Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

* в таблиці наведені тільки ті метали та їхні концентрації, які статистично достовірно змінювали відносну тривалість фаз мітозу

Після обробки іонами Сu2+ у вищій концентрації (5 мкМ) на препаратах апікальної кореневої меристеми не вдавалось знайти жодної клітини на стадіях мітозу; при цьому більшість інтерфазних ядер було зруйновано, що свідчило про некроз тканини. Наявність мітотичних клітин на препаратах після обробки міддю надлетальними концентраціями (50-1000 мкМ) (Рис. 2д, 3д) може пояснюватись тим, що у таких дозах метал діє як фіксатор, швидко вбиваючи клітини, але не пошкоджуючи ядерний матеріал.

Порівняння відносної тривалості фаз мітозу привертає увагу ще до двох тестованих катіонів -- Cd2+ і Ni2+. Обидва метали статистично достовірно змінюють розподіл фаз мітозу серед клітин, що діляться (Табл. 2). Однак мітотичні пертурбації, зумовлені цими полютантами, відмінні. Кадмій, починаючи з ефективних токсичних концентрацій, сприяє суттєвому збільшенню відсотку профаз серед мітотичних клітин (Табл. 2) і одночасному зниженню інтенсивності клітинних поділів (Рис. 2). Така, на перший погляд, невідповідність між падінням МІ та формуванням профазного блоку в дослідах з Cd2+ може свідчити на користь того, що даний катіон не тільки перешкоджає конденсації хромосом, що затримує профазу, але й сильно пригнічує перехід клітин із G2 до М стадії клітинного циклу.

Іони Ni2+, на відміну від усіх інших катіонів, спричиняють статистично достовірне накопичення метафаз у популяції мітотичних клітин (Табл. 2), і також, як і у випадку з Cd2+, значно знижують мітотичний індекс (Рис. 2). Падіння МІ з одночасним блокуванням мітозу в метафазі також вказує на значне інгібування здатності клітин до поділу, а сам метафазний блок свідчить про порушення функціонування мітотичного апарату, основу якого складають мікротрубочки веретена поділу.

Крім вищезгаданих цитологічних параметрів, після обробки іонами токсичних металів виявлялись численні цитогенетичні порушення, які були підсумовані нами в загальний кількісний показник - індекс аберацій УІА (Рис. З). Серед виявлених порушень окремо варто виділити злипання хромосом (Рис. 4а). Ця хромосомна аберація вказує на високу токсичність діючих речовин, на ефект, що в більшості випадків не піддається репарації і призводить до клітинної смерті [Fiskesjх, 1995; El-Ghamery et al., 2003] і тому характеризує, як правило, летальні концентрації тестованих речовин. Про смерть клітин також свідчить пікноз ядерного матеріалу в інтерфазних клітинах (Рис. 4б). Аналіз відсотків клітин з пікнотичними ядрами та із злипанням хромосом після обробки солями тестованих металів дозволив зробити висновок про ступінь цитотоксичної дії досліджуваних речовин: Cu2+>Cd2+VPb2+>Zn2+>Ni2+>Al3+. Запропонований ряд цитотоксичності металів співпадає з рядом металів за сублетальними концентраціями інгібування росту коренів проростків A. cepa.

Рис. 3. Сумарний індекс аберацій, % в клітинах кореневої меристеми проростків цибулі після обробки різними концентраціями солей токсичних металів, мкМ: а - CdCl2; б - Pb(CH3COO)2; в - NiSO4; г - Al(NO3)3; д - CuSO4; е - ZnSO4.

Цитогенетична активність важких металів та алюмінію. Усі зареєстровані цитогенетичні аномалії, індуковані тестованими металами в апікальній меристемі коренів проростків цибулі, умовно можна розділити на три основні групи: 1) патології, пов'язані з пошкодженням хромосом (кластогенний ефект); 2) патології, пов'язані з пошкодженням мітотичного апарату та 3) патології, що є наслідком порушення проходження цитокінезу. Аномалії 2-ої і 3-ої групи можна розглядати як анеугенні ефекти - цитогенетичні пошкодження на надхромосомному рівні.

