Вплив іонізуючого опромінення на стан еритроцитів у нормі та при злоякісних новоутвореннях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Львівський національний університет

ІМЕНІ івана франка

УДК: 577.346

вплив іонізуючого опромінення на стан еритроцитів У НОРМІ ТА при злоякісниХ новоутвореннях

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Батюк Лілія Василівна

Львів - 2005

АНОТАЦІЯ

Батюк Л.В. Вплив іонізуючого опромінення на стан еритроцитів у нормі та при злоякісних новоутвореннях. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Львівський національний університет ім. Івана Франка, м. Львів, 2005.

В роботі досліджено вплив променевої терапії на діелектричні властивості еритроцитів хворих при злоякісних новоутвореннях. Виявлені немонотонні зміни показників комплексної діелектричної проникності в суспензіях і тінях еритроцитів в інтервалі 2-47°С. Отримано, що гідратація мембран еритроцитів онкологічних хворих, зменшується в області температур 2-15 °С і зростає при температурах 15-20 та 28-47 °С. Показано, що в умовах радіаційного впливу на організм відбуваються зміни ступеня гідратації мембран еритроцитів онкологічних хворих. Розраховано величини енергії активації часу діелектричної релаксації молекул води в даних системах до і після опромінення. Досліджено вплив променевої терапії на показники кислотного гемолізу та терморезистентності еритроцитів. Показано, що при злоякісних новоутвореннях змінюються щільність розподілу клітин за об'ємом, відносна провідність цитоплазми, індекс форми еритроцитів, вміст іонів у плазмі крові та еритроцитах.

На експериментальних моделях щурів-пухлиноносіів карциноми Герена досліджено вплив локального фракційного рентгенівського опромінення організму на показники діелектричної проникності, кислотного гемолізу, вмісту іонів у плазмі і в еритроцитах. З'ясовано, що в умовах опромінення спостерігається зменшення частоти діелектричної релаксації молекул води в суспензіях еритроцитів, стабілізація показників електричних параметрів клітин, відновлення електролітної рівноваги, зміна розподілу еритроцитів за індексом форми.

Ключові слова: еритроцити, тіні еритроцитів, мембрани, злоякісні новоутворення, карцинома Герена, іонізуюче опромінення, діелектрична проникність, гідратація, енергія активації, гемоліз, електролітна рівновага, індекс форми.

АННОТАЦИЯ

Батюк Л.В. Влияние ионизирующего излучения на состояние эритроцитов в норме и при злокачественных новообразованиях. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Львовский национальный университет им. Ивана Франка, г. Львов, 2005.

В работе исследовано влияние лучевой терапии на диэлектрические свойства эритроцитов при злокачественных новообразованиях. Выявлены немонотонные изменения показателей комплексной диэлектрической проницаемости в суспензиях и тенях эритроцитов в интервале 2-47°С. Получено, что гидратация мембран эритроцитов онкологических больных, уменьшается в области температур 2-15 °С и растет при температурах 15-20 и 28-47 °С. Показано, что в условиях радиационного влияния на организм происходят изменение степени гидратации мембран эритроцитов онкологических больных. Рассчитаны значения энергии активации времени диэлектрической релаксации молекул воды в данных системах до и после облучение. Исследовано влияние лучевой терапии на показатели кислотного гемолиза и терморезистентности эритроцитов. Показано, что при злокачественных новообразованиях изменяются плотность распределения клеток по объему, относительная проводимость цитоплазмы, индекс формы эритроцитов, содержание ионов в плазме крови и эритроцитах.

На экспериментальных моделях крыс-опухоленосителей карциномы Герена исследовано влияние локального фракционного рентгеновского облучения in vivo на показатели диэлектрической проницаемости, кислотного гемолиза, содержания ионов в плазме и эритроцитах. Выяснено, что в условиях облучения наблюдается уменьшение частоты диэлектрической релаксации молекул воды в суспензиях эритроцитов, стабилизация показателей электрических параметров клеток, восстановление электролитного равновесия, изменение распределения эритроцитов по индексу формы.

Ключевые слова: эритроциты, тени эритроцитов, мембраны, злокачественные новообразования, карцинома Герена, ионизирующее излучение, диэлектрическая проницаемость, гидратация, энергия активации, гемолиз, электролитное равновесие, индекс формы.

SUMMARY

Batyuk L.V. Influence of ionizing radiation on properties of erythrocytes in health and in cancer cases . - Manuscript.

Thesis for a Candidate's degree of Biological Sciences by specialty 03.00.02 - biophysics. - Ivan Franko National University of L'viv, L'viv, 2005.

The investigation of ionizing radiation influence on properties of erythrocytes among healthy people and oncology patients was performed. The temperature dependence of the real е? and imaginary е?? parts of the complex dielectric permittivity, the frequency of relaxation of water molecules dielectric permittivity and hydration in the erythrocyte suspension and erythrocyte membranes within the temperature range 2-47 °С has been studied by the microwave dielectric method among donors and oncology patients after radiation therapy. The non-monotonous changes in dielectric permittivity, frequency of water molecules dielectric relaxation time for the erythrocytes suspension and erythrocyte membranes at 2-47 °С were founded.

