Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний аграрний університет

УДК 631.151.6:631.145:658

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Спеціальність 06.01.11 - Фітопатологія

Біологічне обґрунтування використання бактерій роду Bacillus для захисту суниці від сірої гнилі та плодів яблуні при зберіганні

Лапа Світлана Володимирівна

Київ - 2004

Дисертація є рукописом

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету міністрів України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, академік УААН, заслужений діяч науки і техніки України Кирик Микола Миколайович, Національний аграрний університет, завідувач кафедри фітопатології. гниль бацила спора фітопатогенність

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Слюсаренко Олександр Миколайович, Одеський національний університет ім.. І.І. Мечнікова, професор кафедри ботаніки кандидат біологічних наук, доцент Дереча Олексій Артемович, Державний агроекологічний університет, завідувач кафедри рослинництва.

Провідна установа: Харківський національний аграрний університет ім. В.В. Докучаєва Міністерства аграрної політики України, кафедра фітопатології, м. Харків

Захист відбудеться «28» січня 2005 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 в Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус 3, аудиторія 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус 4, к. 41

Автореферат розісланий «22» грудня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Мороз М.С.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Важливу роль у збільшенні виробництва плодів і ягід відіграють заходи щодо зменшення втрат від різних хвороб і шкідників, які нині становлять значну величину. Як показує світовий досвід, сучасні спеціалізація і концентрація сільськогосподарського виробництва неминуче призводять до посилення розвитку хвороб та зростання чисельності шкідників сільськогосподарських культур.

У даний час у зв'язку з посиленим екологічним контролем з приводу застосування засобів захисту рослин значна увага приділяється пошуку бактеріальних штамів, які продукують біологічно активні речовини, мають фунгіцидні властивості і находять практичне застосування. Серед потенційних штамів особливе місце займають бацили, на основі яких створюються біопестициди, які захищають сільськогосподарські рослини від захворювань і шкідників (Міненков І.Б., 2002).

Для збільшення обсягу виробництва ягід на сучасному етапі інтенсифікації садівництва важливе значення має створення високопродуктивних насаджень ягідних культур. Важливе місце серед них належить суниці, яка в Україні є найбільш поширеною і цінною культурою. Значну загрозу для вирощування суниці становить сіра гниль, яка при певних погодних умовах може знищити до 70% урожаю. Крім того, збудник цього захворювання (Botrytis cinerea Pers.) призводить до значних втрат сільськогосподарської продукції при зберіганні (Кадимова З.І., 1997; Менлікієв М.Я.,1995). Хімічні засоби захисту недостатньо захищають урожай від цього фітопатогена, тому виникла необхідність пошуку біологічних препаратів, створених на основі живих мікробних культур аеробних спороутворюючих бактерій роду Bacillus, які б надійно захищали рослини від хвороб та зберігали зібраний урожай у сховищах від гниття (Недорезков В.Д.,1998).

Теоретичним обгрунтуванням використання бактерій роду Bacillus для захисту рослин від хвороб є поєднання в них таких якостей, як активна вибіркова дія на фітопатогенні мікроорганізми, висока біосинтетична активність (у т.ч. ферментативна), безпечність для макроорганізмів і аутомікрофлори, висока стійкість проти несприятливих умов зовнішнього середовища. За сукупністю фізіологічних властивостей і факторів біологічної активності найбільш перспективними для створення препаратів для захисту рослин є бацили (Смирнов В.В.,1995), які належать до виду Bacillus subtilis, для котрих характерним є:

- розповсюдження бактерій роду Bacillus у навколишньому середовищі і відсутність несприятливих реакцій при проникненні в організм людини і тварин;

- нефітотоксичність і присутність їх у грунті як представників нормобіоценозу;

- еволюційно симбіотичні взаємовідносини бацил з рослиною;

- висока антагоністична активність стосовно патогенних мікроорганізмів.

Основною метою нашої роботи є: дослідження біологічних властивостей бактерій роду Bacillus, як перспективних агентів захисту суниці від сірої гнилі та інших фітопатогенів; використання штаму бактерії Bacillus subtilis 2/10 для cтворення препарату проти сірої гнилі суниці та плодів яблуні при зберіганні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Робота виконана згідно з планами науково-дослідних робіт відділу антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за темами: «Еколого-таксономічне дослідження бактерій та вищих рослин як ресурсів біотехнології» - (державний реєстраційний номер 0100U004324); «Дослідження генетичних особливостей бацил та деяких грамнегативних бактерій як потенційних пробіотиків та продуцентів антибіотичних речовин» - (державний реєстраційний номер 195U008825), «Підтримка та розвиток Української Колекції Мікроорганізмів» - (державний реєстраційний номер 0101U004321).

Мета і задачі дослідження. Основна мета наших досліджень полягала в з'ясуванні біологічних властивостей бактерій роду Bacillus та обґрунтуванні їх використання для захисту суниці від сірої гнилі та захисту плодів яблуні при зберіганні.

Згідно з наявною метою необхідним було вирішити такі завдання:

- визначити біоекологічні особливості розвитку сірої гнилі та з'ясувати її шкодочинність;

- вивчити стійкість сортів суниці проти сірої гнилі;

- ізолювати з грунту аеробні спороутворюючі бактерії роду Bacillus та створити робочу колекцію цих мікроорганізмів;

- ідентифікувати досліджувані штами бактерій роду Bacillus та відібрати штами, які найбільш активні до сірої гнилі та інших фітопатогенів;

- вивчити морфолого-культуральні, фізіолого-біохімічні та генетичні властивості штаму Bacillus subtilis 2/10;

- визначити активність ізольованих бацил-антагоністів щодо фітопатогенних грибів;

- дослідити патогенні властивості штаму Bacillus subtilis 2/10;

- отримати дослідні серії біопрепарату на основі штаму Bacillus subtilis 2/10 проти сірої гнилі суниці та перевірити його біологічну активність;

- вивчити вплив біопрепарату на мікрофлору грунту та самоочищення його від умовно-патогенних мікроорганізмів;

- визначити біологічну ефективність фунгіцидів у зниженні розвитку сірої гнилі.

Об`єкт дослідження. Збудник сірої гнилі суниці, фітопатогенні гриби та бактерії, тест-культури, штами мікроорганізмів роду Bacillus.

Предмет дослідження. Екологічні та біологічні особливості збудника сірої гнилі суниці Botrytis cinerea Pers., ураження сортів та фактори, що впливають на розвиток хвороби, заходи з обмеження її шкодочинності.

