Молекулярні механізми дії вуглекислоти на розвиток та підтримання гіпобіотичного стану тварин

Размещено на http://www.allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О.В. ПАЛЛАДІНА НАН УКРАЇНИ

УДК 577.192.3:619:612.015:3:616-089.5

Молекулярні механізми дії вуглекислоти на розвиток та підтримання гіпобіотичного стану тварин

03.00.04 - біохімія

Автореферат

на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Мельничук Сергій Дмитрович

Київ 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії тварин Національного аграрного університету Кабінету Міністрів України

Захист дисертації відбудеться 27 грудня 2004 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9

Автореферат розісланий 26 листопада 2004 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

протон кров гіпобіох температура

АНОТАЦІЯ

Мельничук С.Д. Молекулярні механізми дії вуглекислоти на розвиток та підтримання гіпобіотичного стану тварин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2004.

У дисертації, відповідно до поставленої мети і завдань досліджень, отримано нові дані стосовно вивчення молекулярно-біологічних особливостей механізмів дії вуглекислоти на розвиток й підтримання гіпобіотичного стану багатьох біологічних об'єктів. Запропоновано гіпотетичну схему анаеробної взаємотрансформації енергії відновлених піридиннуклеотидів у клітинах тварин за умов природного гіпобіозу, яка передбачає паралельне взаємоперетворення СО2 і НСО3-, і здатну відігравати важливу роль у енергозабезпеченні організму за вказаних умов. Вивчено динаміку та встановлено чіткі закономірності змін величин редокс-стану (NАD+/NАDН і NАDP+/NАDPН) у цитозолі та (NАDP+/NАDPН) у мітохондріях гепатоцитів ховрахів за вищевказаних умов. Удосконалено існуючі та розроблено нові методи переведення деяких біологічних об'єктів (тварини, риби, клітини) у стан штучного гіпобіозу і на основі науково-теоретичних й прикладних досягнень розроблено ефективні шляхи й пропозиції щодо використання цього явища у вирішенні ряду важливих проблем тваринництва й медицини.

Ключові слова: природний гіпобіоз, штучний гіпобіоз, енергетичний обмін, азотний обмін, редокс-стан, форми вуглекислоти, гліколіз, ЦТК, ПОЛ, кислотно-основна рівновага, баут, кров, печінка, спермії бугаїв, компартменти клітин.

АННОТАЦИЯ

Мельничук С.Д. Молекулярные механизмы действия углекислоты на развитие и поддержание гипобиотического состояния животных. - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2004.

Получены новые данные относительно изучения молекулярно-билогических особенностей механизмов действия углекислоты на развитие и поддержание гипобиотического состояния большинства биологических объектов. Предложена гипотетическая схема анаэробной взаимотрансформации энергии восстановленных пиридиннуклеотидов в клетках животных при условии природного гипобиоза, которая предусматривает параллельное взаимопревращение СО2 и НСО3-, и может играть важную роль в энергообеспечении организма в указанных условиях. Изучена динамика и установлены четкие закономерности изменений величин редокс-состояния (NАD+/NАDН и NАDP+/NАDPН) в цитозоле и (NАDP+/NАDPН) в митохондриях гепатоцитов сусликов при вышеуказанных условиях. Усовершенствованы существующие и разработаны новые методы перевода некоторых биологических объектов (животные, рыбы, клетки) в состояние искусственного гипобиоза и на основе научно-теоретических и прикладных достижений разработаны эффективные пути и предложения использования этого состояния в решении ряда важных проблем животноводства и медицины.

Ключевые слова: природный гипобиоз, искусственный гипобиоз, энергетический обмен, азотный обмен, редокс-состояние, формы углекислоты, гликолиз, ЦТК, ПОЛ, кислотно-основное равновесие, баут, кровь, печень, сперматозоиды быков.

SUMMARY

Melnychuk S.D. Molecular mechanisms of carbon dioxide on development and support of animal hibernation state. - Manuscript.

Thesis for Doctor of Science degree on speciality 03.00.04 - biochemistry. A.V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2004.

In dissertation, according to the definite aim and tasks of researches, we received a new data concerning to explore molecular and biological characteristics of mechanisms of carbon dioxide affect on development and support of gypobiotic state of the majority of biological objects. The hypothetical schema of anaerobic co-transformation of the renewed pyridinnucleotide's energy in animals' cells under the circumstances of natural hibernation which specifies parallel reciprocal conversion of СО2 and НСО3- and can play an important role in energy support of organism according to mentioned circumstances is proposed. Explored the dynamic and distinguished the definite principals of redox state amount changes in cytoplasm (NАD+/NАDН and NАDP+/NАDPН) and (NАDP+/NАDPН) in chondriosomes of the hamsters' hepatocytes according to mentioned circumstances. Showed the main role of рСО2 amount changes and NH3 concentration in the dormant animals' tissues in redox state in cells' compartments that has an important meaning in the anabolism-catabolism processes intensity correction and heat production of the whole organism. Defined that the mentioned above рСО2 amount changes in the experimental animals' blood in dynamic of hibernation baut are in the inverse relation to changes in ammonia concentration and in the instant dependence to changes of glutamate levels, malate and lactate in the liver tissues. At the first time was showed correlations between decarboxylation and carboxylation in the liver tissues according to circumstance of natural and artificial hibernation use to side of СО2 fixation dominance in comparatively with active state of experimental animals. Improved the present and established the new methods of some biological objects (animals, fish and cells) conversion to the artificial hibernation state and effective ways and proposals for range important problems resolving in animal husbandry and medicine.

Keywords: nature and artificial hibernation, energetic exchange, ammonia exchange, redox state, different forms of CO2, glycolysis, acid-base equilibrium, CTA, blood, liver, bull sperm.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення молекулярних механізмів переходу і перебування тварин та інших видів живих організмів у стані природного й штучного зниження життєдіяльності (анабіоз, гіпобіоз, гібернація, естивація, торпідний стан тощо) належить до десяти найактуальніших наукових проблем біології початку ХХІ століття (“Дойчланд”, № 3, 1999). Такий висновок німецьких науковців є своєрідним узагальненням результатів опитування з цього питання багатьох видатних вчених сучасності.

Наукові пошуки у вказаному напрямі мають надзвичайно важливе значення для розробки нових та модифікації існуючих способів консервування біологічних об'єктів (клітин, тканин, органів, організмів), загального знеболення організму, боротьби з хворобами тварин і людей, вирішення ряду проблем стосовно перебування людей в екстремальних умовах (під водою, під землею, у космосі тощо).