The dielectric relaxation time of water molecules is a parameter that characterizes the molecule mobility in a very high frequency field, and consequently, the degree of molecule interaction with environment. The structural disorders in erythrocyte membranes result in the difference in the free-bound water system ratio and are accompanied by the change in the dielectric parameters. The increase of the frequency of water molecules dielectric relaxation in erythrocyte suspension of oncology patients as compared to healthy donors has been revealed. It is established that erythrocyte suspension at 10-12 °С, 20-23 °С and 30-36 °С among the patients with malignant tumors are accompanied by the change in the proportion of free and bound water in erythrocytes and loosening of lipid layer structure on membranes. It has been shown that the structural transitions of erythrocyte membranes of the oncology patients within temperatures range are accompanied by the change of the membrane permeability for water molecules in the erythrocyte membranes. The water molecule dielectric relaxation time activation energy in these systems has been obtained before and after radiotherapy.

The increasing of erythrocyte membrane hydration at cancer leads to extension of hydrated layer and slowing down of water diffusion through a membrane. Membrane dehydration among oncology patients precedes the structure transition. In this work the increase in hydration of the erythrocyte membranes at 2 to 15 °C and reduces at 15-20 and 28-47 °C has been shown for the first time. It is shown the increase of degree of hydration of the erythrocyte membranes during radiation influence on organism.

The change in hemolytic and thermal resistance of erythrocytes in cancer patient's undergoing radiation therapy has been investigated. The parameters characterizing hemolytic resistance of erythrocytes, velocity constants and energy of thermal hemolysis activation were determined.

Changes in erythrocyte resistance to acid of cancer patients were observed before radiation therapy when compared with donor blood, which was determined by percentage of cell destruction, terms of beginning and ending of haemolysis. Radiation therapy reduces erythrocytes resistance to acid haemolysis that can be associated with appearance of a new population of erythrocytes with renewed membranes. Structural reconstruction of lipid layer is observed at temperature below 45 °С in cancer patient before and after radiation therapy. Radiation therapy causes the changes of protein-lipid interaction in the membranes so activation energy parameters among cancer patients approach to those of healthy donors.

In experimental models of Guerin's carcinoma at local fractionated x-ray irradiation of the organism in combination with sodium succinate action has been investigated the changes of the state of erythrocyte membrane, the parameters characterizing dielectric permittivity, hemolytic tolerance of erythrocyte membranes, disturbance in the electrolyte balance of potassium and sodium ions in plasma and erythrocytes suspension.

In rats with tumors the increase in the relative conduction, disturbances in the electrolyte balance of potassium and sodium ions in plasma and erythrocytes, significant changes change in the index of the cell shape, increase in the frequency of water molecule dielectric permittivity in erythrocytes suspension, disturbances in the hydration of the erythrocyte membranes were observed when compared with controls. The amount of sodium in the erythrocytes remained increased at local fractionated x-ray exposure of the site Guerin's carcinoma cell transplantation and sodium succinate action which was manifested by considerable widening in the volume of erythrocyte histogram and increased values of relative conductivity of the cells. Acid haemolysis indices remain unchanged. It is found that in erythrocyte suspension in conditions of irradiation there is a reduction of the frequency of water molecule dielectric relaxation and stabilizing of electric parameters of cells and renewal of ion equilibrium.

Keywords: erythrocyte suspension, erythrocyte ghosts, membranes, carcinogenic state, Guerin's carcinoma, dielectric permittivity, hydration, activation energy, haemolysis, electrolyte balance, shape index.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент Гаташ Сергій Васильович, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, доцент кафедри біологічної і медичної фізики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Кнігавко Володимир Гілярійович, Харківський державний медичний університет, завідувач кафедри біофізики, інформатики та медичної апаратури

кандидат біологічних наук, доцент Чайка Ярослав Петрович, Львівський національний університет імені Івана Франка, завідувач кафедри біохімії

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, м. Київ

Захист відбудеться “ 7 ” липня 2005 року о14 ⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет, аудиторія 321 .

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий “ 6 ” червня 2005 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради к.б.н., доцент Манько В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Все більш широке застосування ядерних матеріалів в енергетиці й різке зростання онкологічних захворювань, зокрема, внаслідок аварії на ЧАЕС є причинами того, що дослідження дії іонізуючої радіації на клітинному і субклітинному рівнях стали однією з важливих і актуальних проблем сучасної біофізики клітини і медицини. Для з'ясування причин і конкретних механізмів порушення фізіологічних процесів в опроміненому організмі необхідне вивчення пострадіаційних змін в структурі й функціонуванні клітин. Будь-яке опромінення організму - загальне, локальне, разове, багаторазове - викликає морфологічні й функціональні зміни в клітинах крові, радіаційну деструкцію клітинних мембран. Сучасна терапія злоякісних пухлин повинна враховувати закономірності біологічної дії іонізуючих випромінювань, характер росту пухлини і процеси, які його супроводжують.

Накопичені за останні десятиліття численні дослідження показують, що одну з основних універсальних ланок у патогенезі хвороб різного генезу, в тому числі пухлинного, становлять зміни структури і функції біологічних мембран, зокрема мембран еритроцитів. Гетерогенність складу мембрани еритроцита і її здатність швидко міняти характер взаємодії між компонентами зумовлюють наявність широкого спектру структурних і функціональних реакцій клітини, які сприяють її пристосуванню до умов середовища.