Морфологічні, фізіологічні, молекулярно-генетичні властивості штамів роду Bacillus, встановлення на основі їх дослідження видового складу бацил, вивчення антагоністичної дії щодо тест-культур, патогенних та фітопатогенних властивостей.

Методи дослідження. Мікологічний - для вилучення збудника сірої гнилі та інших мікроорганізмів, вивчення впливу екологічних факторів на життєві стадії B.cinerea. Фітопатологічний - для дослідження динаміки розвитку захворювання залежно від екологічних умов, з»ясування стійкості сортів та визначення біологічної ефективності засобів захисту. Методи таксономічного аналізу, які включають мікробіологічні, фізіолого-біохімічні, генетичні, а також методи вивчення антибіотичної активності бактерій. Математично-статистичний - для оцінки достовірності отриманих результатів та встановлення кореляційних зв'язків.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в Україні ізольовано з грунту штам-антагоніст, який у результаті ідентифікації та за основними морфолого-культуральними властивостями віднесено до виду Bacillus subtilis. Вивчено його біологічні властивості. Генотипова ідентифікація штаму Bacillus subtilis 2/10 показала його відмінність від інших представників роду Bacillus за своїм генотипом, який містить 650 пар нуклеотидів і може бути використаний як його генетичний маркер.

На основі антагоністичних особливостей цього штаму обгрунтовано доцільність його використання для біологічного захисту суниці від сірої гнилі.

У лабораторних умовах створено експериментальні зразки біопрепарату (основний діючий чинник - штам Bacillus subtilis 2/10), який позитивно впливає на мікробіоценоз грунту та сприяє самоочищенню його від умовно-патогенних видів мікроорганізмів - сальмонел (S.typhimurium), кишкової палички (E.coli), шигел (S.sonnei).

Ізольовано, ідентифіковано та застосовано штам-антагоніст Bacillus subtilis 63z для створення препарату проти збудників гнилей яблук при зберіганні.

Застосування суспензії бацил-антагоністів штамів Bacillus subtilis 2/10 та 63z (5,0х10⁹ КУО/мл та 10х10⁹ КУО/мл) проти збудників плодових гнилей - Rhizopus nigricans (Ehrenb.), Monilia fructigena (Schroet.) Honey, Penicillium claviforme (Bain), Penicillium expansum (Link.) сприяло затримуванню швидкості їх розвитку під час зберігання плодів яблуні.

Серед досліджених сортів суниці найбільш стійкими до сірої гнилі виявились сорти Талісман і Покахонтас (уражуваність ягід 5%), а найменше - сорт Ясна (28%).

У польових умовах біологічна ефективність біопрепарату (суспензія - 5х10⁹КУО/мл) на сортах Зенга-Зенгана, Коралова 100 і Ясна становила відповідно 71,9%, 70 і 33,3%.

Практичне значення отриманих результатів. Створено лабораторні серії біопрепарату на основі штаму бактерії Bacillus subtilis 2/10 для захисту суниці від сірої гнилі. Вивчено їх біологічну ефективність в умовах Дослідного поля Інституту садівництва УААН.

Отримано авторські свідоцтва та патенти на винаходи "Штам бактерій Bacillus subtilis для отримання препарату проти збудника сірої гнилі суниці" та "Штам бактерій Bacillus subtilis для отримання препарату проти збудників гнилі яблук та винограду при зберіганні".

Результати досліджень можуть бути використані для реєстрації препарату на основі штаму Bacillus subtilis 2/10 в Управлінні безпеки хімічних речовин Міністерства екології та природних ресурсів України.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені на республіканській науково-практичній конференції, присвяченій 60-річчю Українського науково-дослідного Інституту садівництва «Проблемы современного садоводства» (Київ, 1989), науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів» (Чабани, 1991), 11 республіканській конференції молодих вчених та спеціалістів «Перспективы отечественного садоводства» (Київ, 1991), науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів «Наукові розробки та досягнення молодих учених сільськогосподарському виробництву» (В. Бакта,1991), конференції молодих вчених та спеціалістів «Сільське господарство України - проблеми, сучасне, майбутнє» (Чабани, 1993), Міжнародній науково-практичній конференції «Пробіотики ХХ1 століття. Біологія. Медицина. Практика» (м. Тернопіль, 2004 р.), засіданні Комісії з питань гігієнічного регламентування Міністерства охорони здоров'я України (м.Київ, 2004 р.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 15 наукових праць, з них: одна монографія, 2 статті - у наукових журналах, 2 авторські свідоцтва та патенти, 10 - у тезах наукових конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 154 сторінках машинописного тексту і складається з 6 розділів та висновків. Список використаних джерел включає 267 посилань (з яких 117 - іноземних авторів). Робота містить 37 таблиць та 11 рисунків.

Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність теми дослідження, проаналізовано стан проблеми, визначено мету роботи на основі завдань досліджень, вирішення яких дало змогу досягти поставленої мети, наведено характеристику об'єкта та предмета дослідження, зазначено перелік використаних у роботі методів, сформульовано концептуальні положення новизни, показано теоретичне і, практичне значення отриманих результатів, надано відомості про апробацію результатів досліджень, структуру та обсяг роботи.

Огляд літератури

Висвітлено народногосподарське значення і технологію вирощування суниці. Розглядається питання про біоекологічні властивості збудника сірої гнилі (Botrytis cinerea Pers.) та заходи захисту суниці від цієї хвороби.

На основі аналізу літературних джерел показано актуальність теми дисертаційної роботи та визначено доцільність проведення досліджень, спрямованих на обґрунтування створення біологічного препарату на основі живих мікробних культур роду Bacillus для захисту суниці від сірої гнилі.

Матеріали, методи та умови проведення досліджень

Основними об'єктами досліджень був збудник сірої гнилі суниці, ізольований з хворих рослин та ягід; бактерії роду Bacillus; фітопатогенні гриби та бактерії, а також тест-культури, що зберігаються в Колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України ім. Д.К. Заболотного.

Мікробіологічні аналізи зразків грунту, рослин суниці, а також дослідження бактерій роду Bacillus проводились у відділі антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного Національної Академії Наук України та на кафедрі фітопатології Національного аграрного університету.

Вегетаційні та польові досліди здійснювались на дослідному полі Інституту садівництва Української академії аграрних наук сумісно з співробітниками відділу захисту рослин Інституту садівництва УААН .

