6. Kопач O., Федірко Н. Пермеабілізовані ацинарні секреторні клітини слинних залоз як модель вивчення Са2+-транспортних систем мембрани внутрішньоклітинних структур // Збірник тез доповідей VII міжнародного медичного конгресу студентів та молодих учених, 21-23 травня 2003 р., м. Тернопіль. - Тернопіль. - 2003. - С. 202 (Здобувач провела дослідження, взяла участь в опрацюванні даних та написанні тез, представила доповідь на конференції).

7. Копач О., Федірко Н., Кругліков І., Войтенко Н., Костюк П. Пуринергічна внутрішньоклітинна Са2+-сигналізація у ацинарних клітинах слинних залоз щурів // Установчий з'їзд українського товариства клітинної біології, 25-28 квітня 2004 р., м. Львів. - Львів. - 2004. - С. 35 (Здобувач взяла участь у проведенні досліджень, аналізі даних, написанні тез, представила стендову доповідь на конференції).

8. Kopach O.V., Kruglikov I.A., Kostyuk P.G., Fedirko N.V., Voitenko N.V.. Caffeine- induced changes of intrareticular Ca2+ homeostasis in rat submandibular salivary cells // IBRO-advanced school of neuroscience “Receptors, Channels, Messengers”, September 16-28 2004, Yalta (Ukraine). - Р. 17 (Здобувач провела дослідження та опрацювання даних, взяла участь у написанні та перекладі тез, представила доповідь на конференції).

9. Копач О.В., Федірко Н.В. Тапсигаргін-індуковані зміни Са2+-гомеостазу у секреторних клітинах підщелепної слинної залози щурів // І Українська наукова конференція “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики”, 20-22 вересня 2004 р., м. Харків. - Xapків. - 2004. - С. 143 (Здобувач провела всі дослідження, взяла участь в аналізі даних, написанні тез).

10. Копач О.В., Федірко Н.В., Войтенко Н.В. Функціонування кофеїн-чутливого Са2+ депо ендоплазматичного ретикулуму у секреторних клітинах підщелепної слинної залози щурів // Матеріали міжнародної конференції “Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи”, 7-9 жовтня 2004 р., м. Львів. - Львів. - 2004. - С. 37 (Здобувач самостійно провела дослідження та статистичну обробку даних, взяла участь в написанні тез, представила стендову доповідь на конференції).

11. Fedirko N., Kruglikov I., Kopach O., Vats J., Voitenko N.. Changes in functioning of rat submandibular salivary gland under streptozotocin-induced diabetes are associated with alterations of Ca2+ signaling and Ca2+ transporting pumps // XXXV IUPS Congress, 31 March-1 April 2005, San Diego, USA. (Здобувач провела частину досліджень та статистичну обробку результатів).

12. Kopach O., Kruglikov I., Voitenko N., Fedirko N. Caffeine-induced changes of Ca2+ homeostasis in rat submandibular salivary cells // Regional Biophysics Meeting, 16-20 March 2005, Zrece, Slovenija. - P. 42 (Здобувач самостійно провела дослідження та статистичну обробку даних, взяла участь в їх аналізі, написанні та перекладі тез).

13. Копач О.В., Войтенко Н.В., Федірко Н.В. Депо-керований вхід кальцію у секреторні клітин щурів // III конференція Українського товариства нейронаук, 22-25 травня 2005, м. Донецьк. - Нейронауки: теорет. і клін. аспекти. - Т.1, № 1. - 2005. - С. 54. (Здобувач провел всі дослідження, взяла участь у написанні тез).

14. Fedirko N.V., Kopach O.V., Kostyuk P.G., Voitenko N.V. Store-operated Ca2+ entry is regulated by mitochondria in acinar cells of rat submandibular salivary gland // 15-th IUPAB & 5-th EBSA International Biophysics Congress, August 27-Sept. 1 2005, Montpellier, France. - Europ. Biophys. J. - Vol. 34, № 6. - Р. 544. (Здобувач провела дослідження та опрацювання даних, взяла участь в аналізі та інтерпретації результатів).

