Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут медицини праці

Академії медичних наук України

УДК 613.6+615.9+546.81:577.1

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Процес вільнорадикального перекисного окислення ліпідів та активність антиоксидантної системи при впливі свинцю (експериментальні та виробничі дослідження)

14.02.01-Гігієна

Мельник Юлія Петрівна

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис. хімічний окислення ліпіди

Робота виконана в Інституті медицини праці АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, академік АМН України, член-кор. НАН України, Трахтенберг Ісак Михайлович, Інститут медицини праці АМН України, завідувач лабораторії промислової токсикології і гігієни праці при використанні хімічних речовин

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, Яворовський Олександр Петрович, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, завідувач кафедри гігієни праці і профзахворювань

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Левицький Євген Леонідович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник відділу біохімічної фармакології

Провідна установа Інститут екогігієни та токсикології ім. Л.І. Медведя, відділ токсикології та медико-біологічних досліджень, МОЗ України, м.Київ

Захист відбудеться “ 1 ” липня 2004 р. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.554.01 при Інституті медицини праці АМН України (01033, Київ-33, вул. Саксаганського, 75) о 14 годині

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту медицини праці АМН України (01033, Київ-33, вул. Саксаганського, 75)

Автореферат розісланий “ 29 ” травня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради А.В.Степаненко

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Патологія людини в сучасних умовах пов'язана зі значним антропогенним забрудненням навколишнього середовища. За критеріями пріоритетності небезпеки впливу шкідливих чинників на довкілля та здоров'я людини техногенні фактори хімічної природи займають перше місце [Кундиев Ю.И., Трахтенберг И.М., 1991, Румянцев Г.И., 1995, Сердюк А.М., 1998].

Серед хімічних речовин, що забруднюють виробниче та навколишнє середовище, свинець та його сполуки утворюють значну групу токсикантів [Сидоренко Г.И., 1995, 4 th International Workshop on Clinical Toxicology. Pesticides and Heavy Metals, 1997]. Зростання видобування, виробництва та використання свинцю, застосування алкільованого палива, недосконалі технологічні процеси, викиди і відходи свинцевого виробництва призводять до накопичення його в об'єктах довкілля: ґрунтах, поверхневих та ґрунтових водах [Трахтенберг И.М, 1994, Трахтенберг И.М., 1997].

З впровадженням автоматизованого обладнання на підприємствах, застосуванням засобів індивідуального захисту працюючих, важких форм свинцевої інтоксикації майже не зустрічається. Однак, враховуючи значну матеріальну кумуляцію свинцю, слід зауважити, що його накопичення в організмі людини може відбуватися і при концентраціях металу в навколишньому та виробничому середовищі навіть нижче рівнів ГДК [Кравченко Ю.К., Ермоленко А.Е., 1998]. Тому вивчення впливу відносно малих доз (рівнів) свинцю на організм людини залишається актуальним [Tuormaa T.E. 1994, Полякова А.Н., 1995]

Вплив невеликих рівнів свинцю, тобто таких, які наближені до ГДК призводить до “зтертих”, невиразних симптомів свинцевої інтоксикації. Завчасна діагностика таких форм інтоксикації викликає певні труднощі у зв'язку з відносною специфічністю загальноприйнятних діагностичних тестів.

В останій час активно розробляються нові засоби ранньої діагностики багатьох захворювань за результатами дослідження біологічних рідин. Частина з них заснована на точних інструментальних біофізичних вимірюваннях та відповідає таким загальним вимогам: висока швидкість та точність дослідження, простота підготовки та доступність біосубстрату, мінімальний його об'єм, який використовується, об'єктивність параметрів, що реєструються можливість автоматизації досліджень. Це робить їх зручними для проведення скрінінгових досліджень на великих контингентах людей. Таким методом дослідження може бути вимірювання хемілюмінесценції плазми крові, що визначає стан вільнорадикального перекисного окислення ліпідів. Відомо, що система окислювального гомеостазу є чутливою до впливу екзогенних факторів, а порушення прооксидантно-антиоксидантного статусу організму - ранньою універсальною неспецифічною ланкою патогенезу багатьох захворювань. Більш того, його оцінка рекомендована в якості одного з методів моніторингу стану здоров'я людини [Барабой В.А., 1989, Бурлакова Е.Б., 1992, Фархутдинов Р.Р., 1995, Farkhutdinov R.R., 1996] та оцінки впливу на організм факторів виробничого і навколишнього середовища [Стежка В.А., 1993, 1999].

Інший метод - метод лазерної кореляційної спектроскопії плазми крові. Він може використовуватися як для фундаментальних досліджень, так і при вирішенні задач, пов'язаних з експрес-дослідженнями плазми крові при діагностиці окремих захворювань, вивченням динаміки розвитку та ефективності лікування деяких патологічних процесів [Лебедев А.Д., 1987, Омельченко В.С., 1989, Клопов Н.К., 1992].

У зв'язку з зазначеним, актуальним є вивчення перебігу процесу вільнорадикального перекисного окислення ліпідів плазми крові та активності антиоксидантних ферментів, інтегрального гуморального гомеостазу за макромолекулярним складом плазми крові при дії сполук свинцю в експериментальних та виробничих дослідженнях.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом галузевих НДР МОЗ України та АМН “Вивчення субфракційного макромолекулярного складу сироватки крові методом ЛК-спектроскопії при дії важких металів (на прикладі свинцю)” (№ держреєстрації UA 01002060 P), “Обґрунтування застосування методу
ЛК-спектроскопії плазми крові та визначення його специфічності для скрінінгових досліджень ризику розвитку свинцевої інтоксикації” (№ держреєстрації 0194U017100), “Встановити особливості взаємозв'язку імуногенетичних, імунних та біохімічних механізмів гомеостазу з носійством важких металів (на прикладі свинцю, кадмію, марганцю) (№держреєстрації 0194U017100).

Тема дисертаційної роботи: Процес вільнорадикального перекисного окислення ліпідів та активність антиоксидантної системи при впливі свинцю.