Індукція хромосомних аберацій. При дії всіх тестованих солей металів відмічені утворення фрагментів хромосом та хромосомних мостів. Такі кластогенні ефекти були найхарактернішими для сублетальних токсичних концентрацій досліджуваних речовин (Табл. 3). Порівняльний аналіз індексів аберацій кластогенного типу (ІАк) дозволив побудувати ряд металів за здатністю індукувати хромосомні пошкодження. Найсильнішим кластогеном виявився Zn (у 13,6 рази здатний збільшувати частоту хромосомних аберацій у меристемній тканині порівняно з контролем); далі у порядку зниження кластогенної активності тестовані метали розташовуються в такій послідовності: Pb ( 5,7) V Cd (4,8) V Сu (4,3) V Al (4,0) V Ni(3,6) (Табл. 3).

Таблиця 3 Порівняння індексів цитогенетичних аберацій, індукованих іонами токсичних металів у меристемних клітинах проростків цибулі

# виділені в таблиці дані відповідають середньоефективним токсичним концентраціям досліджуваних металів (EК50). Значення, розташовані в таблиці між контролем та ефективними концентраціями, відповідають ініціальним токсичним концентраціям (EК10), а ті, що розташовані нижче - сублетальним (EК90) та летальним дозам тестованих металів;

мк - на препаратах спостерігались тільки або переважно мертві клітини.

Окремо хотілося б звернути увагу на мідь. За індексом аберацій кластогенного типу цей метал займає четверту позицію, однак, при врахуванні його дуже низької діючої концентрації (1 мкМ), можна говорити про його сильнішу кластогенність порівняно з іншими досліджуваними металами.

Мітотичні порушення, пов'язані з пошкодженням веретена поділу. Патології мітозу, пов'язані з пошкодженням мітотичного апарату, а саме відставання хромосом в анафазі (Рис. 6а), багатополюсний мітоз (Рис. 6б) та колхіциноподібний (К-) мітоз (Рис. 6в), спостерігались при дії всіх тестованих сполук. Така турбагенна дія солей важких металів та алюмінію мала дозозалежний характер (див. Табл. 3). Причому, при ініціальних (ЕК10) та середньоефективних (ЕК50) концентраціях досліджуваних токсикантів реєстрували, в основному, зростання кількості клітин з відставанням хромосом. Збільшення концентрацій солей металів до сублетальних (ЕК90) призводило до накопичення клітин із мультиполярними мітозами та К-мітозами. Припускається, що відставання хромосом є проявом слабкої антимікротрубочкової дії токсичних речовин, а багатополюсні та “колхіцинові” мітози характеризують, як правило, високі дози “мітотичних отрут” [Fiskesjц, 1995].

Аналізуючи зміни індексу аберацій за групою анеугенних порушень, виявлених у мітотичних клітинах (див. Табл. 3), можна побудувати ряд солей металів за їхньою здатністю пошкоджувати мітотичний апарат клітини: NiSO4 у 69,6 рази збільшує відсоток пошкоджень порівняно з контролем; CdCl2 - у 32,3 рази; Al(NO3)3 - у 8,3 рази; Pb(CH3COO)2 - у 8,0 раз; СuSO4 - у 4,4 рази і ZnSO4 - у 3,3 рази. Як бачимо, сполуки нікелю та кадмію мають набагато вищу турбагенну (анеугенну) активність, ніж інші тестовані речовини, що характеризує їх як сильні мітотичні отрути і, очевидно вказує на високу спорідненість до мікротрубочок веретена.

Ядерні аномалії в інтерфазних клітинах. Крім хромосомних та мітотичних порушень на препаратах були виявлені численні ядерні аномалії в інтерфазних клітинах, серед них мікроядра, лопатеві ядра та багатоядерність. Клітини з мікроядрами можуть утворюватись як внаслідок виходу із мітозу клітин з відставанням хромосом, що передбачає можливість розвитку анеуплоїдії [Fiskesjц, 1995; Verhoeven et al., 1989], так і внаслідок деконденсації уламків хромосом при фрагментації Antoccia et al., 1991. Оскільки причини виникнення мікроядер у наших експериментах не зрозумілі, даний тип цитогенетичних порушень в інтерфазних клітинах не відносили ні до кластогенних, ні до анеугенних ефектів токсичних металів.

