Поширення та діагностика вірусу шарки сливи на півдні України

Размещено на http://www.allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

РАТУШНЯК ЛІЛІЯ КОСТЯНТИНІВНА

УДК 632.38 + 634.22

Поширення та діагностика вірусу шарки сливи на півдні україни

06.01.11 - фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2004

Дисертацією є рукопис

Дисертаційна робота виконана в Інституті захисту рослин Української академії аграрних наук

Науковий керівник - кандидат сільськогосподарських наук

Сергієнко Валентина Григорівна,

Інститут захисту рослин УААН, старший науковий співробітник

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук

Мілкус Борис Наумович,

Прищеплювальний комплекс ЗАТ “Одеський коньячний завод”, завідувач лабораторією вірусології та мікробіології

кандидат біологічних наук

Таранухо Микола Павлович,

Інститут садівництва УААН, старший науковий співробітник лабораторії вірусології

Провідна установа - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, відділ фітопатогенних вірусів, м. Київ

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус № 4, кім.41

Вчений секретар

cпеціалізованої вченої ради Мороз М.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми.

Найбільш шкодочинним вірусним захворюванням кісточкових культур є шарка сливи (Plum pox virus), яка на сьогодні ідентифікована в усіх зонах земної кулі, де їх вирощують. Хвороба викликає великі втрати врожаю і знижує технологічні і товарні якості плодів. Хворі дерева стають джерелом інфекції. шарка слива вірус антисироватка

В Україні це захворювання вперше виявили в 1966 році в Чернівецькій області на площі 0,3 га. Незважаючи на радикальні заходи знищення, шкодочинність і небезпечність хвороби з кожним роком зростають, розширюється її ареал.

Проблема шарки стоїть гостро для нашої країни. Швидке поширення хвороби перш за все пов'язане з відсутністю державної системи контролю за виробництвом садивного матеріалу.

Сучасні методи боротьби з вірусом шарки розробляються в декількох напрямах: вирощування здорового безвірусного садивного матеріалу, селекція сортів стійких чи толерантних до вірусу.

Такі дослідження мають бути забезпечені швидкими і надійними методами діагностики. За кордоном для діагностики вірусу шарки сливи розроблені методи молекулярної гібридизації та полімеразної ланцюгової реакції, що дозволяють виявити вірус у дуже невеликій концентрації. Однак, для масового тестування ці методи мало придатні через високу вартість, що значно обмежує їхнє застосування. Тому сьогодні на Україні ідентифікацію вірусу шарки проводять серологічними методами: імуноферментний аналіз та імуноелектронна мікроскопія. Але, для широкого застосування цих методів на практиці необхідні діагностичні сироватки. За відсутністю вітчизняних діагностикумів карантинні інспекції та селекцентри змушені закуповувати імпортні, що є економічно невиправдано. Значимість вирішення цієї проблеми і обумовила вибір теми дисертаційної роботи і актуальність дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках робочої програми Дослідної станції карантину винограду і плодових культур Інституту захисту рослин УААН по завданню 06.- “Удосконалити методи виявлення, локалізації та ліквідації вогнищ карантинних шкідників, хвороб та бур'янів (номер державної реєстрації 0101V003711).

Робота проводилась на Дослідній станції карантину винограду і плодових культур ІЗР УААН, м. Одеса та в лабораторії вірусології Науково - дослідного інституту плодівництва м. Кишинів, Республіка Молдова, на основі договору між цими установами.

Мета і задачі дослідження. Виходячи з актуальності питання, метою нашої роботи було виявлення збудника шарки сливи, удосконалення методів його діагностики і отримання діагностичної антисироватки до ізоляту вірусу шарки, виділеного в Україні.

Для досягнення поставленої мети виконували наступні завдання:

- провести моніторинг розповсюдженості шарки сливи в Україні;

- провести обстеження промислових насаджень кісточкових культур в Одеській області на виявлення можливих вогнищ шарки сливи;

- визначити переносників вірусу шарки в промислових насадженнях Одеської області;

- відібрати інфекційний матеріал для точної діагностики вірусу шарки і перевірити на відсутність супутніх вірусів методом імуноелектронної мікроскопії;

- визначити стійкість різних сортів кісточкових культур до вірусу шарки;

- перенести виділений ізолят вірусу шарки на трав'янисті індикатори і накопичення його для серологічних цілей;

- відпрацювати і вдосконалити методику очищення вірусу шарки;

- отримати високоспецифічну антисироватку;

- оптимізувати умови проведення імуноферментного аналізу для виділеного ізоляту вірусу шарки;

- випробування діагностичного набору на різних ізолятах вірусу шарки.

Об'єкт дослідження. Вірус шарки кісточкових культур в Одеській області.

Предмет дослідження. Насадження кісточкових культур.

Методи дослідження. Візуальне обстеження садів за симптомами. Механічна інокуляція трав'янистих індикаторів. Метод очищення вірусу. Імунізація кроликів. Серологічні методи: імуноелектронна мікроскопія, імуноферментний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів.