Мета роботи: Дослідити стан вільнорадикального перекисного окислення ліпідів та активність антиоксидантної системи організму, визначити макромолекулярний склад плазми крові за лазерними кореляційними спектрами при впливі на організм людини і тварин сполук свинцю. В скрінінгових дослідженнях довести доцільність їхнього використання для виявлення осіб з порушеннями в прооксидантно-антиоксидантному стані організму та інтегральному гуморальному гомеостазі, характерними для впливу свинцю.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі завдання:

В умовах експериментальної свинцевої інтоксикації у лабораторних тварин визначити стан вільнорадикального перекисного окислення ліпідів плазми крові, активність антиоксидантної системи організму та активність індикаторних ферментів у сироватці крові.

Визначити прооксидантно-антиоксидантний стан організму та активність індикаторних ферментів в наступних групах:

хворих на хронічну свинцеву інтоксикацію (непрацюючі особи);

робітників, які зазнають в умовах виробництва впливу сполук свинцю;

мешканців великого міста (контрольна група).

В експериментальних та виробничих дослідженнях провести порівняльний аналіз макромолекулярного складу плазми крові за лазерними кореляційними спектрами та оцінити стан інтегрального гуморального гомеостазу в групах:

тварин з модельованою свинцевою, марганцевою, свинцево-марганцевою інтоксикаціями та інтактних щурів;

контрольній, робітників, які зазнають в умовах виробництва впливу сполук свинцю, хворих на хронічну свинцеву інтоксикацію.

Визначити прооксидантно-антиоксидантний статус організму, активність індикаторних ферментів та стан інтегрального гуморального (плазмового) гомеостазу в скрінінгових дослідженнях у механізаторів сільського господарства, які обробляли ґрунти, що забруднені важкими металами.

Об'єкт дослідження: люди, лабораторні тварини, сироватка та плазма крові, еритроцити.

Предмет дослідження: прооксидантно-антиоксидантний стан організму, інтегральний гуморальний гомеостаз.

Методи дослідження: гігієнічні, токсикологічні, хіміко-аналітичні, клініко-лабораторні, біохімічні, біофізичні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше науково обґрунтована та експериментально доведена доцільність та ефективність комплексного застосування показників, що характеризують прооксидантно-антиоксидантний стан організму при дослідження стану здоров'я осіб, що зазнають впливу сполук свинцю.

Доведена висока чутливість та доцільність використання методу лазерної кореляційної спектроскопії плазми крові в скрінінгових дослідженнях з метою виявлення осіб, експонованих сполуками свинцю. Метод дозволяє проводити індивідуальне прогнозування ризику розвитку порушень в організмі, що викликані дією свинцю та робити узагальнення відносно небезпеки впливу цього металу на людей в окремих екологічних зонах чи професійних групах.

Практичне значення отриманих результатів.

Проведення індивідуального порівняльного аналізу лазерних кореляційних спектрів осіб, які зазнають впливу факторів виробничого та/чи оточуючого середовища зі спектрами сформованих референтних груп виявляє зміни в макромолекулярному складі плазми крові, що виникають при впливі сполук свинцю. Це дозволяє своєчасно застосовувати комплекс колективних (на рівні окремих когорт людей чи професійних груп) та індивідуальних лікувально-профілактичних заходів, спрямованих на зниження шкідливого впливу сполук свинцю, які з часом призводять до втрати працездатності і порушення здоров'я, та попередження формування хронічної свинцевої інтоксикації.

Визначення прооксидантно-антиоксидантного статусу людини за наявності впливу на організм сполук свинцю дозволяє аргументувати застосування для профілактики та корекції стану її здоров'я, фармакологічних засобів із антиоксидантним та мембраностабілізуючим типом дії.

Апробація результатів дисертації. Основні результати та положення дисертаційної роботи представлені та обговорені на конгресах, конференціях, симпозіумах:

- Конференціях молодих вчених Інституту медицини праці АМН України (1998р, 1999р., 2001р.);

- Науково практична конференція “Охорона здоров'я і довкілля”,1996, Львів;

- Міжнародна конференція “Здоров'я, оточуюче та виробниче середовище, безпека праці в сільському господарстві на межі двох тисячоліть” Київ, Вересень 8-11, 1998;

- Конференція “Актуальні проблеми токсикології”, 7-8 жовтня, 1999р, Київ;

14 Конгрес міжнародної асоціації з медицини в сільському господарстві та сільського здоров'я (травень 25-27, 2000, Угорщина);

8 Міжнародний симпозіум “Нейроповедінкові методи та ефекти при впливі на людину навколишнього та виробничого середовища”, Липень 23-26, 2002, Брешія, Італія;

VIII Науковий з'їзд Польського токсикологічного товариства, 8-11 вересня, 2002, Лодзь, Польща;

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 наукових робіт, у тому числі 4 статті у фахових наукових виданнях, що входять до переліку ВАК України. Видано 2 інформаційних листки.

Структура та обсяг дисертації. Робота складається із вступу, аналітичного огляду літератури, опису методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, списку літератури. Загальний обсяг дисертації становить 157 сторінок ком'ютерного друку. Дисертація містить 37 таблиць, 33 рисунки. Бібліографія включає 197 джерел.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Для досягнення поставленої в дисертації мети та реалізації її завдань проведено експериментальні дослідження на лабораторних тваринах та виробничі спостереження у людей, які зазнавали впливу сполук свинцю з виробничого та/чи навколишнього середовища.

Експериментальні дослідження проведені на нелінійних щурах-самцях масою 190-280 г. Вивчення впливу свинцю на стан прооксидантно-антиоксидантного статусу та інтегрального гуморального гомеостазу проводили при моделюванні інтоксикації шляхом внутрішньочеревного введення в організм тварин різних доз його ацетату. ЛД50 ацетату свинцю становила 25 мг на 100 г маси тварини. В гострих експериментах вивчали біологічні ефекти двох різних за токсичністю доз оцтовокислого свинцю (1/4 ЛД50 - 6,25 мг/100 г та 1/16 ЛД50 - 1,55 мг/100г маси тварини) після ізольованого одноразового внутрішньочеревного його введення. Біохімічні дослідження проводили на третю добу, що дозволяло уникнути неспецифічної стресорної відповіді організму щурів на введення відносно великих доз ацетату свинцю. В підгострих (5 введень) та субхронічних (25 введень) експериментах тварини отримували ацетат свинцю в дозах 1/50 (загальна кількість солі свинцю, що вводилася -2,5 мг/100г та 12,5 мг/100г, відповідно) та 1/100 ЛД50 (загальна кількість солі свинцю, що вводилася - 1,25 мг/100г та 6,25 мг/100г, відповідно). Контрольні групи склали щурі тих же генерацій, статі та маси, що і експериментальні тварини. В кожній серії експерименту для біохімічних та хіміко-аналітичних досліджень використовувалося по 10 тварин, а для проведення ЛК-спектроскопії - плазма крові від 15 і більше щурів.