15. Kopach O.V., Voitenko N.V., Fedirko N.V. Basal Ca2+ leak from endoplasmic reticulum of sub-mandibular acinar cells // 15-th IUPAB & 5-th EBSA International Biophysics Congress, August, 27- Semp. 1 2005, Montpellier, France. - Europ. Biophys. J. - Vol. 34, № 6. - Р. 803. (Здобувач самостійно провела дослідження та опрацювання даних, взяла участь в написанні тез, представила стендову доповідь на конференції).

АНОТАЦІЇ

Копач О.В. Роль ендоплазматичного ретикулуму у регуляції внутрішньоклітинної Са2+-сигналізації та функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози. - Рукопис.

Дисертація присвячена комплексному дослідженню механізмів вивільнення Са2+ із внутрішньоклітинних депо ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів.

В умовах досліду in vivo та in vitro показано кальцієву залежність секреторних відповідей ацинарних клітин підщелепної слинної залози при активації М-холінорецепторів. Розроблено експериментальні моделі для реєстрації [Са2+]ЕР у пермеабілізованих ацинарних клітинах та доведено їх адекватність для дослідження гомеостазу Са2+ у внутрішньоклітинних депо та Са2+-залежного екзоцитозу. Шляхом реєстрації зміни [Са2+]ЕР досліджено властивості та регуляцію InsP3-чутливих та ріанодинових рецепторів ЕР. Доведено участь ріанодинових рецепторів у [Ca2+]i-сигналізації в ацинарних клітинах. Показано, що в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози основним шляхом пасивного витоку Са2+ з ЕР є транслоконовий комплекс. Кількісно оцінено депо-керований вхід Са2+ в ацинарні клітини та виявлено важливу фізіологічну роль мітохондрій у його регуляції. Проведено ультраструктурний аналіз ацинарних клітин підщелепної слинної залози та виявлено локалізацію мітохондрій у безпосередній близькості до ЕР та у базальному полюсі клітини. Постулюється важлива фізіологічна роль колокалізації мітохондрій, Са2+-АТФаз та ріанодинових рецепторів у визначенні просторово-часових параметрів [Ca2+]i-сигналізації.

Ключові слова: [Са2+]і-сигналізація, ендоплазматичний ретикулум, ІnsР3-чутливі рецептори, ріанодинові рецептори, мітохондрії, депо-керований вхід Са2+, ацинарні клітини, підщелепна слинна залоза.

Копач О.В. Роль эндоплазматического ретикулума в регуляции внутриклеточной Са2+-сигнализации и функционирования ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2005.

Дисертация посвящена исследованию механизмов высвобождения Са2+ из внутриклеточных депо ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы крыс.

В експериментах in vivo и in vitro показано Са2+-зависимость секреции ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы при активации М-холинорецепторов. Разработано экспериментальные модели для прямой регистрации [Са2+]ЭР в пермеабилизированных ацинарных клетках и доказано их адекватность для исследования механизмов Са2+-гомеостаза и Са2+-зависимого экзоцитоза. Проведено измерение [Са2+]ЭР при активации InsP3- и рианодиновых рецепторов ЭР, исследовано их свойства и механизмы регуляции. Доказано участие рианодиновых рецепторов в [Ca2+]i-сигнализации в ацинарных клетках. Показано, что пассивная утечка Са2+ из ЭР ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы осуществляется через пору транслоконного комплекса мембраны ЭР. Проведено количественную оценку депо-управляемого входа Са2+ в ацинарные клетки и установлено важную роль митохондрий в его регуляции. Электронно-микроскопический анализ ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы показал локализацию митохондрий вблизи ЭР и в базальном полюсе ацинарных клеток. Предполагается важная физиологическая роль колокализации митохондрий, Са2+-АТФаз и рианодиновых рецепторов в определении пространственно-временных параметров внутриклеточной [Ca2+]i-сигнализации.

Ключевые слова: [Са2+]і-сигнализация, эндоплазматичний ретикулум, ІnsР3-чувствительные рецепторы, рианодиновые рецепторы, митохондрии, депо-управляемый вход Са2+, ацинарные клетки, подчелюстная слюнная железа.

Kopach O.V. Role of endoplasmic reticulum for the regulation of intracellular Са2+ signaling in acinar cells of rat submandibular salivary gland - Manuscript.

Thesis for Ph.D. degree on the specialty 03.00.13 - Human and Animals Physiology. - Ivan Franko National University of Lviv. Lviv, 2005.

