. и соавт. (1994). В якості кріопротектора використовували розчини гліцерину. Вплив кріопротектора на ембріони вивчали в двох серіях експериментів, що моделюють експозицію у розчині кріопротектора у процедурах повільного і швидкого заморожування.

Вивчення динаміки осмотичної поведінки ембріонів на етапах процедури швидкого заморожування (додавання розчину гліцерину до ембріонів, експозиції їх у гліцерин-сахарозному середовищі і подальшого видалення кріопротектора) вивчали волюмометричним методом [Кулешова Л.Г., 1983]. Реєстрацію осмотичної поведінки ембріонів здійснювали за допомогою кінокамери, з'єднаної з мікроскопом МБИ-13. При аналізі фотографічних зображень ембріонів було отримано експериментальні залежності зміни відносного об'єму клітин від часу експозиції у досліджуваних розчинах.

Тривалість зберігання ембріонів у рідкому азоті становила 3-7 діб. Відігрів контейнерів із замороженими ембріонами здійснювали у водяній бані при 38°C. Швидкість відігріву становила близько 500°C/хв. Після відтавання ембріони вміщували в 0,5М розчин сахарози (10 хв при 22°C) для видалення кріопротектора. Далі ембріони відмивали від сахарози в середовищі М-2.

Ембріонами, що вижили, вважали такі, що зберегли не менш 50% бластомерів після циклу кріоконсервування, від загальної кількості заморожених ембріонів [Межевикина Л.М. и соавт., 1988].

Для визначення рівня життєздатності ембріонів здійснювали їх культивування в умовах in vitro у краплях (100 мкл) середовища М-16 під мінеральною олією у СО₂-інкубаторі при температурі 38C у газовій суміші з 5% CO₂, 5% O₂, 90% N₂. Життєздатними вважали ембріони, що досягли стадії пізньої бластоцисти, бластоцисти, що вилуплюється, і тієї, що вилупилася.

Морфологічні зміни, геномні і хромосомні аномалії у бластомерах ембріонів, підданих експериментальним впливам, досліджували методами цитологічного та цитогенетичного аналізу тотальних сухоповітряних препаратів, виготовлених за методом Tarkowski (1966), які забарвлювали за Гімза - Романовським. Для одержання метафазних хромосом у середовище культивування додавали блокатор мітозу (вінбластин, 0,1 мкг/мл). Мітотичний індекс (МІ) визначали відношенням кількості мітозів до загальної кількості клітин, рівень патологій мітозу (ПМ) - відношенням кількості бластомерів, що патологічно поділяються, до загальної кількості бластомерів, що знаходяться у мітозі [Алов И.А. и соавт., 1969]. Препарати ембріонів, культивованих з використанням вінбластину, піддавали цитогенетичному аналізу без каріотипування.

Для електронно-мікроскопічного дослідження ультраструктурних змін бластомерів деконсервовані ембріони фіксували у 3% розчині глютаральдегіду та розміщали в кубічні агарові блоки (1,51,51,5 мм) (Hyttel P., Madsen I., 1987). Подальші маніпуляції з підготовки матеріалу до електронно-мікроскопічного дослідження проводили з агаровим блоком. Напівтонкі (0,5 мкм) та ультратонкі зрізи (30-40 нм) виготовляли на ультрамiкротомi УМПТ-3М. Напівтонкі зрізи забарвлювали метиленовим синім, ультратонкі контрастували за методом Reynolds (1963). Оцінку матеріалу проводили на електронному мікроскопі ПЕМ-125 (СЕЛМІ, Україна) при збільшенні від 24000 до 75000 разів.

Усі кількісні показники обробляли методом варіаційної статистики. Вірогідність отриманих результатів - не нижче 0,95.

Результати дослідження і їх обговорення

Проведене дослідження впливу гліцерину на ембріони показало, що в контрольній групі рівень життєздатності був практично однаковим для різних стадій і варіював від 84,06±8,32% до 92,14±5,10% (p>0,05) (рис. 1).

Як видно, експозиція в 1М розчині гліцерину протягом 10 хв при 22°C, яка відповідає експозиції у кріопротекторі при повільному заморожуванні, не впливала на рівень життєздатності 2- і 4-клітинних ембріонів, тоді як при температурі експозиції 0°C призводила до помітного зниження рівня їхньої життєздатності. Для 8-клітинних ранніх і 8-клітинних компактизованих ембріонів рівень життєздатності мав тенденцію до зниження, порівняно з контрольними ембріонами (p>0,05).