В виробничих дослідженнях обстежена група з 25 робітників основних професій (група ПКС) заводу художнього скла (видувальники, шліфувальники, набірники скла) та 15 осіб з клінічним діагнозом “хронічна свинцева інтоксикація” з проявами мікросатурнізму (група ХСІ). Діагноз “хронічна свинцева інтоксикація” встановлювався на основі результатів клінічного обстеження лікарями-спеціалістами клініки профзахворювань Інституту медицини праці АМН України з урахуванням результатів лабораторних досліджень. Біологічні ефекти свинцю на організм обстежених осіб виявляли за загальноприйнятими специфічними лабораторно-діагностичними тестами, такими як: вміст дельта-амінолевулінової кислоти (д-АЛК), копропорфірину [Смирнова Л.С., 1987 ] та креатинину у сечі [Колб, 1982], абсолютний вміст еритроцитів у периферичній крові, відносний вміст у ній еритроцитів з базофільною зернистістю та ретикулоцитів [Меньшиков В.В., 1987].

При проведенні скрінінгових досліджень обстежено механізаторів сільського господарства (41 особа) з трьох населених пунктів, які обробляли ґрунти з різним ступенем забруднення важкими металами. Проведено дослідження умов праці на робочих місцях механізаторів при виконанні усіх етапів річного циклу механізованих робіт. Дослідження та оцінка рівнів шуму на робочих місцях проводилися згідно з ГОСТ 12.1.050-86 “ССБТ. Методы измерения шума на рабочих местах”. Санітарні норми припустимих рівнів шуму на робочих місцях №3223-85. Дослідження та оцінка рівнів загальної вібрації на робочих місцях проводилися згідно з ГОСТ 12.1.012-90 “ССБТ. Вибрационная безопасность. Общие требования”. Санітарні норми вібрації на робочих місцях №3044-84. Для розрахунку вібраційного та шумового навантаження проводилося визначення Lекв.фактора. Дослідження та оцінка параметрів мікроклімату на робочих місцях проводилися згідно з ГОСТ 12.1.005.88 “Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны”. Дослідження та оцінку хімічних речовин в повітрі робочої зони проводили згідно з ГОСТ 12.1.005.88 “Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны” та визначали: свинець, кадмій, марганець.

Вміст свинцю, кадмію та марганцю в біосубстратах тварин та крові людей визначали атомно-абсорбційним методом [Dobrovolsky at al, 1993]. Прооксидантно-антиоксидантний стан організму людей та щурів досліджували за визначенням активності вільнорадикального перекисного окислення ліпідів (ВРПОЛ) та активності антиоксидантних ферментів. Активність ВРПОЛ визначали за методом біохемілюмінесцентного аналізу плазми крові та використовували оцінку стану окислювального гомеостазу згідно з [Леоненко О.Б., 1989, Стежка В.А.,1999]. Вміст ТБК-активних сполук в сироватці крові визначали за методом [Гацко Г.Г., 1982]. В еритроцитах, отриманих з венозної крові, визначали активність ферментів супероксиддисмутази (СОД, КФ.1.15.11) та каталази (КТ, КФ.1.11.7) [С. Чевари, 1992], в сироватці крові - активність ферментів церулоплазміну (ЦП, КФ.1.1.6.3), холінестерази (ХЭ, КФ.3.1.1.7) за Хестріним, аланін- та аспартатамінотрансфераз.

У обстежених людей та дослідних тварин досліджували субфракційний макромолекулярний склад плазми крові з використанням методу лазерної кореляційної спектроскопії (ЛК-спектроскопія) [Ломакин А.В. та інш.,1987, Лебедев А.Д., 1987]. Застосування методу ЛК-спектроскопії з діагностичною метою полягає у порівнянні та класифікації індивідуального(них) спектру(ів) з груповим спектром якоїсь групи тварин чи людей на відповідність. Таку можливість надають розроблені алгоритми попарної групової і індивідуальної класифікації результатів ЛК-спектрів за допомогою програми “Багатомірний класифікатор” [Ломакин А.В. та інш.,1987]. Критеріями відмінності між двома групами ЛК-спектрів вважають гомогенність їхньої функції розподілу частинок плазми крові, віддаленість центрів тяжіння, а також величину ділянки перекриття. Існування останньої неминуче свідчить про неоднорідність груп обстежених, що зумовлена об'єктивною недосконалістю критеріїв їхнього відбору і формування за певними ознаками (неточність клінічного діагнозу, особливості перебігу захворювання, наявність неврахованих різноманітних екзогенних впливів, умови праці, стаж професійної діяльності тощо).

Математичну обробку результатів досліджень проводили на ПЕОМ з використанням загальноприйнятих статистичних методів, у тому числі з розрахунком середньої величини, її похибки, критерію Стьюдента, застосуванням кореляційного та дисперсійного аналізу [Мінцер, 1999].

Результати та їхнє обговорення. Експериментальними дослідженнями встановлено, що гостра свинцева інтоксикація, яку моделювали 1-разовим введенням ацетату свинцю в дозах 1/4 та 1/16 ЛД50 супроводжувалася збільшенням вмісту свинцю в усіх біосубстратах, що досліджувалися. Концентрація свинцю в крові становила 1,08±0,56 мг/л після застосування дози ј ЛД50 та 2,14±0,52 мг/л після дози 1/16 ЛД50, в тканині печінки, відповідно, 60,64±37,00 мкг/г та 9,91±1,80 мкг/г, в тканині мозку - 11,23± 2,60 мкг/г та 12,29±5,60 мкг/г.