Найвідоміші фізіолого-біохімічні досягнення минулого століття у вивченні даної проблеми пов'язані з дослідженнями М.І. Калабухова, О.В. Палладіна, Р.В.Чаговця, Я.В. Бєліка, І.В. Смірнова, П.В. Шмідта, В.І.Грищенка, А.М. Білоуса, А.М. Голдовського, Г.Ф. Жегунова, Н.С. Пушкаря, Е.З. Емірбекова, Д.О.Мельничука, В.О. Михайлівського, W. Dawson, G.Heldmaier, A. Malan, N.Stewart, K. Storey, J.Wang та ін. Вони свідчать, що основними факторами, які обумовлюють перехід організму у стан гіпобіозу є різкі температурні перепади у навколишньому середовищі (холод, спека) і пов'язаний з цим дефіцит води та корму. Завдяки одержаним знанням сформувалися такі нові галузі науки, як кріобіологія, кріомедицина тощо, успіхи яких незаперечні.

Ще у позаминулому столітті було встановлено, що зміна складу газової атмосфери (у першу чергу, зміна вмісту СО2 і О2), також є фактором, який зумовлює перехід організму в стан гіпобіозу. Доведено, що комбінація факторів холоду й гіперкапнії значно посилює кінцевий ефект (В.Е.Маршак, 1969). Проте результати досліджень стосовно вуглекислотного гіпобіозу тривалий час залишалися без належної уваги. Роль вуглекислоти в регуляції метаболізму в організмі тварин було з'ясовано порівняно недавно - у другій половині минулого століття, коли були детально вивчені механізми реакцій декарбоксилювання та карбоксилювання певних метаболітів у тканинах тварин та встановлена значущість згаданих реакцій у процесах біосинтезу та біоенергетики. Тоді й виникла потреба знову повернутиcя до проблеми вивчення ролі та механізмів впливу вуглекислоти на процеси обміну речовин у тварин у стані гіпобіозу (H.G. Wood, C.H. Werkman, М.Ф. Гулий, Д.О.Мельничук, A. Malan, Н.М. Гула, В.О. Михайлівський, С.П. Роговський, С.Д.Мельничук).

Зв'язок робот із науковими програмами, планами, темами. У 1996-1997 роках експериментальні дослідження за темою дисертаційної роботи виконувалися у відділі біохімії ліпідів (зав. відділу - членкор НАН України Н.М. Гула), а також у відділі регуляції обміну речовин (в.о. зав. відділу - канд. біол. наук В.О.Михайлівський) Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України у рамках науково-технічної програми: “Механізми метаболічної адаптації і шляхи корекції їх порушень в організмі тварин і людини” (номер державної реєстрації: 0194U135507).

З 1997 року і по теперішній час робота ведеться в проблемній науково-дослідній лабораторії “Біохімія гіпобіозу тварин” (зав. лабораторії - канд. біол. наук С.Д.Мельничук), що функціонує на базі кафедри біохімії тварин Національного аграрного університету України, та в інших установах у межах тем: “Вивчення молекулярних механізмів розвитку гіпобіотичного стану тварин та його моделювання” (№ державної реєстрації 0197U007141), “Вивчення впливу різних форм вуглекислоти на розвиток стану штучного гіпобіозу та розробка технологій переведення організму тварин, тканин та клітин в стан штучного гіпобіозу” (№ державної реєстрації 0103U005378), а також у рамках теми: “Розробка та впровадження системи кріоконсервації та збереження сперми плідників великої рогатої худоби в умовах штучного гіпобіозу” (№ державної реєстрації 0196U013527, з 1998 року - 0198U004071).

Мета і задачі дослідження. Основною метою роботи було з'ясувати молекулярно-біохімічні механізми дії основних форм вуглекислоти (рСО2 і НСО3-) на основні ланки обмінних процесів у динаміці розвитку, підтримання та виходу тварин із стану природного гіпобіозу, а також на основі результатів молекулярно-біохімічних й клінічних досліджень розробити моделі і ефективні шляхи застосування явища штучного гіпобіозу біологічних об'єктів для вирішення важливих проблем тваринництва й медицини.

Для досягнення вказаної мети необхідно було вирішити такі задачі:

вивчити молекулярно-біохімічні особливості та встановити закономірності щодо змін концентрації протонів, вмісту СО2, НСО3- і О2 у крові та температури тіла тварин (крапчасті ховрахи) у стані природного гіпобіозу (в динаміці етапів його розвитку, підтримання та виходу з нього);

з'ясувати особливості вуглеводнево-ліпідного і азотного обміну у тканинах та окисно-відновного стану у компартментах клітин печінки тварин за умов природного (в динаміці гіпобіотичного бауту) та штучного гіпобіозу;

визначити й порівняти інтенсивність процесів утилізації вуглекислоти в тканинах печінки тварин за умов природного та штучного гіпобіозу;

дослідити дію зміни кислотно-основної рівноваги (КОР) крові тварин на процеси їх входження у стан штучного гіпобіозу;

встановити оптимальні концентрації СО2, НСО3-, Н+ та температури в живильних середовищах для сперми бугаїв з метою переведення сперміїв у стан гіпобіозу, а також виявити особливості впливу цього явища на енергетичний обмін та здатність клітин до зберігання й запліднення;

розробити способи переведення риб у стан штучного гіпобіозу, а також вивчити його вплив на стан їх енергетичного й азотного обміну та термін їх життєдіяльності;

вивчити і дати біохімічне й клінічне обґрунтування способу застосування стану штучного гіпобіозу у тварин для загального знеболення та запобігання крововтрат при хірургічних втручаннях в організм.

Об'єкти досліджень: щури, крапчасті ховрахи (Cittelus suslicus Gueld), риба (озерний короп Cuprinus carpio), окремі органи, кров, тканини печінки, спермії бугаїв, компартменти клітин, інтермедіати.

Предмет дослідження: молекулярно-біохімічні механізми дії вуглекислоти на розвиток та підтримання гіпобіотичного стану тварин, ензиматичні реакції, редокс-стан, концентрація протонів, НСО3-, величина рСО2 та О2, природний і штучний гіпобіоз.

Методи досліджень: молекулярно-біохімічні, радіоізотопні, спектрофотометричні, хроматографічні, ензиматичні, потенціометричні, кріоскопічні, фізико-хімічні, ультрацентрифугування та інші.

Наукова новизна одержаних результатів. Експериментально доведено, що характер змін вмісту кожної з основних форм вуглекислоти (рСО2 і НСО3-) та концентрації протонів у крові гібернуючих тварин (ховрахів) має певні закономірності і відіграє певну роль у процесах їх входження, перебування й виходу із стану гіпобіозу. Виявлено зворотну залежність між парціальним тиском вуглекислоти (рСО2) у крові та засвоєнням О2 тканинами і рівнем температури тіла гібернуючих тварин.