Реститутивні клітини (клітини з лопатевими ядрами або полікаріоцити) можуть утворюватись внаслідок виходу клітин із К-мітозу шляхом деконденсації хаотично розкиданих хромосом, минаючи стадію розходження хромосом та утворення клітинної стінки [Кундельчук, 2002; Verhoeven et al., 1989]. Такі ядерні аномалії інтерфазних клітин теж характеризували турбагенну дію досліджуваних металів. За результатами наших досліджень Cd2+, Ni2+ та Al3+ сприяють утворенню найбільшої кількості клітин з реститутивними ядрами.

Порушення клітинного поділу третьої групи, пов'язанe із запізненням цитокінезу, призводить до утворення двоядерних клітин (Рис. 7г). Згідно з нашими даними, найвираженіший цитокінез-блокуючий ефект має Ni2+: вже при концентрації 10 мкМ відсоток двоядерних клітин на препаратах у 4 рази перевищував контрольний рівень. Cd2+, Pb2+ та Al3+ в діапазоні ефективних концентрацій майже не змінювали відсоток двоядерних клітин порівняно з контролем, проте суттєво збільшували його в сублетальних та летальних концентраціях (100-1000 мкМ). Іони ж Cu2+ та Zn2+ із зростанням концентрацій не сприяли помітному накопиченню двоядерних клітин у кореневій меристемі проростків цибулі.

За кількістю реститутивних та двоядерних клітин характеризували анеугенні ефекти досліджуваних металів в інтерфазних клітинах (див. Табл. 3). За індексом аберацій такого типу найсильнішим анеугеном є Ni (17,8). Далі, в порядку зниження анеугенної активності, тестовані метали розташовуються в такій послідовності: Cd (13,5) V Al (12,2) > Сu (8,5) > Pb ( 4,5) > Zn (3,3).

Антимікротрубочкова дія тестованих токсичних агентів. Як видно із результатів цитогенетичного аналізу турбагенна (анеугенна) дія є характернішою для більшості токсичних металів, ніж здатність спричиняти кластогенні аберації. Оскільки прийнято вважати, що анеугенні ефекти виникають унаслідок пошкодження мікротрубочок веретена поділу та фрагмопласту, наступним етапом нашої роботи було дослідження впливу солей Cd, Pb, Ni, Al, Cu та Zn (у концентраціях, що сприяли виникненню найінтенсивніших анеугенних порушень) на мікротрубочкові структури інтерфазних та мітотичних клітин кореневої меристеми.

Залежно від стадій клітинного циклу мікротрубочки можуть формувати чотири типи структур: інтерфазну сітку, препрофазну стрічку, мітотичне веретено та цитокінетичний апарат - фрагмопласт.

Експозиція проростків цибулі з CdCl2 у концентрації 50 мкM призводила до глибоких змін в організації мікротрубочкових структур у клітинах кореневої меристеми цибулі. Після обробки Cd2+ на препаратах із імуноміченим тубуліном не вдавалось виявити жодної типової для контролю мікротрубочкової структури. У таких клітинах спостерігались тільки численні короткі фрагменти мікротрубочок, локалізовані, в основному, на периферії клітини. Очевидно, іони цього металу здатні спричиняти жорстку розборку мікротрубочок, ініціюючи даний процес на незаякорених плюс-кінцях. Подібну, але слабше виражену, картину спостерігали на препаратах після обробки 50 мкМ Pb2+. У варіантах зі свинцем серед клітин із пошкодженими мікротрубочками траплялись клітини з майже нативною мікротрубочковою організацією.

Цілком інший тип пошкоджень мікротрубочок був виявлений у клітинах, експонованих з NiSO4. Обробка Ni2+ призводила до появи товстих зв'язок чи агрегатів мікротрубочок у перинуклеарній частині інтерфазних клітин з одночасною повною втратою мікротрубочок на клітинній периферії. У мітотичних клітинах на таких препаратах вдавалось ідентифікувати тільки уламки веретена поділу.

На відміну від вищеописаних сполук, Al(NO3)3 в концентрації 100 мкМ не пошкоджував жодну із мікротрубочкових структур, типових для контролю, однак індукував щільніше упаковування мікротрубочок в меристемних клітинах цибулі. Візуальний ефект алюмінію на мікротрубочки подібний до дії таксолу, однак механізми такого впливу, очевидно, відмінні.

В експериментах із сульфатами Cu та Zn в експонованих клітинах не виявлено жодних відмінностей в організації мікротрубочкових структур порівняно з контролем.