В експериментах при застосуванні ацетату свинцю у дозах 1/50 та 1/100ЛД50 після 5 введень вміст свинцю в крові тварин становив, відповідно, 2,15±0,38 та 1,76± 0,68 мг/л, в тканині печінки - 7,99±1,14 мкг/г та 6,43±1,52 мкг/г, в тканині мозку - 7,02±2,40 мкг/г та 3,46±0,33 мкг/г. 25-разове введення тваринам цих доз супроводжувалося подальшим накопиченням свинцю в біосубстратах і становило: 9,68±1,80 мг/л та 5,90±2,80 мг/л в крові; 9,38±1,26 мкг/г та 7,20±0,44 мкг/г в тканині печінки; 9,47±1,80 мкг/г та 4,40±0,54 мкг/г в тканині мозку. У контрольних щурів концентрація свинцю знаходилася в межах 0,28-0,33 мг/л в крові, 1,36-1,74 мкг/г в тканині печінки, 2,99-5,78 мкг/г в тканині мозку.

Одноразове введення тваринам ацетату свинцю в дозах ј ЛД50 та 1/16 ЛД50 на третю добу експерименту не викликало суттєвих змін в перебігу процесу ВРПОЛ плазми крові, але супроводжувалося пригніченням активності антиоксидантних ферментів в еритроцитах. У щурів цих груп достовірно знижувалася активність ферментів СОД (16,9±2,9 од.акт/гHb проти 25,8±6,3 од.акт/ гHb в контрольній групі та 21,8±3,6 од.акт/ гHb проти 42,8±11,9 од.акт/ гHb в контролі) та КТ (4,1±0,6 од/ гHb та 1,7±0,4 од/ гHb проти 5,3±2,4 од/ гHb та 3,1±0,5 од/ гHb в контролі,відповідно).

Моделювання інтоксикації у тварин ацетатом свинцю в дозі 1/50 ЛД50 після 5-разового введення супроводжувалося зростанням вмісту гідропероксидів ліпідів, зниженням інтегральної антиоксидантної забезпеченості організму, а після 25-разового введення - зростанням рівня спонтанної хемілюмінесценції плазми крові, збільшенням вмісту в ній гідропероксидів ліпідів та продуктів вільнорадикальних реакцій, зниженням інтегральної антиоксидантної забезпеченості організму (табл.1). У тварин цієї групи спостерігалося підвищення активності ферменту КТ після 5- та його достовірне зниження - після 25-разового введення ацетату свинцю (табл. 2). Таким чином, за умови багаторазового введення щурам ацетату свинцю в дозі 1/50 ЛД50 спостерігалися такі зміни в системі ВРПОЛ, що свідчать про активацію цього процесу.

Таблиця 1 Стан системи вільнорадикального окислення ліпідів в плазмі крові щурів при моделюванні субхронічної свинцевої інтоксикації (M±m)

Примітка: *- в цій на наступних таблицях вірогідна відмінність показників по відношенню до контрольної групи (p<0.05)

Інтоксикація тварин ацетатом свинцю в дозі та 1/100 ЛД50 призводила до зростання рівня СХЛ плазми крові і зниження інтенсивності перебігу процесу перекисного окислення ліпідів, швидкості окислення ліпідів, вмісту продуктів вільнорадикальних реакцій та збільшенню резистентності ліпідів до переокислення після 5-разового введення; зниження швидкості окислення ліпідів, вмісту перекисних продуктів вільнорадикальних реакцій і збільшенню резистентності ліпідів до переокислення після 25-разового введення (табл.1).

Таблиця 2 Активність ферментів антиоксидантного захисту організму у щурів при моделюванні субхронічної свинцевої інтоксикації (M±m)

Моделювання інтоксикації дозою 1/100 ЛД50 ацетату свинцю викликало зростання активності антирадикальної та антиперекисної ланки АОС після 5-разового введення. Після 25-разового введення зберігалася підвищеною активність ферменту СОД, а активність КТ достовірно знижувалася (табл.2). За якісними критеріями такий функціональний стан системи ВРПОЛ свідчить про пригнічення її активності і відповідає наявності виразних порушень ліпідного складу плазми крові, що може бути пов'язане з високою спорідненістю свинцю до легкоокислювальних фракцій ліпідів плазми крові, а також мобілізацією ферментів антиоксидантного захисту [Стежка В.А.,1999, Стежка В.А., Леоненко О.Б.,2002, Стежка В.А., Леоненко О.Б.,2003].

Результати проведених санітарно-гігієнічних досліджень умов праці робітників групи ПКС дозволили зроби висновок про комплексну дію несприятливих виробничих факторів на організм працюючих. До них відносяться пил, шум, локальна вібрація. Серед всіх вивчаємих факторів ведучим за інтенсивністю дії є хімічний, зокрема вміст в пилові оксидів свинцю (перевищення ГДК в 2-4 рази).

Обстеження робочих з груп ПКС та ХСІ виявило, що вони в значній мірі експоновані свинцем: вміст катіонів свинцю у їхній крові був однаковим (відповідно 0,52±0,04 та 0,52±0,06 мг/л, p>0,05). Вміст свинцю у крові обстежених з контрольної групи, які не працювали в умовах його надходження з виробничого середовища, був також достатньо високим (0,39±0,05 мг/л). Найбільш суттєві зміни стану порфіринового обміну та “червоної” крові відбувалися у осіб групи ПКС: зростання вмісту -АЛК у сечі (2,93±0,47мг/г креатиніну проти 1,61±0,25 мг/г креатиніну в контрольній групі), збільшення у крові відносної кількості еритроцитів з базофільною зернистістю ((7,00,9)% проти (2,01,0)%) та ретикулоцитів (1,20,1)% проти (0,90,03)%). Припинення надходження свинцю до організму з виробничого середовища (група ХСІ) призводило до нормалізації стану порфіринового обміну, однак залишався підвищенним вміст у крові базофільнозернистих еритроцитів (7,11,0)%. Проведені ензимологічні дослідження виявили збільшення активності ферментів ЛФ та АЛТ, пригнічення активності ферменту ХЕ в групах ХСІ та ПКС, а у хворих ХСІ - активності ЦП в сироватці крові, що свідчить про наявність структурних ушкоджень мембран гепатоцитів та порушення білоксинтезуючої функції печінки. Характерною особливістю хронічного впливу сполук свинцю на робітників групи ПКС було порушення стану окислювального гомеостазу, що відповідало пригніченню системи ВРПОЛ в плазмі крові, вірогідно, за рахунок дефіциту субстратів переокислення (найбільш легко окислювані фракції ненасичених жирних кислот)(рис.1). У хворих на ХСІ реєструвався типовий розгалужений вільнорадикальний патологічний процес зі збільшеним утворенням ТБК-активних сполук. Це було обумовлено антиоксидантною недостатністю організму у обстежених цієї групи та підтверджувалося дослідженням хемілюмінесценції плазми крові і визначенням активності ферментів АОС: зниження активності СОД та ЦП, підвищення КТ (табл.3). Значний вклад в порушення окислювального гомеостазу в групі хворих на ХСІ могла чинити діагностована у них хронічна соматична патологія, зокрема, захворювання гепатобіліарної системи (хронічний гепатит, хронічний холецистит та інш.).

