Механізми реалізації імуносупресивних властивостей умовно-патогенних бактерій - етіологічних агентів гнійно-запальних захворювань

Размещено на http://allbest.ru

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

бактерія імунітет імуносупресивний

Актуальність теми. Гнійно-запальні захворювання і на межі тисячоліть залишаються актуальною медико-соціальною проблемою (Кондракова О.А. та співавт., 1999; Костюченко А.Л., 1999; Сьоміна Н.А. та співавт., 1999). Протягом останніх двох десятиліть питома вага даної групи хвороб залишалась досить високою і не мала тенденції до зниження (Коваль Г.С. та співавт., 1999). Особливу значимість набула проблема шпитальних гнійно-запальних захворювань, які виникають у стаціонарах різних профілів (Бондаренко В.М., Боєв Б.В., 1999). У загальній структурі інфекційної захворюваності на Україні вони складають 4-18 % (Сміян І.С., Павлишин Г.А., 1999). Протягом останніх десятиліть ХХ століття відбулася зміна видового складу мікрофлори, яка викликає гнійно-запальні захворювання (Бажукова Г.А., 1997).

В результаті антропогенного впливу помітно змінилися не тільки реактивність організму самої людини, але і деякі біологічні властивості мікроорганізмів (вірулентність, антигенність, імуногенність). Тому бактерії, які рахувалися раніше непатогенними, набули спроможності викликати різні клінічні форми гнійно-запальних захворювань (Курлаєв П.П. та співавт., 1996; Бондаренко В.М., 1997). Так, значно зросла питома вага гнійно-запальних інфекцій, обумовлених аспорогенними анаеробними мікроорганізмами (Зайцев В.Т. та співавт., 1999). Ці збудники, виділені з осередків, як правило, асоціюють з аеробними, а також з спороутворюючими бактеріями (Бельський В.В., Шаталова О.В., 1999).

Застосування антибіотиків при гнійно-запальних інфекціях сприяло як зміні клінічної картини даної групи захворювань, так і поширенню стійких до антибіотиків форм їх збудників, полірезистентних до антибіотиків, яка збільшується при інфікуванні бактеріальними асоціаціями (Палій В.Г., 1997; Дяченко В.Ф. та співавт., 1999). Проблема стійкості до антибіотиків умовно-патогенних бактерій (УПБ) обумовлює необхідність пошуку нових низькотоксичних антибактерійних препаратів. До їх числа належить антибіотик батумін, синтезований співробітниками Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (Смирнов В.В. та співавт., 1999). Чутливість до батуміну клінічних штамів анаеробних УПБ - збудників гнійно-запальних захворювань - раніше не вивчалася.

Визнання головної ролі порушень імунної системи у розвитку гнійно-запальних процесів, викликаних УПБ, дозволяє з нових позицій зрозуміти все різноманіття клінічних варіантів захворювання (Бухарін О.В., 1997; Дерябін Д.Г., Курлаєв П.П., 1999). Відповідно до сучасних уявлень, адекватна імунна відповідь на гетерологічні та автологічні антигени можлива тільки за умови узгодженої взаємодії різних субпопуляцій лімфоцитів (Карпова М.Р., 1999). Функціональна готовність цих субпопуляцій здійснюється сигналами, що виділяються взаємодіючими у процесі імунної відповіді клітинами опосередковано через систему циклічних нуклеотидів. Штучний імунітет проти інфекцій, викликаних бактеріями з позаклітинною локалізацією, опосередкований гуморальними імунними механізмами, зокрема комплементом та лізоцимом. Основна роль у захисті від збудників бактеріальних інфекцій належить фагоцитозу збудників захворювання поліморфноядерними лейкоцитами, активність яких значною мірою залежить від ступеню опсонізації бактерій (Маянський А.М. та співавт., 1997).

Розвиток інфекційного процесу веде до активації ряду ланок адаптаційно-пристосувального механізму, спрямованого на підтримку гомеостазу організму (Васильєв М.В. та співавт., 1999). Однією з цих ланок є система інтерферонів (Фільчаков І.В. та співавт., 1999).

Спроможність УПБ ініціювати розвиток інфекції певною мірою пов'язана з комплексом біологічних ознак, які включають групу властивостей, спрямованих на інактивацію чинників неспецифічного і специфічного протиінфекційного захисту макроорганізму (Бухарін О.В. та співавт., 1997; Вороніна Л.Г., 1997). До числа таких ознак належить продукція бактеріями субстанцій, які інактивують чинники імунітету (Ісачкова Л.М. та Плехова Н.Г., 1997). Виявлено спроможність бактерій специфічно взаємодіяти з комплементом, індукувати інтерферон, зв'язувати лізоцим, руйнувати імуноглобуліни, пригнічувати фагоцитоз. Зазначені ознаки відзначені у деяких видах мікроорганізмів, переважно у грамнегативних бактеріях (Позур В.К., 1995; Борисова О.В., 1999; Benedi V. et al., 1998). Водночас, комплексне вивчення імуносупресивних властивостей збудників гнійно-запальних захворювань та їх структурних елементів (капсули, пептидогліканів, ліпополісахаридів (ЛПС), тейхоєвих кислот) раніше не проводилося.

Антигенна стимуляція імунокомпетентних клітин, здійснена при дефіциті чинників, які забезпечують проліферацію, може призвести до запрограмованої загибелі активованої імунокомпетентної клітини, тобто до феномена, що отримав назву апоптоз (Новиков В.С., 1996; Ковальчук Л.В. та Чередеєв А.Н., 1999; Маянський А.М. та співавт., 1999; Ayala A., 1999; Martinez O.M., Krams S.M., 1999). Імуноцити, які підпали під негативну активацію, експресують рецептор Fas і його ліганд Fas і передчасно гинуть (Delgado M., 2000). У клітинних культурах впливають на апоптоз віруси, бактерії, гриби, найпростіші (посилення або ослаблення). З цим пов'язані нові погляди в уявленнях про молекулярні механізми інфекційної патології. При гнійно-запальних захворюваннях, викликаних УПБ, явище апоптозу раніше не досліджувалося.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертація є фрагментом планових наукових робот кафедри мікробіології Луганського державного медичного університету № 0198U005713 “Етіологія і патогенез гнійно-запальних поразок шкіри” та № 0198U005712 “Мікробіологічні і імунологічні аспекти захворювань легень”, а також планової наукової роботи кафедри патологічної фізіології “Запалення як результат дії бактерій” (№ 0198U005713).