Вперше, виділений в Одеській області ізолят вірусу шарки сливи, перенесено на трав'янисті індикатори;

вперше встановлено, що насадження плодових кісточкових культур в Одеській області уражені хлоротичним штамом вірусу шарки сливи;

модифіковано схему очищення вірусу шарки, на основі якої отримано очищені препарати вірусу;

отримано вперше високоспецифічну антисироватку з титром 1:1024 до вітчизняного ізоляту вірусу шарки сливи;

поставлено та оптимізовано метод імуноферментного аналізу;

розроблено календарні строки відбору проб для масового тестування садивного матеріалу кісточкових культур та плодових насаджень на наявність вірусу шарки.

Практичне значення одержаних результатів.

Отримана антисироватка і виготовлений із неї на основі лужної фосфатази діагностичний набір дозволяє швидко і точно імуноферментним методом проводити аналіз рослин на виявлення збудника шарки сливи за невеликий проміжок часу.

Імуноферментний аналіз дає можливість здійснювати ефективний контроль садивного матеріалу плодових культур та насаджень під час вегетації на наявність вірусу шарки вже на самих ранніх етапах, що дозволить уникнути невиправданих витрат при подальшому розмноженні хворих рослин.

Метод можна використовувати в селекційній роботі при перевірці на стійкість плодових культур до вірусу шарки сливи.

Розроблені нами календарні строки відбору проб дають можливість надійно виявляти вірус шарки в процесі масового тестування протягом року.

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів та їх узагальнення виконані особисто дисертантом.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені та обговорені на звітних сесіях Вчених рад ІЗР УААН (Київ, 2000, 2001, 2002, 2003 рр.); на міжнародній науковій конференції “ Интегрированные системы защиты растений, настоящее и будущее” (Минск, 15-17 июля 2002 г.), на міжнародній науково - практичній конференції “ Сучасний стан і перспективи розвитку захисту рослин” (Харків, 8-9 вересня 2002року), на III міжвузівській науково - практичній конференції аспірантів “Сучасна аграрна наука: напрями досліджень, стан і перспективи” (Вінниця, 17-19 березня 2003 року), на II міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений ” (Харків, 19 - 23 травня 2003 року).

Публікації. По темі дисертаційної роботи опубліковано 9 наукових праць, з них: 3 статті - у наукових журналах, 3 - у збірниках наукових праць, 3 - в тезах наукових конференцій.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 152 сторінках машинописного тексту. Дисертація складається з вступу, загальної характеристики роботи, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, експериментальної частини, висновків та переліку посилань. В дисертації міститься 17 таблиць, 22 рисунка, з них 11 фотознімків. Перелік літературних джерел складається із 150 найменувань, в тому числі 71 іншомовних.

Висловлюю щиру подяку колективу Одеської дослідної станції карантину винограду і плодових культур ІЗР УААН, особисто директору к.с.-г.н. Клечковському Ю.Е., колективу вірусологічної лабораторії Молдавського науково-дослідного інституту плодівництва, м. Кишинів, особисто завідувачу к.с.-г.н. Калашяну Ю.А., працівникам Прикордонної державної інспекції з карантину рослин по Одеській області за допомогу при виконанні дисертаційних досліджень.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

На підставі узагальнених джерел літератури висвітлено історія вивчення, розповсюдженості і шкодочинність хвороби шарки на кісточкових культурах. Приведені відомі дані про систематичне положення та біологічні особливості патогену. Описано типові симптоми захворювання, способи передачі та шляхи поширення вірусу шарки в природних умовах.

Матеріали і методи досліджень

Матеріалом наших досліджень були ізоляти вірусу шарки (ізоляти 7/20С і 3/8С), які виділені з дерев сливи сортів Угорка домашня і Суперниця в господарстві “Плодове” Біляївського району Одеської області. Названі ізоляти були ідентифіковані в лабораторії вірусології Науково-дослідного інституту плодівництва, м. Кишинів, Республіка Молдова, методом імуноелектронної мікроскопії (R.Milne, E.Luisoni, 1977) з використанням антисироватки, приготовленої до голандського ізоляту вірусу шарки сливи.

Для з'ясування особливостей поширення хвороби шарки сливи проводили моніторинг розповсюдженості хвороби на території України та маршрутні обстеження промислових насаджень кісточкових культур на виявлення нових вогнищ шарки сливи.

Моніторинг розповсюдженості хвороби проводили шляхом аналізу та проведення математичної обробки даних річних звітів обласних карантинних інспекцій і Головної державної інспекції з карантину рослин України за період з 1996 по 2003 роки.

Основні маршрутні обстеження, обліки та спостереження за розвитком хвороби в 2000 - 2003 рр. проводились в Одеській області на базі Дослідної станції карантину винограду і плодових культур ІЗР УААН (м. Одеса). Насадження кісточкових культур в господарствах області обстежувались сумісно з Прикордонною Державною інспекцією з карантину рослин по Одеській області.