Рис. 1 Стан системи вільнорадикального окислення ліпідів у обстежених
(% по відношенню до контрольних значень)

Таблиця 3 Активність ферментів системи ендогенних антиоксидантів у обстежених (M±m)

Таким чином, отримані результати дозволили встановити у робочих ПКС та хворих на ХСІ наявність двох якісно різних функціональних станів системи ВРПОЛ в залежності від інтенсивності та тривалості впливу сполук свинцю:

пригнічення активності, що відображує наявність порушень ліпідного складу плазми крові та структурного ураження мембран клітин внутрішніх органів, зокрема гепатоцитів, внаслідок переокислення ліпідів, що найбільш легко окислюються (робітники ПКС);

активація ВРПОЛ внаслідок інтегральної антиоксидантної недостатності (хворі на ХСІ).

Одним з методів, який в останній час застосовується в наукових і клінічних дослідженнях для визначення гетерогенності корпускулярного складу різних рідин, у тому числі і макромолекулярного складу плазми та сироватки крові людей є метод лазерної кореляційної спектроскопії. Отримані нами в експериментальних дослідженнях результати свідчать, що за допомогою методу ЛК-спектроскопії плазми крові можливо достатньо переконливо “відрізняти” зміни в стані гуморального гомеостазу за її макромолекулярним складом у тварин з модельованими свинцевою та марганцевою інтоксикаціями, як між собою, так і з контрольною групою та групою тварин зі свинцево-марганцевою інтоксикацією (табл. 4).

Таблиця 4 Результати класифікаційного аналізу ФРЧ плазми крові у щурів після моделювання свинцевої, марганцевої та свинцево-марганцевої інтоксикації (%)

В кожній групі тварин визначалася доволі висока гомогенність корпускулярного складу плазми крові (67-95%). Проте, частина ЛК-спектрів окремої досліджуваної групи мала в своїй структурі спільні ознаки з ЛК-спектрами щурів іншою групи та контролем. Наявність спільних ознак в функції розподілу частинок плазми крові (ФРЧ) тварин, яким вводилися солі свинцю чи марганцю, імовірно, пояснюється ефектами матеріальної кумуляції даних елементів з оточуючого середовища та наявністю, внаслідок цього, певних змін в стані гуморального гомеостазу. З іншого боку, можливо, що моделювання інтоксикації ізольованим введенням солі одного з металів внаслідок неспецифічної стресорної та специфічної токсичної дії призводить до мобілізації іншого металу (марганцю чи свинцю) з “депо” та більш виразної реалізації його біологічної дії.

Аналіз структури ЛК-спектрів плазми крові виявив ряд суттєвих відмінностей її субфракційного макромолекулярного складу у трьох групах обстежених людей (контрольна, робітники ПКС, хворі на ХСІ). По-перше, в групах робітників ПКС та хворих на ХСІ зростав відносний вміст у ЛК-спектрах низькомолекулярних (відповідно, 16,1% і 9,6% проти 5,6% у контрольній групі) і середньо молекулярних фракцій (відповідно, 35,9% і 47,2% проти 23,7% у контрольній групі) та знижувався вміст високомолекулярних (відповідно, 48,0% і 43,4% проти 70,7% у групі порівняння) субфракцій плазми крові. По-друге, спостерігалася значна розбіжність в областях локалізації центрів тяжіння індивідуальних ЛК-спектрів у просторі між окремими групами обстежених, що свідчило про наявність якісної різниці у стані субфракційного макромолекулярного гуморального (плазмового) гомеостазу. За структурою ЛК-спектрів, яка відображає якісні та кількісні характеристики стану інтегрального гуморального гомеостазу ці групи можуть бути класифіковані як референтні. По-третє, у групах визначалася незначна кількість обстежених, які за індивідуальними особливостями ФРЧ плазми крові мали певну кількість ознак, за якими могли бути віднесеними до іншої репрезентативної групи, чи не відповідали ні одній з них, що, вірогідно, може бути пов'язане з особливостями індивідуальної (знижена або підвищена) чутливості їхнього організму до біологічного впливу сполук свинцю. В групі робітників ПКС виявлялися особи, у яких за ФРЧ плазми крові виявлялося від 1 до 94% ознак, що були характерними для контрольної групи та від 1 до 98% ознак - групі хворих сатурнізмом. Серед хворих на ХСІ виявлялися особи, у яких структура ЛК-спектрів за ФРЧ плазми крові мала ознаки притаманні групі робітників ПКС.

Враховуючи отримані результати, проведено визначення стану ВРПОЛ, активності ферментів АОС та індикаторних ферментів, стану інтегрального гуморального гомеостазу методом ЛК-спектроскопії у осіб, які зазнавали впливу сполук свинцю з виробничого і навколишнього середовища з метою обґрунтування доцільності їх використання для скрінінгового виявлення осіб з ознаками свинцевої інтоксикації. Для цього проведено обстеження механізаторів з трьох населених пунктів, які обробляли ґрунти з різним ступенем забруднення важкими металами. Проведені гігієнічні дослідження умов праці механізаторів виявили однакові шумові (86-92 дБА) та загальні вібраційні (112-120 дБА) навантаження на організм механізаторів незалежно від класу тракторів, що використовувалася. Незначна різниця спостерігалася в тривалості робіт в умовах високої запиленості повітряного середовища, впливу нагріваючого мікроклімату та контакту з хімічними речовинами як між трактористами які працювали в межах одного населеного пункту, так і між механізаторами окремих господарств. Відмічалася різниця в пилових навантаженнях та тривалості робіт в умовах нагріваючого мікроклімату в залежності від класу машин. В с.Рогозов на тракторах Т-16 спостерігалася найбільша тривалість контакту з високими концентраціями пилу та високою температурою повітря в кабінах (65-69 днів на рік), на тракторах МТЗ/ЮМЗ, відповідно,- 50-53 днів, на тракторах Т-150 та К-700 - 39 та 22 дні. У механізаторів с.Вороньков найбільша тривалість контакту з пилом відмічалася на тракторах типу 1.4 (91 день), на тракторах класу 3.0 та 5.0 - 77 днів на рік. Тривалість роботи в несприятливих мікрокліматичних умовах була приблизно однаковою на всіх видах тракторів (68 та 70 днів на рік, відповідно).

