Молекулярні механізми утворення фібрину та фібринолізу

9. Belitser V.A., Lugovskoi E.V., Musjalkovskaja A.А., Gogolinskaja G.K. Quantitation of the inhibitory effect of fibrinogen and its degradation products on fibrin polymerization // Throm. Res. 1982. 27, N3. Р. 261-269.

10. Угарова Т.П., Луговской Э.В., Горкун О.В., Дерзская С.Г. Исследование стабильности промежуточных полимеров фибрина, образующихся в системе фибриноген-фибрин // Укр. биохим. журн. 1983. 55, №3. С. 254-260.

11. Луговской Э.В., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г. Исследование криокомплексов фибриногена и фибрина методом количественного анализа N-концевых аминокислот // Укр. биохим. журн. 1983. 55, №3. С. 250-253.

12. Белицер В.А., Луговской Э.В., Угарова Т.П. Взаимодействие фибриногена с двумя формами фибрина, различающимися по степени активации тромбином // Биохимия. 1985. 50, №8. С. 1336-1341.

13. Чудновец В.С., Луговской Э.В., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г., Назимов И.В., Комисаренко С.В. Выделение NH₂-концевых дисульфидных узлов фибриногена и фибрина человека и фрагментов полипептидных цепей, входящих в их состав // Доклады АН СССР. 1991.317, №6. С.1496-1499.

14. Луговской Э.В., Макогоненко Е.М., Чудновец В.С., Дерзская С.Г., Гоголинская Г.К., Колесникова И.Н., Буханевич А.М., Ситак И.Н., Ляшко Е.Д., Комисаренко С.В. Применение моноклональных антител для исследования процессов полимеризации фибрина // Доклады АН СССР. 1991.318, №1. С. 224-227.

15. Lugovskoi E.V., Makogonenko E.M., Chudnovets V.S., Derzskaya S.G., Gogolinsikaja G.K., Kolesnikova I.N., Bukhanevich A.M., Komisarenko S.V. The study of fibrin polymerization with monoclonal antibodies // Biomedical science. 1991. 2. Р. 249-296.

16. Макогоненко Е.М., Луговской Э.В., Колесник Л.А., Кудинов С.А. О функциональном и диагностическом значеии А-, ВВ1-42, ВВ 15-42 пептидных фрагментов фибрин(оген)а // Укр. биохим. журн. 1992.64, №4. С. 78-82.

17. Луговской Э.В., Позднякова Т.М., Макогоненко Е.М., Степанова Л.Л., Дерзская С.Г., Гоголинская Г.К., Михаловская Л.И., Мороз. Е.Д., Комисаренко С.В. Комплексообразование димерного Д-фрагмента с NH₂-концевым дисульфидным узлом фибрина // ДAН України. 1994. №6.С. 146-150.

18. Луговской Э.В., Макогоненко Е.М., Чудновец В.С., Дерзская С.Г., Гоголинская Г.К., Колесникова И.Н., Михаловская Л.И., Комисаренко С.В. Исследование полимеризации фибрина с помощью моноклональных антител 2d-2a и их Fab-фрагментов // Укр. биохим. журн. 1995. 67, №1. С. 64-71.

19. Луговской Э.В., Макогоненко Е.М.,Чудновец В.С., Дерзская С.Г., Гоголинская Г.К., Михаловская Л.И., Комисаренко С.В. Фибриновый фрагмент 15-118. Ингибиторные и комплексообразующие свойства // Укр. биохим. журн. 1995. 67, №4. С. 57-64.

20. Луговской Э.В., Позднякова Т.М., Sederholm-Willams, Комисаренко С.В. Структура и механизм функционирования центров полимеризации фибрина // Укр. биохим. журнал. 1996. 68, №6. С. 3-17.

21. Lougovskoi E.V., Gogolinskaya G.K., Preparation of fibrin des-AA by thrombin // Укр. біохім. журн. 1999. 71, №4. P.107-108.

22. Lugovskoi E.V., Komisarenko S.V. The use of monoclonal antibodies for studying the fibrin polymerization // Russian Journal of Bioorganik Chemistry. 2000. -26, N12. Р.791-798.