Таким чином, із шести досліджуваних іонів металів тільки Cd2+, Pb2+, Ni2+ та Al3+ здатні спричиняти помітні пошкодження мікротрубочкових утворень у меристемних клітинах, що, в свою чергу, може призводити до порушень мітозу і цитокінезу. Однак механізми антимікротрубочкової дії цих токсикантів відмінні, і, зокрема, вони можуть включати: а) різну спорідненість іонів металів до рослинного тубуліну; б) різні біохімічні механізми опосередкованого впливу на структуру мікротрубочок; в) додатковий вплив цих металів на інші цитоскелетні структури, що взаємодіють з мікротрубочками (наприклад, мікрофіламенти).

Тестування впливу кислотного залишку на токсичність важкого металу. Для з'ясування ефекту кислотного залишку на токсичну дію солей важких металів було вирішено порівняти цитогенетичну та антимікротрубочкову активність двох різних сполук (органічної та неорганічної) одного металу - ацетату та нітрату свинцю. Виявлені при цитогенетичному аналізі відмінності в частоті виникнення кластогенних та анеугенних пошкоджень були статистично недостовірними. Візуалізація мікротрубочкових структур в меристемі проростків, оброблених 50 мкМ Pb(CH3COO)2 та 50 мкМ Pb(NO3)2, також підтвердила думку, що токсичність солей металів зумовлюють катіони, а кислотні залишки сполук суттєво не впливають на специфіку дії іонів металів.

Порівняння ЕК50 та ГДК для важких металів та алюмінію. У Табл. 4 порівнюються ЕК50 металів, визначені в наших експериментах, та ЕК50 таких же металів, запропоновані з класичного Allium тесту, з офіційно визнаними ГДК цих металів у ґрунті. Як бачимо, модифікований нами Allium тест (заміна додаткових коренів дорослих цибулин на корінці проростків цибулі) є набагато чутливішим за класичний стандарт-метод екологічного моніторингу, він виявляє токсичними навіть ті концентрації металів, що є загальновизнано безпечними і допустимими у навколишньому середовищі. Особливо неадекватними, з точки зору результатів наших досліджень, є офіційно визнані гранично допустимі концентрації рухомих форм Ni, Cu та Zn в ґрунті. Зокрема нікель виявляє фітотоксичність вже за концентрацій у 8 раз нижчих від гранично допустимих, цинк за концентрацій, у 12,5 раз нижчих, а мідь є потенційно небезпечною в концентраціях, нижчих за гранично допустимі у 23 рази. Можливо, враховуючи такі дані, варто переглянути існуючі ГДК і внести до них відповідні зміни.

Таблиця 4 Гранично допустимі концентрації (ГДК)1 для важких металів та алюмінію та їхні ефективні токсичні концентрації (ЕК50), виявлені в Allium тесті

¹ - інформацію про ГДК використано із книги “Земельні ресурси України” [ред. Медведєв, Лактіонова, 1998];

І - ЕК50, визначені для металів у дослідах з додатковими коренями цибулин, використано з Wierzbicka, 1994 (для Pb); Fiskesjх, 1995 (для решти металів)

Висновки

У дисертаційній роботі проведено дослідження ризотоксичної, цитотоксичної, генотоксичної та антимікротрубочкової дії широкого діапазону концентрацій кадмію, свинцю, нікелю, алюмінію, міді та цинку в меристемних клітинах проростків цибулі.

1. Показано, що всі досліджувані метали дозозалежно інгібують кореневий ріст, однак найбільша ризотоксичність характерна для Cu. За ефективними токсичними концентраціями (ЕК50) метали розташовуються в такій послідовності: Cu > Cd > Ni > Pb > Al > Zn; а за концентраціями повного пригнічення росту коренів ряд металів дещо змінюється: Cu > Pb > Cd > Zn > Ni > Al.

2. Встановлено, що за зміною показників мітотичного індексу та співвідношення фаз мітозу найсильніший антимітотичний ефект мають Ni і Cd, а найслабший вплив на мітотичну активність клітин проявляє Al.

3. Виявлено високу кореляцію між ризотоксичністю кадмію, свинцю, нікелю, алюмінію, міді та цинку і їхньою цитотоксичністю для апікальної кореневої меристеми. Ряди токсичності металів за цими показниками співпадають.