Вивчено динаміку та встановлені чіткі закономірності змін величин редокс-стану (NАD+/NАDН і NАDP+/NАDPН) у цитозолі та (NАDP+/NАDPН) у мітохондріях гепатоцитів ховрахів за вищевказаних умов. Показано важливу роль змін вмісту рСО2 та концентрації NH3 у тканинах гібернуючих тварин у регуляції окисно-відновного стану в компартментах їх клітин, що має визначальне значення в корегуванні інтенсивності процесів анаболізму - катаболізму та теплопродукції цілого організму. Вперше виявлено, що вказані вище зміни величини рСО2 у крові дослідних тварин у динаміці гіпобіотичного бауту знаходяться у зворотній залежності із змінами концентрацій аміаку та у прямій - із змінами рівнів глутамату, малату й лактату у тканині їх печінки.

За допомогою радіоізотопного методу вперше показано, що співвідношення між інтенсивністю процесів декарбоксилювання та карбоксилювання в тканинах тварин за умов природного і штучного гіпобіозу зсувається у бік домінування фіксації вуглекислоти порівняно з активним станом досліджуваних тварин.

Запропоновано гіпотетичну схему анаеробної взаємотрансформації енергії відновлених піридиннуклеотидів і АТР у клітинах тварин за умов природного гіпобіозу, яка передбачає паралельне взаємоперетворення СО2 і НСО3-, що здатне відігравати важливу роль у енергозабезпеченні організму за вказаних умов.

Удосконалено існуючі та розроблені нові методи переведення деяких біологічних об'єктів (тварини, риби, клітини) у стан штучного гіпобіозу, показані певні молекулярно-біохімічні особливості впливу цього явища на ключові ланки енергетичного і азотного метаболізму та на утворення вільних радикалів у тканинах.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати досліджень стали науково-теоретичною й практичною основою для:

модифікації номограми Д. Ван-Слайка для роботи з пойкілотермними та гіпобіотичними тваринами;

внесення коректив у загальноприйняту формулу розрахунків окисно-відновного стану в компартментах клітин за умов природного й штучного гіпобіозу тварин за концентраціями субстратів дегідрогеназних реакцій, в яких одним з компонентів є СО2. Суть коригувань полягає в тому, що значення рСО2 у цитозолі клітин пропонується розраховувати за концентрацією його у крові, а не вважати за сталу величину (як пропонувалося раніше);

удосконалення відомого вуглекислотного способу зберігання сперми бугаїв-плідників (Науково-практичні рекомендації “Спосіб зберігання охолодженої сперми бугаїв шляхом використання комбінованого вуглекислотного гіпобіозу”, 2004). Удосконалений спосіб успішно пройшов виробниче випробування та рекомендований Міністерством аграрної політики України для застосування у практиці тваринництва;

розробки способу переведення риб (озерний короп) у стан штучного гіпобіозу, що має велику перспективу застосування його з метою подовження терміну зберігання живої риби, у тому числі при перевезенні на далекі відстані;

доведення перспективності способу переведення тварин у стан штучного гіпобіозу як альтернативи загальному знеболенню організму без застосування тривіального хімічного наркозу, що надзвичайно важливо для тривалих складних оперативних втручань.

Пріоритетність усіх вищезгаданих способів підтверджена чотирма патентами України на винаходи, позитивним рішенням про видачу патенту України та практичними рекомендаціями.

Продовжується організаційна робота щодо широкого практичного застосування розроблених рекомендацій, зокрема: налагоджується виробництво спеціального середовища для зберігання охолодженої сперми; проектується спеціальне обладнання для переведення риби у гіпобіотичний стан та транспортування їх у цьому стані на далекі відстані; опрацьовується метод загального гіпобіотичного знеболення на інших видах тварин тощо.

Результати експериментальних досліджень, висновки та пропозиції використовуються у навчальному процесі при викладанні курсу “Біохімія тварин”.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було сплановано і виконано автором в основному самостійно, під загальним керівництвом наукового консультанта. Ідеї, гіпотези та теоретичні концепції роботи належать здобувачеві. Автор дисертації є основним виконавцем досліджень, результати яких викладені у даній роботі. Роль співавторів окремих досліджень визначена у відповідних публікаціях і патентах та окремих письмових угодах. Деякі результати досліджень опубліковані у співавторстві (М.В. Маренець, В.І. Цвіліховський, П.В. Ярош, С.В. Терещенко, Н.Б. Силонова, В.І. Вихованець, О.В.Арнаута) і цитуються у роботі при обговоренні певних висновків, але експериментальні дані цих робіт у дисертацію не увійшли.

Апробація дисертації. Результати досліджень, які увійшли в дисертаційну роботу, доповідались її автором на:

Першій Всеукраїнській науково-виробничій конференції ветеринарних патологів (13-15 листопада 1996 р., м. Київ); VII-му Українському біохімічному з'їзді (20-21 вересня 1997 р., м. Київ); Світовому ветеринарному конгресі (World International Veterinary Congress, 23-26 September 1999, Leon, France); Симпозіумі гіпобіозу (Life in the cold - Hibernation Symposium - Jungholz, Germany 13-18 August 2000); 1-й Міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми ветеринарної медицини з питань фізіології і патології відтворення с.-г. тварин” (25-26 травня 2000 р., м. Київ); 2-й Всеукраїнській конференції ветеринарних патологів (21-24 листопада 2001 р., НАУ, м. Київ); VI-й Міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин” (27-28 вересня 2001 р., м. Київ); VIII-му Українському біохімічному з'їзді (22-23 жовтня 2002 р., м. Чернівці); І-му з'їзді токсикологів України (11-13 жовтня 2001 р., м. Київ); науково-практичній конференції “Лікування хірургічних ран” (12-13 грудня 2002 р., м. Київ); засіданні відділення ветеринарної медицини Української академії аграрних наук (17 березня 2004 р., м. Київ); засіданні Президії Національної академії наук України (23 березня 2004 р., м. Київ); науковому семінарі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України (6 липня 2004 р., м. Київ).

Публікації. Результати дисертаційної роботи відображені у 37 статтях, опублікованих у 7 фахових наукових журналах, збірниках наукових праць, у 4 патентах на винаходи, матеріалах і тезах наукових конференцій та у практичних рекомендаціях.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу; огляду літератури; загальної методики та основних методів досліджень; результатів досліджень; аналізу і узагальнення результатів досліджень; висновків; списку використаних джерел; додатків. Робота викладена на 242 сторінках основного тексту, містить 48 таблиць та 34 рисунки. Список використаних джерел включає 298 найменувань, у тому числі 161 - зарубіжних авторів.