Обстеження плодових кісточкових насаджень проводили згідно “Тимчасової інструкції по виявленню, локалізації і ліквідації вогнищ шарки сливи”.

Очищення вірусу шарки проводили за методом Van Oosten (1972), а також за деякими власними модифікаціями.

Спектрофотометричні дослідження проводили на спектрофотометрі DU - 64 фірми “Beckman” в діапазоні хвиль 220 - 320 нм.

Для проведення імуноферментного аналізу методом афінної хроматографії виділяли фракцію імуноглобулінів (Clark M., Bar-Joseph M, 1984). В якості субстрату - носія використовували комплекс протеїн А - сефароза CL - 4В фірми “Serva”.

За методом Clark, Adams (1977) отримували кон'югат (комплекс імуноглобулінів з ферментом). В якості маркера використовували лужну фосфатазу, активністю 10000 units/ml, фірми “Serva”.

Імуноферментний аналіз в варіанті “сендвіч - методу” проводили згідно класичній методиці Clark, Adams(1977).

Статистичний аналіз експериментальних даних здійснювали за методиками Б.А.Доспєхова (1985).

Зовнішня симптоматика захворювання кісточкових культур, уражених ВШС

Перші симтоми вірусного інфікування переважно проявлялись на листках в кінці травня місяця, приблизно через 4 тижні після цвітіння. Це були розпливчасті плями різної величини у вигляді кілець та широких смуг від світло - зеленого до блідо - жовтого кольору. Вони розташовувались упродовж жилок і по краях листової пластинки. Плями добре проглядались на світлі. В центрі плям тканини листка зберігали нормальний зелений колір.

В кінці серпня при повторному огляді садів були виявлені симптоми і на плодах сливи. На сприйнятливих сортах (Угорка звичайна, Угорка італійська, Угорка молдавська, Суперниця, Сентябрська) вірус шарки викликав некротичні вдавлені темно - фіолетові плями і кільця, що нагадували мозаїчний візерунок на листках. Там де з'явились плями і кільця, розвиток плодів зупинився і на їх поверхні утворились вм'ятини, які сполучались в кільцеві візерунки. Тканина плоду під такими некротичними плямами до самої кісточки була забарвлена в червоно - бурий колір, ущільнена та просочена камеддю. Подібний візерунок спостерігався і на кісточці плоду. Уражені плоди були дрібними, частково осипались.

У толерантних сортів сливи, таких як Стенлі, Анна Шпет, Ренклод Альтана, Ренклод зелений, Персикова, на плодах некротичного візерунку не було. Але на шкірці спостерігалось мозаїчне забарвлення без деформації. Такі плоди не втрачали свого товарного вигляду.

При проведенні обстежень в 2000 - 2003 роках на старих вогнищах шарки в сливовому саду господарства “Плодове“ Біляївського району установлено, що відсоток заражених дерев щороку зростав (табл.1).

Таблиця 1 - Результати обстеження кісточкових насаджень на виявлення зараженості вірусом шарки сливи в ТОВ “Плодове” ( Біляївський р-н Одеської обл.)

Роки обстежень	Кількість обстежених дерев, екз	Без симптомів	з симптомами
			на листках і плодах	тільки на листках	тільки на плодах	% уражених дерев
2000	1000	975	15	8	2	2,5
2001	1000	964	21	12	3	3,6
2002	965	926	24	11	4	3,9
2003	965	911	35	13	6	5,6

Таблиця 2 - Результати обстеження кісточкових насаджень на виявлення зараженості вірусом шарки сливи в Овідіопольському районі, Одеської області

Роки обстежень	Кількість обстежених дерев, екз	Без симптомів	з симптомами
			на листках і плодах	тільки на листках	тільки на плодах	% уражених дерев
2000	3600	2165	833	587	15	39,9
2001	3600	2089	985	514	12	42,0
2002	3597	2019	1150	418	10	43,8
2003	3597	1952	1214	421	10	45,7

Так, в 2000 році симптоми шарки сливи виявлені у 2,5 обстежених дерев, в 2001 році - у 3,6. При обстеженні саду в 2002 році відсоток заражених дерев становив 3,9 , а в 2003 році - 5,6 %.

При обстеженні саду господарства “Овідіопольське” Овідіопольського району в 2000 році відсоток уражених дерев складав 39,9%. З кожним роком хвороба в саду поширювалась. Так, в 2001 році симптоми шарки сливи були виявлені у 42,0% обстежених дерев, в 2002 році - в 43,8%. А в 2003 році із 3597 обстежених дерев 45,7% були уражені вірусом (табл. 2).

Показники свідчать про тенденцію до розширення меж вогнищ та збільшення щільності заражених фітопатогеном дерев у підкарантинній зоні.

Виділення, ідентифікація та характеристика вірусу шарки

Для ідентифікації і дослідження основних морфологічних показників вірусних частинок, що викликають хворобу шарки, їх виділяли з листків інфікованих рослин із чітко вираженими ознаками хвороби. Із отриманих супернатантів після виділення готували препарати для електронної мікроскопії.