Дослідження впливу іонізуючого опромінення на стан еритроцитів при злоякісних новоутвореннях часто мають гіпотетичний характер і ґрунтуються на загальних уявленнях про роль мембранних структур у функціонуванні живих систем, проводяться без детального розгляду деструктивних процесів, що відбуваються в мембранах клітин при наявності в організмі пухлини. В мембранних структурах еритроцитів виникають зміни, виявлення котрих необхідне для встановлення взаємозв'язку між структурно-функціональними порушеннями клітин і закономірностями впливу іонізуючого опромінення на живий організм. В рамках зазначеної проблеми у роботі проведено вивчення впливу іонізуючої радіації при розвитку злоякісних новоутворень в експериментальних та клінічних умовах на структурно-функціональні показники, гідратацію та діелектричні властивості еритроцитів, що необхідно для підвищення ефективності діагностики променевої патології, розробки ефективних радіопротекторів і є одним із перспективних шляхів вирішення проблеми пошуку показників, які характеризують загальний стан організму.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з держбюджетними НДР МОН України Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна: “Дослідження впливу гідратації та біологічно активних речовин на макромолекули і клітини в умовах дії іонізуючого випромінювання” (№ держреєстрації 0100U003334), “Дослідження впливу іонізуючого випромінювання і біологічно активних речовин на клітини та організм” (№ держреєстрації 0197U016741), “Фізичні механізми впливу іонізуючого випромінювання, температури і гідратації на макромолекули і біомембрани” (№ 0103U004236), 1998-2004 рр.; науково-дослідної роботи Інституту медичної радіології ім. С.П. Григор`єва, АМН України: “Молекулярно-метаболічні основи механізмів радіаційних і цитостатичних ушкоджень сполучної тканини у онкологічних хворих, їх індивідуальне прогнозування і корекція” (№ держ. реєстрації 0199U002236), 1999-2001 р. іонізуючий радіація мембрана еритроцит

Мета i задачі дослідження. Мета роботи полягала в дослідженні впливу іонізуючої радіації in vivo на структурно-функціональний стан, гідратацію та діелектричні властивості мембран еритроцитів при злоякісних новоутвореннях у хворих людей і при експериментальному канцерогенезі у лабораторних тварин.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:

1. Дослідити стан еритроцитів у нормі та при злоякісних новоутвореннях в умовах впливу променевої терапії за допомогою методу діелектрометрії в діапазоні надвисоких частот (НВЧ) в інтервалі температур від 2 до 47 єС.

2. Визначити характер впливу іонізуючого опромінення in vivo на гідратацію і час діелектричної релаксації молекул води в суспензіях еритроцитів при злоякісних новоутвореннях.

3. Дослідити зміни гемолітичної резистентності еритроцитів в популяції дорослих донорів і онкологічних хворих до і після променевої терапії. Визначити вплив температури на порушення бар'єрних функцій мембран еритроцитів в умовах опромінення in vivo.

4. Дослідити стан мембран еритроцитів щурів на моделі карциноми Герена під впливом локального фракційного рентгенівського опромінювання і в присутності радіосенсибілізатора за зміною таких біофізичних характеристик, як гемолітична резистентність, щільність розподілу за об'ємом, відносна провідність цитоплазми, індекс форми еритроцитів, вміст електролітів у плазмі крові та еритроцитах.

Вивчити вплив локального фракційного рентгенівського опромінювання в умовах експериментального канцерогенезу на комплексну діелектричну проникність і ступінь гідратації еритроцитів щурів.

Об'єкт дослідження: структурні та функціональні зміни мембран еритроцитів при злоякісних новоутвореннях у людей і при експериментальному канцерогенезі у щурів лінії Вістар.

Предмет дослідження: вплив іонізуючого опромінення in vivo на структурно-функціональний стан, діелектричну проникність та гідратацію мембран еритроцитів при наявності в організмі пухлини.

Методи дослідження: НВЧ-діелектрометрія, полум'яна фотометрія, кислотний і температурний гемоліз, спектроскопія імпульсів опору.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше досліджено діелектричні властивості суспензії еритроцитів людини при злоякісних новоутвореннях і в умовах радіаційного впливу на організм. Експериментально виявлено зростання частоти діелектричної релаксації молекул води в суспензії еритроцитів онкологічних хворих в температурному інтервалі 2-47 °С у порівнянні з частотою діелектричної релаксації молекул води в суспензії еритроцитів здорових донорів. Показано, що після променевої терапії частота діелектричної релаксації молекул води в суспензіях еритроцитів хворих із злоякісними новоутвореннями наближається до величини для здорових донорів.

2. Вперше виявлено, що при температурах 10-12 °С, 20-23 °С та 30-36 °С в суспензіях еритроцитів донорів та онкологічних хворих змінюється стан води, а в умовах радіаційного впливу на організм спостерігається збільшення ступеня гідратації мембран еритроцитів онкологічних хворих.

3. Встановлено неспецифічне зростання кислотної та термічної стійкості мембран еритроцитів в умовах онкологічної патології і зменшення в умовах опромінення організму. Показано, що при злоякісних новоутвореннях змінюються щільність розподілу еритроцитів за об'ємом і транспортні характеристики їх мембран.