Рис. 1. Рівень життєздатності ембріонів різних стадій після експозиції протягом 10 хв у 1М розчині гліцерину.

Використання процедури швидкого заморожування передбачає дегідратацію клітин перед охолодженням. Це здійснюється шляхом короткочасної експозиції ембріонів у розчинах гліцерину підвищеної (30%) концентрації після попередньої експозиції у 10% (1,36M) розчині гліцерину.

Вивчення осмотичної поведінки ембріонів на етапах процедури швидкого заморожування показало, що 2- і 4-клітинні ембріони, на відміну від 8-клітинних, необоротно ушкоджуються (рис. 2).

При перенесенні ембріонів цих стадій з розчину сахарози у фізіологічне середовище спостерігалося різке і надмірне збільшення відносного об'єму бластомерів до значень, які у 1,3-1,4 рази перевищували початкові. Іноді спостерігалися морфологічні порушення у вигляді мембранних пухирів на поверхні бластомерів. У зв'язку з цим подальші порівняльні дослідження двох методів кріоконсервування включали тільки стадію 8-ми бластомерів.

Рівні життєздатності 8-клітинних ембріонів в експериментах, що моделюють етап додавання кріопротектора у процедурі швидкого заморожування, при 0°C та 22°C були близькими за значенням. Результати експериментів свідчать про наявність залежності між стадією розвитку ембріона і температурою експозиції його у розчині кріопротектора і демонструють, що при консервуванні 8-клітинних ембріонів з використанням процедури швидкого заморожування можливо початкову експозицію у розчині кріопротектора проводити як при 22єC, так і при 0єC. Отримані результати збігаються з літературними даними [Межевикина Л.М. и соавт., 1991; Van der Elst J. et al., 1995].

Цитологічний аналіз препаратів ембріонів показав, що з просуванням стадії розвитку ембріона (контрольна група) значення МІ зменшувалося від 2-клітинної (0,761±0,045) до 8-клітинної (0,267±0,036 для ранніх і 0,318±0,014 для компактизованих) стадії. Експозиція у 1М розчині гліцерину протягом 10 хв при 22°C не позначалася на значенні МІ 2- і 4-клітинних ембріонів, тоді як при 0°C вона призводила до зниження (p<0,05) цього показника в 1,3 рази. На МІ 8-клітинних ембріонів зниження температури експозиції не впливало. Аналогічні дані отримано для 8-клітинних ембріонів, підданих обробці кріопротектором для подальшого швидкого заморожування. Зазначені результати систематизовано і представлено у 4-х таблицях.

Серед бластомерів, що поділяються, як в контрольних, так і в експериментальних групах стрічалися клітини з патологіями мітозу (ПМ). В контролі цей показник варіював від 5,71% у 2-клітинних до 3,99% у 8-клітинних компактизованих ембріонах. В контрольних 2- і 4-клітинних ембріонах співвідношення двох типів ПМ, пов'язаних з ушкодженням хромосом (відставання хромосом у метакінезі) і з ушкодженням мітотичного апарату (колхіциноподібний, або К-мітоз), було однаковим. У 8-клітинних ембріонах контрольної групи серед загальної кількості ПМ частка патологій, пов'язаних з ушкодженням хромосом, була відносно меншою (31,58% для ранніх і 28,57% для компактизованих) частки патологій, пов'язаних з ушкодженням мітотичного апарату (68,42% і 71,43% відповідно).

Після експозиції у 1М розчині гліцерину при 0°C виявлено тенденцію до збільшення кількості ПМ в бластомерах 2- і 4-клітинних ембріонів (p>0,05) за рахунок патологій, пов'язаних з ушкодженням мітотичного апарату (моноцентричний мітоз, тригрупова і порожниста метафази), що є типовою реакцією клітини на охолодження [Алов И.А., 1982]. Восьмиклітинні ембріони на дію цього фактора реагували інакше: в бластомерах ембріонів, експонованих при 22єС, спостерігалася тенденція до збільшення кількості ПМ, пов'язаних з ушкодженням хромосом (набрякання і злипання), на 10%.

Відсоток пікнотичних ядер в ембріонах контрольних груп не перевищував 2,5%. В бластомерах ембріонів експериментальних груп цей показник вірогідно не відрізнявся від такого в контролі, хоча в групах 2- і 4-клітинних ембріонів, експонованих при 0°С, відзначалася тенденція до збільшення кількості пікнозів.

