Структурні особливості плазматичної та мітохондріальної мембран ентероцитів тонкої кишки щурів за дії іонізуючої радіації та кадмію

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 577.46+546.48/616.341:576.314:57.012+57.013

СТРУКТУРНІ ОСОБЛИВОСТІ ПЛАЗМАТИЧНОЇ ТА

МІТОХОНДРІАЛЬНОЇ МЕМБРАН ЕНТЕРОЦИТІВ ТОНКОЇ КИШКИ

ЩУРІВ ЗА ДІЇ ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ ТА КАДМІЮ

03.00.01 - радіобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИСІЛЬ ОЛЕНА ОЛЕКСАНДРІВНА

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Хижняк Світлана Володимирівна

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

біологічний факультет, провідний науковий співробітник

лабораторії фізико-хімічної біології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Серкіз Ярослав Іванович Інститут ядерних досліджень НАН України,

провідний науковий співробітник сектору радіаційних технологій

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Тугай Василь Андрійович

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

провідний науковий співробітник відділу біохімії м'язів

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології

та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м.Київ

Захист дисертації відбудеться "23" лютого 2004 року о 1600 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 433

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 60, спецрада Д26.001.24, біологічний факультет

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033 м.Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “22” січня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, к.б.н. Андрійчук Т.Р.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Зростаюче використання випромінювання в різних галузях промисловості, медицини та біології, небезпека аварій на АЕС - все це постійно посилює негативний вплив іонізуючої радіації на різноманітні компоненти біосфери, зокрема людину. Для України вплив іонізуючого випромінювання становить особливо серйозну проблему внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, яка класифікується як глобальна техногенна катастрофа. За сучасної екологічної ситуації, поряд із радіаційним фактором, значне місце посідають хімічні забруднювачі довкілля, зокрема сполуки важких металів. Однією з властивостей важких металів є їх накопичення в організмі, а їх стійкість до процесів природної детоксикації створює безпосередній ризик для здоров'я людини [Трахтенберг и др., 1994]. Кадмій, один із розповсюджених забруднювачів, не піддається біотрансформації, характеризується високою токсичною і канцерогенною дією. Навіть низькі рівні радіації сумісно із забрудненням важкими металами, що досить часто спостерігається в ряді районів, можуть взаємно посилювати вплив один одного на організм. Першим бар'єром при надходженні сполук кадмію до організму з їжею виступає тонка кишка, основна функція якої полягає в розщепленні та всмоктуванні екзогенних харчових субстратів [Уголев и др., 1986, 1992]. В той же час, тонка кишка вважається одним із найбільш радіочутливих органів [Федоровский, 1984].

Формування відповіді клітини на дію техногенних факторів, зокрема іонізуючої радіації та іонів кадмію, може бути значною мірою зумовлено змінами в структурі та функції як плазматичної, так і внутрішньоклітинних мембран. Оскільки, саме біологічні мембрани інтегрують діяльність окремих компартментів клітини та забезпечують її взаємодію із зовнішнім середовищем, пошкодження структурної цілісності мембран може призводити до порушення клітинного гомеостазу [Эйдус, 2001; Бурлакова и др., 1996; Burlakova, 2000]. Якщо вплив летальних та сублетальних доз випромінювання на організм достатньо вивчено, то механізми дії іонізуючої радіації на рівні клітинних мембран в області низьких доз та потужностей за умов хронічного впливу, залишаються остаточно не з'ясованими. Радіаційно-індуковані процеси, що відбуваються в різних клітинних мембранах, близькі за своєю природою - переходи молекул у вільнорадикальні стани, хімічна модифікація та розрив зв'язків макромолекул тощо. Кінцевий прояв реакції клітинних мембран на дію іонізуючої радіації залежить від особливостей як структури мембран, так і середовища їх оточення [Гродзінський, 2000].

З цих позицій, при дослідженні біологічних ефектів дії пошкоджуючих факторів, радіаційного та хімічного, особливого значення набуває вивчення структурно-функціональних порушень на рівні клітини та клітинних мембран.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках підрозділу ”Дослідження структурно-функціонального стану клітин слизової оболонки тонкого кишечника та печінки за умов впливу іонізуючої радіації” теми № 01 БФ 036-04 “Розробка наукових основ пошуку біологічно-активних сполук радіозахисної дії” (№ ДР 0101U002291) кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідити структурний стан плазматичної (апікальної) та мітохондріальної (внутрішньої) мембран ентероцитів тонкої кишки за умов гострого та хронічного впливу іонізуючої радіації та кадмію.