Матеріали та методи досліджень

Відповідно до поставлених завдань та для досягнення мети були змодельовані стани природного і штучного гіпобіозу тварин. Кожна модель мала ряд досліджуваних серій і підсерій. Модель природного гіпобіозу тварин включала першу, другу і третю серії, а штучного - четверту, п'яту і шосту відповідно.

Матеріали і методи моделі природного гіпобіозу тварин. Досліди проведені на крапчастих ховрахах (Cittelus suslicus Gueld), масою 150-200 г, яких відловлювали в степу Херсонської області (Асканія-Нова). Відбір проб крові тканин здійснювали у 1-й, 2-й, 3-й, 6-й, 8-й і 9-й день з початку періодичного гіпобіотичного бауту. За контроль слугували тварини, які перебували в активному стані.

Зимова сплячка ховрахів - процес циклічний, який складається з баутів. Баут - це вхід у сплячку - сплячка - вихід з неї. Між гіпобіотичними баутами ховрах знаходиться у стані нормотермії 1-2 дні. У січні-лютому тривалість бауту становить 8-12 днів. У наших дослідженнях тривалість гіпобіотичного бауту ховрахів дорівнювала 9 днів.

Перша серія - вивчення молекулярно-біохімічних особливостей змін основних параметрів кислотно-основної рівноваги (КОР) та рівня О2 в крові ховрахів у динаміці розвитку природного гіпобіотичного бауту. Досліджувані показники визначали на кислотно-основному аналізаторі Radelkis OP-215.

Друга серія - вивчення молекулярно-біохімічних особливостей окисно-відновного стану в гепатоцитах ховрахів у динаміці їх гіпобіотичного бауту.

Величини окисно-відновного стану в мітохондріях (за глутаматдегідрогеназною системою) і цитозолі (за лактатдегідрогеназною та NADР+-малатдегідрогеназною (декарбоксилюючою) системами) гепатоцитів піддослідних тварин визначали за методом Г. Кребса (Krebs H.A., Veech R., 1970), а концентрації пірувату, лактату, оксалоацетату, малату, -кетоглутарату, глутамату, аміаку та глюкози - використовуючи загальновідомі методи, які описані у роботах автора.

Відбір тканин печінки для визначення вказаних параметрів здійснювали в динаміці гіпобіотичного бауту аналогічно, як і в першій серії досліджень.

Третя серія - вивчення молекулярно-біохімічних особливостей процесів утилізації вуглекислоти (карбоксилювання) в тканинах печінки ховрахів у стані природного гіпобіозу. Використано методику визначення інтенсивності сумарного процесу утилізації вуглекислоти тканинами печінки тварин в умовах in vitro за кількістю радіоактивного вуглецю NaH[14C]O3, який перейшов у молекули органічних сполук інкубованих гомогенатів печінки. Дослідження включення радіоактивної мітки проводили на сцинтиляційному лічильнику SL-30 “Intertechnique” за відомою методикою, описаною в роботах автора. Радіоактивність зразків визначали на базі радіоізотопної лабораторії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Матеріали і методи моделі штучного гіпобіозу тварин

Четверта серія - розробка бікарбонат-вуглекислотного способу переведення сперміїв бугаїв-плідників у стан гіпобіозу та вивчення за вказаних умов молекулярно-біохімічних особливостей їх енергетичного обміну, тривалості зберігання та запліднювальної здатності.

Дослідження проводили спільно з відомими вченими в області штучного осіменіння тварин кандидатами с.-г. наук А.П. Кругляком, М.П. Журавлем та асистентом О.І. Смирновою на базі Броварської районної станції штучного осіменіння, Бородянської станції осіменіння (Київська область), Головного Селекційного Центру України (м. Переяслав-Хмельницький), кафедри генетики і розведення с.-г. тварин Національного аграрного університету.

Свіжу сперму контрольних зразків розріджували живильним середовищем згідно з інструкцією (“Инструкция…”, 1981). Технологічну придатність сперми у процесі її зберігання визначали шляхом підрахунку рухливих сперміїв у полі зору мікроскопу. При зниженні рухливості нижче 50% (5 балів), сперму вважали технологічно непридатною для використання.

На другому етапі досліджень проводили вивчення впливу бікарбонат-вуглекислотного способу переведення сперміїв бугаїв у стан гіпобіозу на їх енергетичний обмін. Використовували живильне середовище з такими встановленими дослідним шляхом параметрами рН - 6,7; НСО3- - 40 ммоль/л; СО2 - 10,05 ммоль/л; температура - 12 0С і вивчали їх вплив на концентрацію основних метаболітів фруктолізу та цикл трикарбонових кислот у сперміях бугаїв (М.В.Маренець, С.Д. Мельничук, 2000; Д.О. Мельничук та ін., 2000). У сперміях та плазмі сперми визначали концентрації фруктози, молочної, піровиноградної, лимонної, ?-кетоглутарової, яблучної та щавлевооцтової кислот за відомими методами, описаними у роботах автора.

На третьому етапі проводили вивчення запліднювальної здатності сперміїв розбавленої сперми при її зберіганні у бікарбонат-вуглекислотному гіпобіотичному стані. Контрольні проби сперми розводили відповідно до вищевказаної інструкції.

У п'ятій серії вивчали молекулярно-біохімічні особливості метаболізму за умов вуглекислотно-кисневого гіпобіозу риб та з'ясовували перспективи його практичного використання.

Використовували суміш СО2 і О2 у співвідношенні 1:1, яка продувалась крізь воду акваріума. Коропів середньою живою масою 250-350 г відбирали із Переяслав-Хмельницького рибного господарства Київської області. Для переведення у стан штучного гіпобіозу рибу поміщали у прикритий зверху склом акваріум (об'єм 40 л) і продували крізь воду газову суміш двоокису вуглецю й кисню у певному співвідношенні протягом години із швидкістю 150-200 мл/хв (на 50-100 л води) (температура води - 16-18 0С). Через годину риба поступово переходила у штучний гіпобіотичний стан, в якому могла знаходитись до трьох діб. Після перенесення у чисту воду риба через 5-8 хв виходила із стану гіпобіозу. Контролем слугувала риба, яка перебувала у ненасиченій газовою сумішшю воді з такою самою температурою.