Мета дослідження: Визначення імуносупресивних властивостей і механізмів їх реалізації в УПБ - етіологічних агентів гнійно-запальних захворювань.

Для досягнення мети поставлені такі окремі задачі:

Визначити видовий склад УПБ при гнійно-запальних захворюваннях.

Дослідити чутливість УПБ - збудників гнійно-запальних захворювань до антибіотиків, у тому числі і до батуміну.

Вивчити імунний статус хворих на гнійно-запальні захворювання, викликані УПБ.

Визначити вплив УПБ на гуморальні чинники імунітету (комплемент, лізоцим, імуноглобуліни).

Дослідити вплив УПБ на клітинні чинники імунітету (фагоцитоз, Т-, В-лімфоцити, натуральні кілери).

Дослідити роль структурних елементів грампозитивних і грамнегативних УПБ у прояві їх імуносупресивних властивостей.

Вивчити метаболізм циклічних нуклеотидів (цАМФ, цГМФ) у лімфоцитах і його роль у формуванні імуносупресії під впливом УПБ.

Визначити вплив УПБ - збудників гнійно-запальних захворювань на апоптоз імуноцитів.

Провести порівняльний аналіз імуносупресивної і апоптоз-індукуючої активності видового складу УПБ - збудників гнійно-запальних захворювань.

Об'єкт дослідження: вплив умовно-патогенних бактерій на фактори імунного захисту організму людини.

Предмет дослідження: механізми реалізації імуносупресивних властивостей умовно-патогенних бактерій - етіологічних агентів гнійно-запальних захворювань

Методи дослідження: бактеріологічні (вивчення видового складу бактерій, їх антибіотикочутливості, виділення структурних компонентів і продуктів метаболізму бактерій), імунологічні (обстеження імунного статусу хворих на гнійно-запальні захворювання, вивчення клітинного і гуморального імунітету in vitro, вивчення спроможності бактерій продукувати субстанції, що інактивують фактори імунітету), біохімічні (визначення циклічних нуклеотидів), електронно-мікроскопічні (вивчення процесів апоптозу), статистичні (опрацювання отриманих цифрових результатів).

Наукова новизна отриманих результатів. Тяжкість розвитку гнійно-запального процесу обумовлена як саморегулюючою системою УПБ у нарощуванні ними патогенних властивостей, так і імунорегуляторними процесами макроорганізму. Виразність імунопатологічних порушень залежала від ступеня тяжкості патологічного процесу та видового складу збудників. Доведено, що імуносупресивний антиклітинний потенціал УПБ є видоспецифічним і підвищується в бактеріальних асоціаціях. Імуносупресивні властивості належать як цілій клітині, так і її структурним компонентам - пептидоглікану, тейхоєвим кислотам, білку А, ЛПС, а також продуктам метаболізму, зокрема токсину.

Комплексна оцінка змін системної імунної відповіді, як загальної, так і місцевої, при впливі УПБ - збудників гнійно-запальних захворювань, їх структурних елементів та продуктів метаболізму дали змогу встановити односпрямованість їх дії. Показано вплив УПБ на метаболізм циклічних нуклеотидів в лімфоцитах і формування відносного супресорного стану в системі імунорегуляторних Т-клітин. Доведений дозозалежний вплив УПБ на апоптоз імунних клітин. Доведено корелятивну залежність імуносупресивної і апоптоз-індукуючої активності УПБ - основних збудників гнійно-запальних захворювань.

Практична значимість отриманих результатів. Визначені патогенетичні підходи до лікування гнійно-запальних захворювань, які викликаються УПБ на основі вивчення антибіотикорезистентності УПБ. Розроблено критерії з використання замісної імунотерапії і імуностимуляції хворих на гнійно-запальні захворювання з урахуванням імуносупресивної активності їх збудників. Розроблені способи лікування гнійно-запальних захворювань (Деклараційні патенти 40777 А Україна та 63375 А Україна).

Основні результати проведених досліджень впроваджені в практику 5 лікувальних установ м. Луганська, Луганської області і м. Києва (ЦМЛ м. Рубіжне Луганської області, Краснодонське територіально-медичне об'єднання Луганської області, ЦМЛ м. Первомайська Луганської області, Краснодонський державний лікувально-діагностичний центр “Ультрамед” Луганської області; районне медичне об'єднання “Медичне містечко” Жовтневого району м. Києва). Отримані дані впроваджені у навчальний процес 3-х медичних вищих навчальних закладів України: Луганський державний медичний університет МОЗ України (акт про впровадження № 3 від 16.02.1999 р.); Запорізький державний медичний університет МОЗ України (акти про впровадження № 3135 від 16.02.1998 р., № 7 від 20.02.1999 р.); Українська медична стоматологічна академія (м. Полтава) МОЗ України (акти про впровадження № 3136 від 13.09.1998 р., № 3137 від 25.09.1998 р.).

Особистий внесок автора. Автором особисто визначено напрямок наукового дослідження, мети та окремих задач, методологічних основ та методичних підходів її виконання. Дисертанткою самостійно обрано комплекс спеціальних мікробіологічних, імунологічних та електронно-мікроскопічних методів дослідження, з яких самостійно проведене імунологічне та електронно-мікроскопічне дослідження з вивченням апоптозу, індукованого УПБ. Досліджено видовий спектр УПБ, їх чутливість до антибіотиків, у тому числі до батуміну. Вивчено імунний статус хворих на різні клінічні варіанти гнійно-запальних захворювань. Автор брала участь у вивченні імуносупресивних властивостей ізольованих патогенів (антикомплементарної, антилізоцимної і антиімуноглобулінової активностей, впливу УПБ на клітинні чинники імунітету), дослідженні внутрішньоклітинного вмісту циклічних нуклеотидів у імуноцитах при впливі на них окремих видів УПБ. Проведена статистична обробка цифрових результатів бактеріологічних, імунологічних і клінічних досліджень.