У вибіркових пробах повітря робочої зони спостерігалося перевищення концентрації свинцю порівняно з існуючим ГДК для атмосферного повітря (в 2-6 разів), що свідчить про реальне існування пресингу важких металів на механізаторів.

Для вивчення залежності особливостей стану біохімічного та гуморального гомеостазу від концентрації свинцю в крові механізатори були розподілені на чотири умовні підгрупи: 1. 0,60?Pb<0,70 (0,65±0,012 мг/л), 2. 0,70?Pb<0,80 (0,77±0,008 мг/л), 3. 0,80?Pb<0,90 (0,85±0,007 мг/л), 4, 0,90?Pb (0,93±0,007 мг/л). В усіх підгрупах механізаторів спостерігалося достовірне зростання рівня СХЛ плазми крові, збільшення резистентності ліпідів до переокислення та зменшувався вміст ТБК-активних сполук у порівнянні з контрольною групою (табл.5). Зростання концентрації свинцю в крові обстежених призводило до більш виразних порушень в активності процесу ВРПОЛ. Так, у механізаторів 2 підгрупі визначалося зниження інтенсивності процесу ПОЛ, швидкості окислення ліпідів та вмісту перекисних продуктів вільнорадикальних реакцій в плазмі крові, а в 4 підгрупі, крім вище названих порушень відбувалося і зменшення вмісту гідропероксидів ліпідів в плазмі крові. За своєю якісною суттю, такі зміни вказували на пригнічення системи ВРПОЛ, що розвивалося, імовірно, внаслідок попередньої тривалої активації процесу ПОЛ та виникнення дефіциту легко оксилювальних фракцій ліпідів в плазмі крові. В усіх підгрупах механізаторів була зниженою активність ферменту церулоплазміну в сироватці до рівнів 150-170 мг/л проти 227,00±10,8 мг/л в контрольній групі. Крім того, в 2-4 підгрупах спостерігалося зниження активності ферменту СОД в еритроцитах (30-35 Од/гHb проти 63,30±4,70 Од/гHb в контролі), а в 3-4 підгрупах - зростання активності КТ (8-9 Од/ гHb проти 5,98±0,20 Од/ гHb в контрольній групі).

Таблиця 5 Стан системи вільнорадикального перекисного окислення ліпідів в плазмікрові обстежених в залежності від вмісту катіонів свинцю (M±m)

У обстежених механізаторів проводилося порівняння індивідуальних ЛК-спектрів плазми крові до групових ЛК-спектрів робітників ПКС та хворих на ХСІ (як репрезентативних). Це надавало можливість класифікувати механізаторів за наявністю біологічного впливу свинцю на організм чи ознаками, що характерні для ХСІ. Серед обстежених механізаторів виявлялися особи які в ЛК-спектрах мали ознаки, що за ФРЧ плазми крові були властивими для групи ПКС та ХСІ (від 1% до 100%) (табл. 6). Слід відзначити, що ознаки наявності біологічного впливу свинцю на організм за даними ЛК-спектроскопії, що визначалися у механізаторів, які мали доволі різні рівні свинцю в крові. Так, у механізатора №99, у якого концентрація свинцю в крові була 0,39 мг/л, визначалося 35% ознак властивих для групи робітників ПКС. В той же час механізатори №84, 86, 94 з більш значним вмістом свинцю в крові (0,85-0,86 мг/л) мали тільки 1% ознак в ЛК-спектрах спільних з групою робітників ПКС. Те ж саме стосується механізаторів, у яких спостерігалися ознаки належності ЛК-спектру до групи хворих на ХСІ: у механізатора №76, який мав високий вміст свинцю в крові 0,9 мг/л, виявлялося 38% ознак характерних для цієї групи, а у обстеженого № 80 з концентрацією катіонів свинцю в крові 0,64мг/л реєструвалося 95% таких ознак. Таким чином, за даними ЛК-спектроскопії деякі механізатори (№ 76, 80, 81, 82, 99, 101) потребують ретельного клініко-лабораторного обстеження на встановлення можливої наявності свинцевої інтоксикації.

Таблиця 6 Вибіркові дані про імовірність віднесення механізаторів до груп робітників ПКС та хворих на ХСІ за даними ЛК- спектроскопії зразків плазми крові

Результати проведених досліджень дозволяють стверджувати, що метод ЛК-спектроскопії плазми крові володіє достатньою для медико-біологічних досліджень чутливістю та специфічністю для визначення інтегральних порушень стану гуморального (плазмового) гомеостазу, які пов'язані з впливом на організм людини сполук свинцю. Його використання доцільне для проведення скрінінгових досліджень на великих контингентах людей з метою визначення осіб з наявністю біологічної експозиції сполуками свинцю та підвищеним ризиком розвитку свинцевої інтоксикації, які потребують поглибленого клініко-лабораторного обстеження. Наведені вище результати ЛК-спектрометрії плазми крові показують перспективи використання методу в експериментальній та клінічній токсикології

Висновки

Проведеними експериментальними дослідженнями на щурах та виробничими дослідженнями за участі людей, які зазнають професійного впливу сполук свинцю, доведено, що визначення прооксидантно-антиоксидантного статусу організму з використанням методу хемілюмінесценції плазми крові і активності ферментів антиоксидантного захисту та стану інтегрального гуморального гомеостазу за субфракційним макромолекулярним складом плазми крові методом лазерної кореляційної спектроскопії є інформативним для виявлення осіб з підвищеним ризиком розвитку свинцевої інтоксикації.