Шоста серія присвячена вивченню молекулярно-біохімічних особливостей метаболізму при штучному гіпобіозі теплокровних тварин та розробці способів його використання у хірургічній практиці. Експерименти проводили на білих щурах лінії Вістар живою масою 180-200 г, яких утримували в умовах віварію.

Ця серія досліджень включала три етапи.

Перший етап. Вивчення впливу змін стану КОР крові щурів на швидкість їх входження у стан штучного гіпобіозу. За принципом аналогів (за масою, віком та статтю) тварин розділяли на три групи:

перша дослідна група - тварини, яких переводили у стан метаболічного ацидозу за загальноприйнятою методикою (S.Vaccarezza, A. Charney, 1988);

друга дослідна група - тварини, яких переводили в стан метаболічного алкалозу за аналогічною методикою;

третя контрольна група - тварини, яким вводили еквівалентно за кількістю Nа+ розчин NаCl. Кров для досліджень стану КОР у тварин відбирали через одну годину після введення.

Наступний хід досліджень полягав у переведенні тварин кожної із груп (контрольна і дослідні) у стан штучного гіпобіозу за методикою Бахмет'єва-Анжуса, детально описаною у роботах автора. Для цього застосовувалась розроблена автором гіпобіотична камера ГК-01 та змішувач газів 122 СГ-01. Як тест на швидкість розвитку явища штучного гіпобіозу у піддослідних тварин брались показники інтенсивності зниження у них ректальної температури у динаміці.

Другий етап. Вивчення інтенсивності процесів карбоксилювання в тканинах печінки щурів за умов штучного гіпобіозу. Відбір проб печінки та вивчення інтенсивності процесів утилізації вуглекислоти (як і у ховрахів 3-ї серії досліджень) у щурів здійснювали при перебуванні їх у стані штучного гіпобіозу (через 3 год. від початку переведення їх у цей стан) та в активному стані (контрольна група).

Третій етап. Вивчення особливостей обмінних процесів при штучному гіпобіозі у щурів та можливостей його використання у хірургічній практиці. Дослідження щодо вивчення принципової можливості використання явища штучного гіпобіозу за умов різноманітних оперативних втручань на щурах були проведені спільно з фахівцями Інституту хірургії та трансплантології АМН України (д.м.н., професор Ю.О. Фурманов) і кафедри хірургії ветеринарного факультету НАУ (д.в.н., професор О.Ф. Петренко). В процесі досліджень були виконані такі оперативні втручання: резекція легені, часткова гепатектомія, операції на шлунку, ампутація кінцівки, остеосинтез трубчастих кісток тощо (С.Д. Мельничук, Ю.О. Фурманов, П.В. Ярош, 1998). Характер біохімічних та клінічних післяопераційних змін в організмі дослідних і контрольних груп щурів вивчався на прикладі операції з ампутації передньої кінцівки тварини. Як контроль використовували групу тварин, для яких застосовували типовий хімічний наркоз. У процесі цих досліджень використовувалися, в основному, методики, які описані вище.

Дослідження вільно-радикального окислення ліпідів у мітохондріях печінки щурів здійснювали на хемолюмінометрі (ПХЛ-01) з фотоелектронним помножувачем (ФЄУ-84-3), додатково обладнаним комп'ютером АХЛГ-01 згідно з методикою описаною у статті С.Д. Мельничука, О.І. Кузьменка, В.М. Маргітича та ін. (1998).

Одержані дані обробляли статистично за допомогою комп'ютерної програми MS Excel з використанням критерію t Стьюдента.

2. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Біологічна роль вуглекислоти та можливі біохімічні механізми її впливу на організм тварин за умов природного гіпобіозу

Особливості змін концентрацій основних форм вуглекислоти (СО2 та НСО3-), Н+ і О2 в крові та температури тіла ховрахів у динаміці розвитку природного гіпобіотичного бауту

За наведеними даними, вже протягом першої доби у період, коли тварини “заснули”, значно знижується температура їх тіла (рис. 1) порівняно з активним станом.

Надалі спостерігається її поступове зниження до рівня температури навколишнього середовища (шоста доба). При пробудженні (восьма доба) температура тіла тварин різко підвищується і досягає контрольних значень. З початком наступного бауту цей показник знову різко знижується.

Рівень парціального тиску СО2 у крові тварин протягом першої доби (рис. 2) зростає на 65,8 % порівняно з їх активним станом. Приблизно такий самий парціальний тиск вуглекислого газу в крові тварин залишається протягом наступних двох діб.

На четверту добу тиск вуглекислоти в крові починає знижуватися і спадає до восьмої доби - аж до повного пробудження тварин, коли величина рСО2 досягає контрольного значення. На дев'яту добу, після повторного засипання тварини, рівень вуглекислоти в крові знову різко зростає на 60,5% порівняно з контрольними величинами.

Рівень бікарбонатів у крові піддослідних ховрахів змінюється дещо по-іншому - їх концентрація поступово підвищується і на шосту добу після початку гіпобіотичного бауту стає на 59,7 % вище, ніж у контролі (рис. 3). Надалі, протягом сьомої-восьмої діб відмічається поступовий спад цього показника з виходом на контрольний рівень при повному пробудженні тварини.

Отже, за перебігом гіпобіотичного стану піддослідних тварин динаміка змін парціального тиску СО2 і концентрації НСО3- в їх крові має протилежний характер. Ці факти пояснюють наявність існуючих протиріч у результатах аналогічних досліджень, отриманих попередніми дослідниками стосовно величини рСО2 і концентрації НСО3- у крові гібернуючих тварин, коли не бралася до уваги стадія їх гіпобіотичного бауту (K.M. Kent, E.C. Piece, 1967).

Досить показовими слід вважати також дані щодо зміни величин рН крові протягом усього періоду досліджень (рис. 4).

Так, уже через добу після початку гібернації рівень рН крові різко знижується (на 0,238 од.) порівняно з контролем. Цей стан за класифікацією Д. Ван-Слайка характеризується як гострий респіраторний ацидоз. На третю добу величина рН крові підвищується і на шосту досягає величини 7,636, що вже можна характеризувати як метаболічний субкомпенсований алкалоз. На наступних етапах рівень рН крові знижується і досягає контрольних величин при повному пробудженні тварин. Треба підкреслити, що значення величин рН крові гіпобіозних тварин ми розраховували, беручи до уваги пряму кореляційну залежність зміни величини рК вугільної кислоти від температури середовища. Це впливає на рівень рН крові згідно з формулою Хандерсона-Хассельбаха:

.