В контролі кількість ембріонів з ПМ майже не відрізнялася серед ембріонів різних стадій розвитку: цей показник варіював від 8,69% для 2-клітинних до 11,63% для 8-клітинних ранніх ембріонів. Слід, однак, зазначити, що після експозиції у розчинах гліцерину в деяких випадках спостерігалася виражена тенденція до збільшення кількості ембріонів з патологіями мітозу (у 1,5 рази). Так, після експозиції у 1М розчині гліцерину при 0єС для 4-клітинних ембріонів цей показник дорівнював 16,67% (p>0,05), у порівнянні з 10,0% в контролі. Для 8-клітинних ранніх ембріонів після експозиції у 1М або 1,36М розчинах гліцерину при 22єС кількість ембріонів з патологіями мітозу становила відповідно 16,67% та 17,14%, у порівнянні з 11,63% в контролі (p>0,05). Разом з тим, кількість 8-клітинних ембріонів з ПМ після експозиції при 0єС була близькою до контролю незалежно від умов експозиції та ступеня компактизації ембріона.

Отримані дані узгоджуються з нашою оцінкою рівня життєздатності ембріонів після експозиції у розчинах кріопротектора. Причинами зниження МІ і збільшення кількості ПМ в ембріонах перших стадій дроблення (2- і 4-клітинних) при 0°C можуть бути як осмотичні ефекти, так гіпотермія.

Цитогенетичне дослідження показало, що анеуплоїдія представлена в основному гіпоплоїдією (2n<40), і її рівень після експозиції в кріопротекторі не перевищував контрольні значення. Гаплоїдія (n=20) була відсутня.

Отримані результати щодо зниження МІ, збільшення кількості ПМ і зміни спектра патологій після дії кріопротекторів і охолодження узгоджуються з даними інших дослідників [Алов И.А., 1982; Юрченко Т.Н. и соавт., 1989; Петрушко М.П., 1994].

У подальших експериментах з кріоконсервування метод швидкого заморожування було модифіковано: експозицію ембріонів у розчинах гліцерину проводили при 0єC. Метод повільного заморожування використовували без модифікацій.

В експериментах з кріоконсервування 8-клітинних ембріонів порівняльна оцінка двох режимів охолодження містила морфологічний аналіз та визначення рівня життєздатності. Морфологічний аналіз показав, що при швидкому заморожуванні, на відміну від повільного, незалежно від ступеня компактизації ембріона, вірогідно більше ембріонів (p<0,05) зберігало непошкодженими бластомери. Відсоток ембріонів з ушкодженнями zona pellucida (тріщини, розриви) і кількість ембріонів, що загинули, яка становила близько 12%, були однаковими при заморожуванні з різними швидкостями охолодження.

Рівень життєздатності 8-клітинних ембріонів після повільного заморожування був нижчим для компактизованих ембріонів (71,86±4,65%), порівняно з контролем (89,39±3,59%, p<0,05) і деконсервованими ранніми ембріонами (78,40±5,93%, p>0,05). Після швидкого заморожування він становив 80,25±4,70% для ранніх і 83,43±3,52% для компактизованих ембріонів (p>0,05) (рис. 3).



Рис. 3. Рівень життєздатності 8-клітинних ембріонів після різних етапів кріоконсервування за різними процедурами: К - контроль; КП - експозиція у розчині кріопротектора; КК - повний цикл кріоконсервування.

Тенденція до зниження рівня життєздатності ембріонів спостерігається вже на першому етапі кріоконсервування - після їх експозиції у розчині кріопротектора. При подальшому повільному заморожуванні спостерігалося додаткове зниження рівня життєздатності. На противагу цьому, висока швидкість заморожування (занурення в рідкий азот) не створювала додаткового негативного впливу на життєздатність ембріонів.

Таким чином, при кріоконсервуванні з використанням методу повільного заморожування необхідно враховувати ступінь компактизації 8-клітинних ембріонів. Вісьмиклітинні компактизовані ембріони миші більш чутливі до заморожування з повільною швидкістю. Кріоконсервування за швидким режимом заморожування є менш ушкоджуючим.

Повний цикл кріоконсервування, на відміну від експозиції у розчинах гліцерину, впливав на проліферативну активність 8-клітинних ембріонів. МІ 8-клітинних ранніх ембріонів після швидкого заморожування був вірогідно нижче, ніж після повільного програмного заморожування. Різниця між значеннями МІ 8-клітинних ранніх контрольних і деконсервованих ембріонів не досягала статистичної вірогідності. МІ 8-клітинних компактизованих ембріонів, навпаки, був вірогідно нижчим, порівняно з контрольними.