У спостереженнях за розвитком збудника хвороби при визначенні його морфологічних ознак та чутливості до екологічних умов використовували методи мікроскопічних досліджень, наведених у роботах М.К.Хохрякова (1984), та «Методах експериментальної мікробіології» (Білай, 1982).

Стійкість сортів проти хвороби вивчали в умовах природного і штучного інфекційних фонів. Обліки ураження ягід проводили за п'ятибальною шкалою, наведеною у «Визначнику хвороб рослин» (Хохряков, 1984).

Хімічний аналіз ягід суниці з ділянок, оброблених фунгіцидами, та не оброблених (контроль) проводили в Інституті екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя (ЕКОГІНТОКС) ДП МОЗ України. Вміст цукру визначали за В.Л.Вознесенським (1984), вміст аскорбінової кислоти - за Муррі (1981).

В усіх польових дослідах обліки та оцінку уражених і неуражених ягід з'ясовували в усі строки збору врожаю. Уражені та неуражені ягоди після кожного збору зважували. Біологічну ефективність захисних заходів оцінювали за методикою І.Я.Полякова та ін. (1984) зіставленням ураженості рослин на оброблених ділянках і на контрольній. Дані обліків ураження ягід і врожайності на всіх варіантах досліду були оброблені методом дисперсійного аналізу (Доспехов,1985).

Бактеріологічний склад ґрунту визначали за методикою, наведеною в роботі Бюргер (1973).

Ідентифікацію виділених бактерій роду Bacillus проводили на основі культурально-морфологічних та фізіолого-біохімічних тестів, викладених у визначнику Бергі (1980) а також за методами, які були розроблені в Інституті мікробіології і вірусології НАН України та викладені в «Методичних рекомендаціях з виділення та ідентифікації бактерій роду Bacillus…» (1983).

Генетичне типування культур бацил-антагоністів визначали за методом RAPD, який описано в роботі I.B.Sorokulova та ін. (2003).

Чутливість до антибіотиків вивчали методом дифузії в агар з використанням стандартних індикаторних дисків (Єгоров, 1986).

Антагоністичну активність бацил досліджували методом відстроченого антагонізму по відношенню до широкого спектру фітопатогенних грибів і бактерій (Єгоров,1986).

Визначення фітопатогенності штамів аеробних спороутворюючих бацил та їх активність щодо фітопатогених мікроорганізмів досліджували згідно з методиками, викладеними у роботі А.А. Кудряшової (1986).

Токсигенні, токсичні та вірулентні властивості бактерій роду Bacillus досліджували за М.О.Біргер (1982). Результати дослідів співставляли з "Методическими указаниями по гигиенической оценке микробных средств защиты растений от насекомых и болезней..." МОЗ СРСР (1982).

Дослідні зразки біопрепарату на основі штаму Bacillus subtilis 2/10 виготовляли в лабораторних умовах Інституту мікробіології та вірусології НАН України.

Вплив біопрепарату на мікрофлору грунту досліджували згідно з загальноприйнятими в ґрунтовій мікробіології методиками (Біргер,1983).

Оздоровлення мікробіоценозу грунту за допомогою штаму Bacillus subtilis 2/10 досліджували за методом, описаним у «Справочнику по микробиологическим и вирусологическим методам исследования» (1973).

Ефективність біологічного препарату на основі штаму Bacillus subtilis 2/10 та деяких фунгіцидів у польових умовах вивчали шляхом обприскування рослин суниці на початку та в кінці цвітіння (двічі) згідно з методикою наведеною у «Визначнику хвороб рослин...» (Хохряков,1984).

Статистичну обробку експериментальних даних здійснювали згідно з методиками, викладеними в книзі І.Б. Доспєхова (1987), І.П. Ашмаріна (1962) та комп'ютері в програмах Exel.

Біоекологічні особливості Botrytis cinerea Pers.

Проведений нами аналіз рослинних рештків суниці показав, що зимуюча інфекція гриба Botrytis cinerea Pers. зберігається у вигляді склероціїв на поверхні та в середині уражених рослинних залишків. Проростаючи навесні, останні утворюють міцелій і конідіальне спороношення, тобто вони є первинною інфекцією.

Розмножується гриб конідіями, які розповсюджуються за допомогою вітру, води (під час дощу). Конідієносці деревовидно розгалужені, конідії одноклітинні, овальні, зібрані на кінцях конідієносців у коремії. Наші спостереження з цих питань узгоджуються з численними даними, одержаними іншими авторами (Мещерякова,1968; Гришанович,1971; Прієдіте,1974).

Суттєвої різниці між розмірами конідій - безстатевих спор, узятих із суниці різних сортів, не виявлено.

Результати наших досліджень свідчать про те, що наявність збудника сірої гнилі у відмерлих пелюстках та тичинках у вигляді склероціїв може спричинити ураження ще до цвітіння суниці. Квітконоси в період формування можуть нести в собі приховану інфекцію, яка може проявитися в сприятливих для розвитку хвороби умовах.

Для того, щоб виявити в яких частинах квітів знаходиться інфекція, нами були проведені спеціальні досліди. При цьому встановлено, що кількість інфікованих пелюсток становила 100%, тичинок - 70%, а в чашолистиках та бутонах, які не розкрилися, інфекція в таких же умовах була відсутня.

З метою перевірки природних шляхів зараження суниці сірою гниллю нами були проведені експерименти з штучним інфікуванням збудником гнилі Botrytis cinerea Pers. При цьому було досліджено, що процесу зараження сприяє наявність на ягодах суниці інфікованих часток квіток (пелюстки, тичинки), які згодом розкладаються. Вони є джерелом поживних речовин для розвитку гриба Botrytis cinerea. Встановлено, що більш сприйнятливими до зараження були стиглі ягоди, ураження яких на другу добу після інфікування становить 75-100%, бурих ягід - 60-80 %; зелені ягоди не уражувались.

Для того, щоб з'ясувати терміни ураження ягід суниці сірою гниллю проводились фенологічні спостереження за її розвитком. Так, ріст рослин сорту Коралова 100 за даними трирічних спостережень починається на початку квітня (3-6 квітня), висування бутонів припадає на першу декаду травня (до 10 травня), цвітіння - в середині травня (20 травня), а кінець масового цвітіння - в кінці травня (30 травня). Ягоди починають визрівати наприкінці першої декади червня (10 червня), а кінець визрівання відбувається через три тижні (2-3 липня). Збирання ягід закінчується 5-10 липня.