З тієї самої причини ми не могли користуватися класичною номограмою Д. Ван-Слайка при розрахунках параметрів КОР у гіпобіозних тварин, оскільки зміни рівнів рН крові, як і величини рСО2 останньої, не входили в межі визначених класичною номограмою величин.

Враховуючи досвід роботи з тваринами в стані штучного і природного гіпобіозу та зробивши відповідні розрахунки, ми модифікували номограму Д. Ван-Слайка, якою і користувалися у своїх дослідженнях (С.Д. Мельничук, 2002).

За цією номограмою, при температурі 37°С величина рН крові становить 7,40; при 20°С - 7,47; а при 5°С - 7,61.

Величина рО2 у крові тварин у динаміці гіпобіотичного бауту також змінюється, і ці зміни мають певні закономірності. Так, через добу після “засипання” тварин величина рО2 у крові стає вищий (на 50,1 %), ніж у контролі. Підвищення рівню кисню спостерігається до четвертої доби, після чого він поступово починає знижуватись і на восьму добу стає нижчий, ніж у контролі (на 25,7 %). У період, коли тварини повністю прокидаються і виходять із стану гіпобіозу, парціальний тиск О2 наростає до контрольних величин, і при повторному “засипанні” - знову має місце тенденція до його підвищення.

Узагальнюючи результати проведених досліджень, є всі підстави вважати, що різке збільшення концентрації розчиненого вуглекислого газу в тканинах печінки тварин на початковій стадії гіпобіозу може бути своєрідним пусковим механізмом не тільки для подальших змін рівнів Н+ і НСО3- у них, а й впливу на зміни концентрації кисню у тканинах та теплопродукцію організму взагалі.

На наступних етапах розвитку гіпобіозу (четверта доба) величина рСО2 у крові знижується, а концентрації НСО3- і відповідно загальної вуглекислоти -поступово збільшуються. Підвищення триває протягом шести діб, а величина рН крові при цьому досягає 7,636. Останнє наводить на думку, що саме підвищення рівня НСО3- та збільшення величини рН крові (у лужний бік) і здатні стати пусковим механізмом відповідних змін у стимуляції процесів теплопродукції, що забезпечує розігрівання й пробудження організму гібернуючих тварин. Важливо ще раз звернути увагу на зворотну залежність між концентраціями СО2 і НСО3- у крові тварин у динаміці гіпобіотичного бауту. Зважаючи на це, можна припустити, що в процесі гібернації ендогенний СО2 очевидно посилено перетворюється в НСО3-, що певною мірою забезпечує життєдіяльність організму в період значного гальмування газообміну.

На регуляцію процесів в організмі тварин за умов гіпобіозу впливає і рівень кисню у крові - на початковому етапі розвитку гіпобіозу він вищий, ніж в активному стані. Це явище незвичного метаболізму кисню у гібернуючих тварин відмічено також іншими авторами (G. Nahas and K. Schaefer, 1974; D. Jackson, 2002; Q. Hong, 2003), на думку яких кисень за вказаних умов перебуває в тканинах у неактивній формі. І хоча в розумінні факту тканинної гіпероксії у тварин за умов гіпобіозу існує ще багато незрозумілого, встановлення його, як і закономірностей динаміки змін концентрацій Н+, СО2 та НСО3- у тканинах? стало для нас дуже важливим при наступній розробці моделей переведення інших видів тварин (тканин) у стан штучного гіпобіозу

Аналіз кореляційної залежності особливостей КОР у крові тварин за умов гіпобіозу (за методом Пірсона) дав можливість розрахувати ступені лінійної взаємозалежності досліджуваних параметрів між собою, про що детально викладено в дисертаційній роботі.

Дослідження величин окисно-відновного стану в гепатоцитах ховрахів у динаміці розвитку природного гіпобіотичного бауту

Розпочинаючи аналіз результатів цієї серії досліджень, ми, передусім, акцентували увагу на необхідності при розрахунку величини редокс-стану за рівнем NADP+/NADPH у цитозолі робити поправку на ступінь збільшення (зменшення) рСО2 в тканинах, оскільки рСО2 є одним з компонентів NADP-ізо-цитратдегідрогеназної і NADP-малатдегідрогеназної (декарбоксилюючої) систем. Як показали наші дослідження, величина рСО2 може змінюватися у декілька разів порівняно з нормою. Особливо значні зміни спостерігались у тварин за умов входження їх у стан гіпобіозу. Це має виключне значення для розуміння механізму такого впливу гіперкапнії на інтенсивність як катаболічних, так і анаболічних процесів. Другим нашим завданням було встановлення функціонального взаємозв'язку між інтенсивністю процесів декарбоксилювання-карбоксилювання та станом редокс-стану в клітинах. Для вирішення цих питань були досліджені особливості протікання реакцій карбоксилювання (декарбоксилювання), які перебігають, як відомо, за участю окислених або відновлених піридиннуклеотидів і рСО2, або АТР (ADP) і НСО3- (Д.О. Мельничук, 1989).

Зважаючи на дане припущення, ми очікували, що характер змін редокс-стану в клітинах тварин за умов гіпобіозу може певною мірою залежати від змін величини рСО2 у тканинах. У такому випадку цю залежність можна було б розглядати як один з можливих біохімічних механізмів дії вуглекислоти на обмін речовин, енергетичні та фізіологічні функції організму.

Для підтвердження вищезазначеного припущення ми дослідили концентрації основних інтермедіатів гліколізу та ЦТК у тканинах печінки ховрахів у динаміці їх гіпобіотичного бауту (експозиція досліду аналогічна першій серії досліджень з вивчення стану КОР крові)

Цікавим є характер змін концентрацій пірувату і лактату в тканинах у динаміці гіпобіотичного бауту. Так, рівень пірувату на третю добу гіпобіотичного бауту суттєво зростає (у 2 рази). У цей самий час рівень лактату зменшується на 37 %, що може свідчити про гальмування процесів гліколізу у згаданий період та зумовлювати підвищення величини редокс-стану у цитозолі клітин

Результати досліджень показують, що як у цитозолі, так і в мітохондріях гепатоцитів мають місце значні зміни окисно-відновного стану. Так, величина співвідношення окислених і відновлених піридиннуклеотидів (NAD+/NADH) у цитозолі гепатоцитів, яка визначалася за відношенням до концентрацій субстратів лактатдегідрогеназної системи (лактат : піруват) по номограмі (Д.О. Мельничук, Л.В. Скорик, І.М. Сулима, 1987), різко зростає після входження ховрахів у стан гіпобіотичного бауту і на третю добу стає більше майже у 3 рази, ніж у тварин за умов активної життєдіяльності

На наступних етапах гіпобіотичного бауту (друга-третя доба) величина співвідношення NAD+/NADH у цитозолі зменшується і на третій, четвертий та наступний дні стає майже такою, як у контролі. При входженні тварин у стан чергового бауту (дев'ята доба) зазначений показник знову збільшується.