Виявлено, що кріоконсервування призводить до вірогідного зменшення площі ядер бластомерів 8-клітинних ембріонів (у 1,5 рази).

Після повільного заморожування відсоток пікнотичних ядер у 8-клітинних ранніх ембріонах вірогідно перевищував цей показник в контролі.

Відзначено зростання загального рівня ПМ в бластомерах 8-клітинних компактизованих ембріонів після повільного заморожування, тоді як в 8-клітинних ранніх ембріонах цей показник не збільшувався (рис. 4, табл. 1), однак в останніх спостерігалася зміна спектра патологій.

Рис. 4. Співвідношення типів ПМ в 8-клітинних ембріонах після кріоконсервування за різними процедурами. Повільне - процедура повільного заморожування, Швидке - процедура швидкого заморожування.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблиця 1. Співвідношення патологій мітозу (ПМ) у 8-клітинних ембріонах після кріоконсервування

Показник	8-клітинні ранні	8-клітинні компактизовані
	Контроль n (%)*	Повільне n (%)*	Швидке n (%)*	Контроль n (%)*	Повільне n (%)*	Швидке n (%)*
Кількість ембріонів	129	179	83	92	98	76
Загальна кількість бластомерів	1273	1980	907	1105	1274	890
Бластомерів у мітозі	340	617	224	351	335	245
Бластомерів з патологіями мітозу	19	37	14	14	44	12
ПМ, пов'язані з ушкодженням хромосом	відставання хромосом мікроядра міст в анафазі набрякання і злипання хромосом	2 (33,33) 1 (16,67) 1 (16,67) 2 (33,33)	1 (7,14) 3 (21,43) 4 (28,57) 6 (42,86)	1 (20,0) 1 (20,0) 1 (20,0) 2 (40,0)	2 (50,0) 1 (25,0) - 1 (25,0)	- 2 (15,38) 1 (7,69) 10 (76,93)	1 (25,0) 1 (25,0) 1 (25,0) 1 (25,0)
ПМ, пов'язані з ушкодженням мітотичного апарату	К-мітоз багатополюсний мітоз моноцентричний мітоз асиметричний мітоз тригрупова метафаза порожниста метафаза грудкувата метафаза	11 (84,62) - - - - 2 (15,38) -	9 (39,13) 1 (4,35) 3 (13,04) - - 2 (8,70) 8 (34,78)	3 (33,34) 2 (22,22) - - 1 (11,11) 1 (11,11) 2 (22,22)	6 (60,0) - - - - 2 (20,0) 2 (20,0)	- - 1 (3,23) 1 (3,23) 2 (6,45) 2 (6,45) 25 (80,64)	1 (12,5) 1 (12,5) 2 (25,0) - 1 (12,5) 1 (12,5) 2 (25,0)

Примітки:

1. Повільне - повільне заморожування; 2. Швидке - швидке заморожування; 3. * - відносний відсоток патології від загальної кількості ПМ даного типу, прийнятої за 100%; 4. - - не виявлено.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Збільшення кількості ПМ в компактизованих ембріонах після повільного заморожування відбувалося здебільшого за рахунок грудкуватих метафаз (див. табл. 1), які призводять до загибелі бластомерів. Після швидкого заморожування зберігалося співвідношення ПМ, близьке до контрольного.

Виникнення таких грубих порушень перебігу мітозу як моноцентричний (рис. 5, б), асиметричний (рис. 5, в) і багатополюсний (рис. 5, г) мітози, які були виявлені в деконсервованих ембріонах, підтверджує факт ушкодження мітотичного апарату при кріоконсервуванні.

Дослідження генетичних порушень показало, що кріоконсервування збільшує кількість ембріонів з ПМ. Так, після повільного заморожування спостерігали: у 8-клітинних компактизованих ембріонах - вірогідне збільшення (p<0,001) частки ембріонів з патологіями мітозу (28,57%), у 8-клітинних ранніх - тенденцію до збільшення цього показника (18,44%). Очевидно, що процедура кріоконсервування не є нейтральною щодо ембріонів: вона впливає на проліферативну активність і приводить до серйозних клітинних змін, в тому числі й до некробіотичних.

Анеуплоїдія в контрольній групі стрічалася з частотою 2,86% в ранніх і 3,33% в компактизованих ембріонах. Після повільного заморожування рівень анеуплоїдії в ембріонах дорівнював 2,78% і 3,03% відповідно (p>0,05). Після швидкого заморожування анеуплоїдія була виявлена в 1 з 24 ранніх ембріонів (4,17%) і в жодному з 23 компактизованих ембріонів.