4. Вперше показано, що частота діелектричної релаксації молекул води в суспензії еритроцитів щурів-пухлиноносіїв вища, ніж у контрольних тварин, що відповідає зменшенню кількості зв'язаної мембранами води. Структурні зміни мембран еритроцитів при експериментальному канцерогенезі залежать від дози опромінення організму і приводять до відновлення електролітної рівноваги й збільшення ступеня гідратації клітинних мембран.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані у дисертації результати можуть використовуватися при з'ясуванні механізмів пошкодження мембран еритроцитів при рості й поширенні пухлинного процесу і дії на цьому фоні іонізуючого випромінювання. Результати дослідження можуть бути застосовані у практичній медицині для контролю за ефективністю і удосконаленням методів променевої терапії при онкологічних захворюваннях. Результати роботи також можуть використовуватися для встановлення в експерименті на радіобіологічних і цитостатичних моделях характеру захисної, профілактичної і лікувальної дії препаратів на патогенетичний розвиток хвороби.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні експериментальної частини дисертації, проведенні розрахунків, аналізі даних літератури. У плануванні напрямків досліджень та інтерпретації одержаних результатів брали участь науковий керівник та співавтори публікацій. В опублікованих разом із співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає в наступному:

– у роботах [1, 2, 8, 11, 13, 15, 16] - у проведенні діелектричних вимірів, отриманні та узагальненні експериментальних даних, проведенні розрахунків фізичних констант і енергії активації, у співучасті в обговоренні та інтерпретації даних;

– у роботах [3-5, 7, 9, 14] - у постановці експерименту, аналізі літературних даних, проведенні вимірювань біофізичних і біохімічних показників і формулюванні висновків;

– у роботах [6, 10, 12] - участь у формулюванні й обґрунтуванні актуальності дослідження, експериментальних вимірюваннях, опрацюванні й інтерпретації одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи за темою дисертації доповідались і обговорювались на: II З'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, Україна, 1998); Conference for students, PhD students and young scientists. On Molecular Biology and Genetics (Kyiv, Ukraine, 2001); III З'їзді Українського біофізичного товариства (Львів, Україна, 2002); III З'їзді з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія), (Київ, Україна, 2003); I Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології з міжнародним представництвом (Львів, Україна, 2004); I Українській науковій конференції „Проблеми біологічної і медичної фізики” (Харків, Україна, 2004); 3^rd International Conference on „Broadband Dielectric Spectroscopy and its Applications” (Delft, Netherlands, 2004).

Публікації. Основні результати дисертації викладено в 5 статях у фахових наукових журналах і 11 тезах доповідей на національних та міжнародних конференціях і з'їздах.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, 5 розділів, заключення, висновків і списку використаних джерел. Повний обсяг дисертації складає 164 сторінки, містить 26 рисунків і 17 таблиць, з них 4 рисунки та 4 таблиці займають окремі аркуші. Список використаних літературних джерел, 294 найменування, займає 28 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертації, сформульовані мета і задачі дослідження, розкрито наукову новизну і практичне значення отриманих результатів, визначено особистий внесок здобувача, наведено відомості про апробацію результатів.

У першому розділі подано літературний огляд за темою дисертації, який охоплює аналіз експериментальних і теоретичних наукових праць, присвячених дослідженню впливу іонізуючого опромінення на стан еритроцитів та впливу онкологічної патології і експериментального канцерогенезу на структурно-функціональні характеристики еритроцитів. Розглянуто молекулярні механізми змін структурної стабільності мембран еритроцитів під впливом температури та діелектричні властивості розчинів макромолекул і суспензій клітин. На основі проведеного аналізу обґрунтовано актуальність проведення дослідження, визначені його мета і задачі.

У другому розділі описано об'єкти досліджень, обґрунтовано і розглянуто фізичні основи використаних методів дослідження.

Дослідження проведені на еритроцитах 47 здорових донорів і 95 онкологічних хворих на рак грудної залози, легені та тіла матки (II-III стадії за класифікацією TNM), які проходили лікування в Інституті медичної радіології АМН України. Медіана віку становила 50 і 52 роки для донорів і хворих. Групи хворих на рак грудної залози і рак тіла матки отримували комбіноване лікування: хірургічне втручання і післяопераційну променеву терапію в режимі класичного фракціонування. Разова осередкова доза на пухлину складала 6 Гр для хворих на рак грудної залози та 2 Гр для хворих на рак тіла матки (сумарна доза 40-45 Гр). Хворі на рак легені отримували променеву терапію як самостійний курс у режимі класичного фракціонування (сумарна доза 45-50 Гр), з разовою осередковою дозою 1,8-2,2 Гр. Променеву терапію проводили з використанням гамма-випромінювання ⁶⁰Со на терапевтичному апараті РОКУС-АМ.

При експериментальному канцерогенезі використовували статевозрілих щурів лінії Вістар масою 160-180 г (92 тварини). Проведено дві серії експериментів, по 4 групи тварин в кожній. Перша група - тварини з прищепленою карциномою Герена. Друга група - тварини, пухлини яких піддавали локальному фракційному рентгенівському опромінюванню в дозі 2 Гр Ч 7 фракцій (I серія) та в дозі 4 Гр Ч 8 фракцій (II серія). Сумарна доза на зону росту пухлини складала у I серії - 14 Гр, у II серії - 32 Гр. Третя група - тварини, яким внутрішньошлунково, за допомогою спеціального зонду вводили натрій сукцинат (100 мг/кг), за одну годину до опромінення у дозі 14 та 32 Гр. Четверта група - тварини, яким внутрішньошлунково вводили 400 мг/кг натрію сукцинату, за одну годину до опромінення у дозах 14 та 32 Гр. Контрольною була група інтактних щурів.

Локальне опромінення поверхні стегна щурів проводили на апараті РУМ-17 у стандартних технічних умовах: напруга на трубці U = 190 кВ, сила току I = 10 мА, фільтри 0,5 мм Cu + 1,0 мм Al, шкірно-фокусна відстань 40 см, потужність поглиненої дози дорівнювала 0,64 Гр/хв. Тіло тварин екранували свинцевою прокладкою завтовшки 3 мм.

Еритроцити відмивали від плазми крові у фізіологічному розчині (0,15 М NaCl, 10 мМ фосфатний буфер, рН 7,4) за стандартною методикою. Білі тіні еритроцитів виділяли з крові за методом [Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan D.J., 1963].