Як свідчать одержані результати, в препаратах виявлялись типові для вірусу шарки ниткоподібні частини завдовжки 700-800 нм. Специфічна адсорбція антитіл на поверхні вірусних частин вказувала на те, що дані частини були саме збудником шарки сливи.

Перенесення і накопичення вірусу шарки на трав'янистих індикаторах

Для визначення штаму вірусу шарки та вивчення впливу різних екстрагуючих буферних розчинів на стабільність вірусу виділений ізолят було успішно перенесено на трав'янистий індикатор Chenopodium foetidum (табл.3).

Як видно з таблиці, найбільш ефективним виявився 0,05 М калійфосфатний буфер рН 7,4 з домішками 0,15 Na₂SO₃ і 0,15 аскорбінової кислоти. При його застосуванні була отримана найбільша кількість уражених рослин Chenopodium foetidum, на яких вірус на 7 день після інокуляції на натертих листках утворював симптоми в вигляді округлих плям вохряного кольору.

Згідно класифікації по Шутичу (Sutic D.,1973), характер симптомів на натертих листках рослини-індикатора вказував на те, що в досліджуваному регіоні насадження сливи уражені саме хлоротичним штамом вірусу шарки.

Для визначення кола сприйнятливих трав'янистих господарів до одеського ізоляту вірусу шарки сливи нами було інокульовано 12 видів трав'янистих рослин: Nicotiana tabacum “ Barley ”, Nicotiana clevelandii Nicotiana glutinosa, Nicotiana rustica, Nicotiana occidentalis B-1, Nicotiana occidentalis 37 B, Nicotiana acuminata, Nicotiana bentamiana, Petunia hybrida, Chenopodium foliosum, Chenopodium quinoa, Chenopodium murale, Chenopodium amaranticolor.

Сприйнятливими до даного ізоляту 7/20С виявились два трав'янистих індикатори: Nicotiana glutinosa Nicotiana clevelandii та Nicotiana occidentalis 37B.

На гібриді Nicotiana glutinosa Nicotiana clevelandii перші симптоми хвороби з'явились на натертих листках в вигляді хлоротичних плям, діаметром близько 2 мм, з наступним системним поширенням патогену по всій рослині. На відростаючих листках симптоми проявлялись на 19 - 21 день після зараження.

Таблиця 3 - Результати механічного перенесення ізоляту вірусу шарки 7/20С на трав'янистий індикатор Chenopodium foetidum із застосуванням різних екстрагуючих буферів

Назва екстрагуючого буферу	Кількість рослин в досліді, шт.	Кількість уражених рослин, шт.	Середня кількість плям на 1 листок
2% нікотин--основа	25	5	2
0,05 М НЕРЕS - буфер, рН 7,5	25	0	0
0,05 М НЕРЕS - буфер, рН 7,5 + 0,01М ДІЕКА + 0,005 М ЕДТА	25	3	2
0,05 М калійфосфатний рН 7,4 + 0,15% Na2SO3 + 0,15% аскорбінова кислота	25	20	3
0,05 М цитратний буфер рН 6,7 + 0,03 М ДІЕКА.	25	0	0
0,02 М тріс-HCl, рН 8,1 + 0,03 М ДІЕКА + 0,01 М гліцерил	25	3	2

На Nicotiana occidentalis 37B на 7-8 день на натертих листках симптоми проявились також в вигляді хлоротичних плям. А ще через 8-10 днів інфекція поширювалась системно. На відростаючих листках індикатора вірус утворював хлоротичну мозаїку з подальшою затримкою росту рослин.

Для подальшої роботи нами був вибраний індикатор Nicotiana glutinosa Nicotiana clevelandii, так як в його системно інфікованих тканинах, за даними імуноелектронної мікроскопії, вірус накопичувався в набагато більших концентраціях, ніж в аналогічних тканинах індикатора Nicotiana occidentalis 37B.

Отримання очищених препаратів і антисироваток до вірусу шарки

Щоб отримати очищені препарати вірусу шарки, досліджуваний ізолят 7/20С переносили на здорові тест-рослини Nicotiana glutinosa Nicotiana clevelandii. Пасаж здійснювали 0,05 М калійфосфатним буфером, рН 7,4 без стабілізуючих домішок. В якості джерела інфекції були нові відростаючі листки індикатора з системними симптомами захворювання.

Очищення вірусу проводили на 14 -18 день після пасажу з інфікованих рослин Nicotiana glutinosa Nicotiana clevelandii методом Van Oosten (1972). Оскільки, вірусний препарат виявився недостатньо очищеним від нормальних білків, ця методика була модифікована: перед гомогенізацією інфікований матеріал заморожували при -18⁰С -22⁰С протягом 24 годин. Така обробка дала можливість звільнитися зразу при першому центрифугуванні від низькомолекулярних білків і сприяла кращому екстрагуванню вірусних частин із зруйнованих рослинних клітин інфікованих листків. Процедура очищення вірусу шарки сливи поетапно представлена схемою (рис.1).