Як відомо, більш сприйнятливими до сірої гнилі є сорти суниці з розвинутим листям. У них квітконоси знаходяться під листками, що затримує визрівання ягід, створює сприятливий мікроклімат для збудника хвороби і в той же час рослини не рівномірно покриваються фунгіцидами під час обприскування. Досліди були проведені на сприйнятливих до сірої гнилі сортах - Ясна, Коралова 100 та Зенга-Зенгана.

Результати досліджень динаміки розвитку хвороби на сортах Ясна, Зенга-Зенгана і Коралова 100 за 1998-2000 рр. свідчать про те, що під час цвітіння суниці ураження її сірою гниллю практично відсутнє. Кількість хворих ягід досліджуваних сортів збільшується з початку їх визрівання, а максимальне ураження спостерігається в усіх сортів під час визрівання ягід (рис.1).

На місці ураження сірою гниллю на ягодах суниці спочатку з'являється малопомітна пляма, яка згодом розповсюджується на всю її поверхню. Такі ягоди через декілька днів повністю покриваються міцелієм гриба і стають непридатними для споживання. При сприятливих умовах для розвитку хвороби - опади, підвищена вологість, оптимальна температура - ураження відбувається досить інтенсивно і призводить до значних втрат урожаю.

Сіра гниль в умовах Лісостепу України широко поширена і залежно від кліматичних умов із року в рік завдає великої шкоди. За роки проведення досліджень (1998-2000) під час визрівання ягід була волога погода, кількість опадів у травні і червні кожного року становила - відповідно 115,5 мм; 143,6 і 195 мм. Відносна вологість повітря за період від появи до масового розвитку хвороби в ці роки була в межах 62-79%. Як показали наші спостереження, в роки середнього розвитку хвороби гідротермічний коефіцієнт (ГТК) за період від появи до масового розвитку хвороби в середньому дорівнює 1,6-2,3, у роки сильного розвитку - два і вище.

Отже, ГТК у травні і червні разом, а також у червні окремо можна використовувати як основний показник, який характеризує розвиток сірої гнилі за періоди від появи хвороби до її масового поширення.

Відомо, що останнім часом стійкі сорти набувають все більшого значення в комплексних програмах захисту рослин. Випробування таких сортів не тільки впливає на поліпшення фітосанітарного стану насаджень, але й сприяє у деяких випадках, активізації корисної діяльності ентомофагів і дає можливість диференційовано підійти до вибору пестицидів.

При вирощуванні стійких сортів зменшується потреба в пестицидах, значно змінюються процеси транслокації хімічних засобів, що нанесені на рослини. У ряді випадків це дозволяє зменшити кількість обробок і норми витрат препаратів.

Ураженість різних сортів суниці сірою гниллю ми вивчали у лабораторних та польових умовах. Було встановлено, що всі сорти суниці в тій чи іншій мірі уражуються збудником сірої гнилі, але найменше - сорти Десна (7%), Талісман (5%), Покахонтас (5%).

Біологічні властивості штаму бактерій Bacillus subtilis 2/10

Основна мета наших досліджень полягала у вивченні біологічних властивостей бактерій роду Bacillus, як перспективних агентів захисту суниці від сірої гнилі та використання штаму Bacillus subtilis 2/10 для одержання препарату проти збудника цієї хвороби.

У процесі попереднього виділення штамів-антагоністів виявилось, що бактерії виділяються в полікультурі. Для ідентифікування та дослідження їх морфологічних і фізіолого-біохімічних властивостей одержані ізоляти розділили на монокультури. Для контролю тестували колекційні штами бацил з відомою видовою приналежністю.

Головні висновки біохімічного тестування збігаються з даними, відомими з літератури (Бергі, 1980; Смирнов, 1983). Значна диференційна навантаженість припадає на такі ознаки, як здатність до анаеробного росту, роздування спорангію під час спороутворення, продукція каталази, реакція Фогес-Проскауера, редукція нітратів і гідроліз крохмалю. Деякі тести можна відокремити як специфічні ознаки окремих видів. Наприклад, утворення газу під час росту на середовищі з глюкозою є характерною ознакою для B.polymyxa і B.macerans; утворення глобул полі--оксимасляної кислоти у цитоплазмі - для B.cereus і B.megaterium; лецитіназна активність - для B.cereus; утворення газу в анаеробних умовах під час росту на середовищі з нітратами і продукція аргініндигідрогенази - для B.licheniformis; утворення термінальних сферичних спор з роздуванням спорангію - для B.sphaericus.

Проте існує певна внутрішньовидова варіабельність між штамами, що поряд з ймовірністю отримання помилкових результатів тестування може призвести до помилки ідентифікації, якщо визначення видів буде засновано лише на цих провідних ознаках. Зброджування вуглеводів та утилізація органічних кислот є надто варіабельними ознаками, тому можуть застосовуватись лише як допоміжні.

У результаті проведеної ідентифікації бацил усі вони віднесені до роду Bacillus, а в процесі подальшого тестування - до видів: B.subtilis - 59%, B.licheniformis - 11%, B.pumilus - 5%, B.cereus - 8%, B.mycoides - 2%; B.thuringiensis - 1%; B. megaterium - 8%; B. polymyxa - 3%; B.macerans, B.alvei, B.badius, B.circulans - 1% .

Антагоністичним властивостям бактерій роду Bacillus приділяється значна увага дослідників, які займаються проблемою біологічного захисту рослин від шкідників та хвороб. З метою виявлення найбільш активних штамів серед виділених бактерій роду Bacillus нами в якості тест-культур використовували збудника сірої гнилі суниці - Botrytis cinerea (Рers.), а також ряд фітопатогенних грибів - Rhizopus nigricans (Ehrenb.), Monilia fructigena (Schroet.) Honey, Penicillium claviforme (Bain), Penicillium expansum (Link.).

Аналіз первинного скринінгу 110 штамів відібраних нами бацил по відношенню до згаданих вище фітопатогенів показав, що не всі бацили мають виражені інгібуючі властивості щодо до випробуваних нами тест-культур. Серед штамів досліджуваних бацил антагоністична активність проявилась наступним чином: найбільше антагоністів було виявлено до Penicillium expansum (28%) та Penicillium claviforme (27%), до Botrytis cinerea (20%), менше всього до Rhizopus nigricans (19%) та Monilia fructigena (19%).

У результаті цих досліджень був відібраний активний штам Bacillus subtilis 2/10, який проявляв антагоністичні властивості не тільки до збудника сірої гнилі суниці, а й до широкого спектру фітопатогенних грибів і бактерій (табл.3).