4. Цитогенетична активність тестованих металів характеризується як кластогенною, так і анеугенною дією, причому здатність спричиняти порушення ходу мітозу й цитокінезу (анеугенні ефекти) є більш властивою для досліджуваних сполук, ніж індукція хромосомних аберацій.

5. За кількістю хромосомних пошкоджень, що виникають під впливом важких металів та алюмінію у кореневій меристемі, запропоновано такий ряд кластогенності тестованих металів: Zn > Pb ? Cd ? Cu ? Al ? Ni.

6. За здатністю індукувати анеугенні порушення в мітотичних та інтерфазних клітинах кореневої меристеми цибулі токсичні метали розташовуються в такій послідовності: Ni >> Cd > Al > Pb > Cu > Zn.

7. Вперше показано антимікротрубочкові ефекти нікелю, кадмію та свинцю у рослинних клітинах. Виявлено, що кадмій і свинець характеризуються подібним механізмом дії, спричиняючи руйнацію окремих мікротрубочок, тоді як нікель зумовлює агрегацію мікротрубочок у товсті нефункціональні пучки.

8. Виявлено стабілізуючий вплив іонів алюмінію на мікротрубочкові структури в клітинах цибулі.

9. На основі порівняння цитогенетичних та антимікротрубочкових ефектів ацетату й нітрату свинцю продемонстровано, що сполуки важких металів проявляють свою токсичність в основному через катіони, а кислотні залишки солей несуттєво впливають на специфіку пошкоджуючої дії іонів металів.

10. Виявлено, що ефективні токсичні концентрації Cu, Zn та Ni є нижчими за затверджені гранично допустимі концентрації цих металів у ґрунті відповідно у 23, 12,5 та 8 разів, що дає підстави для їх перегляду.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Довгалюк А.І., Калиняк Т.Б., Блюм Я.Б. Токсична дія іонів металів на ріст та мітотичну активність клітин коренів цибулі Allium cepa L. // Доповіді НАН України - 1998. - № 6. - С. 173-178.

2. Довгалюк А.И., Калиняк Т.Б., Блюм Я.Б. Оценка фито- и цитотоксической активности солей металлов с помощью корневой апикальной меристемы лука // Цитология и генетика - 2001. - № 1. - С. 3-9.

3. Довгалюк А.И., Калиняк Т.Б., Блюм Я.Б. Цитогенетические эффекты солей токсичных металлов в клетках апикальной меристемы корней проростков Allium cepa L. // Цитология и генетика - 2001. - № 2. - С. 3-10.

4. Довгалюк А.И., Калиняк Т.Б., Блюм Я.Б. Специфические эффекты ионов токсических металлов на микротрубочки меристематических клеток корней лука (Allium cepa L.) // Доповіді НАН України - 2002. - № 1. - С. 162-168.

5. Довгалюк А.І., Ляшенко Ю.О., Блюм Я.Б. Цитотоксична активність нітрату та ацетату свинцю та її зв'язок з порушеннями хромосомного апарату і мікротрубочкових утворень меристемних клітин цибулі (Allium cepa L.) // Доповіді НАН України - 2002. - № 8. - С. 149-154.

6. Dovgalyuk A.I., Kalynyak T.B., Blume Ya.B. Heavy metals have a different action from aluminium in disrupting microtubules in onion meristematic cells // Cell Biol. Intern. - 2003. - Vol. 27, № 3. - P. 193-195.

7. Dovgalyuk A., Trofimyak T., Blume Ya. Mitotic disturbances induced by toxic metal ions / ECBO 97 - European Congress for Molecular Cell Biology (Brighton, England, March 22-25, 1997) // ECBO 97 - 1997. - P. 24.

8. Dovgalyuk A., Trofimyak T., Blume Ya. Screening of the salts of cadmium, lead, nickel, aluminium, copper and zinc for the identification of their mutagenic activity / SEB Annual Meeting (Canterbury, England, April 7-11, 1997) // J. Exp. Bot. - 1997. - V. 48 (Suppl. 2). - P. C2.

9. Dovgalyuk A., Kalynyak T., Blume Ya. Chromosome and genome mutations caused by toxic metals / International Conference “Molecular Biology of Plants Under Environmental Stress” (Poznan', Poland, September 17-19, 1997) // Biological Bulletin of Poznaс. - 1997. - V. 34 (Supplement). - P. 41.