Вимірювання комплексної діелектричної проникності та частоти діелектричної релаксації молекул води у суспензії еритроцитів і тіней проводили методом НВЧ-діелектрометрії на частоті 9,2 ГГц. Величину дійсної частини діелектричної проникності е? визначали за зміною резонансної частоти резонатора зі зразком відносно порожнього резонатора, а уявну частину е?? - за величиною затухання потужності НВЧ поля внаслідок внесення у резонатор діелектрика. Температура досліджуваного зразка реєструвалася з точністю ±0,1 °С [Николов О. Т., Жилякова Т. А., 1991].

Частоту діелектричної релаксації молекул води в досліджуваних системах обчислювали за теорією Дебая. Ступінь гідратації диспергованих у воді об'єктів оцінювали по зміні статичної діелектричної проникності суспензії в порівнянні з величинами діелектричної проникності чистої води [Hasted J.B., Ritson D.M., Collie C.H., 1948].

Вміст електролітів K⁺ та Na⁺ в еритроцитах та плазмі крові вимірювали методом полум'яної фотометрії [Бриккер В.Н., 1961].

Для реєстрації динаміки кислотного та термічного гемолізу еритроцитів у роботі було використане обладнання для вимірювання оптичної густини біологічних суспензій [Дегтярев А.В., Руденко С.В., Бондаренко Т.П., 1990].

Об`єм та концентрація еритроцитів реєструвалися методом спектроскопії імпульсів опору [Richiery G.V., Akeson S.P. and Mel H.C., 1986].

Статистичну обробку отриманих даних проводили за методом Фішера-Стьюдента з використанням t - критерію та кореляційного аналізу.

У третьому розділі наведено одержані методом НВЧ-діелектрометрії результати дослідження діелектричних властивостей еритроцитів та їх тіней у нормі і при злоякісних новоутвореннях в умовах радіаційного впливу на організм. Отримані залежності від температури (в інтервалі 2-47 °С) дійсної та уявної частин комплексної діелектричної проникності та частоти діелектричної релаксації молекул води в суспензіях еритроцитів і тінях еритроцитів для донорів і хворих. Розраховано енергію активації часу діелектричної релаксації молекул води в досліджуваних системах і величини ступеня гідратації мембран еритроцитів донорів і хворих до і після опромінення.

Встановлено, що температурні залежності діелектричної проникності суспензій еритроцитів і їх тіней для донорів і хворих (рис. 1 а, б) в дослідженому інтервалі температур характеризуються немонотонними змінами діелектричної проникності е? і діелектричних втрат е?? та достовірним зростанням частоти діелектричної релаксації молекул води в суспензії еритроцитів хворих у порівнянні з частотою діелектричної релаксації молекул води в суспензії еритроцитів донорів (рис. 2 а, б).

З отриманих даних видно (рис. 2 а, б), що час діелектричної релаксації молекул води ф в суспензіях еритроцитів хворих на рак грудної залози та рак легені на етапі до застосування променевої терапії менше часу релаксації в суспензіях еритроцитів донорів. Отже, в суспензіях еритроцитів хворих із злоякісними новоутвореннями молекули води є більш рухливими.

Енергія активації часу діелектричної релаксації молекул води зростає на 9,8 кДж/моль при температурі 10 °С в суспензії еритроцитів хворих на рак грудної залози та на 8,1 кДж/моль в суспензії еритроцитів хворих на рак легені (табл. 1).

В суспензії еритроцитів донорів та онкологічних хворих спостерігається зміна енергії активації часу діелектричної релаксації молекул води на п'яти температурних інтервалах. Максимальні зміни енергії активації відбуваються від 12,6 до 31,4 кДж/моль.

Встановлено, що променева терапія призводить до наближення величини частоти діелектричної релаксації f_d молекул води в суспензіях еритроцитів хворих до показників здорових донорів. Для тіней еритроцитів онкологічних хворих спостерігається зменшення частоти діелектричної релаксації відносно донорів при температурах вище 20 °С, що свідчить про збільшення кількості зв'язаної води у мембранних системах.

Температури зламів Арреніусових залежностей, що спостерігаються (рис. 2), лежать в області температур, відомих як критичні, в яких відбуваються зміни швидкостей багатьох фізіологічних процесів, пов'язаних з мембранами еритроцитів.

Збільшення енергії активації в діапазоні 8-12 °С, як для донорів так і для хворих може бути пов'язане з глобальним структурним переходом в мембранах клітин, який торкається як периферійних білків цитоскелетного комплексу так і інтегральних білків мембрани, зокрема білка смуги 3.

Для з'ясування гідратного стану мембран еритроцитів при злоякісних новоутвореннях в умовах впливу іонізуючого опромінення були отримані температурні залежності декремента статичної діелектричної проникності суспензій еритроцитів та тіней еритроцитів донорів і онкологічних хворих (рис. 3, 4). Величина декремента статичної діелектричної проникності ?е_s суспензії відносно середовища пропорційна гідратації диспергованих речовин [Buchanan T.J., Haggis J.H. et all., 1952].

З рис. 3, 4 видно, що ступінь гідратації мембран еритроцитів онкологічних хворих зменшується в області температур від 2 до 15 °С і збільшується в інтервалах температур 15-20 °С і 28-47 °С, досягаючи екстремальних значень при температурах 20-23 °С, і мінімальних при температурах 10-12 °С та 30-36 °С, що свідчить про значні зміни стану вільної та зв'язаної води в суспензії еритроцитів. В умовах радіаційного впливу на організм спостерігається зростання ступеня гідратації мембран еритроцитів онкологічних хворих.