Морфолого-культуральні властивості штаму Васіllus subtilis 2/10

Відібраному нами за антагоністичними властивостями високоактивному штаму Васіllus subtilis 2/10 притаманні такі морфолого-культуральні ознаки: культура спороносна, аеробна, грампозитивна. В мазках із колоній, що виросли на м'ясо-пептонному агарі при температурі 37^оС через 18год. можна побачити прямі паличковидні клітини 1,9-2,1х0,3-0,4 мкм, які розташовані поодинці, рідше ланцюгом. Клітина при спороутворенні не роздувається, після росту на глюкозному агарі в протоплазмі глобули не помітні. Після росту на МПБ культура утворює плівку.

Через 48 годин росту при температурі 37^оС на середовищі Громико і сусло-агарі культура має вигляд шорсткуватих плоских тьмяних колоній з різаним краєм, діаметром 5-8 мм, світло-сірого або тілесного кольору, пастоподібної консистенції, добре знімається петлею з поверхні агару.

Мінімальна температура росту Bacillus subtilis 2/10 від 5^оС до 20^оС; максимальна - від 45^оС до 55^оС; оптимальна - від 28^оС до 37^оС. pH середовища для росту: мінімальна - 4, максимальна - 8, оптимальна - 6-7. Як органічне джерело азоту штам Bacillus subtilis 2/10 може використовувати такі органічні сполуки: пептон, гідролізат казеїну, дріжджовий автолізат; неорганічні сполуки - амонійні солі (NH₄NO_3; (NH₄)₂SO₄), нітрати (KNO₃; NaNo₃).

Характерною ознакою штаму Bacillus subtilis 2/10 є вибіркова дія на збудника сірої гнилі - Botrytis cinerea Pers.

До фізіолого-біохімічних властивостей штаму Bacillus subtilis 2/10 слід віднести те, що він ферментує глюкозу, арабінозу, манніт, ксилозу з утворенням кислоти без газу. Дає позитивну реакцію Фогес-Проскауера, гідролізує крохмаль і желатин, росте при 7% NaCl, утилізує цитрат, пропіонат не використовує.

Зберігається культура на середовищі Громико, середовищі Гаузе N2 (стрептоміцетний агар), або картопляному агарі протягом 2-3 місяців при кімнатній температурі та під шаром стерильного вазелінового масла на вказаних вище середовищах не менше 1-2 років.

В ліофільно висушеному стані культура зберігається до 3 років і більше, для цього штам В.subtilis 2/10 вирощують на середовищі Громико, середовищі Гаузе N2 або сусло-агарі протягом 5-7 діб при Т 37^оС. З агаризованого середовища біомасу змивають фізіологічним розчином. Як захисне середовище використовують сахарозо-желатиновий наповнювач (4:1). Температура заморожування не вище мінус 25^оС, режим висушування - від мінус 25^оС до 32^оС протягом 32 год.

Після зберігання під мінеральним маслом або в ліофілізованому стані культура утворює однотипні колонії: на МПА-складчасті, в'язкої консистенції, тілесного кольору, краї колонії порізані.

Визначення антибіотикочутливості проводили з метою виявлення додаткових характерних ознак штаму B.subtilis 2/10. У результаті досліджень було встановлено, що відібраний нами штам проявляє різну чутливість до широкого спектру різноманітних груп антибіотиків. Ця чутливість може бути характерною при ідентифікації цього штаму серед інших представників роду Bacillus.

Для захисту рослин від хвороби за допомогою біопрепарату, який включає штам Bacillus subtilis 2/10, необхідно мати можливість ідентифікувати його серед інших споріднених культур. Генетичне типування за допомогою методу RAPD дає можливість виявити цей штам серед інших штамів бацил, які ізольовані з грунту, рослин, плодів та інших екологічних ніш. Нами було проведено генетичне типування культури Bacillus subtilis 2/10, а також відібраних з Української колекції мікроорганізмів високоактивних культур бацил-антагоністів (61D,26D та ін.) для порівняння за методом RAPD, який описано в роботі I.B.Sorokulova (2002).

Встановлено, що отриманий штам має не тільки виражену біологічну активність, але і відрізняється від споріднених культур за своїм генотипом, який містить 650 пар нуклеотидів і може бути використаний як генетичний маркер цього штаму.

Як відомо, мікроорганізми, які застосовуються як агенти біологічного захисту рослин, не повинні бути фітопатогенними. Дослідження з приводу цієї ознаки відібраного нами штаму B.subtilis 2/10 проводились у лабораторних умовах. Для порівняння застосували не фітопатогенний штам B.subtilis 63 z.

Установлено, що відібраний штам-антагоніст B.subtilis 2/10 не фітопатогенний, про що свідчить відсутність гнилі на плодах. Суспензія вегетативних клітин та спор штаму захищає плоди від ураження сірою гниллю, в той час як у контролі уже на 2-й день інтенсивно розвивалась гниль і на 8-й день плоди були повністю уражені хворобою.

З метою розширення застосування активних антагоністів бацил ми провели серію дослідів щодо антагоністичного впливу Bacillus subtilis 2/10 та Bacillus subtilis 63z (еталон) на фітопатогенні гриби - Penicillium expansum, Penicillium claviforme, Rhizopus nigricans, Monilia fructigena, які уражують плодово-ягідну продукцію під час транспортування та при зберіганні і викликають гниття.

Як показали наші дослідження, застосування суспензії бацил-антагоністів Bacillus subtilis 2/10 та 63z (5,0х10⁹ КУО/мл та 10х10⁹КУО/мл) проти фітопатогенних грибів - Penicillium expansum, Penicillium claviforme, Rhizopus nigricans, Monilia fructigena, дозволить затримати швидкість їх розвитку під час зберігання.

Культури мікроорганізмів, які використовуються як агенти біологічного захисту рослин, мають характеризуватись безпечністю для теплокровних та людей, це є необхідною умовою нешкідливої роботи з ними, тому дослідження патогенних властивостей мікроорганізмів є важливим етапом роботи з культурами. Це було вивчено на мишах та щурах згідно методики М.О.Біргер (1973) та "Методических указаний по гигиенической оценке микробных средств защиты растений..." (1982). Результати досліджень показали, що штам Bacillus subtilis 2/10 невірулентний, нетоксигенний і нетоксичний для теплокровних організмів, не проникає і не розмножується в клітинах організму, не викликає інфекційний процес. Отримані дані дають підстави для того, щоб віднести штам Bacillus subtilis 2/10 до 4 класу небезпеки, тобто до мікроорганізмів "які практично не мають алергенних та загальнотоксичних властивостей".