В зв'язку з цим були поставлені наступні завдання:

1. Дослідити одноразову дію іонізуючого випромінювання (в дозі 1,0 Гр) та кадмію (per os 1,0 мг/кг маси тіла), як окремо, так і сумісно, на структурні властивості плазматичної та мітохондріальної мембран ентероцитів тонкої кишки щурів.

2. За даних умов впливу оцінити просторову організацію білок-ліпідних комплексів плазматичної та мітохондріальної мембран ентероцитів.

3. Дослідити хронічну дію (протягом 145 діб, потужність дози 0,72 сГр/добу) іонізуючого випромінювання та кадмію (10 ГДК в питній воді), окремо та сумісно, на структурний стан плазматичної та мітохондріальної мембран ентероцитів тонкої кишки щурів.

4. Визначити фосфоліпідний склад різних мембран ентероцитів за умови гострої та хронічної дії досліджуваних чинників.

5. Дослідити Са2+-транспортуючу властивість мітохондріальної та плазматичної мембран ентероцитів за гострої чи хронічної дії різних чинників.

6. Методом факторного аналізу виявити основні ланки радіаційно-індукованих модифікацій структури плазматичної і мітохондріальної мембран ентероцитів тонкої кишки за умови гострого чи хронічного впливу іонізуючої радіації та кадмію.

Об'єкт дослідження: одноразова та хронічна дія іонізуючої радіації, окремо чи сумісно з іонами кадмію, на структуру мембран ентероцитів.

Предмет дослідження: фізико-хімічні та структурно-динамічні властивості плазматичної і мітохондріальної мембран ентероцитів тонкої кишки за одноразової та хронічної дії іонізуючої радіації чи сумісно з кадмієм.

Методи дослідження: радіометричні, флуоресцентні (з використанням зондів: пірену, 1_анілінонафталін-8-сульфонату (АНС), а також визначенням власної флуоресценції білків), біохімічні для визначення активності ферментів та вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), хроматографічні для визначення ліпідного складу мембран, радіоізотопний для вивчення Са2+_транспортуючої властивості мембран, а також математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне порівняльне дослідження одноразової (в дозі 1,0 Гр) та хронічної (в сумарно поглинутих дозах 0,3_1,0 Гр, потужність дози 0,72 сГр/добу) дії іонізуючої радіації, окремо чи сумісно з надходженням до організму низьких доз кадмію, на фізико-хімічні і структурно-динамічні властивості плазматичної (апікальної) та мітохондріальної (внутрішньої) мембран ентероцитів тонкої кишки щурів.

Отримані результати з використанням флуоресцентних зондів різної локалізації в мембрані (АНС та пірен) свідчать про відмінності структурної модифікації клітинних мембран ентероцитів за одноразової чи хронічної дії іонізуючої радіації та кадмію. Вперше показано, що за хронічної дії досліджуваних чинників для мітохондріальної мембрани характерним є збільшення структурної жорсткості білкових молекул та просторова перебудова в мембранах білок-ліпідних комплексів, на що вказують зміни ефективності індуктивно-резонансного переносу енергії в парах флуорофорів різної мембранної локалізації. Для апікальної мембрани ентероцитів виявлено зменшення структурної впорядкованості ліпідної фази як за хронічної, так і одноразової дії випромінювання та кадмію, а мітохондріальної - лише в умовах хронічної дії досліджуваних чинників. Результати досліджень фосфоліпідного складу клітинних мембран ентероцитів в умовах експерименту свідчать про зменшення в них відносного вмісту основних фосфоліпідів та підвищення рівня їх лізоформ, поряд з встановленими для мембран відмінностями у перерозподілі мінорних фосфоліпідів.

Виявлено порушення Са2+-транспортуючої здатності як апікальної мембрани ентероцитів, так і мітохондрій за умов проведених досліджень. Вперше за хронічного досліду показано інгібування процесу трансмембранного перенесення Са2+ апікальною мембраною ентероцитів за умови сумісної дії іонізуючої радіації та кадмію. Встановлено різноспрямовані зміни процесу енергозалежного накопичення Са2+ мітохондріями за умови одноразової чи хронічної дії досліджуваних чинників.