Апробація роботи. Основні положення дисертації доповідались та обговорювались на: засіданнях 4-го з'їзду лікарів-лаборантів УРСР “Нове в лабораторній діагностиці захворювань внутрішніх органів” (Ворошиловград, 1989); регіональній конференції студентів і молодих спеціалістів “Питання клінічної імунології, імуноморфології і медичної генетики” (Луганськ, 1990); 2-му Національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Луганськ, вересень 1998 р.), 94-му з'їзді анатомів Німеччини (секція імуноморфології, Гамбург, березень 1999 р.); Українській науковій конференції з міжнародною участю “Мікроциркуляція та її вікові зміни” (Київ, травень 1999 р.); 10-му симпозіумі робочої групи з тератології (Грайфсвальд, Німеччина, вересень 1999 р.); 16-й наукової сесії товариства анатомів Німеччини (секція імуноморфології, Вюрцбург, вересень 1999 р.); науковій конференції співробітників КМАПО “Актуальні проблеми гематології і трансфузіології” (Київ, червень 1999 р.); об'єднаному Пленумі кардіологів, ревматологів і кардіохірургів України з міжнародною участю “Некоронарогенні захворювання серця: сучасні підходи до класифікації, нові напрямки діагностики і лікування” (Київ, 6-8 жовтня 1999 р.); 5-му Національному анатомічному конгресі (Анталія, Туреччина, жовтень 1999 р.); 18-му конгресі іспанського анатомічного товариства (Вальядолід, Іспанія, жовтень 1999 р.); а також на засіданнях Луганських обласних товариств мікробіологів, інфекціоністів і патофізіологів у 1989-2004 р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 монографій, 70 статей та тез у центральній пресі, 1 методичні рекомендації, затверджені МОЗ України (в співавторстві), оформлені і впроваджені у практику 10 раціоналізаторських пропозицій, отримані 2 деклараційні патенти України.

Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 335 сторінках машинописного тексту (15 авторських аркушів без списку використаних джерел та таблиць і малюнку, які повністю займають площу сторінки) та складається із вступу, огляду літератури, 7 розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій. Список літератури включає 496 джерел вітчизняних та іноземних авторів. Матеріали дисертації ілюстровано 79 таблицями та 1 малюнком.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріал та методи дослідження. Матеріалом дослідження служили 3180 штамів УПБ, виділених від 970 хворих з різними клінічними варіантами гнійно-запальних захворювань. Група обстежених включала 109 новонароджених віком від 1 до 28 днів життя (в середньому 9,8+0,5 днів), а також 861 дорослу людину віком від 18 до 63 років (середній вік 41,5+2,5 років). З 970 хворих було 553 осіб чоловічої статі (57,0 %) і 417 жіночої (43,0 %). Хворі знаходились на лікуванні в: хірургічних відділеннях обласної клінічної лікарні та центральної міської лікарні № 2 м. Луганська та територіально-медичного об'єднання смт. Новосвітлівка Краснодонського району Луганської області; травматологічному відділенні Луганської обласної клінічної лікарні; терапевтичному відділенні центральної районної лікарні м. Первомайська Луганської області, гастроентерологічному відділенні центральної міської лікарні № 6 м. Києва, гінекологічному відділенні центральної районної лікарні м. Кремінна Луганської області, відділенні патології новонароджених Луганської обласної дитячої лікарні, обласному шкірно-венерологічному диспансері м. Луганська.

В залежності від клінічного варіанту гнійно-запальних захворювань всі обстежені пацієнти були розподілені так - у 297 чол (30,6 %) мали місце гострі кишкові розлади. Від хворих даної групи було ізольовано 297 культур патогенів, які далі стали об'єктом досліджень. У 209 чол (21,5 %) гнійно-запальні захворювання, викликані УПБ, розвилися протягом перебування у хірургічних і терапевтичних стаціонарах. З патологічних осередків цієї групи хворих було ізольовано 375 культур гноєтворних УПБ. Виділені від хворих штами відповідали за своїми біологічними властивостями таким, що виділені з навколишнього середовища (повітря, обладнання та інвентарю палат) і від медичного персоналу відділень, що дозволило ідентифікувати дані гнійно-запальні захворювання як внутрішньошпитальні інфекції. У 135 хворих (13,9 %) були діагностовані різні клінічні варіанти піодермій. З уражених ділянок шкіри хворих піодерміями було ізольовано 309 культур УПБ. У 109 дітей (11,2 %) мали місце різноманітні клінічні варіанти гнійно-запальних захворювань. З гнійно-запальних осередків 109 новонароджених було ізольовано 219 культур гноєтворних збудників. У 120 хворих (13,2 %) спостерігалися післяопераційні гнійно-запальні ускладнення з локалізацією в черевній порожнині, які розвилися після хірургічних втручань. Всього з ексудату черевної порожнини даної групи хворих була ізольована 1441 культура УПБ. У 33 жінок (3,4 %), що знаходилися на стаціонарному лікуванні в гінекологічних відділеннях, мали місце гнійно-запальні захворювання статевих органів. З ексудату в цьому випадку було ізольовано 339 культур гноєтворних бактерій. У 22 хворих (2,3 %) з гнійно-запальними захворюваннями ЛОР-органів і ротової порожнини у 10 мали місце сінусити, отити, тонзилофарингіти, в інших - перідонтити і стоматити. З патологічного матеріалу даної групи хворих було виділено 163 культури УПБ.

З метою створення власних нормативних імунологічних показників нами було обстежено 63 дорослих практично здорових чоловіків і жінок віком від 30 до 52 років і 35 здорових новонароджених дітей віком від 1 до 30 днів.