Створення та використання біологічного препарату на основі штаму Bacillus subtilis 2/10 для захисту суниці від сірої гнилі суниці та плодів яблуні при зберіганні

Створенню препарату на основі Bacillus subtilis 2/10 передувало вивчення біологічних властивостей бактерій роду Bacillus і їх дослідних зразків. У результаті досліджень нами було відібрано штам, який відповідає всім вимогам, що ставляться до мікроорганізмів, як основи бактеріального препарату та отримав високу оцінку за активністю в польових умовах.

Штам бактерії Bacillus subtilis 2/10 - основний інгредієнт препарату, ізольований з грунту. Його ідентифіковано за визначником Бергі (1980), та досліджено згідно з «Методичних рекомендацій по виділенню та ідентифікації бактерій роду Bacillus...» [1983]; депоновано в Центральному музеї промислових мікроорганізмів та в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України. Штам зберігається в Українській колекції мікроорганізмів (Смирнов,1998). Отримано авторське свідоцтво та патент на винахід "Штам бактерій Bacillus subtilis для отримання препарату проти збудника сірої гнилі суниці".

Штам Bacillus subtilis 2/10 має всі основні культурально-морфологічні ознаки та фізіолого-біохімічні властивості притаманні цьому роду (Бергі,1986).

Експериментальні зразки біопрепарату виготовлені в лабораторних умовах Інституту мікробіології і вірусології НАН України.

Біопрепарат являє собою висушену пористо-кристалізовану масу живих спор і клітин штаму Bacillus subtilis 2/10 з желатиново-сахарозним наповнювачем (4:1). Призначається для захисту суниці від сірої гнилі. Вміст бактерій - основного діючого інгредієнту в препараті - 5х10 ⁹ КУО/г.

Специфічну активність отриманого біопрепарату визначали за антагоністичною активністю по відношенню до Botrytis cinerea - збудника сірої гнилі суниці методом радіальних штрихів.

Контроль бактеріологічної чистоти біопрепарату проводили методом розсіву розведеного в фізіологічному розчині ліофілізованого препарату на агаризовані живильні середовища.

Як показали результати бактеріологічних посівів, приготовані дослідні серії біопрепарату відповідали вимогам і не були контаміновані сторонньою мікрофлорою.

Контроль безпечності біопрепарату здійснювали на білих мишах при пероральному введенні суспензії, приготованої з розрахунку 1х10⁹ КУО/мл на тварину. Спостереження за станом тварин вели протягом 10 діб. Висновок про безпечність біопрепарату робили після розтину тварин і макроскопічному дослідженні внутрішніх органів. Дослідні серії біопрепарату на основі штаму Bacillus subtilis 2/10 відповідали всім вимогам, які ставляться до препаратів для захисту рослин.

Вивчення впливу біологічного препарату на основі штаму Bacillus subtilis 2/10 на мікрофлору сірого опідзоленого на лісовидному суглинку грунту дослідної ділянки вивчали в лабораторних умовах. Для порівняння застосовували хімічний препарат Топсін М. За контроль була взята ділянка без обробітку.

В результаті досліджень встановлено, що препарат на основі штаму Bacillus subtilis 2/10, підвищує вміст у грунті кількість амоніфікуючих та целлюлозоутворюючих мікроорганізмів.

Показано, що під дією штаму Bacillus subtilis 2/10 відбувається самоочищення мікрофлори грунту від умовно патогенних мікроорганізмів - сальмонел (S.typhimurium) - на 20-й день, кишкової палички (E.coli) - на 30-й , шигел (S.sonnei) - на 20-й день за рахунок продукування штамом Bacillus subtilis 2/10 комплексу біологічно-активних речовин.

Біологічну ефективність біопрепарату на основі Bacillus subtilis 2/10 перевіряли шляхом обприскування суниці на початку цвітіння та в період масового цвітіння (двічі) на дослідному полі Інституту садівництва УААН сумісно з співробітниками відділу захисту рослин.

Як видно з представлених результатів, біологічна ефективність застосування суспензії біопрепарату (5х10⁹ КУО/мл) з нормою витрати робочої рідини 400-500 л/га для сорту Зенга-Зенгана становить - 71,9%, для сорту Коралова 100 - 70,0%, для сорту Ясна - 33,3%, що набагато вище, ніж із застосуванням еталону - фунгіциду Байлетон 25% з.п., з нормою витрати 0,24 кг/га.

Позитивно вплинув обробіток насаджень суниці біопрепаратом на урожайність і при цьому результат був вищий ніж у контролі.

З метою розширення застосування активних штамів бацил ми провели серію дослідів щодо антагоністичного впливу Bacillus subtilis 2/10 та Bacillus subtilis 63z (еталон) на фітопатогенні гриби - Rhizopus nigricans (Ehrenb.), Monilia fructigena (Schroet.) Honey, Penicillium claviforme (Bain), Penicillium expansum (Link.), які уражують плодово-ягідну продукцію під час транспортування та при зберіганні і викликають гниття. В якості тест-об'єктів були затосовані плоди яблуні (сорт Кальвіль сніжний).

У результаті дослідів встановлено, що застосування суспензії бацил-антагоністів штамів Bacillus subtilis 2/10 та Bacillus subtilis 63z (5,0х10⁹ КУО/мл та 10х10⁹ КУО/мл) проти збудників плодових гнилей - R.nigricans, M.fructigena, P.claviforme, P. expansum дозволить затримати швидкість їх розвитку під час зберігання плодів яблуні.

При технології вирощування суниці в промислових насадженнях для захисту суниці від сірої гнилі поряд з агротехнічними заходами використовуються хімічні препарати. Для порівняння з дією препарату на основі штаму Bacillus subtilis 2/10 нами випробовувались такі фунгіциди: Бордоська рідина - 1%, Еупарен М, 50% з.п., норма витрати препарату - 2,0 кг/га; Топсін М, з.п., норма витрати препарату 1,0-1,5 кг/га, а також їх суміші. За еталон застосовано препарат Байлетон, 25% з.п., який зареєстрований на суниці з нормою витрати 0,24 кг/га. Обробіток плантацій суниці шляхом обприскування проводили на початку цвітіння та в кінці масового цвітіння. Найбільш ефективним для захисту суниці від сірої гнилі виявився: Еупарен М,50% з.п. з нормою витрати препарату 2,0 кг/га. Біологічна ефективність його використання становила 80,3 %.