10. Kalynyak T.B., Dovgalyuk A, Blume Ya. Evaluation of heavy metal toxicity by the Allium test / SEB Annual Meeting (York, England, April 4-7, 1998)// J. Exp. Bot. - 1998. - V.49 (May, Suppl.). - P. 89.

11. Довгалюк А.И., Калиняк Т.Б., Блюм Я.Б. Иммунофлуоресцентный анализ влияния Ni, Cd и Al на микротрубочки клеток корня лука / Международная конференция “Цитоскелет и клеточная регуляция” (Пущино, Россия, 11-12 мая, 2000) // Тезисы докладов конференции - Москва: МАКС Пресс, 2000. - С. 14.

12. Dovgalyuk A., Kalynyak T., Blume Ya. Different effects of toxic metal ions on plant microtubules / 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology (Budapest, Hungary, August 21-26, 2000) // Plant Physiol. and Biochem. - 2000. - V. 38 (Suppl.). - P. 38.

13. Довгалюк А.І., Блюм Я.Б. Роль мікротрубочок рослинних клітин в реалізації антимітотичної активності іонів токсичних металів / VII Конференція молодих вчених “Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття” (Київ, 18-20 жовтня, 2000) // Збірник тез конференції - Київ: Україна-СВІТ, 2000. - С. 77.

14. Dovgalyuk A. Lead influences on the microtubule organization in Allium meristem cells /International Symposium “Plants under Environmental Stress” (October 23-28, 2001, Moscow, Russia) // Plants under Environmental Stress (Abstracts) - Moscow: Publishing House of Peoples' Friendship University of Russia, 2001. - P. 56-57.

15. Довгалюк А.І. Морфогенетичні ефекти іонів фітотоксичних металів у корінцях проростків цибулі / VIII Конференція молодих вчених “Сучасні напрямки в фізіології та генетиці рослин” (23-25 жовтня, 2002, Київ) // Збірник тез конференції - Київ, 2002. - C. 67.

16. Довгалюк А.І. Allium cepa L. як тест-об'єкт для індикації біологічного ризику важких металів // IV Міжнародна наукова конференція „Промислова ботаніка: стан та перспективи розвитку” (17-19 вересня, 2003, Донецьк) // Матеріали конференції. - Донецьк: ТОВ „Либідь”, 2003. - С. 61-63.

Анотації

Довгалюк А.І. Порівняння цитогенетичної та антимікротрубочкової активності фітотоксичних металів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, клітинна біологія та гістологія. - Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2004.

Дисертацію присвячено порівняльному вивченню впливу іонів Cd2+, Pb2+, Ni2+, Al3+, Cu2+ та Zn2+ на мітотичну активність, цитогенетичні параметри та мікротрубочкові утворення меристемних клітин проростків цибулі. Виявлено високу кореляцію між ризотоксичністю та цитотоксичністю тестованих полютантів, на основі чого запропоновано два ряди токсичності металів: Cu > Cd > Ni > Pb > Al > Zn - за ефективними інгібуючими концентраціями; та Cu > Pb > Cd > Zn > Ni > Al - за сублетальними і летальними концентраціями. За результатами цитогенетичного аналізу показано, що для більшості тестованих металів властивішою є індукція турбагенних аномалій, пов'язаних з порушенням проходження мітозу та цитокінезу, ніж спричинення кластогенних пошкоджень (хромосомних аберацій) в клітинах кореневого апексу. На підставі аналізу частоти виникнення турбагенних ефектів (відставання хромосом, К-мітозів, мультиполярних мітозів, реститутивних та двоядерних клітин) висловлено припущення, що мікротрубочки рослинних клітин можуть бути важливою мішенню для іонів токсичних металів, яке було перевірено шляхом візуалізації мікротрубочок в апікальній меристемі коренів цибулі за допомогою імунофлюоресцентної мікроскопії. Виявлено, що Сd2+ і Pb2+ зумовлюють руйнування мікротрубочкових структур, Nі2+ сприяє зшиванню пучків мікротрубочок у великі розгалужені агрегати, що не можуть повноцінно функціонувати через втрату динамічної нестабільності. В той же час Al3+ стабілізує, а Cu2+ i Zn2+ не проявляють пошкоджуючої дії на мікротрубочки меристемних клітин цибулі. Проаналізована роль мікротрубочок в опосередкуванні дії токсичних металів на рослинну клітину.