Заражений рослинний матеріал

екстрагуючий буфер (1:4)

гомогенізація

фільтрація

сік інфікованої рослини

осад Ц ( 6000 об/хв, 15 хв )

надосадкова рідина + 3% Тритон Х-100

УЦ ( 29000 об/хв, 90 хв )

осад + буфер +0,1 М сечовина

Ц ( 5000 об/хв, 10хв )

Перший контроль осаду і надосадкової рідини

надосадкова рідина на 20% сахарозній подушці

УЦ ( 36000 об/хв, 120 хв)

осад + буфер

інкубація 4 год. при t +4⁰С

суспензія на 10 - 40 % сахарозній подушці

УЦ ( 25000 об/хв, 3 год. )

вірусна зона + буфер

УЦ ( 39000 об/хв, 90 хв )

осад - чистий препарат вірусу

Рис.1. Схема очищення вірусу шарки

Перевірка очищених препаратів вірусу шарки в електронному мікроскопі показала наявність великої кількості неагрегованих частин, морфологія яких не була порушена. Це були типові для вірусу шарки частинки довжиною 700-800 нм.

Спектрофотометрична крива очищених препаратів, отриманих по модифікованій методиці, мала один пік з мінімумом при довжині хвилі 240 нм і з максимумом при 260 нм, що характеризувало ці препарати, як нуклеопротеїди.

Відношення величини поглинання вірусу шарки слив при А₂₆₀/А₂₈₀ рівнялось 1,65, що відповідає літературним даним (Albrechtova E., Holubcova L., Jokes N.,1986). Таке співвідношення може варіювати від 1,2 до 1,7 (Rancovic M., 1978).

Вихід вірусу при очищенні складав від 0,6 до 0,8 мг / 100 г листків. Очищені препарати в подальшому були використанні для імунізації тварин.

Імунізація кроликів. Для імунізації використовували кроликів породи шиншила віком 1-1,5 роки, вагою 2-3 кг. Для отримання антисироватки застосовували дві схеми імунізації (табл.4, 5). В кожній схемі було використано по 2 кролика.

Таблица 4 - Імунізація кроликів очищеним препаратом вірусу шарки за схемою № 1

День імунізації	Спосіб введення	Кількість введеного імуногену, мл	Концентрація вірусу в препараті, мг
1	Внутрішньом'язово з повним ад'ювантом Фрейнда	1	0,600
3	Внутрішньовенно	1	0,800
5	Внутрішньовенно	1	0,800
29	Внутрішньом'язово з неповним ад'ювантом Фрейнда	1	0,600
30	Внутрішньовенно	1	0,800
43	Внутрішньом'язово з неповним ад'ювантом Фрейнда	1	0,600
44	Внутрішньовенно	1	0,800

Таблиця 5 - Імунізація кроликів очищеним препаратом вірусу шарки за схемою № 2

День імунізації	Спосіб введення	Кількість введеного імуногену, мл	Концентрація вірусу в препараті, мг
1	Підшкірно з повним ад'ювантом Фрейнда	2	0,600
8	Внутрішньом'язово з неповним ад'ювантом Фрейнда	2	0,700
15	Внутрішньовенно	1	0,800

В результаті застосування першої схеми імунізації ми отримали антисироватки з титром 1:256 від кролика №1 та 1:16 від кролика №2 (рис.3).

На рисунку 4 представлені дані, отримані при застосуванні другої схеми імунізації. Після проведення циклу ін'єкцій активність антитіл в крові обох кроликів була однаковою, титр антисироватки був високим і становив 1:1024.

Проведені дослідження показали, що при отриманні антисироваток з високим рівнем антитіл раціонально використовувати скорочену схему імунізації з двома наступними реімунізаціями. Це дозволило тривалий час отримувати антисироватку високого титру (1:1024). Дослідження за першою схемою імунізації були зупинені через низький титр антитіл.

Визначення оптимальних умов проведення ІФА і його чутливості

У процесі розробки умов проведення імуноферментного аналізу досліджуваного ізоляту вірусу шарки ми вивчали різні концентрації імуноглобулінів і розведення кон'югату з метою оптимізації умов тестування.

Для сенсибілізації мікроплат використовували імуноглобуліни в концентрації 2; 1,5; 1; 0,75 і 0,5 мкг/мл. Абсорбцію проводили протягом 3-х годин при 30⁰С. В зв'язку із змінами об'єму і можливими втратами імуноглобулінів під час діалізу в процесі приготування кон'югату, його застосовували не в абсолютній концентрації, а в розведеннях 1:500; 1:750; 1:1000; 1:1500; 1:2000.

Оптимізацію ІФА - методу проводили в сирому соку Nicotiana glutinosa Nicotiana clevelandii і уражених дерев сливи. Рослинний сік застосовували в розведеннях 1:10. В якості контролю був сік здорових рослин Nicotiana glutinosa Nicotiana clevelandii та PBS - буфер.