В окремих бластомерах ембріонів після кріоконсервування зрідка стрічалися порушення структури хромосом - хромосомні аберації (ахроматичний пробіл, кільцеподібна хромосома). Однак, результати дослідження показали, що в цілому кріоконсервування обраними методами не призводить до вірогідного збільшення геномних аномалій і хромосомних аберацій у 8-клітинних ембріонах миші.

Дослідження стану внутрішньоклітинної структури ембріонів виконували на 8-клітинних ембріонах, які виглядали морфологічно нормальними після швидкого заморожування. Аналіз зразків дозволив оцінити ступінь збереженості і характер ушкоджень ультраструктури клітинних компонентів бластомерів, обумовлених впливом процедури заморожування - відтавання. Цитоплазматична мембрана деяких бластомерів характеризувалася наявністю локальних ушкоджень невеликої площі, що супроводжувалися мікроклазматозом у перівіттеліновий простір. Ядерна мембрана зберігала цілісність, однак в деяких клітинах виявлялися розширення перинуклеарного простору. Ядра бластомерів великі, округлі, із гладкою поверхнею, каріоплазма світла, містила невеликі глибки гетерохроматину. Ядерця в деяких бластомерах спостерігалися у периферичних зонах ядра.

В структурі цитоплазми істотних змін не виявлено. Бластомери містили повний набір органел, які, в основному, зберігали характерну для контролю структуру і кількісні співвідношення. Виключенням були невеликі вакуолі з обривками мембран в периферичних ділянках бластомерів деяких ембріонів, а також близькі до розмірів мітохондрій порожнечі в цитоплазмі навколоядерної зони. Можливо, ці порожнечі є наслідком набрякання цистерн агранулярної ЕПС і деструкції мітохондрій. Отримані дані свідчать на користь теорії, відповідно до якої мембрани клітини є основним структурним елементом, на якому виявляється дія кріоконсервування [Mazur P., 1970].

Таким чином, при кріоконсервуванні 8-клітинних мишачих ембріонів з використанням методу повільного програмного заморожування необхідно враховувати ступінь їх компактизації - доцільніше заморожувати ранні ембріони, більшість бластомерів яких знаходиться в інтерфазі, щоб уникнути пошкодження веретена поділу.

ВИСНОВКИ

1. Визначення морфологічних і цитогенетичних параметрів ембріонів поряд з оцінкою рівня життєздатності на основних етапах циклу заморожування - відтавання є підставою прогнозування генетичної безпеки і ефективності методів кріоконсервування ембріонів ссавців. У дисертації проведено порівняння двох методів кріоконсервування ембріонів миші з використанням цитологічного та цитогенетичного аналізу для виявлення можливих морфологічних і генетичних порушень, які виникають під впливом чинників кріоконсервування.

2. Дроблення підвищує стійкість ембріонів до зниження температури. Експозиція 2- і 4-клітинних ембріонів у 1М розчині гліцерину при 0°C, на відміну від експозиції при 22°C, призводить до зниження рівня життєздатності в 1,2 рази, що супроводжується вірогідним зниженням мітотичного індексу в 1,3 рази і підвищенням рівня патологічних мітозів; експозицію 8-клітинних ембріонів у розчині гліцерину можна здійснювати як при 22°C, так і при 0°C.

3. На етапі додавання та видалення кріопротекторів у процедурі швидкого заморожування 2- і 4-клітинні ембріони, на відміну від 8-клітинних, мають морфологічні порушення у вигляді набрякання бластомерів, у зв'язку з чим використання швидкого заморожування для 2- і 4-клітинних ембріонів не є доцільним.

4. Експозиція у розчинах гліцерину не призводить до підвищення рівня анеуплоїдії у ембріонах різних стадій розвитку.

5. Швидке заморожування, порівняно з повільним, забезпечує більш високу збереженість бластомерів 8-клітинних ембріонів і не впливає на їх життєздатність, тоді як повільне заморожування викликає вірогідне зниження рівня життєздатності 8-клітинних компактизованих ембріонів в 1,25 рази.

6. Кріоконсервування, незалежно від методу заморожування і ступеня компактизації 8-клітинних ембріонів, не змінюючи рівень анеуплоїдії, призводить до зміни спектра патологій мітозу; повільне програмне заморожування, на відміну від швидкого, призводить до вірогідного підвищення в 3 рази рівня патологічних мітозів у 8-клітинних компактизованих ембріонах.