Отримані температурні залежності можна інтерпретувати наступним чином. Відомо, що, наявність пухлини супроводжується підвищенням вмісту у крові вільних радикалів і перекисів в умовах недостатності антиоксидантного захисту, що здатне викликати окисну денатурацію білків мембрани й цитоскелету еритроцитів, головним чином спектрину й білка смуги 3. В літературі неодноразово вказувалося, що зміни ліпідного складу і жирно-кислотного спектру мембран онкологічних хворих можуть приводити до утворення менш щільної вуглеводневої зони в центрі бішару і до меншої його структурної міцності. Порушення енергетичного обміну в еритроцитах і структурно-функціонального стану ліпідів мембран при злоякісних новоутвореннях, супроводжуються зростанням активності фосфоліпаз. Можливо, що підвищена протеолітична деградація білків мембрани й цитоскелету еритроцитів при патології вносить вклад у підвищення величини декремента статичної діелектричної проникності, тобто ступеня гідратації мембран еритроцитів, у порівнянні з показниками донорів, і, відповідно, причиною зміни частоти діелектричної релаксації молекул води в суспензії еритроцитів при злоякісних новоутвореннях в порівнянні з донорами є зменшення товщини гідратних примембранних шарів води, тобто частини зв'язаної води.

Зменшення гідратації (при 2-15 °С) пояснюється збільшенням кількості вільної води та відповідним зменшенням частки зв'язаної води внаслідок дестабілізації мембранних структур. Під впливом променевої терапії спостерігається підвищення ступеня гідратації мембран еритроцитів, ймовірно, у зв'язку з появою в крові нової популяції еритроцитів з оновленими мембранами.

У четвертому розділі наведено результати досліджень структурно-функціональних характеристик еритроцитів у нормі і при злоякісних новоутвореннях (рак грудної залози, легені, тіла матки) в умовах радіаційного впливу на організм, отримані за допомогою методів полум'яної фотометрії, спектроскопії імпульсів опору, кислотної і температурної резистентності еритроцитів.

За наявності в організмі пухлини відбуваються істотні зміни складу і розподілу еритроцитів за стійкістю до кислотного гемолізу, що виявляється в зміні часу початку та закінчення гемолізу та зсуві максимуму розподілу (рис. 5 а). Гамма-опромінення in vivo призводить до зменшення кислотної резистентності клітин крові всіх досліджених груп онкологічних хворих (рис. 5 б). В групі онкологічних хворих спостерігається вірогідне зменшення об'єму клітин до 89,6 % та зростання відносної провідності до 110%.

Порушення проникності клітинних мембран еритроцитів хворих на рак підтверджується даними дослідження електролітного балансу калію та натрію в еритроцитах та плазмі крові онкологічних хворих до і після променевої терапії (табл. 3).

До терапії у хворих виявлено високий достовірний рівень в клітинах вмісту обох типів іонів на тлі незначних змін їх у плазмі крові. Під впливом опромінення, при регресії пухлини, клітини втрачають цей підвищений фон.

Відбувається достовірне зниження вмісту іонів калію та натрію в еритроцитах онкологічних хворих у порівнянні з хворими до опромінювання. Зміни балансу основних іонів (K⁺, Na⁺) свідчать про порушення мембранної проникності клітин після опромінення.

При злоякісних новоутвореннях спостерігається зменшення енергії активації термогемолізу еритроцитів у хворих в порівнянні з донорами (табл. 4). Не виключено, що цей ефект пов'язаний з наявністю структурної нестабільності мембрани та дегідратацією мембран еритроцитів при злоякісному новоутворенні.

Променева терапія призводить до зміни білок-ліпідних взаємодій в мембранах, що супроводжується наближенням енергії активації термогемолізу еритроцитів онкологічних хворих до показників донорів.

Зростання енергії активації більш ніж у 2 рази у донорів та онкологічних хворих при температурах 45 С пов'язані з денатурацією білків. Таким білком може бути Hb, який в денатурованому стані з великою сорбційною здатністю здатен реагувати з білками мембран еритроцитів, викликаючи агрегацію білка смуги 3 і деструктуризацію мембрани.

У п'ятому розділі подано результати дослідження структурно-функціонального стану еритроцитів при пухлинному зростанні в експерименті на моделі щурів-пухлиноносіїв карциноми Герена під впливом локального фракційного рентгенівського опромінення пухлин у сумарних дозах 14 та 32 Гр і застосуванні натрію сукцинату.

Дослідження, проведені в групах тварин, показали, що ще до початку опромінення, у щурів з розвиненою пухлиною спостерігалися структурно-функціональні зміни стану мембран еритроцитів крові порівняно з інтактними тваринами. Показано, що об'єм еритроцитів щурів-пухлиноносіїв перевищує об'єм контрольних клітин в середньому на 13 %, і спостерігається збільшення відносної провідності мембран еритроцитів на 28 %. При опроміненні пухлин у сумарних дозах 14 та 32 Гр спостерігається зменшення відносної провідності щодо контрольних значень і зростання об'єму еритроцитів щурів-пухлиноносіїв на 20 та 18 % порівняно з інтактними тваринами. Оцінка стійкості еритроцитів до кислотного гемолізу показує, що при опроміненні пухлин проникність мембран еритроцитів, особливо при дозі 32 Гр, різко збільшувалася. При використанні натрію сукцинату спостерігалось достовірне зростання середнього об'єму еритроцитів щурів-пухлиноносіїв порівняно з контролем. В умовах опромінення та вживання натрію сукцинату показники кислотного гемолізу відновлюються до рівня контрольних значень.