Мікробіологічне дослідження здійснювали згідно з наказом МОЗ СРСР № 535 від 22.04.1985 р. “Про уніфікацію мікробіологічних (бактеріологічних) методів дослідження, які застосовуються в клініко-діагностичних лабораторіях лікувально-профілактичних установ” та “Визначника бактерій Берджі”. Для ідентифікації виділених бактерій використовували комерційні тест-системи Мікро-Ла-Тест продукції АТ “Лахема” (Чехія). Належність ізольованих штамів до роду Staphylococcus вивчалася також з використанням тест-препарату “Діастаф”, розробленого Інститутом мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Визначення чутливості виділених культур аеробних бактерій до антибіотиків проводили методом Кірбі-Бауера. Результати дослідження інтерпретували у відповідності з методичними вказівками “Антибіотикограма: диско-дифузійний метод. Інтерпретація результатів” (Москва, 1999), а також відповідно до рекомендацій NCCLS від 1991 р. і Наказу Міністерства охорони здоров'я СРСР № 250 від 13.03.1975 р. Визначення чутливості виділених культур анаеробних бактерій до антибіотиків проводили методом елюції з дисків у напіврідинних середовищах.

При виконанні даної роботи застосовували імунологічні методи дослідження: визначення кількості Т-, В-лімфоцитів, Т-хелперів/індукторів, Т-супресорів/цитотоксиків методом непрямої імунофлюоресценції; визначення антитілоутворюючих клітин (АУК); вивчення фагоцитарної активності нейтрофілів і моноцитів; визначення функціональної активності натуральних кілерів НК- і клітинних К-кілерів; визначення антикомплементарної, антилізоцимної та антиімуноглобулінової активності бактерій; кількісне визначення імуноглобулінів методом радіальної імунодифузії в гелі; визначення вмісту циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) методом преципітації в поліетиленгліколі та вмісту циклічних нуклеотидів (цАМФ та цГМФ) радіоімунним методом з використанням комерційних тест-систем фірми Amercham (Великобританія), електронно-мікроскопічне дослідження імуноцитів методом трансмісійної мікроскопії.

Пептидоглікани одержували з клітинних стінок бактерій за методом Peterson P.K. et al. Тейхоєві кислоти екстрагували з клітинних стінок 10 % трихлороцтовою кислотою. Екстракт очищали за допомогою колонки з ДЕАЕ-целюлозою і софадексу J-50. Препарати ЛПС одержували з грамнегативних бактерій водно-феноловою екстракцією при 65?С з наступним очищенням триразовим ультрацентрифугуванням. Для відновлення імуносупресивної активності ЛПС і його структурних частин застосовували редокс-обробку (Васильєв М.В. і співавт., 1984).

Математичну обробку отриманих даних здійснювали за допомогою пакету прикладних програм для обробки наукових медико-біологічних досліджень на ЕОМ “Pentium-133” (Мінцер О.П. і співавт., 1996).

Видовий склад і чутливість до антибіотиків умовно-патогенних бактерій при гнійно-запальних захворюваннях. Всього від 970 хворих на гнійно-запальні захворювання було ізольовано 63 види бактерій, які належали до 24 родів. Із 3180 штамів виділених патогенів на частку аеробних і факультативно анаеробних бактерій прийшлося 53,0 % (1685 штамів) від загальної кількості ізолятів, на частку облігатно анаеробних бактерій - 47,0 % (1495 штамів). Питома вага грампозитивних і грамнегативних патогенів склала 44,1 % (1403 штами) і 55,9 % (1777 штамів) відповідно. Серед грампозитивних збудників гнійно-запальних захворювань аеробних бактерій було 69,4 % (973 штами), анаеробних - 30,6 % (430 штамів). В групі грамнегативних бактерій переважали анаеробні над аеробними бактеріями, відповідно 60,0 % (1065 штамів) і 40,0 % (712 штамів).

З 63 ідентифікованих видів збудників гнійно-запальних захворювань 47,6 % належали до аеробних і факультативно анаеробних бактерій, при цьому найбільш частими патогенами були S. aureus (14,3 %) та E. coli (7,3 %) від загальної кількості ізолятів. Питома вага інших патогенів з числа аеробних і факультативно анаеробних бактерій була менш значною. Найбільш розповсюдженими видами серед облігатно анаеробних бактерій були B. fragilis, P. magnus, P. melaninogenicus, P. loescheii, P. niger, F. necroforum, частота ідентифікації яких склала у групі анаеробних бактерій відповідно 10,8 %, 8,1 %, 7,9 %, 5,7 %, 4,7 % та 4,2 %. Частота розповсюдженості інших патогенів зазначеної групи була меншою. У 56,5 % випадках від загальної кількості обстежених хворих гнійно-запальний процес перебігав як моноінфекція, а у 43,5 % випадків - як мікст-інфекція.

Видовий склад збудників гнійно-запальних захворювань мав певні розходження в мікробному пейзажі у залежності від клінічної форми інфекційного процесу.

У групі хворих на гострі кишкові захворювання, викликані УПБ (харчові токсикоінфекції), 72,7 % (216 штамів) були представлені грамнегативними аеробними патогенами. Найбільш частими були E. coli та P. aeruginosa. Видовий склад грампозитивних аеробних патогенів був поданий винятково S. aureus. Облігатно анаеробні збудники у даного контингенту пацієнтів ізольовані не були. Гнійно-запальний процес у хворих на гострі кишкові захворювання перебігав як моноінфекція.

У групі гнійно-запальних захворювань м'яких тканин (абсцеси, флегмони, післяопераційні рубці) мало місце значне збільшення питомої ваги грампозитивних аеробних і факультативно анаеробних патогенів, що склали 82,4 % від загального числа ізолятів (375 штамів). Значна кількість виділених бактерій була представниками роду Staphylococcus (91,6 %). Інші грампозитивні аеробні бактерії належали до родів Streptococcus (5,5 %) і Enterococcus (2,9 %).

Група грамнегативних аеробних збудників гнійно-запальних захворювань з локальним враженням м'яких тканин склала 17,6 %. У 43,5 % хворих інфекційний процес перебігав як моноінфекція, у 56,5 % - як мікст-інфекція.

Видовий склад збудників піодермій відрізнявся як помітним збільшенням представників роду Staphylococcus, так і зміною питомої ваги в ініціації захворювання окремих патогенів. Поряд з цим в аналізованій групі збудників мало місце переважання грампозитивної мікрофлори над грамнегативною (92,6 % і 7,4 % відповідно). У 33,3 % хворих піодермії перебігали як моноінфекція, у 66,7 % - як мікст.