З використанням методу головних компонент математично доведено відмінності структурних перебудов апікальної та мітохондріальної мембран ентероцитів за одноразової чи хронічної дії іонізуючої радіації, окремо та сумісно з кадмієм, що дає можливість обґрунтувати висновки про особливості дії досліджуваних чинників на клітинні мембрани.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі дані поглиблюють відомості про біологічні особливості одноразової (1,0 Гр) та хронічної дії (в інтервалі доз 0,3_1,0 Гр) іонізуючої радіації, окремо та сумісно з надходженням до організму низьких доз кадмію.

Виявлено окремі ланки структурних порушень клітинних мембран в умовах впливу іонізуючої радіації та кадмію. Ці дані можуть становити основу для подальшого вивчення мембранних механізмів дії випромінювання та важких металів.

Викладені в роботі результати можуть бути використані в установах Міністерства охорони здоров'я при оцінці потенційної небезпеки сумісної дії іонізуючої радіації та важких металів, розробці заходів профілактики хронічних отруєнь та способів корекції патології мембранної природи, а також в педагогічному процесі при підготовці спеціалістів з радіобіології, біохімії, біофізики тощо.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проаналізовано наукову літературу за темою роботи, самостійно виконано експериментальні дослідження, проведено підготовку матеріалів публікацій, статистичну обробку та аналіз результатів. За участю наукового керівника проведено планування експериментальних робіт, інтерпретацію результатів дослідження, а також сформульовані висновки роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були висвітлені на: ІІ З'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), Міжнародній конференції "Фізика рідкого тіла: сучасні проблеми" (Київ, 2001), Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), III З'їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), II Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 2002), 6_й Пущинській школі-конференції молодих вчених (Пущино, 2002), науково-методичній конференції біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, 2002), Всеукраїнській науково-практичній конференції Інституту ядерних досліджень НАН України (Київ, 2003), Всеукраїнській конференції молодих вчених "Актуальні питання сучасного природознавства-2003" (Сімферополь, 2003), III З'їзді з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія) (Київ, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертаційних досліджень опубліковано 5 статей у фахових журналах та збірнику наукових праць, 10 тез доповідей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду наукової літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів власних досліджень з їх обговоренням, заключення, висновків, списку використаної літератури, що включає 220 джерел. Робота викладена на 159 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 18 рисунками та 21 таблицею.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проведені на білих безпородних щурах-самцях масою 180_200 г для гострого досліду, а хронічного - 150-160 г (на початок експерименту). Тварин розподіляли на чотири групи. Група І - гострий дослід: 1_ша підгрупа - контрольні тварини; 2-а підгрупа - тваринам перорально вводили хлорид кадмію в дозі 1,0 мг/кг живої маси, що відповідає 1/50 ЛД50; 3_я підгрупа - тварин тотально одноразово опромінювали на установці РУМ-17 з тубусом рентгенівськими променями в дозі 1,0 Гр за наступних умов: потужність дози 0,17 Гр/хв, фільтри 0,5 мм Сu та 1 мм Аl, сила струму 10 мА, напруга 200 кВ, шкіро-фокусна відстань 50 см; 4-а підгрупа - тваринам вводили хлорид кадмію і через дві години піддавали дії рентгенівського випромінювання в дозі 1,0 Гр. Щурів І групи декапітували через одну добу після впливу різних чинників. Даний термін обрано по декількох причинах: по-перше, повне оновлення ентероцитів тонкої кишки відбувається через 3_6 діб [Морозов и др., 1988], по-друге, при одноразовій дії іонізуючої радіації в діапазоні доз 0,5_3,0 Гр більш виражений вплив на функціонування епітелію тонкої кишки проявляється саме через 1 добу [Хижняк, 1997], а через 3 доби після опромінення в дозах менших 10 Гр спостерігається відновлення структурних властивостей тонкої кишки [Бродский и др., 1987].

За хронічного експерименту щурів розподіляли на наступні групи: ІІ група (5-та, 6-та, 7-ма, 8_ма підгрупи) - тривалість дослідження 42 доби; ІІІ група (9-та, 10-та, 11-та, 12-та підгрупи) - тривалість дослідження 84 доби; ІV група (13-та, 14-та, 15-та, 16-та підгрупи) - тривалість дослідження 145 діб. Тварини 5-ої, 9-ої та 13-ої підгруп - контрольні; 7-ої,11-ої та 15-ої підгруп піддавали лише дії кадмію; 6-ої, 10-ої та 14-ої підгруп - впливу г_випромінювання; 8-ої, 12-ої та 16_ої підгруп піддавали сумісній дії г_випромінювання та кадмію. Щурів ІІ, ІІІ та ІV груп декапітували через 42, 84 та 145 діб, що відповідає сумарно поглинутим дозам 0,3 Гр, 0,6 Гр та 1,0 Гр відповідно. Хронічне зовнішнє г_опромінення експериментальних тварин здійснювали на установці “ЕТАЛОН” (Інститут ядерних досліджень НАН України), яка як джерело випромінювання містила 60Со. Потужність дози становила - 0,72 сГр/добу. Дозиметричний контроль проводили перед початком досліду та 2 рази на тиждень протягом всього терміну дослідження, при необхідності вносили відповідні корективи. Хлорид кадмію щури отримували з питною водою, яка містила 0,01 мг/л CdCl2 в перерахунку на Cd2+ (10 ГДК). В середньому кожна тварина споживала 0,25 мкг CdCl2 / добу. Хронічний дослід проводили в трьох повторах.