Висновки

1. В умовах Лісостепу України сіра гниль суниці є широко поширеною хворобою і при сприятливих умовах (опади, підвищена вологість повітря, оптимальна температура) для її розвитку, завдає великої шкоди. Втрати врожаю від сірої гнилі на промислових насадженнях суниці протягом 1998 - 2000 рр. становили 31,8 - 39,9 ц/га.

2. Зимує збудник хвороби Botrytis cinerea Pers. у вигляді склероціїв на поверхні та в середині рослинних залишків. Оптимальна температура для їх проростання знаходяться в діапазоні від 20^оС до 35^оС. При вивченні морфології патогена виявлено, що його конідії мають довжину в межах 8,9-10,3 мкм, ширину - 6,4-8,8 мкм.

3. Серед досліджених сортів суниці найбільш стійкими проти сірої гнилі виявились сорти Талісман і Покахонтас (уражуваність ягід 5%), а найменше - сорт Ясна (28%).

4. Проведено скринінг аеробних спороутворюючих бактерій роду Bacillus у мікрофлорі грунту та створено робочу колекцію. Нами відзначено, що ці бактерії представлені в основному видами Bacillus subtilis (59%) та B.licheniformis (11%).

5. Ізольовано з грунту штам-антагоніст, який у результаті ідентифікації та за основними морфолого-культуральними властивостями віднесено до виду Bacillus subtilis. При вивченні фізіолого-біохімічних властивостей цього штаму (Bacillus subtilis 2/10) встановлено, що він ферментує глюкозу, арабінозу, манніт, ксилозу з утворенням кислоти без газу. Дає позитивну реакцію Фогес-Проскауера, гідролізує крохмаль і желатин, росте на поживному середовищі з вмістом 7% NaCl, утилізує цитрат.

6. Генотипова ідентифікація за методом RAPD штаму Bacillus subtilis 2/10 показала, що він відрізняється від інших споріднених культур за своїм генотипом, який містить 650 пар нуклеотидів і може бути використаний як генетичний маркер цього штаму.

7. Вперше запропоновано штам-антагоніст Bacillus subtilis 2/10 для захисту суниці від сірої гнилі. Поряд з вираженою біологічною активністю він не проявляв фітопатогенних властивостей і характеризувався вибірковістю антагоністичної дії на збудника сірої гнилі - Botrytis cinerea Pers

8. Застосування суспензії бацил-антагоністів штамів Bacillus subtilis 2/10 та 63z (5,0х10⁹ КУО/мл та 10х10⁹ КУО/мл) проти збудників плодових гнилей - Rhizopus nigricans (Ehrenb.), Monilia fructigena (Schroet.) Honey, Penicillium claviforme (Bain), Penicillium expansum (Link.) сприяло затримуванню швидкості їх розвитку під час зберігання плодів яблуні.

9. Встановлено, що штам Bacillus subtilis 2/10 невірулентний, нетоксигенний і нетоксичний для теплокровних організмів, не проникає і не розмножується в клітинах організму, не викликає інфекційний процес. Він належить до 4 класу небезпеки, тобто до мікроорганізмів "які практично не мають алергенних та загальнотоксичних властивостей".

10. В лабораторних умовах створено експериментальні зразки біопрепарату (основний діючий чинник - штам Bacillus subtilis 2/10), який позитивно впливає на мікробіоценоз грунту та сприяє самоочищенню його від умовно-патогенних видів мікроорганізмів - сальмонел (S.typhimurium), кишкової палички (E.coli), шигел (S.sonnei).

11. У польових умовах біологічна ефективність біопрепарату (суспензія - 5х10⁹КУО/мл) на сортах Зенга-Зенгана, Коралова 100 і Ясна становила відповідно 71,9%; 70,0 і 33,3%.

12. Для захисту суниці від сірої гнилі при епіфітотійному розвитку хвороби позитивні результати забезпечує застосування фунгіциду Еупарен М, 50% з.п. з нормою витрати 2 кг/га (біологічна ефективність - 80,3%).

13. Рекомендувати біопрепарат на основі штаму Bacillus subtilis 2/10 для подальшої токсиколого-гігієнічної оцінки і реєстрації в Управлінні хімічних речовин Міністерства охорони навколишнього середовища України.

14. За результатами досліджень зареєстровано патенти на винаходи:

- "Штам бактерій Bacillus subtilis для одержання препарату проти збудника сірої гнилі суниці" (№ патенту 12939; Опубл. 28 лютого 1997 р.);

- "Штам бактерій Bacillus subtilis для одержання препарату проти збудників гнилі яблук та винограду при зберіганні" (№ патенту 9224; Опубл. 30 вересня 1996 р.).

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. О.М.Лапа, Ю.П.Яновський, В.В.Воєводін, С.В.Лапа, М.Ф.Кучер. Захист ягідних культур. - К.: Колобіг, 2004 - 67 с. (Узагальнення та висвітлення експериментального матеріалу).

2. Лапа С.В., Смирнов В.В. Сіра гниль суниці //Захист рослин.- 1998. - №6. - С.24. ( Проведення досліджень та написання статті).

3. I.B.Sorokulova, O.N.Reva, V.V.Smirnov, I.V.Pinchuk, S.V.Lapa and M.C.Urdaci /Genetic diversity and involvement in bread spoilage of Bacillus strains isolated from flour and ropy bread / Letters in Applied Microbiology 2003,- 37,- P.169-173. (Проведення досліджень, узагальнення даних).

4. Штам бактерій Bacillus subtilis для одержання препарату проти збудника сірої гнилі суниці: А.С. 1738200 СССР /Лапа А.М., Резник С.Р., Лапа С.В. (Україна). - (Патент на винахід 12939 України. А01N63/00, С12N1/20; Опубл. 28.02.1997. Бюл. №1.- 6 с.)

5. Штам бактерій Bacillus subtilis для одержання препарату проти збудників гнилі яблук та винограду при зберіганні: А.С. 1706504 СССР /Лапа А.М., Резник С.Р., Лапа С.В., Фарафонов В.А., Сорокулова И.Б. (Украина). - (Патент на винахід 9224 України. А01N63/00, С12N1/20. Опубл. 30.09. 1996г. Бюл. №3. - 4 с.)

6. Лапа С.В., Сорокулова І.Б. Оздоровлення мікробіоценозу грунту за допомогою штаму Bacillus subtilis 2/10 //Міжнародна науково-практ. конф. «Пробіотики ХХ1 століття. Біологія. Медицина. Практика» (20-22 травня 2004 р. м. Тернопіль). - Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. - 101-105с.