23. Луговской Э.В., Чудновец В.С., Гоголинская Г.К., Колесникова И.Н., Ляшко Е.Д., Литвинова Л.М., Матсуэда Г.Р., Комисаренко С.В. Влияние моноклональных антител к N-концевому фрагмента В-цепи фибриногена на полимеризацию фибрина // ДАН України. 2001. №10. C. 190-194.

24. Луговской Э.В., Колесникова И.Н., Золотарева Э.Н., Чернишов В.И., Гриценко П.Г., Гоголинская Г.К., Веселовская Л.Д., Ляшко Е.Д., Литвинова Л.М., Костюченко Е.П., Петрова Ю.И., Комиссаренко С.В. Новый сайт полимеризации фибрина // ДАН України. 2001. №11. С. 167-170.

25. Lugovskoy E.V., Zolotareva E.N., Gogolinskaya G.K., Gritsenko P.G., Moroz E.D., Komisarenko S.V. Polymerization Sites in the D-Domain of Human Fibrin(ogen) // Biochemistry. 2002. 67, N4. P. 446-450.

26. Луговской Э.В., Гриценко П.Г., Скурский С.И., Комисаренко С.В. Роль ионов Са в полимеризации фибрина // Укр. биохим. журн. 2002. 74, №3. С. 5-9.

27. Lugovskoi E.V., Gritsenko P.G., Kolesnikova I.N., Zolotareva E.N., Gogolinskaya G.K., Lyashko E.D., Litvinova L.M., Petrova J.I., Kostuchenko E.P., Komisarenko S.V. Neoantigenic determinant in the D-dimer fragment of fibrin // Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine. 2002. N 2. P. 188-191.

28. Lugovskoi E.V., Kolesnikova I.N., Gritsenko P.G., Zolotareva E.N., Gaffney P., Nieuwenhuizen W., Komisarenko S.V. A neoantigenic determinant in the D-dimer fragment of fibrin // Throm. Res. 2002. 107, N 3-4. P. 151-156.

29. Луговской Э.В. Молекулярные механизмы образования фибрина и фибринолиза. Физико-химический и иммунохимический анализ (монография) // Наукова думка, Київ. 2003 р. 224 с.

30. Луговськой Е.В., Гриценко П.Г., Колеснікова І.М., Золотарьова Е.М., Чернишов В.І., Гоголінська Г.К., Ляшко Є.Д., Литвинова Л.М., Костюченко О.П., Петрова Ю.І., Комісаренко С.В. Новий центр полімеризації фібрину у його D-домені, який необхідний для побудови протофібрил // ДАН України. - 2004. - №1.С.171-176.

31. Lugovskoy E.V., Gritsenko P.G., Kolesnikova I.N., Zolotareva E.N., Chernishov V.I., Nieuwenhuizen W., Komisarenko S.V. Two monoclonal antibodies to D-dimer specific inhibitors of fibrin polymerization // Thromb. Res. 2004. 113, N 3-4, P. 251-259.

Анотація

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2004.

Дисертація присвячена пошуку раніше невідомих центрів полімеризації фібрину та створенню нової моделі формування тривимірної сітки фібрину - каркаса тромбу, а також одержанню моноклональних антитіл (монАТ), специфічних до головного продукту фібринолізу - D-димеру, для дослідження його антигенної структури та використання цих монАТ для кількісного визначення D-димеру в плазмі крові людини. Головна концепція даної роботи, яка сформувалася після аналізу літературних даних, полягає в тому, що кожна стадія полімеризації фібрину здійснюється не однією парою комплементарних центрів, як вважали раніше, а як мінімум двома парами. Для пошуку нових центрів полімеризації в цій роботі були використані монАТ як молекулярні зонди. З їх допомогою було показано існування невідомого раніше центру латеральної асоціації протофібрил фібрину в NH₂-кінцевій частині В-ланцюга фібриногену, який для свого функціонування не вимагає відщеплення фібринопептиду В. Показано існування нового центру полімеризації фібрину, який необхідний для побудови протофібрил. Цей центр локалізований в NH₂-кінцевій частині -ланцюга D-домену фібрину і не співпадає з відомим центром “а”, який розташований в СООН-кінцевому фрагменті -ланцюга D-домену. Зроблено висновок, що побудова протофібрил фібрину здійснюється не тільки за рахунок міжмолекулярної взаємодії відомої пари центрів “A”-“a”, але й за рахунок, як мінімум, ще однієї пари комплементарних центрів. Одержано монАТ III-3b проти D-димеру людини, епітопу для якого співпадає з невідомою раніше антигенною детермінантою, що формується в процесі гідролізу фібрину плазміном. Показано, що монАТ III-3b може бути використано для кількісного визначення D-димеру в плазмі крові людини з діагностичною метою.