7. Ультраструктурний аналіз 8-клітинних ембріонів миші, які зберігають морфологічну цілісність після швидкого заморожування, виявив наявність нелетальних ушкоджень мембранних структур бластомерів.

8. На підставі результатів вивчення збереженості ембріонів за даними світлової й електронної мікроскопії, мітотичного режиму, вивчення хромосомного набору бластомерів, можна заключити, що при кріоконсервуванні 8-клітинних ембріонів перевагу слід віддавати процедурі швидкого заморожування; застосовувати повільне заморожування доцільно тільки для кріоконсервування 8-клітинних ранніх ембріонів.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Хроменкова О.Б., Смольянинова Е.И., Ханина Л.А. Осмотическое поведение эмбрионов мыши в растворах глицерина и его оксиэтилированного производного // Проблемы криобиологии. - 1999. - №4. - С. 77-78. (дисертантом проведено вивчення осмотичної поведінки 2-клітинних ембріонів і виконаний розрахунок зміни площі перерізу бластомерів у розчинах гліцерину).

2. Смольянинова Е.И., Жегунов Г.Ф., Хроменкова О.Б. Осмотическое поведение эмбрионов мыши в гипертонических растворах 1,2-пропандиола и его оксиэтилированных производных // Проблемы криобиологии. - 2000. - №1. - С. 49-51. (дисертант провела вибірку літератури з проблеми використання різних кріопротекторів і режимів заморожування ембріонів, виконала отримання і оцінку ембріонів і розрахунок зміни площі перерізу бластомерів у кріозахисних розчинах).

3. Грищенко В.І., Жегунов Г.Ф., Петрушко М.П., Хроменкова О.Б. Причини низької ефективності програми ЗІВ: цитогенетичний аспект // Педіатрія, акушерство та гінекологія. - 2000. - № 2. - С. 107-110. (дисертантом проведено вибірку вітчизняної та закордонної літератури з проблеми ефективності програм запліднення in vitro і систематизацію даних щодо результатів цитогенетичного аналізу).

4. Смольянинова Е.И., Хроменкова О.Б., Жерноклев Г.В. Влияние различных этапов криоконсервирования методом сверхбыстрого замораживания на осмотическую устойчивость и морфофункциональную сохранность эмбрионов мыши // Проблемы криобиологии. - 2001. - №2. - С. 49-55. (дисертантом вивчено вплив прямого занурення у рідкий азот на рівень життєздатності і мітотичний режим ембріонів) .

5. Хроменкова О.Б. Цитогенетические нарушения в доимплантационных эмбрионах мыши после криоконсервирования // Вісник проблем біології і медицини. - 2001. - № 3. - С. 35-39.

6. Хроменкова О.Б., Жегунов Г.Ф. Мітотичний індекс ембріонів миші після обробки гліцерином // Буковинський медичний вісник. - 2002. -Т. 6, №3-4. - С. 197-199. (дисертантом досліджено вплив 1М розчину гліцерину на мітотичну активність та рівень життєздатності 2-8-клітинних ембріонів в умовах in vitro).

7. Khromenkova O.B., Zhernoklev G.V., Zhegunov G.F., Grischenko V.I. The incidence of mitotic abnormalities in cryopreserved eight-cell early and compacted mouse embryos // CryoLetters.-2003.-Vol.24, №1-2.-P.27-32. (дисертантом вивчено вплив двох методів кріоконсервування на рівень життєздатності в умовах in vitro та на цитогенетичні характеристики 8-клітинних ембріонів миші - кількість пікнотично змінених ядер, рівень патологічних мітозів, співвідношення різних типів патологій мітозу).

8. Хроменкова О.Б., Жерноклев Г.В. Необходимость использования животной модели в программе искусственного воспроизводства // Тези доповідей міжнар. симп. “Біоетика на порозі III тисячоліття”. - Харків, 2000.- С. 121-122. (дисертантом проведено експерименти з кріоконсервування і цитологічний аналіз ембріонів миші).

9. Хроменкова О.Б., Жегунов Г.Ф., Жерноклев Г.В. Нарушения митотического режима в эмбрионах мыши после криоконсервирования // Проблемы криобиологии. - 2001. - №3. - С. 65-66. (дисертантом виконано консервування ембріонів з використанням методу повільного програмного заморожування, цитогенетичними методами досліджено його вплив на мітотичний режим ембріонів).