1. Підгостра та субхронічна свинцева інтоксикація після, відповідно, 5-ти та 25-разового внутрішньочеревного введення щурам ацетату свинцю у дозі 1/100 LD50 супроводжується пригніченням активності вільнорадикального перекисного окислення ліпідів у плазмі крові, що проявляється зниженням швидкості окислення ліпідів, вмісту перекисних продуктів вільнорадикального окислення та наростанням резистентності ліпідів до переокислення. При цьому в антиоксидантній системі організму щурів спостерігається функціональна напруга, на що вказує підвищена активність ферменту супероксиддисмутази (на 64%) та каталази (на 57%) після 5-разового і підвищена активність супероксиддисмутази (на 84%) та знижена активність каталази (на 71%) після 25-разового введення ацетату свинцю. Внаслідок цього розвиваються структурно-функціональні порушення в тканині печінки та пошкодження мембран гепатоцитів, на що вказує дистопія індикаторних ферментів у кров, свідченням якої є підвищена активність ферментів аланінамінотрансферази і лужної фосфатази в сироватці крові.

2. У робочих заводу з виготовлення художнього скла основних професій (видувальники, шліфувальники, набірники скла), умови праці яких характеризуються комплексним впливом нагріваючого мікроклімату, шуму, локальної вібрації (на рівні ГДР) та переважно несприятливим впливом окислів свинцю на рівні 0,048-0.01мг/м3 (перевищення ГДК до 4 разів) виявлено збільшення вмісту свинцю в крові (0,52±0,03 мг/л), д-АЛК (2,93±0,94 мг/г Кр) і копропорфірину (57,41±21,8 мкг/г Кр) в сечі, еритроцитів з базофільною зернистістю (7,1±0,9), відсотка ретикулоцитів (1,2±0,10) та зниження активності процесу вільнорадикального перекисного окислення ліпідів у плазмі крові у порівнянні з контрольною групою, особи якої не працюють в шкідливих умовах і також експоновані сполуками свинцю (рівень свинцю у крові 0,39±0,01 мг/г). В антиоксидантній системі організму виявлялося зниження активності ферменту церулоплазміну (на 20%) та підвищення активності каталази (на 50%).

3. У хворих на хронічну свинцеву інтоксикацію, які не зазнають професійного впливу сполук свинцю, не виявлено суттєвого порушення порфіринового обміну та спостерігалося дещо інтенсивніше у порівнянні з робочими основних професій виведення свинцю з організму з сечею (0,094±0,044 мг/л). При цьому у них реєструвалася активація процесу вільнорадикального перекисного окислення ліпідів у плазмі крові з його розгалуженням внаслідок антиоксидантної недостатності, на що вказували результати дослідження її індукованої хемілюмінесценції та активності ферментів антиоксидантного захисту організму: зниження активності супероксиддисмутази (на 40%) та церулоплазміну (на 20%) і зростання активності каталази (на 70%).

4. На фоні виявлених порушень прооксидантно-антиоксидантного статусу організму у робочих основних професій заводу з виготовлення художнього скла, які розвивалися внаслідок впливу сполук свинцю з виробничого середовища, виявлена дестабілізація внутрішньосистемних кореляційних зв'язків між окремими показниками, що характеризують активність процесу вільнорадикального перекисного окислення ліпідів. У них зберігалося 15 зв'язків з 29 можливих та змінювалася направленість зв'язків між вмістом ТБК активних сполук та іншими показниками ВРПОЛ. В той же час, у хворих на ХСІ в умовах відсутності поточного впливу сполук свинцю з виробничого середовища спостерігалося відновлення окремих внутрішньосистемних зв'язків (між спонтанною хемілюмінесценцією плазми крові та інтенсивністю перебігу процесу ПОЛ, швидкістю окислення ліпідів, резистентністю ліпідів до переокислення) та формування нових (між показником інтегральної антиоксидантної забезпеченості організму антиоксидантами та вмістом ТБК активних сполук).

5. В порівняльних експериментальних дослідженнях на щурах при моделюванні гострої свинцевої, марганцевої і свинцево-марганцевої інтоксикацій одноразовим внутрішньоочеревним введенням високих доз ацетату свинцю (1/4 та 1/16 ЛД50 дози), хлористого марганцю (1/2 та 1/8 ЛД50) та їхньої суміші (1/16 ЛД50 ацетату свинцю 1/8 ЛД50 хлориду свинцю) та підгострої (5 введень) і субхронічної (25 введень) свинцевої інтоксикацій відносно меншою дозою (1/50 ЛД50 ацетату свинцю) доведено, що метод ЛК-спектроскопії володіє достатньою для медико-біологічних досліджень чутливістю та специфічністю для визначення особливостей порушень стану інтегрального гуморального гомеостазу за субфракційним макромолекулярним складом плазми крові. Це підтверджувалося встановленою високою гомогенністю функції розподілу частинок плазми крові в групах щурів при кожній інтоксикації на рівні 67-95% та незначним відсотком спільних ознак в ЛК-спектрах (до 13%).

6. Дослідженням субфракційного макромолекулярного складу плазми крові методом ЛК-спектроскопії у контрольній групі, у робітників, професійно контактуючих із свинцем та хворих на хронічну свинцеву інтоксикацію встановлена його висока гомогенність за ФРЧ (53-84%), суттєва розбіжність між областями локалізації центрів тяжіння групових ЛК-спектрів і незначна зона їхнього перекриття (4-11%). Це свідчило про наявність специфічних порушень у стані інтегрального гуморального гомеостазу за субфракційним макромолекулярним складом плазми крові у робітників ПКС та хворих на ХСІ у порівнянні з контролем та у робітників ПКС у порівнянні з хворими на ХСІ. Останнє дозволило сформувати референтні групові ЛК-спектри, які в подальшому могли використовуватися у якості еталонних при проведенні класифікаційного математичного аналізу особливостей ФРЧ в ЛК-спектрах плазми крові при скрінінгових дослідженнях серед людей, що зазнавали впливу сполук свинцю з виробничого та/або навколишнього середовища, для виявлення ступеню біологічної експозиції організму свинцем.