У новонароджених, хворих на гнійно-запальні захворювання, питома вага грампозитивних патогенів склала 73,5 %, грамнегативних - 26,5 %. У даного контингенту хворих мало місце істотне скорочення видового складу стафілококів і збільшення їх питомої ваги відносно грамнегативних патогенів. У 71,6 % захворювання перебігало як моноінфекція, в 28,4 % - як мікст-інфекція.

У хворих хірургічного профілю, у яких гнійно-запальні осередки розвинулись в черевній порожнині після оперативного втручання на кишечнику, було ідентифіковано 34 види збудників, що склало 54,0 % від їх загального видового складу. При цьому аеробні і факультативно анаеробні патогени були подані 9 видами (26,5 %), тоді як інші 25 видів (73,5 %) були облігатно анаеробними бактеріями. У всіх хворих даної групи патологічний процес був викликаний асоціаціями УПБ.

У хворих гінекологічного профілю на частку облігатно анаеробних патогенів прийшлося 86,1 % ізолятів. При цьому питома вага грампозитивних і грамнегативних бактерій склала 23,9 % та 62,2 % відповідно. На частку аеробних та факультативно анаеробних збудників при даній патології прийшлося 13,9 %. В усіх хворих цієї групи інфекційний процес протікав як мікст-інфекція.

У видовому складі збудників гнійно-запальних захворювань стоматологічного та ЛОР-профілей мало місце істотне превалювання облігатно анаеробних патогенів (67,0 %) над аеробними (33,0 %). З числа облігатно анаеробних патогенів найбільшу питому вагу мали грамнегативні (63,1 %), подані переважно родами Prevotella, Porphyromonas та Fusobacterium. У всіх хворих ЛОР- та стоматологічного профілів гнійно-запальні захворювання перебігали як мікст-інфекція.

Значна кількість УПБ - збудників гнійно-запальних захворювань була резистентною до ряду антибіотиків, які широко використовуються в клінічній практиці. Найбільшу антибіотикорезистентність мали шпитальні штами стафілококів, особливо S. aureus. Аеробні і факультативно анаеробні бактерії, що належали до родів Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, а також до родини Enterobacteriaceae, були найбільш стійкими до пеніцилінів і чутливими до аміноглікозидів, тоді як облігатно анаеробні бактерії виявляли резистентність до аміноглікозидів і чутливість до пеніцилінів. Антибіотик батумін вибірково пригнічував ріст представників роду Staphylococcus, що дозволяє рекомендувати даний препарат як для його широкого клінічного використання при лікуванні стафілококових інфекцій, так і для родової ідентифікації стафілококів. Всі інші ізольовані грампозитивні та грамнегативні збудники гнійно-запальних інфекцій були до батуміну резистентними.

Імунний статус хворих на гнійно-запальні захворювання, викликані УПБ. Імунний статус хворих на гнійно-запальні захворювання характеризувався порушеннями як клітинної, так і гуморальної ланок імунітету. Це виражалось в зменшенні абсолютної кількості Т-, В-лімфоцитів, Т-хелперів/індукторів та натуральних кілерів. Поряд з цим, були пригнічені кілерна та фагоцитарна активності імунокомпетентних клітин. Загальна тенденція змін у системі основних імунорегуляторних Т-клітин характеризувалася значним зниженням Т-хелперів (CD₄-клітини) при відносному переважанні Т-супресорів (CD₈-лімфоцити). Внаслідок цього імунорегуляторний індекс CD₄/CD₈ у всіх групах хворих на гнійно-запальні захворювання, викликані УПБ, мав тенденцію до зниження, що свідчило про розвиток відносного гіперсупресорного варіанту імунодефіциту. Ступінь виразності дисбалансу в системі основних імунорегуляторних популяцій Т-клітин залежав від клінічного варіанта гнійно-запальних захворювань і був найбільшим у хірургічних хворих з ускладненнями в черевній порожнині.

Гуморальна ланка імунітету характеризувалась розвитком гіпоімуноглобулінемії по класах А, М, G, збільшенням в крові хворих циркулюючих імунних комплексів переважно за рахунок їх найбільш патогенних середньо- та дрібномолекулярних фракцій. Виразність імунопатологічних порушень залежала від ступеню тяжкості інфекційного процесу, викликаного УПБ, та була найбільшою при тяжкому перебігу хвороби.

Імуносупресивні властивості УПБ - збудників гнійно-запальних захворювань. Усі види УПБ - збудників гнійно-запальних захворювань володіли дозозалежною антикомплементарною активністю (АКА). З 3180 ізолятів УПБ частота АКА при концентрації комплементу 5 СН50/мл склала 80,8 %, при концентрації 10 СН50/мл - 30,4 %, при 20 СН50/мл - 7,9 % (кратність зниження частоти АКА в порівнянні з концентрацією 5 СН50/мл - 2,7 і 10,2 раз відповідно). Найбільшу АКА виявляли аеробні та факультативно анаеробні бактерії. При концентрації комплементу 10 СН50/мл сумарна частота АКА цих патогенів була в 1,8 раз, а при 20 СН50/мл - в 4,8 раз вищою такої по зрівнянню з облігатно анаеробними УПБ. Серед аеробних і факультативно анаеробних збудників гнійно-запальних захворювань більш вираженою АКА володіли грампозитивні бактерії. Серед облігатно анаеробних збудників істотної різниці в частоті АКА між групами грампозитивних та грамнегативних патогенів виявлено не було. Найбільшою АКА серед аеробних та факультативно анаеробних УПБ володіли S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. intermedius, S. pyogenes, S. anginosus, K. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, у яких частота АКА коливалась при концентрації комплементу 5 СН50/мл від 100 % до 71 %, при 10 СН50/мл - від 66,7 % до 40,6 %, при 20 СН50/мл - від 33,3 % до 10,9 %. Серед облігатно анаеробних збудників найбільш активно комплемент інактивували B. fragilis, B. thetaiotaomicron, B. caccae, P. melaninogenicus, P. loescheii, F. necroforum, P. magnus, P. tetradius, C. perfringens, у яких частота АКА при 5 СН50/мл коливалась від 100 % до 67,3 %, при 10 СН50/мл - від 33,5 % до 14,3 %, при 20 СН50/мл - від 8,1 % до 2,9 %.