10. Хроменкова О.Б., Жерноклев Г.В. Цитологический анализ эмбрионов мыши после эквилибрации // Сб. тез. 5-й Пущинской конф. молодых ученых “Биология - наука 21-го века”.- Пущино, 2001. - С. 97. (дисертантом вивчено вплив експозиції у розчині гліцерину при різних температурах на рівень патологій мітозу в ембріонах миші).

11. Khromenkova O.B., Zhernoklev G.V., Antonenko T.S., Zhegunov G.F. Effect of cryopreservation on morphological features and chromosomal set of mouse embryos // Ab. 38th Annual Meeting of Society for Cryobiology. - Edinburgh (UK), 2001. - P. 82. (дисертантом досліджено рівень патологій мітозу методами цитологічного аналізу і рівень життєздатності ембріонів миші методом культивування після повільного заморожування).

12. Смольянінова Є.І., Хроменкова О.Б., Жернокльов Г.В., Коваленко І.Ф. Вплив умов еквілібрації на морфофункціональні параметри 8-клітинних ембріонів миші // Тези доповідей III з'їзду Українського біофізичного товариства з міжнародною участю. - Львів, 2002. - С. 141. (дисертантом досліджено вплив тривалості експозиції 8-клітинних ембріонів миші у кріозахисному розчині на рівень життєздатності в умовах in vitro).

13. Хроменкова О.Б. Изучение стабильности веретена деления в эмбрионах мыши после криовоздействия // Тези доповідей межвуз. конф. молодих учених “Медицина третього тисячоліття” - Харків, 2003. - С. 42-43.

АНОТАЦІЯ

Хроменкова О.Б. Цитогенетичний аналіз ембріонів ссавців при дії різних факторів кріоконсервування. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України, Харків, 2003.

Дисертацію присвячено проблемі оцінки впливу факторів кріоконсервування (розчинів гліцерину, гіпотермії та заморожування з різними швидкостями) на рівень життєздатності, мітотичний режим та хромосомний набір 2-8-клітинних ембріонів миші.

Дроблення підвищує стійкість ембріонів до зниження температури. Експозиція у розчинах гліцерину не призводить до підвищення рівня анеуплоїдії в ембріонах різних стадій. Процедура швидкого заморожування, порівняно з повільним програмним заморожуванням, забезпечує більш високу збереженість бластомерів 8-клітинних ембріонів і не знижує рівень життєздатності.

Методами цитологічного і цитогенетичного аналізу встановлено, що кріоконсервування 8-клітинних ембріонів незалежно від методу заморожування і ступеня їх компактизації не впливає на рівень анеуплоїдії, але змінює спектр патологічних мітозів. Електронно-мікроскопічним дослідженням показано, що 8-клітинні ембріони після швидкого заморожування в основному характеризуються збереженістю ультраструктури ядра й основних органел цитоплазми бластомерів.

Ключові слова: кріоконсервування, кріопротектор, доімплантаційні ембріони миші, патології мітозу, анеуплоїдія.

АННОТАЦИЯ

Хроменкова О.Б. Цитогенетический анализ эмбрионов млекопитающих при воздействии различных факторов криоконсервирования. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины, Харьков, 2003.

Диссертация посвящена проблеме оценки влияния факторов криоконсервирования на морфофункциональные показатели доимплантационных эмбрионов мыши. С помощью цитологического и цитогенетического анализа изучены особенности течения митоза при воздействии растворов глицерина, гипотермии и замораживания с разными скоростями на уровень жизнеспособности, митотический режим и хромосомный набор 2-8-клеточных эмбрионов мыши. Особенное внимание уделено процессам, которые являются причиной хромосомных аберраций, а именно различным нарушениям митоза.

Чувствительность эмбрионов мыши ранних стадий развития к факторам криоконсервирования уменьшается с продвижением в дроблении. Дробление повышает стойкость эмбрионов к снижению температуры. Экспозицию 8-клеточных эмбрионов в процедуре быстрого замораживания можно осуществлять как при 22°C, так и при 0°C. Экспозиция 2- и 4-клеточных эмбрионов в 1М растворе глицерина при 0°C, в отличие от экспозиции при 22°C, приводит к снижению уровня жизнеспособности в 1,2 раза.

Изучение осмотического поведения эмбрионов на этапах процедуры быстрого замораживания показало, что 2- и 4-клеточные эмбрионы, в отличие от 8-клеточных, необратимо повреждаются, в связи с чем дальнейшие сравнительные исследования двух методов криоконсервирования включали только стадию 8-ми бластомеров.