7. В скрінінгових дослідженнях за участю трьох груп механізаторів сільського господарства, умови праці яких суттєво не розрізнялися за шумовими (86-92 дБА) та загальними вібраційними (112-120 дБА) навантаженнями, тривалістю робіт в умовах запиленості виробничого середовища, впливу нагріваючого мікроклімату та контакту з хімічними речовинами (до 80 днів на рік), але обробляли ґрунти, що були в різному ступені забруднені важкими металами, виявлена залежність порушень прооксидантно-антиоксидантного статусу організму від інтенсивності накопичення свинцю у крові. Зі збільшенням біологічної експозиції організму свинцем наростали явища дезорганізації у взаємопов'язаному функціонуванні систем вільнорадикального перекисного окислення ліпідів та антиоксидантної системи, що проявлялося пригніченням активності цього процесу і дестабілізацією у забезпеченні сукупного антиоксидантного захисту організму: антирадикальної (фермент СОД), антиперекисної (фермент КТ) і сироваткової (фермент ЦП) ланок АОС. Це супроводжувалося структурно-функціональним ураженням тканини печінки та мембран гепатоцитів, свідченням чому було порушення білоксинтетичної функції цього органу (зниження активності ферментів церулоплазміну та холінестерази).

8. Класифікаційним математичним аналізом особливостей ФРЧ в ЛК-спектрах плазми крові механізаторів у порівнянні зі сформованими референтними групами контролю, робітників ПКС та хворих на ХСІ у частини з них виявлена у субфракційному макромолекулярному її складі наявність від 1 до 100% ознак, які характерні для високої професійної біологічної експозиції свинцем та хронічної свинцевої інтоксикації. Виділена група механізаторів, які потребували поглибленого клініко-лабораторного обстеження у зв'язку з підвищеним ризиком (1-100% спільних ознак) розвитку свинцевої інтоксикації.

Список опублукованих праць за темою дисертації

1. Стежка В.А., Мельник Ю.П. Состояние свободнорадикального окислительного гомеостаза у человека при воздействии соединений свинца// Совр. проблемы токсикологии.-2003.-№2.- С.50-54. (Дисертанткою проведено аналіз сучасної наукової літератури, дослідження активності ферментів в сироватці крові, статистичний аналіз одержаних результатів та порівняльна характеристика стану окислювального гомеостазу у робітників, що зазнають впливу сполук свинцю з виробничого чи оточуючого).

2. Стежка В.А., Мельник Ю.П. Використання методу лазерної кореляційної спектроскопії плазми крові для дослідження впливу катіонів свинцю на стан гуморального гомеостазу у людини //Фізика живого.- 2003.-Т.11, №2.-С.81-90. (Дисертанту належить ідея проведення порівняльного аналізу специфічних тестів біоекспозиції свинцем та стану гуморального гомеостазу, проведено аналіз сучасної наукової літератури, здійснена підготовка проб плазми крові для проведення ЛК-спектроскопії та статистичний аналіз одержаних результатів, обґрунтовані підходи до індивідуального прогнозу ризику розвитку свинцевої інтоксикації).

3. Кундиев Ю.И., Стежка В.А., Дмитруха Н.Н., Лампека Е.Г, Диденко М.Н, Покровская Т.Н, Оникиенко Ф.А., Блакита И.В., Мельник Ю.П., Падакина Е.В. Зависимость изменения иммунных и биохимических механизмов поддержания гомеостаза от особенностей и выраженности материальной кумуляции свинца в организме //Медицина труда и промышленная экология.-2001.-№4.-С.11-17. (Дисертанткою проведено визначення активності антиоксидантних та індикаторних ферментів в сироватці крові експериментальних тварин).

4. Dmytrukha Natakiya, Melnik Yuliya. The State of Nervous and Immune Systems in Occupationally Lead Exposed Persons// Neurobehavioral methods and effects in occupational and environmental health. Proceeding from 8th international symposium, June 23-26, 2002, Brescia, Italy, p. 223-226 (сборник статей). (Дисертанту належить ідея проведення порівняльного аналізу стану нервової системи людей, що зазнавали впливу сполук свинцю з результатами іммунологічного дослідження, проведено статистичний аналіз захворюванності нервової системи серед обстежених).

5. Стежка В.А., Оникієнко Ф.О., Блакіта І.В., Остроухова В.А., Покровська Т.Н., Дмитруха Н.М., Мельник Ю.П., Леоненко Н.С. До механізму ізольованої та комбінованої загально- та імунотоксичної дії свинцю та марганцю в експериментальних дослідженнях /наук.-практична конф. “Охорона здоров'я і довкілля”, Львів,1996, - С.99-100.

6. Stezhka V.А., Onikienko F.A., Blakita I.V., Melnik Yu., Dudko I.A. Agriculture operators biochemical homeostasis shifts depending on xenobiotic total biological exposure International Conferens “ Environmental and Occupational Health and Safety in Agriculture on the Boundary of Two Millenia” Kiev, September 8-11, Abstr.-K, 1998,-p.84.

7. Stezhka V.А., Karathentseva A.I., Melnik Yu. Use of the method of lazer correlative spectroscopy of blood plasma for individual risk prognosis of lead intoxication and chronic bronchitis development in agriculture operators Environmental and Occupational Health and Safety in Agriculture on the Boundary of Two Millenia” Kiev, September 8-11, Abstr.-K,1998,-p.85.

8. Stezhka V.А., Dmitrukha N.N. Melnik Yu. Dependence of the state of biochemical and immune homeostasis in agriculture machine operators from expression of exposition to heave metals// Association of Agricultural Medicine and Rural Health /May 25-27, 2000 Pecs, Hungery. - P. 16.

9. Stezhka V. Melnik Yu. Risk prognosis of lead intoxication and chronic bronchitis development in agriculture machine operators. Use of the method of lazer correlative spectroscopy of blood plasma Association of Agricultural Medicine and Rural Health /May 25-27, 2000 Pecs, Hungery. - P. 74.

10. Stezhka V., Melnik Yu. The integral humoral homeostasis state in humans exposed to lead compounds /VIII Naukowy zjazd Polskiego Towarzystwa Toksykologicznego, 8-11 wrzesnia, 2002, Lodz.-C.171.(Дисертанту належить ідея проведення порівняльного аналізу результа...