Dissertation is devoted to a complex study of Ca2+ release from the intracellular Ca2+ stores in acinar cells of rat submandibular salivary gland.

In vivo and in vitro experiments showed that activation of m-cholinoreceptors leaded to the complex of Ca2+-dependent changes in the functioning of rat submandibular gland. Cholinergic stimulation in vivo leaded to rise of salivation rate, saliva amylase activity, protein content as well as secretion of Ca2+. In vitro administration to m-cholinoreceptors agonists caused increase of total calcium content and [Ca2+]i in isolated acinar cells.

Since activation of cholinoreceptors leads to release of Ca2+ from the endoplasmic reticulum (ER) we have elaborated methods for direct measurements of Ca2+ inside the ER. We have found that digitonin-permeabilized cells posses Са2+-dependent protein secretion and ATP-dependent Са2+ transport suggesting their acceptability for studying Са2+-dependent exocytosis and functioning of Ca2+ stores. Besides we have shown that в-escin permeabilized cells posses Ca2+ release from ER upon the activation of m-cholinoreceptors.

We have elucidated heterogeneity of intracellular Ca2+ stores in the acinar cells. Inhibition of Ca2+ ATPase of the ER with thapsigargin (Tg) resulted in the release ~ 30 % of total ER Ca2+ but subsequent application of Ach further release Ca2+ from Tg-discharged stores in permeabilized cells. Thus, the acinar cells posses the ІnsP3-dependent Tg-sensitive and -insensitive Ca2+ stores. Exogenous ІnsP3 decreased [Ca2+]ER with EC50 1,3 0,21 M. Such a release was amplified by Са2+ (100-400 nM), decreased by caffeine (2 mM). ATP (<1 mM) enhanced Ca2+ release but in high concentrations - suppressed it. Inhibition of ІnsP3-induced Ca2+ release by caffeine was eliminated by high concentration of InsP3 (20 M) and ATP (1 mM) indicating caffeine competition with InsP3 receptor domains.

We also established a contribution of ryanodine receptors (RyRs) to the Са2+ signaling in acinar cells. Caffeine-induced decrease of [Ca2+]ER in permeabilized cells (ЕС50 = 7.3 ± 1.1 мМ) was insensitive to heparin and blocked by ryanodine (100 М). Although in the intact cells, caffeine (10-30 mM) did not cause any changes of [Ca2+]i. [Ca2+]і transient appealed when caffeine was applied under the pair-blocked mitochondria and SERCA or PMCA. We also shown that addition of CCCP following the caffeine application leaded to a rapid increase [Ca2+]і. Thus, on the base of data obtained and electron-microscopy data we suggest that mitochondria entirely captures Са2+ released during activation of RyRs.

We elucidated passive Ca2+ leak from the ER of acinar cells. Such Са2+ leak is not mediated by InsP3- or RyRs receptors. Puromycin (0,1-1 mM), that removes nascent polypeptides from ribosomes, increased Са2+ leak independently of SERCA, InsP3- or RyRs receptors. Thus, we conclude that passive Са2+ leak from ER in acinar cells occurs through a translocon pore in ER membrane.

Store-operated Ca2+ entry is a major pathway for refilling of ER that's activated by emptying of intracellular Ca2+ stores. We have shown that emptying the stores by Tg or ACh leaded to activation of Ca2+ entry. We also found that mitochondria are required to support of Ca2+ entry in the acinar cells. The rate of Ca2+ influx and amplitude of [Ca2+]і transient were significantly lower when mitochondrial Ca2+ accumulated was prevented. Besides, inhibition of mitochondrial Ca2+ release also suppressed of store-operated [Ca2+]і rise. We concluded that trans-mitochondrial Ca2+ transport could have a crucial physiological role for support store-operated Ca2+ entry into acinar cells of rat submandibular salivary gland.

Кey words: [Са2+]і signaling, endoplasmic reticulum, ІnsР3-receptors, ryanodine receptors, mitochondria, store-operated Са2+entry, acinar cells, submandibular salivary gland.

Підписано до друку 5.11. 2005 р.

Формат 60Ч90/16. Друк на різографі. Папір офсетний.

Умовних друк. арк. 1,0. Тираж 100 прим. Замовл. № 27

ПП „Арк-Сервіс”

м. Львів, вул. Драгоманова 14/16, к.3

Размещено на Allbest.ru