В результаті реакції з вірусом шарки сливи в сирому соку Nicotiana glutinosa Nicotiana clevelandii було встановлено, що при концентрації імуноглобулінів 2 мкг/мл жовте забарвлення спостерігалось не тільки у вірусних ізолятів, але й у контрольних рослин, не заражених вірусом (рис.5).

Із збільшенням розведення кон'югату інтенсивність забарвлення була меншою, але рівень фону реакції з екстрактом із листків здорових рослин був високим (0,120).

При зменшенні концентрації імуноглобулінів до 1,5 мкг/мл рівень фону неспецифічної реакції знизився до 0,090, але ці значення були недостатньо достовірними для надійної діагностики.

При концентрації імуноглобулінів 1мкг/мл значення екстинції при 410 нм у вірусного ізоляту був достатньо високим (1,7-1,13), а рівень фону реакції із здоровими рослинами складав (0,08-0,06). Використання концентрації імуноглобулінів 0,75 і 0,5 мкг/мл показало зниження рівня чутливості реакції до 0,030 - 0,020.

Таким чином, при перевірці різних концентрацій імуноглобулінів було встановлено, що для достовірної ідентифікації вірусу шарки методом імуноферментного аналізу достатньо покривати мікроплати розчином імуноглобулінів в концентрації 1; 0,75; 0,5 мкг/мл. Оптимальними для достовірного виявлення вірусу шарки є розведення кон'югату 1:1000 і 1:1500.

Виявлення вірусу шарки в різних органах і тканинах дерев сливи

Крім візуальних обстежень кісточкових насаджень в період прояву характерних симптомів на листках кісточкових культур, спостереження за деревами на чистоту від вірусу шарки проводяться і в невизначенні строки: під час заготовлювання живців для окуліровок в період літньої спеки, коли концентрація вірусу в тканинах помітно зменшується. При імпорті садивного матеріалу, який здійснюють в період спокою рослин, також виникає необхідність перевірити його фітосанітарний стан. Тому нами в різні періоди року був проведений аналіз різних частин крони, органів і тканин заражених дерев сливи для порівняння в них вмісту вірусу шарки.

Найбільша кількість вірусу містилася в нижній частині крони. В результаті проведення імуноферментного аналізу в пагонах внутрішньої та зовнішньої частин крони було встановлено, що максимальний вміст вірусу виявляється в пагонах внутрішньої крони ближче до штамбу. Вміст вірусу в пагонах, відібраних з зовнішньої частини дерева був набагато меншим.

Була визначена динаміка накопичення вірусу шарки сливи в різних органах рослини. В таблиці 6 представлені оптимальні календарні строки та тканина дерев кісточкових культур, використання яких забезпечує достовірне виявлення вірусу шарки в процесі масового тестування протягом року.

Таблиця 6 - Діагностика вірусу шарки в тканинах уражених дерев сливи імуноферментним методом

Вид тканини

Місяці діагностики

I

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX

X

XI

XII

Хлоротичні ділянки симптомів листків

+

+

+

Черешки листків з симптомами

+

+

+

+

+

+

Кора 1 і 2- річних пагонів

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Плоди з симптомами

+

+

+

Пелюстки

+

Протягом всього року вірус шарки можна виявити в корі одно-дворічних пагонів. При тестуванні восени встановили, що вірус шарки в пагонах сливи можна виявити тільки в корі, відібраній на верхівці і у основи пагона. Найменший вміст вірусу в корі був пізньої весни і зимою.

Максимальну концентрацію вірусу шарки виявили в кінці квітня місяця в пелюстках (квітках). Влітку, в якості тестуючого матеріалу, використовували листки з симптомами захворювання, а саме їх хлоротичні ділянки, та черешки цих листків.

В травні в молодих листках вірус поширюється більш рівномірно, а на початку літа (червень) надійно вірус можна виявити в нижній частині листової пластинки (1/3 листка, включаючи середню жилку). В липні концентрація вірусу зменшується і достовірні результати можна отримати тільки при тестуванні кори одно-дворічних пагонів та черешків листків.

В черешках листків, ближче до листової пластинки, вірус можна надійно виявити з травня по жовтень місяці. В липні, серпні та вересні вірус шарки достовірно виявляли і в плодах з видимими симптомами.

Використовуючи наведені вище дані, можна значно розширити строки проведення масового тестування. Наприклад, в зимові та пізні осінні місяці можна використовувати одно-дворічні пагони довжиною 20-30 см, відібрані з внутрішньої частини крони ближче до штамбу. Крім молодих листків, які найчастіше використовують, кращими органами для тестування весною є пелюстки квіток, а в літні місяці - черешки листя і плоди.

висновки

В Одеській області шарка сливи виявлена на площі 10,5 га. В цих вогнищах шарки відсоток заражених дерев щороку зростає, в середньому на 1,5-2%, що свідчить про збільшення щільності заражених фітопатогеном дерев у підкарантинній зоні.