Всі УПБ - етіологічні агенти гнійно-запальних захворювань були спроможні інактивувати лізоцим. В залежності від виду патогену частота антилізоцимної активності (АЛА) коливалась від 100 % до 39,1 % при її інтенсивності від 0,310 до 0,063 мкг/мл од опт. щільн. Найбільшу АЛА проявляли аеробні та факультативно анаеробні бактерії, у яких інтенсивність АЛА складала 0,158+0,006 мкг/мл од опт. щільн. проти 0,116+0,005 мкг/мл од опт. щільн. для облігатних анаеробів, p<0,05. Серед аеробних та факультативно анаеробних УПБ найактивнішими були грампозитивні (інтенсивність АЛА - 0,166+0,006 мкг/мл од опт. щільн. проти 0,150+0,005 мкг/мл од опт. щільн. для грамнегативних, p<0,05). Серед облігатно анаеробних збудників найвираженіша інактивація лізоциму була властива грампозитивним УПБ (0,125+0,004 мкг/мл од опт. щільн. проти 0,107+0,003 мкг/мл од опт. щільн. для грамнегативних, p<0,05).

З 63 видів УПБ - збудників гнійно-запальних захворювань статистично вірогідною антиімуноглобуліновою активністю (АІА) володіло 70,5 % (43 види). Найбільшою частотою АІА відзначались аеробні та факультативно анаеробні патогени - 75,9±3,8 % видів проти 63,6+3,2 % в групі облігатно анаеробних бактерій (p<0,05), тоді як розповсюдженість одночасної інактивації імуноглобулінів (Ig) класів А, М, G склала відповідно 54,5+3,3 % та 14,3+0,9 % (p<0,001). Діапазон АІА істотно звужувався в міру падіння вірулентності збудників гнійно-запальних захворювань, що проявлялось в спроможності руйнувати Ig тільки 1-2 класів. Найзначніша АІА була властива представникам родів Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Klebsiella та Enterobacter. Облігатно анаеробні УПБ відзначалися переважною інактивацією Ig A, серед яких найбільшу АІА мали окремі представники родів Bacteroides, Prevotella і Fusobacterium.

Супернатанти культур УПБ негативно впливали на показники клітинного імунітету. Це виражалося в пригніченні фагоцитарної активності нейтрофілів та моноцитів, що супроводжувалось зменшенням їх фагоцитарного числа і фагоцитарного індексу; інгібуванні кілерної спроможності НК- та К-клітин. Вплив супернатантів культур збудників гнійно-запальних захворювань на В-клітинну ланку імунітету проявлявся в зменшенні антитілопродукуючої спроможності лімфоцитів. Крім того, супернатанти культур УПБ викликали пригнічення клітинної імунної відповіді, про що свідчило зниження рівня гіперчутливості уповільненого типу (ГУТ) мишей до спленоцитів морської свинки. Виразність зазначених імунопатологічних змін залежала від вірулентності виду УПБ і посилювалась у випадку їх асоціації. Найбільш виражену імуносупресію клітинної ланки імунітету викликали аеробні та факультативно анаеробні УПБ, серед яких найсуттєвішим негативним впливом характеризувались супернатанти S. aureus, S. intermedius, S. haemolyticus, P. aeruginosa, K. pneumoniae, P. vulgaris та деякі інші. Серед облігатно анаеробних УПБ найбільше пригнічення клітинного імунітету викликали C. perfringens, B. fragilis, B. thetaiotaomicron, P. melaninogenicus, P. loescheii, F. necroforum, F. nucleatum, F. mortiferum. Одним із чинників, які супресивно та дозозалежно впливали на клітинний імунітет, був стафілококовий токсин.

Імуносупресивну дію на клітинну ланку імунітету проявляли структурні елементи грампозитивних і грамнегативних збудників гнійно-запальних захворювань (пептидоглікани, тейхоєві кислоти, білок А стафілококів, ЛПС). Виразність імуносупресивного впливу вказаних речовин була дозозалежною і видоспецифічною. Дія структурних елементів УПБ на показники клітинного імунітету виявлялась пригніченням функціональної активності нейтрофілів, моноцитів, натуральних кілерів, Т- та В-лімфоцитів. Структурні елементи збудників гнійно-запальних захворювань викликали дисбаланс в системі Т-хелпери/Т-супресори, який характеризувався переважанням Т-супресорів над Т-хелперами.

Пригнічення фагоцитарної активності нейтрофілів та моноцитів по мірі збільшення концентрації пептидогліканів грампозитивних УПБ суттєво зростало (мал.). При рівні 2, 10 та 50 мкг/мл статистично вірогідну антифагоцитарну активність до моноцитів виявляли відповідно пептидоглікани 8,7 %, 56,6 % та 100 %, а до нейтрофілів - 13,0 %, 69,6 % і 100 % видів патогенів. При цьому фагоцитарні індекси та числа нейтрофілів і моноцитів прогресивно зменшувались і вірогідно відрізнялись від контролю. Супресивно впливав на показники імунітету білок А стафілококів. При цьому ступінь виразності зазначеного впливу корелював з концентрацією білка А в тест-середовищі: із збільшенням вмісту білка А порушення імунних показників збільшувалися.