Виявлені в експерименті порушення цілісності мембран еритроцитів, призводять до змін процесів активного та пасивного транспорту іонів крізь мембрану та зміни нормального співвідношення концентрації К⁺ і Na⁺ в системі клітина - позаклітинне середовище. Показано, що в умовах росту пухлини та опромінення спостерігається зниження вмісту К⁺ в еритроцитах до 93 % при сумарній дозі опромінення 14 Гр і до 95 % при дозі 32 Гр (у порівнянні з контролем), та підвищення рівня Na⁺ до 123 % і до 111 %, відповідно, в плазмі. Застосування натрію сукцинату при локальному фракційному рентгенівському опроміненні в дозі 14 Гр призводить до підвищення рівня К⁺ у еритроцитах в середньому на 11 % та зростанню рівня Na⁺ у плазмі на 14%, що мало відрізняється від групи біологічного контролю. При опроміненні в дозі 32 Гр та застосуванні препарату вміст К⁺ в еритроцитах дорівнює значенню у контрольній групі, а вміст Na⁺ у плазмі становить в середньому 89,5 % від контролю.

З метою виявлення особливостей дії пухлини та опромінення на еритроцити було проведено визначення індексу форми еритроцитів щурів-пухлиноносіїв. Встановлено, що в умовах дії локального фракційного рентгенівського опромінення спостерігається наявність недискоїдних клітин у суспензії, можливо, ехіноцитів. Застосування препарату сприяє трансформації клітин у сфероцити.

Отже, в умовах локального фракційного рентгенівського опромінення пухлини Герена та вживанні натрію сукцинату у тварин спостерігалася стабілізація показників електричних параметрів еритроцитів, відновлення електролітної рівноваги, підвищення часу гемолізу, відносне зростання індексу форми клітини.

Для з'ясування конформаційного стану мембран еритроцитів інтактних тварин та щурів в умовах канцерогенезу під впливом опромінення були отримані величини частоти діелектричної релаксації молекул води і декремента статичної діелектричної проникності суспензій еритроцитів. В суспензії еритроцитів щурів-пухлиноносіїв з карциномою Герена до проведення локального фракційного рентгенівського опромінення, спостерігається (рис. 6) збільшення частоти діелектричної релаксації f_d молекул води у порівнянні з частотою діелектричної релаксації молекул води в суспензії еритроцитів контрольних тварин. Можна припустити, що цей ефект обумовлений зменшенням кількості зв'язаної води, що є наслідком структурних перебудов мембран еритроцитів в умовах злоякісного новоутворення. Локальне фракційне рентгенівське опромінення пухлин карциноми Герена у щурів в сумарних дозах 14 та 32 Гр також призводить до зростання частоти діелектричної релаксації молекул води в суспензії еритроцитів на 12 та 10 % відносно контролю (інтактних тварин).

Введення щурам-пухлиноносіям натрію сукцинату в дозах 100 та 400 мг/кг, за годину до опромінення, у дозах 14 та 32 Гр призводить до зниження частоти діелектричної релаксації молекул води в суспензії еритроцитів відносно частоти діелектричної релаксації молекул води в суспензії еритроцитів хворих тварин, які не отримували препарат (рис. 6). В умовах дії локального фракційного рентгенівського опромінення та вживання натрію сукцинату у тварин спостерігається зменшення дегідратації мембран еритроцитів щурів з прищепленою карциномою Герена.

Виявлені на моделі щурів-пухлиноносіїв карциноми Герена порушення стану еритроцитів свідчать, що вони пов'язані з дегідратацією еритроцитарних мембран. Можливо, підвищена протеолітична деградація білків мембрани і цитоскелету еритроцитів в умовах патології вносить вклад у зменшення показників декремента статичної діелектричної проникності суспензій еритроцитів щурів з прищепленою карциномою Герена. Під впливом опромінення мембрани еритроцитів щурів-пухлиноносіїв зазнають суттєвих конформаційних зміни на молекулярному рівні, внаслідок чого змінюються їх структурні та функціональні властивості.

ВИСНОВКИ

1. Відсутність єдиного вичерпного методу, який дозволяє точно описати зміни функціонального стану еритроцитів при канцерогенезі до і після опромінення викликає необхідність використання комплексного підходу до дослідження структурних та функціональних властивостей клітинних мембран еритроцитів. Дослідження впливу іонізуючого опромінення in vivo на еритроцити при злоякісних новоутвореннях у людей і при експериментальному канцерогенезі у лабораторних тварин дозволило з'ясувати особливості зміни стану мембран еритроцитів, виявити деструктивні процеси, які в них відбуваються при наявності в організмі пухлини, показати доцільність їх використання у радіаційній терапії і при розробці нових методів діагностики.

2. Досліджено діелектричні властивості суспензії еритроцитів людини при злоякісних новоутвореннях та при дії іонізуючого опромінення in vivo в температурному інтервалі 2-47 °С. Встановлено, що при температурах 10-12 °С, 20-23 °С та 30-36 °С спостерігаються структурні зміни мембран еритроцитів донорів та хворих зі злоякісними новоутвореннями, що супроводжуються змінами енергії активації

3. Вперше знайдено, що гідратація мембран еритроцитів онкологічних хворих, зменшується в області температур від 2 до 15 °С і зростає в інтервалі температур 15-20 та 28-47 °С. Показано, що в умовах радіаційного впливу на організм відбуваються зміни ступеня гідратації мембран еритроцитів онкологічних хворих.