Встановлено, що в умовах Одеської області вірус успішно передається персиковою зеленою попелицею (Myzus persicae Lulz.). Ефективність передачі вірусу в середньому становила 21,8% дослідних рослин. Період зараження - осіння міграція крилатих особин з трав'янистих рослин на дерева.

За допомогою рослини-індикатора Chenopodium foetidum встановлено, що на Україні (Одеська область) насадження сливи уражені хлоротичним штамом вірусу шарки.

Із 12 видів трав'янистих рослин виділено два індикатори: гібрид Nicotiana glutinosa Nicotiana clevelandii та Nicotiana occidentalis 37B, які в найбільшій мірі накопичували вірус шарки, виділений на Україні.

Модифіковано схему очищення вірусу шарки, на основі якої отримано очищені препарати даного вірусу, вільні від нормальних білків рослини - господаря. Відношення величини поглинання вірусу шарки при А ₂₆₀ / А ₂₈₀ рівнялось 1,65.

Визначено кращу схему імунізації кроликів, за допомогою якої отримано високоспецифічні антисироватки з титром 1:1024.

Оптимізовано метод діагностики вірусу шарки в тканинах плодових культур на основі імуноферментного аналізу. Для достовірної ідентифікації вірусу шарки сливи даним методом достатньо покривати мікроплати розчином імуноглобулінів в концентрації 1; 0,75; 0,5 мкг/мл при розведенні кон'югату 1:1000 і 1:1500, а рослинного соку 1:10.

Вивчена динаміка накопичення вірусу шарки в різних органах і тканинах кісточкових культур. Розроблено оптимальні календарні строки відбору проб, що забезпечують достовірне виявлення вірусу шарки сливи в процесі масового тестування протягом року.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

При контролі за фітосанітарним станом насаджень кісточкових культур та в системі безвірусних плодових розсадників доцільно використовувати імуноферментний метод діагностики на основі високоспецифічних антисироваток, отриманих до вітчизняного штаму вірусу шарки сливи.

Обстеження на виявлення шарки сливи необхідно робити протягом всього вегетаційного сезону з урахуванням місць найбільшої концентрації вірусів в тканинах рослини:

в березні - квітні аналізують кору 1-2річних пагонів нижнього ярусу крони біля штамбу; в квітні (під час цвітіння) - пелюстки квітів; в травні - липні - листки з черешками; кінець липня - вересень - плоди.

В плодових насадженнях зон карантинного режиму в системі карантинних заходів для локалізації та ліквідації вогнищ шарки сливи обов'язково потрібно проводити боротьбу з попелицями-переносниками.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ратушняк Л.К. Шарка сливи у плодових садах Одеської області // Карантин і захист рослин. - 2004. - № 5. - С. 30 - 31.

2. Ратушняк Л.К., Калашян Ю.А. Шарка сливи. Отримання очищених препаратів вірусу - збудника хвороби // Карантин і захист рослин. - 2004. - № 4. - С. 28 - 29. (Особистий внесок здобувача 60 %. Проведено дослідження, зроблено висновки).

3. Ратушняк Л.К. Діагностика шарки сливи в кісточкових садах // Захист і карантин рослин. - 2002. - Вип.48. - С. 199 - 207.

4.Ратушняк Л.К., Калашян Ю.А., Сергієнко В.Г. Отримання антисироватки до вірусу шарки сливи // Агроекологічний журнал. - 2004. - № 3. - С.62 - 65. (Особистий внесок здобувача 60 %. Проведено дослідження, зроблено висновки).

5. Ратушняк Л.К. Шарка сливи в Україні // Вісник Харківського національного аграрного університету імені В.В. Докучаєва / Серія "Ентомологія та фітопатологія". - 2002. - № 4. - С. 90 - 93.

6. Ратушняк Л.К. Розповсюдженість шарки сливи в Україні // Вісник аграрної науки південного регіону. Сільськогосподарські та біологічні науки. - Одеса: СМИЛ, 2003. - Вип. № 4. - С. 156 - 163.

7. Кульминская Л.А., Ратушняк Л.К. Эфективность действия новых инсектицидов против тлей-переносчиков вируса шарки сливы в плодовых садах Одесской области // Матер. Междунар. научн. конф. “Интегрированная система защиты растений. Настоящее и будущее”. - Минск, Прилуки 15-17 июля. - 2002. - С. 189 - 191.

8. Ратушняк Л.К. Шкодочинність шарки сливи в Україні // Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений: Тез. докл. 2-й междунар. конф. молодых ученых, 19 - 23 мая 2003 г., Харьков, 2003. - С. 292 - 293.

9.Ратушняк Л.К. Plum pox - небезпечна хвороба кісточкових культур // Сучасна аграрна наука: напрями досліджень, стан і перспективи: Тези доп. 3-ї міжвуз. наук.-практ. конф. аспірантів, 17-19 березня 2003 р., Вінниця, 2003. - С. 72 - 74.