В роботі використовували препарати апікальної мембрани (АМ), препарати мітохондріальної (внутрішньої) мембрани, які отримували у вигляді субмітохондріальних частинок (СМЧ), а також препарати мітохондрій ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки. Препарати АМ ентероцитів отримували згідно з методиками [Hopfer et al, 1973; Хижняк, 1997]; препарати мітохондрій - [Jemhoff et al, 1971; Ахмеров, 1978]; препарати СМЧ - [Северин и др., 1989]. Чистоту препаратів мітохондрій, СМЧ та АМ з експериментальних тварин аналізували електронно-мікроскопічним [Lewis et al, 1977] та біохімічним (по активності маркерних ферментів відповідних мембран [Chijsen et al, 1980; Ещенко и др., 1982]) методами. Всі препарати із експериментальних тварин характеризувалися достатнім ступенем чистоти, мембранні препарати мали вигляд везикульованих структур. Мg2+-АТФазну активність препаратів АМ та СМЧ визначали так, як вказано в роботах [Samogyi et al, 1962; Chijsen et al, 1980]. Вміст білку в досліджуваних препаратах визначали за методом Лоурі та співавторів (Lowry et al., 1951).

Інтенсивність флуоресценції 1,8-АНС (1-анілінонафталін-8-сульфонат), квантовий вихід флуоресценції та параметри зв'язування зонду з мембранними препаратами визначали згідно [Владимиров, Добрецов, 1980; Добрецов, 1989]. Дослідження мікров'язкості ліпідів препаратів АМ та СМЧ проводили, оцінюючи ступінь ексимеризації пірену, яка залежить від в'язкості оточення зонду в мембрані, незалежно для анулярних ліпідів та загальної ліпідної фази [Добрецов, 1989; Литвинов и др., 1982]. Просторову організацію білок-ліпідних комплексів в препаратах АМ та СМЧ оцінювали за методом індуктивно-резонансного переносу енергії з використанням трьох пар флуорофорів різної мембранної локалізації: триптофан - АНС, триптофан - пірен, пірен - АНС [Фоменко и др., 1985; Лактович, 1986; Шустанова и др., 2001]. Флуоресценцію триптофанових залишків білків препаратів АМ та СМЧ вимірювали у присутності або відсутності гідрофільного гасника (акриламіда) [Лактович, 1986; Демченко, 1988]. Всі флуоресцентні дослідження проводили на спектрофлуориметрі Shimadzu-RF 510 (Японія) в кварцевих односантиметрових кюветах.

Екстракцію ліпідів АМ та СМЧ проводили за методом Блайя і Даера [Bligh, Dyer, 1959]. Розділення фосфоліпідів проводили з використанням двовимірної мікротонкошарової хроматографії [Svetashev et al, 1972; Кейтс, 1975]. Кількісний аналіз холестеролу [Christie, 1979] проводили на хроматографі HRGC 5300 (Італія). (Дослідження вмісту фосфоліпідів та холестеролу проведено на базі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України) Визначення вмісту дієнових кон'югатів в препаратах АМ та СМЧ проводили згідно [Орехович, 1977], ТБК-активних продуктів - згідно [Куклей и др., 1995].

Вивчення пасивного накопичення [Miller et al, 1981] та зв'язування [Miller et al, 1982] Са2+ препаратами АМ, енергозалежного накопичення іонів препаратами мітохондрій [Костерин и др., 1985] проводили радіоізотопним методом з використанням 45Са2+ (0,2-0,3 мкКі/мл). Проби фільтрували через мембранні фільтри "Владипор" МФА-МА №3 (діаметр пор 0,4 мкм). Радіоактивність препаратів вимірювали на рідинно-сцинтиляційному лічильнику SL-4000 фірми "Іntertechnique" (Франція).

Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами статистики [Кучеренко та ін., 2001]. Для аналізу всієї сукупності досліджуваних параметрів за умов одноразової та хронічної дії іонізуючої радіації і кадмію використовували метод головних компонент [Иберла, 1972; Кучеренко та ін., 2001].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Cтруктурні властивості поверхневих ділянок мембран ентероцитів тонкої кишки. Фізичні властивості поверхневих ділянок апікальної та мітохондріальної мембран оцінювали при дослідженні параметрів зв'язування з препаратами АМ та СМЧ флуоресцентного зонду АНС (табл.1, 2), який переважно локалізується в полярній області мембранного бішару [Добрецов, 1989].

Таблиця 1

Спектральні характеристики флуоресцентного зонду АНС, зв'язаного з препаратами АМ ентероцитів тонкої кишки за дії іонізуючої радіації та кадмію, (M±m, n=10-15)

Група дослідних тварин	Контроль	Кадмій	Іонізуюча радіація	Кадмій +
				іонізуюча радіація
	Константа зв'язування, 104 М-1
І	5,7±0,3	4,7±0,3*	4,9±0,2*	4,9±0,2*
ІІ	6,0±0,5	6,6±0,4	6,5±0,3	6,4±0,4
ІІІ	5,9±0,3	6,3±0,5	5,2±0,3	6,1±0,4
ІV	5,9±0,4	4,2±0,4*	7,4±0,5*	8,0±0,5*
	Кількість місць зв'язування, нмоль / мг білка
І	8,2±0,4	11,4±0,7*	10,2±0,5*	9,5±0,4*
ІІ	7,6±0,4	7,9±0,4	8,1±0,3	8,8±0,3*
ІІІ	7,0±0,4	8,8±0,5*	8,5±0,3*	7,3±0,2
ІV	7,5±0,3	5,3±0,6*	6,5±0,2*	6,3±0,2*
	Квантовий вихід флуоресценції, відн.од.
І	1,0	0,94±0,03	0,89±0,02*	0,90±0,02
ІІ	1,0	0,83±0,02*	0,91±0,03	0,80±0,02*
ІІІ	1,0	0,74±0,02*	0,89±0,02*	0,84±0,02*
ІV	1,0	0,70±0,02*	0,85±0,02*	0,80±0,02*

Примітка. Тут і далі: * - р < 0,05 по відношенню до контролю;

І група - гострий дослід;

ІІ, ІІІ та ІV групи - хронічний дослід тривалістю 42, 84 та 145 діб відповідно

Визначені зміни спектральних характеристик мембранозв'язаного АНС (інтенсивність флуоресценції, квантовий вихід флуоресценції, параметри зв'язування зонду: кількість місць зв'язування АНС та константа асоціації зонду з окремим центром сорбції) вказують на наявність такої структурної модифікації апікальної та мітохондріальної мембран ентероцитів за одноразової та хронічної дії випромінювання та кадмію, яка може визначатись змінами як ліпідної (в області полярних голівок та гліцеринових залишків фосфоліпідів), так і білкової компоненти.

Слід відмітити, що при зв'язуванні АНС з АМ, на відміну від СМЧ, спостерігаються виражені зміни квантового виходу флуоресценції зонду, особливо за хронічної дії досліджуваних чинників (табл.1). Зниження квантового виходу свідчить про локальні зміни фізичного оточення зонду, що може бути обумовлено збільшенням доступності зонду гасінню молекулами води або полярними продуктами ПОЛ [Лебедь и др., 1997]; не виключені зміни в'язкості мікрооточення зонду [Горбенко, 1996].

Оцінка просторової організації мембран ентероцитів тонкої кишки. Дослідження спектральних характеристик триптофанової флуоресценції препаратів АМ та СМЧ ентероцитів в присутності або відсутності зовнішнього гасника, акриламіду [Лактович, 1986; Демченко, 1988], дозволило виявити відмінності конформаційних перебудов білкових молекул даних мембран за одноразової та хронічної дії іонізуючої радіації та кадмію. Просторову організацію білок-ліпідних комплексів в мембранах ентероцитів оцінювали за допомогою методу індуктивно-резонансного переносу енергії (ІРПЕ) в парах флуорофорів: триптофан - пірен, триптофан - АНС та пірен - АНС, які локалізуються в різних ділянках мембрани. Ефективність ІРПЕ в кожній парі в значній мірі залежить від взаємного розташування ділянок переважної локалізації флуорофорів, що дає можливість оцінити зміни просторової організації мембрани [Фоменко и др., 1985]. При аналізі результатів досліджень враховували, що найбільш вірогідні ділянки локалізації триптофанових залишків - це гідрофобні ділянки білків, які можуть знаходитись в мембрані як в білковому, так і в ліпідному оточенні [Лебедь и др., 1997]; флуоресцентний зонд АНС переважно локалізується на межі розподілу ліпід-вода, а пірен - в зоні жирнокислотних ланцюгів фосфоліпідів [Добрецов, 1989].