4. Встановлено неспецифічне зростання кислотної та термічної стійкості мембран еритроцитів в умовах онкологічної патології та її зменшення при застосуванні променевої терапії.

5. Виявлено зменшення показників енергії активації термогемолізу еритроцитів онкологічних хворих в інтервалі температур 37-60 °С до і після впливу іонізуючого опромінення in vivo в порівнянні з донорами, що свідчить про порушення структури бішару мембран еритроцитів при злоякісних захворюваннях.

6. Виявлено, що в умовах пухлинного росту спостерігається значне збільшення неоднорідності популяції еритроцитів, циркулюючих в кровоносному руслі. Показано, що частота діелектричної релаксації молекул води в суспензії еритроцитів щурів-пухлиноносіїв вища, ніж у контрольних тварин, що відповідає зменшенню кількості зв'язаної мембранами води. Встановлено, що структурні зміни мембран еритроцитів при експериментальному канцерогенезі в умовах впливу локального фракційного рентгенівського опромінення приводять до зсуву індексу форми еритроцитів в область більших значень, до відновлення електролітної рівноваги й збільшення ступеня гідратації клітинних мембран.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Batyuk L.V., Gatash S.V., Gorobchenko O.A., Nikolov O.T. Dielectric properties of human erythrocytes in normal and carcinogenic state // Вісн. Харк. ун-ту. - 2002. - № 560. - Біофізичний вісник. - Вип.1 (10). - С. 54-57.

2. Батюк Л.В., Гаташ С.В., Горобченко О.А., Николов О.Т. Исследование гидратации мембран эритроцитов до и после лучевой терапии // Вісн. Харк. ун-ту. - 2003. - № 606. - Біофізичний вісник. - Вип. 2(13). - С. 72-77.

3. Батюк Л.В. Структурні зміни мембран еритроцитів щурів під впливом карциноми Герена після фракційного опромінення та дії натрію сукцинату. // Український Радіологічний журнал. - 2003. - T. XI., вип.1. - С.63-67.

4. Батюк Л.В. Аналіз змін показників кислотного гемолізу і терморезистентності еритроцитів при променевої терапії злоякісних захворювань // Український Радіологічний журнал. - 2004. - вип.4. - С. 388-393.

5. Батюк Л. В. Вплив локального фракційного ікс-опромінювання на гідратацію і структурний стан еритроцитів в умовах експериментального канцерогенезу // Вісник проблем біології і медицини. - 2004. - вип.4.- С. 135-141.

6. Мамотюк Є. М., Френкель Л.А., Батюк Л. В., Тарасова О. М. Біофізична оцінка гемолітичної стійкості мембран еритроцитів крові у онкологічних хворих при хіміопроменевої терапії // Тези доповідей II З`їзду Українського біофізичного товариства (УБФТ- 98). - Харків. - 1998. - С. 175.

7. Batyuk L. V. Erythrocytes hemolysis parameters changes patients with cancer of various localization // Conference for students, PhD students and young scientists. On Molecular Biology and Genetics. Abstracts book.. - Kyiv (Ukraine). - 2001. - P.134.

8. Батюк Л.В., Гаташ С.В., Горобченко О.О. Вплив рентгенівського опромінення на діелектричну проникність та швидкість осідання еритроцитів онкологічних хворих. // Тези доповідей III з'їзду Українського біофізичного товариства. - Львів. - 2002. - С. 298.

9. Батюк Л.В., Мамотюк Е.М., Леонова І.А., Масленнікова Е.Л. Стан мембран еритроцитів щурів - пухлиноносіїв в умовах локального фракційного рентгенівського опромінення та дії сукцината натрію // III З'їзд з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія). - Київ. - 2003.- С.132.

10. Мамотюк Е.М., Батюк Л.В., Леонова И. А., Уразова В.И. Исследования термоустойчивости фракций эритроцитов в норме и при онкологической патологии // III З'їзд з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія). - Київ. - 2003. - С. 235.

11. Батюк Л. В., Гаташ С.В., Бережна О.А Вплив г - опромінення на еритроцити крові онкологічних хворих за даними НВЧ-діелектрометрії // Тези доповідей Установчого з'їзду Українського товариства клітинної біології. - Львів. - 2004. - С.50.

12. Batyuk L. V., Gatash S. V., Tovstiak V.V. Influence of temperature on the aggregation of erythrocytes in patients with malignant neoplasm's // Тези доповідей Установчого з'їзду Українського товариства клітинної біології. - Львів. - 2004. - С. 66.

13. Batyuk L. V., Gatash S. V. Study of erythrocyte hydration in normal and carcinogenic state // Тези доповідей I Української наукової конференції „Проблеми біологічної і медичної фізики”. - Харків. - 2004. - С. 134.

14. Batyuk L. V., Gatash S. V. Thermal resistance of erythrocytes in patients with malignant neoplasms // Тези доповідей I Української наукової конференції „Проблеми біологічної і медичної фізики”. - Харків. - 2004. - С. 135.

15. Gatash S., Gorobchenko O., Batyuk L., Nikolov O., Tovstiak V. Dielectric permittivity and hydration of human erythrocytes in normal and carcinogenic state // Book of abstracts. 3^rd International Conference on Broadband Dielectric Spectroscopy and its Applications. - Delft (Netherlands). - 2004. - P. 92.

Размещено на Allbest.ru

...