АНОТАЦІЇ

Ратушняк Л.К. Поширення та діагностика вірусу шарки сливи на півдні України. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук із спеціальності 06.01.11 - фітопатологія. Національний аграрний університет, Київ, 2004.

Дисертація присвячена вивченню вірусної хвороби плодових кісточкових культур - шарки сливи на півдні України та отриманню діагностичної антисироватки до виділеного ізоляту вірусу для удосконалення методів її діагностики. В польових дослідах встановлено, що Plum pox virus в садах успішно передається персиковою зеленою ппопелицею (Myzus persicae Lulz.) на початку осені (кінець серпня - перша декада вересня). Резерваторами вірусу є заражені дерева сливи. Встановлено, що насадження сливи уражені хлоротичним штамом вірусу. Отримано очищені препарати вірусу шарки за модифікованою методикою. Визначена раціональна схема імунізації, за якою отримано високоспецифічну антисироватку. Оптимізовано умови проведення імуноферментного аналізу. Визначено оптимальні календарні строки для виявлення вірусу в процесі масового тестування протягом року.

Ключові слова: шарка сливи, вірус, антисироватка, діагностика, інфекція.

Ратушняк Л.К. Распространение и диагностика вируса шарки сливы на юге Украины. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 06.01.11 - фитопатология. Национальный аграрный университет, Киев, 2004.

Диссертация посвящена изучению вирусного заболевания плодовых косточковых культур - шарки сливы на юге Украины и получению диагностической антисыворотки к выделенному изоляту вируса для усовершенствования методов её диагностики.

Проведён мониторинг распространения вирусной инфекции шарки сливы в промышленных насаждениях косточковых культур на территории Украины за период с 1996 по 2003 гг. Его данные свидетельствуют о том, что за этот период площадь очагов болезни увеличилась на 441,85 га. Наиболее заражены сады Закарпатской и Тернопольской области. Разработано карантинное районирование территории Украины относительно шарки сливы с выделением двух зон: свободной и ограниченного распространения болезни.

При проведении обследований плодовых косточковых культур в Одесской области установлено, что количество поражённых деревьев с каждым годом увеличивается.

Результаты полевых опытов показали, что в насаждениях косточковых культур вирус шарки (Plum pox virus) передаётся в начале осени (конец августа - первая декада сентября) зелёной персиковой тлёй (Myzus persicae Lulz.). Резерваторами вируса являются заражённые деревья сливы.

Впервые изучено влияние различных экстрагирующих смесей на стабильность выделенного вируса. Лабораторные исследования показали, что наиболее эффективным является 0,05 М калийфосфатный буфер рН 7,4 с добавками. Его применение и позволило механически перенести вирус из ткани поражённой сливы на травянистые тест-растения.

Наиболее восприимчивыми оказались гибрид Nicotiana glutinosa Nicotiana clevelandii, Nicotiana occidentalis 37B, Chenopodium foetidum. На основании симптомов, полученных на натёртых листьях Chenopodium foetidum, определено, что насаждения косточковых культур поражены хлоротическим штамом вируса.

Впервые получены очищенные препараты вируса шарки по модифицированной методике. Для получения антисыворотки проведена иммунизация кроликов за 2 схемами. В результате выбрана наиболее рациональная схема, которая позволила получать антисыворотку с высоким титром антител (1:1024).

Разработаны условия проведения иммуноферментного метода, изучены различные концентрации применения иммуноглобулинов и разведения конъюгата для оптимизации условий тестирования.

Изучена динамика накопления вируса шарки сливы в различных органах растений. Определены оптимальные календарные сроки отбора проб инфицированных тканей деревьев косточковых культур, использование которых обеспечивает достоверное выявление вируса в процессе массового тестирования на протяжении года.

Ключевые слова: шарка сливы, вирус, диагностика, антисыворотка, плодовые косточковые культуры.

Ratushnyak L.K. - The distribution and diagnostic of Plum Pox Virus on the South Part of the Ukraine. - Manuscript.

Present thesis presented for Ph. D. degree of biology the specialty is 06.01.11 - phytopathology. The National Agrarian University, Kyiv, 2004.

The thesis is dedicated to the research of Plum Pox Virus ( PPV ) disease at the South Part of the Ukraine. It was determined that PPV strain found in the Ukraine is belonging to the chlorosis isolate. The virus is usually present at very low levels in infected trees where it is, moreover, unevenly distributed. The dynamics of PPV accumulation in different trees organs and tissues was studied. The optimal time of plant samples selection for PPV diagnostic was determined. Detection technique of high sensitiviti are therefore required to index trees for the presence of the disease, a key step in sanitary selection measures which are still the only effective means to fight the disease. That's why the purified PPV solution was obtained and ELISA - test diagnostic kit was developed. In the field experiments it was established that PPV is transmitted by Myzus persicae aphids at the beginning of autumn. The infected trees became a virus reservoir.

Key words: Plum Pox Virus, PPV antiserum, diagnostic of PPV, PPV spread.

Размещено на Allbest.ru

...