Білок А стафілококів пригнічував фагоцитарну активність нейтрофілів та моноцитів. Це виявлялося у зниженні як їх фагоцитарного індексу (ФІ), так і фагоцитарного числа (ФЧ). При концентрації білка А стафілококів 0,01 мг/мл ступінь зниження ФІ нейтрофілів склав 2,1 і 1,6 разів, а ФЧ - 2,2 та 1,8 разів відповідно (p<0,05). Зі збільшенням концентрації білка А до 0,1 мг/мл ФІ нейтрофілів та моноцитів знижувався порівняно з референтною нормою в 3,8 та 2,9 раз, тоді як ФЧ - у 4,8 і 4,1 разів. Імуносупресивний вплив білка А стафілококів виявлявся у пригніченні утворення АУК, а також їх антитілопродукуючої спроможності, що мало прояв в зменшенні діаметра зони гемолізу навколо АУК. Найбільш виражена дія білка А на зазначені показники імунітету реєструвалась при концентрації 0,1 мг/мл. Дозозалежний супресивний ефект білка А стафілококів мав місце відносно функціональної активності НК- і К-кілерів. При мінімальному вмісті білка А в розчині кілерна спроможність НК- та К-клітин знижувалася невірогідно, тоді як при збільшенні концентрації до 0,1 мг/мл індекси цитотоксичності ІЦ НК та ІЦ К були відповідно у 1,5 і 1,4 раз нижчими від аналогічних показників референтної норми (p<0,05). Білок А стафілококів пригнічував вторинну імунну відповідь, що проявлялось у зменшенні рівня ГУТ до спленоцитів морської свинки.

Негативним впливом на показники імунітету характеризувались тейхоєві кислоти. Серед аеробних і факультативно анаеробних УПБ найбільший вплив на систему фагоцитозу спричиняли тейхоєві кислоти S. aureus. Під їх дією ФІ нейтрофілів та моноцитів був зниженим у 1,7 і 1,4 разів, а ФЧ - у 1,45 та 1,5 разів відповідно (p<0,05). В інших стафілококів вплив тейхоєвих кислот на систему фагоцитозу був значно меншим. Серед облігатно анаеробних УПБ найбільшу імуносупресивну активність стосовно нейтрофілів і моноцитів проявляли тейхоєві кислоти P. niger та C. perfringens. Встановлений переважний вплив тейхоєвих кислот на функціональну активність системи натуральних кілерів, що виражався в істотному зниженні їх індексу цитотоксичності. Найбільш вірогідне пригнічення кілерної спроможності НК- і К-клітин під впливом тейхоєвих кислот мало місце у S. aureus. В інших збудників тейхоєві кислоти пригнічували функціональну активність натуральних кілерів в меншій мірі. Тейхоєві кислоти помірно знижували утворення АУК, інтенсивність їх антитілопродукції, пригнічували клітинну імунну відповідь на моделі ГУТ.

Імуносупресивні властивості мали ЛПС грамнегативних УПБ. При цьому їх активність залежала від ступеня патогенності збудника і діючої концентрації. Чіткий імуносупресивний ефект ЛПС грамнегативних УПБ виявлявся при їх вмісті в тест-середовищі 20-40 мкг/мл (залежно від виду). ЛПС викликали суттєве зменшення числа нейтрофілів та моноцитів, які фагоцитують, а також їх поглинальної спроможності. Найбільшу антифагоцитарну активність мали ЛПС H. influenzae, P. aeruginosa та K. pneumoniae. Кратність зниження ФІ нейтрофілів під їх дією склала 1,76, 1,68 і 1,67 разів відповідно. Аналогічна динаміка змін мала місце і у моноцитів. Серед облігатно анаеробних грамнегативних УПБ найбільшу антифагоцитарну активність виявляли ЛПС F. necroforum, F. mortiferum та F. nucleatum. Менш активно порівняно з ними фагоцитарну активність нейтрофілів і моноцитів пригнічували ЛПС бактероїдів, превотел та порфіромонад. Імуносупресивна дія ЛПС грамнегативних збудників гнійно-запальних захворювань мала прояв у зниженні числа АУК і їх спроможності утворювати антитіла, у пригніченні функціональної активності натуральних кілерів та вторинної імунної відповіді на моделі ГУТ. Найбільший імуносупресивний ефект на імунні показники чинили ЛПС аеробних і факультативно анаеробних патогенів.

Метаболічні механізми реалізації імуносупресивних властивостей умовно-патогенних бактерій - збудників гнійно-запальних захворювань. Популяції імуноцитів здорових донорів відрізнялись за внутрішньоклітинним рівнем цАМФ і цГМФ. Нейтрофіли характеризувались практично однаковим співвідношенням цАМФ та цГМФ; моноцити і Т-хелпери - істотним переважанням цГМФ над цАМФ, Т-супресори, В-лімфоцити і натуральні кілери - цАМФ над цГМФ. Рівень циклічних нуклеотидів в імунокомпетентних клітинах хворих на гнійно-запальні захворювання, викликані УПБ, характеризувався вірогідним збільшенням концентрації цАМФ і відносним переважанням над цГМФ, що супроводжувалось підвищенням коефіцієнту цАМФ/цГМФ. Вміст цАМФ в нейтрофілах хворих був у 1,8 разів, а в моноцитах - у 1,7 разів вищим від норми. Рівень цГМФ у зазначених клітинах мав тенденцію до зниження, у зв'язку з чим коефіцієнт цАМФ/цГМФ збільшувався і перевищував такий у здорових осіб у 2,1 та 2,4 разів відповідно (p<0,05). Подібні зміни мали місце і у В-лімфоцитах і натуральних кілерах.

Вміст цАМФ в Т-хелперах, виділених від хворих на гнійно-запальні захворювання у гострому періоді, перевищував референтну норму у 3,0 рази, у Т-супресорах - у 1,9 разів. В Т-хелперах спостерігалося вірогідне зниження цГМФ (у 2,3 рази), тоді як у Т-супресорах відбувалося його збільшення у 2,0 рази. Це супроводжувалось збільшенням коефіцієнта цАМФ/цГМФ у Т-хелперів при незмінному його значенні у Т-супресорів. Стафілококовий токсин у концентрації 10^-1 сприяв підвищенню внутрішньоклітинної концентрації цАМФ, яка залежно від виду імунокомпетентних клітин зростала від 1,5 разів (нейтрофіли) до 3,9 раз (СD₄-лімфоцити). В той самий час стафілококовий токсин знижував рівень цГМФ у нейтрофілах, моноцитах та Т-хелперах і підвищував його у Т-супресорах, В-лімфоцитах й натуральних кілерах. Це призводило до збільшення співвідношення цАМФ/цГМФ у нейтрофілах і моноцитах в 1,9 та 2,4 разів, у CD₃, CD₄, CD₂₂ та CD₁₆-лімфоцитах відповідно у 2,4, 6,0, 1,3 та 1,2 разів. В CD₈-клітинах коефіцієнт цАМФ/цГМФ суттєво не змінювався.