При оценке влияния полного цикла консервирования на эмбрионы установлено преимущество быстрого замораживания, по сравнению с медленным, по морфологическому критерию: процедура быстрого замораживания обеспечивала более высокую сохранность бластомеров 8-клеточных эмбрионов. Установлена зависимость между степенью компактизации 8-клеточных эмбрионов мыши и уровнем их жизнеспособности после медленного программного замораживания: показатель был ниже для компактизированных эмбрионов (71,86±4,65%), по сравнению с контролем (89,39±3,59%, p<0,05) и деконсервированными ранними эмбрионами (78,40±5,93%, p>0,05). После быстрого замораживания он составлял 80,25±4,70% для ранних и 83,43±3,52% для компактизированных эмбрионов (p>0,05).

Цитологический анализ эмбрионов после экспозиции в 1М растворе глицерина показал достоверное снижение митотического индекса и выявил тенденцию к повышению патологических митозов в 2- и 4-клеточных эмбрионах, экспонированных при 0єС. Для 8-клеточной стадии не наблюдалось отличий в частоте патологических митозов после экспозиции при 22єС и 0єС. Среди патологий митоза встречались патологии, связанные как с повреждением хромосом, так и с повреждением митотического аппарата.

Достоверное снижение уровня жизнеспособности 8-клеточних компактизированных эмбрионов в 1,25 раза, наблюдаемое после медленного замораживания, сопровождается снижением митотического индекса и достоверным увеличением (в 3 раза) количества патологических митозов. Быстрое замораживание не приводит к достоверному снижению уровня жизнеспособности 8-клеточных эмбрионов.

В отличие от 8-клеточных компактизированных эмбрионов, для 8-клеточных ранних не наблюдалось увеличения уровня патологических митозов после медленного программного и быстрого замораживания, однако имело место изменение спектра встречающихся патологий. Процедура медленного замораживания приводила к более серьезным повреждениям ядерного материала (увеличение количества набуханий и слипаний хромосом и комковатых метафаз), чем процедура быстрого замораживания (многополюсный митоз, трехгрупповые и полые метафазы).

На основании цитогенетического анализа установлено, что уровень анеуплоидии в эмбрионах не увеличивался после криоконсервирования с использованием методов медленного и быстрого замораживания. Результаты электронно-микроскопического исследования свидетельствуют, что 8-клеточные эмбрионы, сохранившие свою морфологическую целостность после процедуры быстрого замораживания, в основном характеризуются сохранностью ультраструктуры ядра и основных органелл цитоплазмы бластомеров. Доказано, что при криоконсервировании 8-клеточных эмбрионов целесообразно использование метода быстрого замораживания, а при использовании медленного программного замораживания предпочтение следует отдавать 8-клеточным ранним эмбрионам.

Ключевые слова: криоконсервирование, криопротектор, доимплантационные эмбрионы мыши, патологии митоза, анеуплоидия.

ANNOTATION

Khromenkova O.B. Cytogenetic analysis of mammalian embryos after influence the various factors of cryopreservation - Manuscript.

Thesis for competition of scientific degree of the candidate of Biological Sciences on the speciality 03.00.19 - cryobiology. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Science of the Ukraine, Kharkov, 2003.

The thesis is devoted to the problem of effect of the cryopreservative factors (glycerol solutions, hypothermia and freezing with different rates) on the viability, mitotic mode and chromosome set of 2-8-cell mouse embryos.

The division increases the stability of embryos to the temperature decreasing. The exposure in glycerol solutions does not increase the aneuploidy rate in embryos of different stages. The procedure of rapid freezing provides higher integrity of blastomeres of 8-cell embryos and does not decrease the viability, compared with slow program freezing.

By cytological and cytogenetic methods it was revealed that cryopreservation of 8-cell embryos regardless of freezing method and their compaction degree does not influence on the aneuploidy rate, but changes the spectrum of mitotic abnormalities. Electronic-microscopic study has shown that 8-cell embryos are mainly characterized by the integrity of ultrastructure of nuclei and of the main cytoplasmic organelles after rapid freezing .

Key words: cryopreservation, cryoprotectant, preimplantation mouse embryos, mitotic abnormality, aneuploidy.

Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук

_____________________________________________________

Підписано до друку 01.06.2004 р. Формат 6090 1/16

Тираж 100 прим. Авт. арк. 0,9. Замовлення № 1190/05

Надруковано в комп'ютерно-копіювальному центрі “МіФ”,

61022 Харків, пр. Правди, 17.

Размещено на Allbest.ru

...