Ключові слова: фібрин, центри полімеризації, D-димер фібрину, моноклональні антитіла, епітопи, неоантигенна детермінанта.

Аннотация

Луговской Э.В. “Молекулярные механизмы образования фибрина и фибринолиза.” - Монография.

Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2004.

Диссертационная работа посвящена поиску ранее неизвестных центров полимеризации фибрина и созданию новой модели формирования трёхмерной сети фибрина - каркаса тромба, а также получению монАТ, специфических к главному продукту фибринолиза - D-димеру для исследования его антигенной структуры и использования этих монАТ для количественного определения D-димера в плазме крови человека. В работе представлены результаты физико-химических исследований известных центров полимеризации фибрина и описаны открытые нами ранее неизвестные центры полимеризации в Е- и D-доменах фибрина. Полученные результаты позволили создать новую модель процесса самосборки трёхмерной сети фибрина - яркого примера полимеризации биологических макромолекул.

В крови человека существуют две антагонистичные системы - свёртывания крови и фибринолиза. Первая приводит к образованию растворимого фибрина и/или формированию тромба, вторая - к их расщеплению. В результате активации системы свёртывания крови образуется тромбин, который отщепляет от фибриногена два фибринопептида А, и образуется фибрин дезАА. Фибрин дезАА способен к спонтанной полимеризации, которая осуществляется в несколько стадий. На первой стадии из мономерных молекул фибрина формируются протофибриллы, а на второй стадии протофибриллы после достижения критической длины ассоциируют латерально с образованием фибрилл. Фибриллы также ассоциируют латерально, ветвятся и образуют трёхмерную сеть фибрина. Фактор XIIIa стабилизирует протофибриллы и фибриллы путём соединения соседних молекул фибрина ковалентными связями. На уровне протофибрилл резко ускоряется отщепление фибринопептидов В и молекулы фибрина дезАА в составе полимерного фибрина превращаются в фибрин дезААВВ. В настоящее время общепринятым является то, что самосборка мономеров фибрина дезАА осуществляется только одной парой комплементарных центров “А”-“а”, а после образования фибрина дезААВВ в построении фибриновой сети принимает участие и пара центров “B”-“b”. Однако, существует целый ряд данных, которые позволяют предположить, что в полимеризации фибрина принимают участие и другие пары комплементарных центров. Известно, что уже на уровне протофибрилл происходит превращение плазминогена в плазмин, который расщепляет фибрин с образованием различных растворимых фрагментов. Главным из этих фрагментов является D-димер, имеющий большое диагностическое значение.

В диссертационной работе впервые показано, что полимеризация фибрина дезАА осуществляется главным образом за счёт электростатических и водородных взаимодействий, а после образования фибрина дезААВВ дополнительно включаются и гидрофобные взаимодействия. Для идентификации фибринов дезАА и дезААВВ, которые получались при действии на фибриноген тромбина, автором впервые был разработан метод количественного анализа NH₂-концевых аминокислот фибриногена и двух форм фибрина. Ранее в течение долгого времени обсуждался вопрос о возможном межмолекулярном взаимодействии периферических D-доменов фибрина в процессе его полимеризации. В данной работе была открыта способность к димеризации комплексов D-фрагмента с фрагментом В15-118 фибрина, что явилось первым прямым экспериментальным доказательством существования нековалентных взаимодействий между D-доменами при полимеризации фибрина.