Дія пептидоглікану S. aureus на вміст циклічних нуклеотидів в імунокомпетентних клітинах була менш вираженою, ніж стафілококового токсину. Це проявилось у менш значному підйомі вмісту цАМФ, а також у менш суттєвій зміні рівня цГМФ та коефіцієнта цАМФ/цГМФ. Під впливом пептидоглікану S. aureus співвідношення цАМФ/цГМФ у Т-хелперах було у 1,9 разів нижчим, ніж під дією стафілококового токсину. Дія тейхоєвих кислот S. aureus була аналогічною такій при дії на імуноцити стафілококових токсину і пептидоглікану, хоча і поступалася останнім за активністю. Вплив пептидогліканів інших аеробних та анаеробних грампозитивних УПБ не відрізнявся за спрямованістю від такого для S. aureus, хоча був менш інтенсивним. Їх пептидоглікани сприяли підвищенню індексу цАМФ/цГМФ у нейтрофілах у середньому у 1,4 разів, в моноцитах - у 1,1-1,3 разів. Під їх дією рівень цАМФ у Т-хелперах підвищувався від 2,0 до 2,5 разів, а цАМФ/цГМФ у 2,2-2,7 разів проти 3,0 рази і 3,2 для S. aureus. В той самий час, концентрація цГМФ знижувалась у 1,13 разів, проти 1,4 разів для S. aureus (p<0,05).

ЛПС як аеробних, так і анаеробних грамнегативних патогенів також індукували внутрішньоклітинний синтез цАМФ та пригнічували продукцію цГМФ. Найвищий вплив на циклічні нуклеотиди в імуноцитах чинили ЛПС аеробних та факультативно анаеробних УПБ.

Вплив УПБ - етіологічних агентів гнійно-запальних захворювань на апоптоз імуноцитів. У хворих на гнійно-запальні захворювання, викликані УПБ, мало місце збільшення кількості імуноцитів, які несли маркери апоптозу - рецептори CD₉₅ i CD₃₈. Посилення експресії апоптозного фенотипу корелювало із ступенем тяжкості хвороби і було найбільшим при тяжкому перебігу. Серед імунокомпетентних клітин, що апоптують, переважали нейтрофіли, а серед лімфоцитів - Т-хелпери. Експресію маркерів апоптозу на імуноцитах здорових донорів індукували структурні елементи та токсини УПБ. Найінтенсивнішу стимуляцію апоптозу викликав стафілококовий токсин. Під його дією кратність збільшення CD₉₅₊-клітин порівняно з контролем для нейтрофілів склала 2,8 разів, для моноцитів - 3,9 разів, для Т-, В-лімфоцитів і натуральних кілерів - 4,9, 3,5 і 7,2 разів відповідно. Серед Т-лімфоцитів, які апоптували, значну питому вагу мали Т-хелпери (73,0 %), тоді як на частку Т-супресорів приходилось 27,0 % CD₉₅₊ клітин.

Під впливом стафілококового токсину відбувалося також значне збільшення частоти експресії маркера апоптозу CD₃₈. Порівняно з контролем кількість CD₃₈-позитивних нейтрофілів та моноцитів зросла відповідно у 5,6 і 5,0 разів, тоді як Т-, В-лімфоцитів і натуральних кілерів - у 6,0, 6,2 та 7,9 разів. В субпопуляційному складі Т-лімфоцитів мало місце переважання CD₃₈₊-Т-хелперів над CD₃₈₊-Т-супресорами. У цілому, при стимуляції імунокомпетентних клітин стафілококовим токсином спостерігалося переважання експресії CD₃₈-рецепторів над CD₉₅-рецепторами. Аналогічні, але менш виражені зміни питомої ваги апоптуючих імуноцитів спостерігались під впливом білка А стафілококів, пептидогліканів, тейхоєвих кислот грампозитивних та ЛПС грамнегативних УПБ. Разом з тим, ЛПС грамнегативних збудників на апоптоз нейтрофілів і моноцитів не впливали.

Індукція експресії CD₉₅- і CD₃₈-рецепторів на імунокомпетентних клітинах супроводжувалась зростанням числа імуноцитів з типовими для апоптозу морфологічними змінами. Апоптозні клітини закруглювались, стискувались, втрачали мікроворсинки, але зберігалась цілісність плазматичної мембрани і внутрішньоклітинних органел. Ядерний хроматин апоптозних клітин агрегував та фрагментувався. Частина їх виявлялась як апоптозні тіла - фрагменти апоптозних клітин, що містили шматки конденсованого ядра або були позбавлені ядерного матеріалу.

Структурні компоненти і токсини збудників гнійно-запальних захворювань збільшували кількість клітин, які мають типові ознаки апоптозу. Під впливом стафілококового токсину питома вага апоптозних нейтрофілів на другу добу культивування перевищувала контроль у 4,5 раз (p<0,05). Аналогічна кратність стимуляції морфологічних проявів реєструвалась також і у відношенні моноцитів та лімфоцитів.

Виражена стимуляція апоптозу серед імунокомпетентних клітин спостерігалася під дією білка А, пептидоглікану та тейхоєвих кислот S. aureus. Проте у порівнянні зі стафілококовим токсином їх вплив на апоптоз імунних клітин був менш суттєвим. Під дією білка А, пептидоглікану і тейхоєвих кислот S. aureus питома вага апоптозних нейтрофілів була відповідно у 2,0, 1,4 та 2,2 разів нижчою, проти дії стафілококового токсину (p<0,05). Подібна тенденція реєструвалася також стосовно моноцитів і лімфоцитів.

Аналіз впливу ЛПС грамнегативних УПБ на апоптоз імуноцитів виявив його відсутність стосовно нейтрофілів та моноцитів і збільшення в 1,9 разів відносно лімфоцитів (p<0,05).

ВИСНОВКИ