Ключові слова: токсичні метали, хромосомні аберації, мітоз, цитокінез, мікротрубочки, Allium cepa.

Довгалюк А.И. Сравнение цитогенетической и антимикротрубочко-вой активности фитотоксичных металлов. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 - цитология, клеточная биология и гистология. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2004.

Диссертация посвящена сравнительному изучению влияния ионов Cd2+, Pb2+, Ni2+, Al3+, Cu2+ и Zn2+ на рост корней проростков лука (Allium cepa), а также на митотическую активность, цитогенетические параметры и микротрубочковые образования клеток корневой апикальной меристемы.

Показано, что ионы тестированных металлов не только дозозависимо ингибируют рост, но и индуцируют морфогенетические изменения корневых апексов в виде свеллинга и крючковидных изгибов, которые были наиболее характерны для Pb2+ и Al3+. Цитологический анализ апикальной меристемы корней после 24-часовой обработки солями металлов выявил митостатическую активность ионов Cd2+, Ni2+, Cu2+ и Zn2+. Причем Cd2+, Cu2+ и Zn2+ было свойственно блокировать митоз в профазе, тогда как для Ni2+ более характерным оказался метафазный блок. С повышением концентрации тестируемые вещества способствовали появлению на препаратах множества различных цитогенетических дефектов, среди которых слипание хромосом и пикноз ядерного материала однозначно указывали на летальные дозы исследуемых агентов. Сопоставлением результатов морфометрического анализа роста корней и цитологического анализа меристемы корневого апекса после экспозиции с металлами, выявлена высокая корреляция между ризотоксичностью и цитотоксичностью этих поллютантов. На основании этого предложено два ряда токсичности металлов: Cu > Cd > Ni > Pb > Al > Zn - по эффективным ингибирующим концентрациям (ЭК50); и Cu > Pb > Cd > Zn > Ni > Al - по сублетальным и летальным концентрациям.

Анализ цитогенетических повреждений, индуцированных токсичными металлами, показал, что аномалии, связанные с нарушением прохождения митоза и цитокинеза (турбагенный или анеугенный эффект) более характерны для тестированных агентов, чем повреждения структуры хромосом (кластогенное действие). По способности вызывать хромосомные аберрации металлы располагались в такой последовательности: Zn (в 13,6±3.1 раза увеличивал процент аберраций по сравнению с контролем) > Pb (5,7±1,8) ? Cd (4,8±1,7) ? Cu (4,3±1,4) ? Al (4,0±1,3) ? Ni (3,6±1,1). По возрастанию количества турбагенных нарушений в митотических клетках (отставание хромосом, К-митозы, многополюсные митозы) делали вывод об анеугенной активности металлов. Самым сильным анеугеном оказался Ni, который в 70 раз увеличивал процент нарушений митоза по сравнению с контролем. Далее, в порядке снижения анеугенной активности, металлы располагались в следующей последованности: Cd (32,3±6,2) >> Al (8,3±2,6) ? Pb (8,0±1,8) > Cu (4,4±1,2) ? Zn (3,3±0,9). По способности индуцировать турбагенные повреждения в интерфазных клетках (лопастевидные ядра, двуядерность или многоядерность) исследованные токсиканты расположены в таком ряду токсичности: Ni (17,8±1,6) > Cd (13,5±1,1) ? Al (12,2±1,1) > Cu (7.5±0.9) > Pb (4,5±0,5) > Zn (3,3±0,6).

Принимая во внимание морфогенетическое действие ионов металлов, а также их преимущественное турбагенное (анеугенное) повреждение клеток, сделано предположение, что цитоскелетные структуры, в частности, микротрубочки, могут быть важной мишенью для ионов токсичных металлов. Путем визуализации микротрубочек в апикальной меристеме корней лука с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии показано, что Сd2+ и Pb2+ вызывают разрушение микротрубочковых структур, Nі2+ способствует сшиванию пучков микротрубочек в большие разветвленные агрегаты, которые не могут полноценно функционировать вследствие утраты динамической нестабильности. В то же время Al3+ индуцирует стабилизацию микротрубочек, а Cu2+ и Zn2+ вообще не оказывают повреждающего действия на микротрубочковые образования в меристематических клетках лука. Проанализирована роль микротрубочек в опосредовании действия токсичных металлов на растительную клетку.