Основная концепция данной работы, которая сформировалась после анализа литературных данных, заключается в том, что каждая стадия полимеризации фибрина осуществляется не одной парой комплементарных центров, как полагали ранее, а как минимум двумя парами. Для поиска новых центров полимеризации в этой работе были использованы моноклональные антитела в качестве молекулярных зондов. С их помощью было показано существование неизвестного ранее центра латеральной ассоциации протофибрилл фибрина в NH₂-концевой части В-цепи фибриногена, который для своего функционирования не требует отщепления фибринопептида В. Показано существование нового центра полимеризации фибрина, который необходим для построения протофибрилл. Этот центр локализован в NH₂-концевой части ?-цепи D-домена фибрина и не совпадает с известным центром “а”, который расположен в СООН-концевом фрагменте ?-цепи D-домена. Сделан вывод, что построение протофибрилл фибрина осуществляется не только за счет межмолекулярного взаимодействия известной пары центров “A”-“a”, но и за счёт, как минимум, еще одной пары комплементарных центров.

В диагностике таких заболеваний человека как тромбоз глубоких вен и тромбоэмболия лёгочных артерий огромную роль играет количественное определение D-димера в плазме крови. Против выделенного нами D-димера фибрина человека было получено моноклональное антитело (III-3b), которое специфически реагирует с D-димером без перекрестной реакции с фибриногеном и мономерным фибрином. Эпитоп для антитела III-3b находится во фрагменте В134-190 D-димера, вероятнее всего, в В155-160. Таким образом, была обнаружена неоантигенная детерминанта в D-домене фибрина, которая экспонируется в процессе гидролиза фибрина плазмином. В модельных опытах с применением донорских плазм и полученного нами D-димера было показано, что моноклональное антитело III-3b может быть использовано для количественного определения D-димера в плазме крови человека в диагностических целях.

Ключевые слова: фибрин, центры полимеризации, D-димер фибрина, моноклональные антитела, эпитопы, неоантигенная детерминанта.

Summary

Lugovskoy E.V. “Molecular mechanisms of fibrin formation and fibrinolysis”. - Monograph.

Thesis for a degree of Doctor of biological sciences on speciality 03.00.04 - Biochemistry. - Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004.

The dissertation is devoted to the search of unknown fibrin polymerization sites and to the creation of a new model of the formation of fibrin three-dimensional network - framework for thrombus. The dissertation is also devoted to production of mAb, specific to the main fibrinolysis product - fibrin D-dimer for the investigation of its antigen structure and for the usage of these mAb for quantification of D-dimer in human blood plasma. The known fibrin polymerization sites have been characterized and unknown polymerization sites in E- and D- domains of human fibrin molecule have been discovered using monoclonal antibodies. The localization of the new neoantigenic determinant in fibrin D-dimer has been found.

It has been shown that fibrin desAA polymerization is carried out mainly by electrostatic and hydrogen bonds and hydrophobic interactions are additionally involved in polymerization process in the case of fibrin desAABB. The tendency for dimerization of the complexes of D-dimer with fibrin fragment B15-118 was discovered. The conclusion was drawn about the existence of noncovalent intermolecular interactions of fibrin D-domains during fibrin polymerization. The site of protofibril lateral association was found in NH₂-terminal fragment of fibrinogen B-chain. This site can function without splitting off the fibrinopeptide B. The unknown site of fibrin polymerization, which takes part in protofibril formation, was discovered. This site proved to be localized in NH₂-terminal part of -chain of fibrin D-domain to the contrary of the known site “a”, which is situated at COOH-terminal fragment of -chain of D-domain. We suggest that protofibril formation is carried out not only by the known pair of sites “A”-“a” but also by another pair of unknown polymerization sites one of which being discovered in this work. Monoclonal antibody III-3b has been obtained, which reacts specifically with D-dimer of human fibrin without cross-reaction with fibrinogen and fibrin. Epitope for monoclonal antibody III-3b was localized in D-dimer fragment B134-190, most probably - in B155-160. Thus this fragment is the neoantigenic determinant, which is exposed during fibrin hydrolysis by plasmin. It has been also shown that monoclonal antibody III-3b can be successfully used for quantification of D-dimer in human blood plasma for diagnostic aims.

Key words: fibrin, polymerization sites, fibrin D-dimer, monoclonal antibodies, epitopes, neoantigenic determinant.

Размещено на Allbest.ru