Аналіз і порівняння одержаних результатів з даними досліджень першої серії (де вивчали основні параметри КОР у динаміці гіпобіотичного бауту) свідчать, що характер змін показників окисно-відновного стану у цитозолі гепатоцитів перебуває практично у прямій залежності від змін величин рСО2, рО2 і концентрації Н+ та у зворотній - від концентрації бікарбонатів у крові тварин за умов природного гіпобіозу. Виявлений взаємозв'язок може мати певне відношення до пояснення особливостей використання кисню тканинами за умов гіпобіотичного стану, а також до регуляції процесів гальмування (на початку гіпобіотичного бауту) та стимуляції (при пробудженні) процесів теплопродукції та дихання в організмі тварин.

Аналогічні за характером змін й дані щодо величини співвідношення NADP+/NADPH у цитозолі гепатоцитів тварин у динаміці гіпобіотичного бауту (рис. 9, 10). Ці величини, як уже відмічалося раніше, розраховували за концентраціями пірувату, малату і СО2 (вміст останнього визначали за істинним його значенням) у крові з наступним збільшенням вказаних величин на 30% (W.J. Longmore, 1965).

Розглянемо також підвищення рівня досліджуваних метаболітів малатного ферменту в тканинах печінки (піруват : малат : СО2) гіпобіозних тварин (особливо у період третьої доби бауту). Так, зростання вмісту малату і СО2 значно більше (у 2,8 та 2 рази відповідно), ніж пірувату (на 24%). Це наводить на думку про можливу особливу роль малату в обміні речовин у тварин у стані гіпобіозу.

З першої до третьої доби розвитку гіпобіотичного бауту має місце значне (майже у 3 рази) підвищення величини досліджуваного показника. Далі відбувається його поступове зменшення, але контрольних величин він досягає лише при пробудженні тварин.

Наведені дані стосовно змін показників NADР+/NADРH, розрахованих за концентраціями субстратів глутаматдегідрогеназної системи у мітохондріях гепатоцитів ховрахів у динаміці гіпобіотичного бауту, за якими характер досліджувальних змін редокс-стану у мітохондріях має зовсім протилежний характер, ніж у цитозолі.

Так, досліджувані показники редокс-стану різко зменшуються (у 3-6 разів) протягом усього періоду гіпобіотичного бауту ховрахів. Значною мірою це залежить від суттєвого зниження концентрації аміаку (у 8,6 раза) в тканинах, а не б-кетоглутарату і глутамату.

Виявлені нами зміни в концентраціях метаболітів лактат-, малат (декарбоксилюючої)- і глутаматдегідрогеназних систем та величин співвідношення NADР+/NADРH і NADР+/NADРH у цитолізі і мітохондріях гепатоцитів явно свідчать, що в період входження тварин у стан гіпобіозу в тканинах печінки очевидно гальмуються гліколіз та цикл трикарбонових кислот порівняно з контролем. Обидві ці зміни обумовлюють підвищення показників NADР+/NADРH і NADР+/NADРH у цитозолі і значне зменшення показника NADР+/NADРH у мітохондріях. Причому всі ці показники знаходяться у тісній залежності з рівнями СО2 і НСО3- у крові, що вказує на їх можливий зв'язок з інтенсивністю реакцій карбоксилювання (утилізації вуглекислоти) і декарбоксилювання та пов'язаних з ними анаболічних і катаболічних процесів у цілому.

Процеси утилізації вуглекислоти (карбоксилювання) в тканинах печінки ховрахів у стані природного гіпобіозу

Процес утилізації вуглекислоти в печінці гібернуючих ховрахів при температурі інкубаційного середовища 37 і 70С за умов внесення в проби субстратів карбоксилювання, а також у печінці тварин контрольних груп при температурі 70С (без внесення екзогенних субстратів) значно інтенсивніший, ніж у їх аналогів за умов активного стану життєдіяльності

Проте, якщо порівняти величини стимулюючого ефекту пірувату на інтенсивність утилізації вуглекислоти, то стає очевидним, що у гіпобіозних тварин він значно вищий, ніж у тварин в активному стані життєдіяльності. Так, у перших він вище фактично у 2 рази (при температурі 37 і 7 0С), у других - на 25-30%, ніж у пробах без додаткового внесення пірувату)

Це може свідчити, що в тканинах гібернуючих тварин очевидно має місце більш виражений метаболізм цієї кетокислоти, ніж у тварин за умов активного стану.

Порівняно з піруватом значно активнішим стимулятором інтенсивності процесів утилізації вуглекислоти у тканинах печінки ховрахів за умов гіпобіотичного стану є екзогенний ?-кетоглутарат. Так, за вказаних умов він посилює процес утилізації вуглекислоти в тканинах печінки у 2,5 раза при температурі інкубації 37 0С і більше ніж у 5 разів при 7 0С. Це свідчить, що за умов гіпобіозу очевидно має місце посилення NADP+-ізоцитратдегідрогеназної реакції у зворотному напрямі. Таке посилення реакції карбоксилювання ?-кетоглутарату у гіпобіозних тварин зрозуміле, оскільки ця реакція являє собою одну з ланок перетворення ряду кислот циклу трикарбонових кислот (?-кетоглутарат, ізоцитрат, цитрат) у глюкозу, яка в умовах гіпобіозу синтезується, в основному, de novo.

Розробка та обґрунтування біохімічних механізмів та способів застосування явища штучного вуглекислотного гіпобіозу у тварин з метою вирішення ряду прикладних проблем тваринництва і медицини

Бікарбонат-вуглекислотний гіпобіоз охолодженої сперми бугаїв - як спосіб подовження терміну її зберігання та ефективного використання

Як відомо (І.В. Смірнов та ін., 1964), при зберіганні сперми у середовищі з підвищеною концентрацією СО2 спермії мають здатність до переходу у гіпобіотичний стан. Проте такий спосіб збільшення терміну життєдіяльності сперміїв у практиці тваринництва не знайшов широкого застосування з тієї причини, що у ряді випадків наступала загибель сперматозоїдів внаслідок різкого зростання концентрації протонів у середовищі та кислотного шоку сперміїв.