7. Лапа А.М., Резник С.Р., Лапа С.В. Эффективность антагонистов против возбудителя серой гнили земляники //Респ. научн.-практ. конференция, посвященная 60-летию Украинского научн.-исслед. Института садоводства «Проблемы современного садоводства» - К., 1989.- С.34-35.

8. Vjunitskaja V.A., Menlikiev M.Ja., Sultanova M.Kh., Lapa S.V., and Slabospitskaja A.T. Bacteria of Bacillus genus in the basis of preparations for agriculture. -JUMS Congress: Bacteriology and Mycology - Osaka, Japan - 1990, September 16 - 22.- P. 92.

9. Лапа А.М., Резник С.Р., Лапа С.В. Использование бактерий антагонистов в борьбе с возбудителями гнилей плодов при хранении //Обл. научн. конф. молодых ученых "Проблемы интенсификации современного садоводства". - Мичуринск, 1990. - С.245.

10. Лапа А. М., Резник С.Р., Лапа С.В. Биологический способ борьбы с возбудителем серой гнили земляники //11 Респ. конф. молодых ученых и специалистов «Перспективы отечественного садоводства».- К., 1991.- С.123.

11. Лапа С.В., Кушнирева С.М. Защита растений земляники от серой гнили - Botrytis cinerea с помощью штамма бактерий рода Bacillus //Научно - практ. конф. молодых ученых и специалистов», (14 марта 1991): Тез. докл. - Чабаны, 1991.- С.45.

12. Лапа С.В. Штам бактерії роду Bacillus - активний антагоніст збудників гнилі яблук //Наук.-практ. конф. молодих вчених і спеціалістів «Наукові розробки та досягнення молодих учених с.- г. виробництву» (В. Бакта, 1991): Тез. доп. - В. Бакта, 1991. - С. 33.

13. Лапа С.В., Сорокулова І.Б. Вплив бактеріального препарату на основі штаму Bacillus subtilis на санітарно - показові мікроорганізми в грунті //Конф. молодих вчених та спеціалістів «Сільське господарство України - проблеми, сучасне, майбутнє» (Чабани, 1993): Тез. доп. - Чабани, 1993. - С.23.

14. Лапа С.В., Сорокулова И.Б. Изучение влияния Bacillus subtilis - антагониста возбудителя серой гнили земляники на микрофлору почвы //Мікробіол. журн. - 1994. - №4. - С.67.

15. Лапа С.В., Сафронова Л.А., Кирик М.М. Антагоністична дія штаму Bacillus subtilis 2/10 щодо фітопатогенних грибів //Х з'їзд Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004 р.): Тез. доп. - Одеса, 2004. - С.282.

Анотація

Лапа С.В. Біологічне обґрунтування використання бактерій роду Bacillus для захисту суниці від сірої гнилі та плодів яблуні при зберіганні. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 06.01.11 - фітопатологія. - Національний аграрний університет, Київ, 2004.

Дисертація присвячена біологічному обґрунтуванню використання бактерій роду Bacillus для захисту суниці від сірої гнилі та плодів яблуні при зберіганні.

Встановлено, що в умовах Лісостепу України сіра гниль суниці при певних умовах для розвитку збудника захворювання Botrytis cinerea Pers. (опади, підвищена вологість повітря, оптимальна температура) завдає великої шкоди і спричиняє значні втрати врожаю, котрі за 1998 - 2000 рр. становили 31,8 - 39,9 ц/га при розвитку хвороби від 14,4 - 17,9%.

З метою створення біологічного препарату на основі штаму Bacillus subtilis 2/10 для захисту суниці від сірої гнилі вперше ізольовано з грунту та ідентифіковано штам-антагоніст.

Показана висока антагоністична активність штаму Bacillus subtilis 2/10 до збудника сірої гнилі суниці та інших фітопатогенів. Вивчено морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні властивості штаму Bacillus subtilis 2/10.

Генотипова ідентифікація штаму Bacillus subtilis 2/10 показала його відмінність від інших штамів роду Bacillus за фрагментом ДНК, який містить 650 пар нуклеотидів і може бути використаний як генетичний маркер цього штаму.

Характерною ознакою B.subtilis 2/10 є вибірковість дії на збудника сірої гнилі - Botrytis cinerea Pers. Біопрепарат на основі штаму B.subtilis 2/10 позитивно впливає на мікробіоценоз грунту і сприяє самоочищенню від умовно-патогенних видів мікроорганізмів.

Обґрунтовано включення до складу біопрепарату штаму Bacillus subtilis 2/10, котрий поряд з вираженою антагоністичною активністю до широкого спектру фітопатогенів, показав нешкідливість для теплокровних, технологічність та виражену специфічну активність.

Встановлено, що застосування суспензії бацил-антагоністів штамів Bacillus subtilis 2/10 та 63z (5,0х10⁹ КУО/мл та 10х10⁹ КУО/мл) проти збудників плодових гнилей - Rhizopus nigricans (Ehrenb.), Monilia fructigena (Schroet.) Honey, Penicillium claviforme (Bain), Penicillium expansum (Link.) сприяло затримуванню швидкості їх розвитку під час зберігання плодів яблуні.

В польових умовах біологічний препарат показав високу ефективність для захисту суниці від збудника сірої гнилі, що привело до збільшення врожаю.

Ключові слова: штам Bacillus subtilis, біопрепарат, сіра гниль, фітопатогенність, антагоністична активність.

Лапа С.В. Биологическое обоснование применения бактерий рода Bacillus для защиты земляники от серой гнили и плодов яблони при хранении. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 06.01.11 - фитопатология. - Национальный аграрный университет, Киев, 2004.

Диссертация посвящена биологическому обоснованию применения бактерий рода Bacillus для защиты земляники от серой гнили и плодов яблони при хранении.

Цель исследований - создание биологического препарата на основании штамма Bacillus subtilis 2/10 для защиты земляники от серой гнили и плодов яблони при хранении.

Изучение биологии возбудителя заболевания серой гнили - Botrytis cinerea Pers.показало, что он зимует в виде склероциев на поверхности и внутри пораженных растительных останков. Весной мицелий является первичной инфекцией для заражения растений. При изучении морфологических особенностей возбудителя заболевания выявлено, что его конидии имеют длину в пределах 8,9-10,3 мкм, ширину - 6,4 - 8,8 мкм. Существенной разницы между размерами конидий - бесполых спор, взятых с земляники различных сортов, не выявлено.

...