Метою наших досліджень було збільшення терміну зберігання та ефективне використання розрідженої сперми через переведення сперміїв у стан штучного гіпобіозу шляхом використання не тільки СО2 (І.В. Смірнов, 1964), а й бікарбонатної форми вуглекислоти. Для досягнення поставленої мети були проведені попередні дослідження на модифікованих нами живильних середовищах, склад яких наведено в дисертації і наших публікаціях.

Термін зберігання сперми, розрідженої стандартним середовищем при температурі 2-4 0С не повинен перевищувати 3 діб, оскільки при триваліших термінах спостерігається різке зниження активності сперміїв (менше 5 балів) і - масова загибель.

Виходячи з отриманих результатів досліджень щодо вивчення ролі кожної з основних форм вуглекислоти (рСО2 і НСО3-) у тканинах тварин за умов природного гіпобіозу, нами були підібрані такі моделі досліджень, які дозволяли контролювати рівні як СО2, так і НСО3- і, змінюючи їх концентрації, регулювати рівень рН їх живильних середовищ. За цими даними, штучне підвищення концентрації бікарбонату натрію в живильному середовищі до 40-50 ммоль/л та насичення його вуглекислим газом до величини рН 6,7 у 1,5-2 рази забезпечує подовження терміну зберігання сперми при температурі 12-13°С з високим рівнем життєдіяльності сперміїв порівняно з контролем. Під час зберігання контрольних і дослідних зразків при температурі 2-4°С спостерігалась подібна закономірність.

Одержані результати другої підсерії досліджень щодо вивчення впливу бікарбонатно-вуглекислотного гіпобіозу на обмінні процеси в клітинах сперміїв свідчать що внаслідок підвищення концентрацій НСО3- і СО2 в цих клітинах значно гальмуються біоенергетичні процеси і, в першу чергу, знижується інтенсивность фруктолізу (М.В. Маренець, С.Д. Мельничук, 2000). Припускається, що завдяки цьому зменшується інтенсивність використання поживних речовин у клітинах сперміїв та підвищується їх здатність зберігати свою життєздатність протягом більш тривалого часу, ніж у контрольних зразках (у 1,5-2 рази).

У третій підсерії досліджень вивчалась біологічна ефективність (запліднювальна здатність) сперми бугаїв, яка зберігалася до шести діб у модифікованому нами середовищі, порівняно з контролем. У контрольній групі осіменили 196 голів спермою, розрідженою стандартним ГЦЖ-середовищем, а в дослідній групі 198 голів - спермою, розрідженою ГЦЖ-середовищем з додаванням до нього вуглекислого газу та натрію бікарбонату в концентрації 10,05 і 40,0 ммоль/л відповідно.

Встановлено, що у контрольних зразках сперми, розрідженої стандартним ГЦЖ-середовищем, рухливість сперміїв у межах 8-5 балів зберігалась протягом трьох діб, а в дослідних зразках - до шести діб.

Важливо, що при використанні сперми після зберігання її протягом трьох діб запліднюваність корів у контрольній групі становила 60,7%, тоді як у дослідній - 69,3%. Тобто, зберігання сперми в стані комбінованого вуглекислотного гіпобіозу не погіршує, а навіть дещо підвищує запліднювальну здатність сперматозоїдів. Високою біологічна ефективність сперміїв досліджуваних зразків залишається і через 4 доби зберігання, а через 5-6 діб - вона починає зменшуватися.

На розроблений спосіб отримано патент України на винахід (автори: С.Д. Мельничук, Д.О. Мельничук, А.П. Кругляк, О.І. Смирнова, М.П. Журавель, М.В. Маренець, П.А.Кругляк, № 24696А), проведено його виробниче випробування. Міністерство аграрної політики України рекомендувало даний метод для практичного застосування.

Біохімічні особливості вуглекислотно-кисневого гіпобіозу риб та перспективи його практичного використання. Результати наших досліджень показали, що насичення вуглекислотою води в акваріумі, в якій знаходилась риба, обумовлювало швидку їх загибель. Це відбувалося на фоні різкої гіперкапнії та гіпоксії крові досліджуваних риб (С.Д. Мельничук, С.В. Терещенко, 2001). Спираючись на результати наших досліджень з вивчення особливостей змін концентрацій СО2, НСО3- і О2 у крові ховрахів за умов природного гіпобіозу, де явище гіперкапнії супроводжувалося гіпероксією крові, ми продовжили вивчати вплив насичення води в акваріумі різними сумішами СО2 і О2 на параметри КОР і О2 у крові та фізіологічний стан риби порівняно з контролем (С.Д. Мельничук та ін., 2001).

Як свідчать результати проведених досліджень, насичення води в акваріумі газовою сумішшю СО2 і О2 (у співвідношенні 1:1) протягом 60 хв дає позитивні результати з точки зору досягнення поставленої мети - переведення риби в стан штучного гіпобіозу (риба опускається на дно, не рухається, не харчується тощо). У такому стані вона зберігає свою життєздатність протягом трьох діб. Показники стану КОР та рівень О2 у крові коропів через годину після насичення води зазначеною сумішшю представлені в табл. 1. За наведеними даними, величина рН крові риб зменшилася із 7,03±0,06 (у нормі) до 6,59±0,05 (у стані штучного гіпобіозу). Величини рСО2 та рО2 при цьому підвищились з 29,2±1,5 до 144,1±2,8 і з 55,2±2,3 до 196,9±3,1 mm Hg відповідно. Рівень НСО3- також набув характерного збільшення (на 57,4%).

Таблиця 1 Величини основних параметрів кислотно-основної рівноваги та рівня О2 у крові коропів за умов штучного гіпобіозу (M m; n = 5)

Показник	Контроль	Штучний гіпобіоз
рН	7,03±0,06	6,59±0,05*
рСО2	29,2±1,5	144,1±2,8*
рО2	55,2±2,3	196,9±3,1*
HCO-3	6,8±0,3	10,7±0,4*
CO2 загальна	7,6±0,4	14,2±0,2*

* - тут і далі Р < 0,05 порівняно з контрольними пробами

Щодо вмісту загальної вуглекислоти, то тут відмічається практично подвійне зростання її концентрації - з 7,6±0,4 до 14,2±0,2 ммоль/л (на 86,8 %).

Як видно з наведених даних, у риб дослідної групи порівняно з контролем має місце типовий респіраторний ацидоз з вираженою гіпероксією.

Результати проведених досліджень з вивчення особливостей обміну речовин у риб у стані штучного гіпобіозу (порівняно з контролем) свідчать, що в тканинах печінки риб дослідної групи гальмуються процеси гліколізу, функціонування циклу трикарбонових кислот, аміакоутворення (С.Д. Мельничук, С.В. Терещенко, 2002).

...