Виявлене зростання триптофанової флуоресценції білкових молекул в препаратах АМ (15_30%) та зниження ефективності ІРПЕ в парі триптофан - пірен (15-20%) вказує на можливість утворення білкових конгломератів в АМ за одноразової та хронічної дії випромінювання та кадмію. Лише за гострого досліду спостерігається підвищення величини ефективної константи гасіння триптофанової флуоресценції препаратів АМ акриламідом приблизно на 15-25% відносно контролю, що свідчить про зменшення структурної жорсткості білкових молекул.

В гострому досліді структурні зміни мітохондріальної мембрани, на відміну від АМ, обумовлюють частковий вихід білкових молекул з ліпідного оточення. На це вказує виявлене зниження інтенсивності триптофанової флуоресценції білків, підвищення ефективності ІРПЕ в парі флуорофорів триптофан - АНС та зменшення кількості триптофанових залишків, які доступні гасінню акриламідом. За одноразової дії досліджуваних чинників структурна жорсткість білкових молекул мітохондріальної мембрани зменшується.

За всіх термінів хронічної дії іонізуючої радіації та кадмію відбувається просторова перебудова білок-ліпідних ансамблів в мітохондріальній мембрані, на що вказують зміни ефективності ІРПЕ в парах флуорофорів різної мембранної локалізації. Крім того, хронічна дія іонізуючої радіації та кадмію призводить до зростання жорсткості білкових молекул мітохондріальної мембрани, оскільки за даних умов ефективна константа гасіння триптофанової флуоресценції акриламідом зменшується відносно контролю приблизно на 15-30%.

Отримані результати свідчать про різні шляхи структурної модифікації АМ і СМЧ за одноразової та хронічної дії іонізуючої радіації і кадмію в умовах проведеного дослідження. Конформаційна модифікація білкових молекул характерна для обох досліджуваних мембран ентероцитів. Однак, для мітохондріальної мембрани слід відмітити більш виражені зміни топографії мембранних компонентів та порушення білок-ліпідних взаємодій в умовах хронічного впливу іонізуючої радіації та кадмію.

Мікров'язкість ліпідної компоненти мембран ентероцитів тонкої кишки. Мікров'язкість ліпідної компоненти досліджуваних мембран оцінювали за ступенем ексимеризації пірену при двох величинах довжини хвилі збудження 335 нм (N335) та 280 нм (N280), для незалежного визначення в'язкості загальної ліпідної фази та анулярних (прибілкових) ліпідів відповідно. Величина ступеню ексимеризації пірену обернено пропорційна мікров'язкості відповідної ліпідної фази [Добрецов, 1989]. В препаратах АМ показано зростання N280 в середньому на 20% відносно контролю за одноразової окремої чи сумісної дії досліджуваних чинників, що свідчить про зменшення мікров'язкості анулярних ліпідів АМ (табл.3). В той же час, лише за умови їх сумісної дії спостерігається зниження мікров'язкості загальної ліпідної фази АМ, про що свідчить ріст N335 на 18%. Мікров'язкість ліпідної компоненти мітохондріальної мембрани за даних умов досліду майже не змінюється.

Хронічна дія іонізуючої радіації та кадмію призводить до зменшення структурної впорядкованості ліпідів як АМ, так і СМЧ, на що вказує зниження мікров'язкості анулярних ліпідів та загальної ліпідної фази досліджуваних мембран в різні терміни хронічного досліду. Слід відмітити, що на відміну від АМ зміни мікров'язкості ліпідної компоненти СМЧ спостерігаються в ранні терміни хронічного експерименту (табл.3).

Представлені результати свідчать про більш глибокі порушення ліпідної компоненти апікальної і, особливо, мітохондріальної мембран в умовах хронічної дії іонізуючої радіації та кадмію на відміну від одноразової дії досліджуваних чинників. Зупиняючись на можливих причинах зниження мікров'язкості ліпідів мембран, слід відмітити кількісні зміни фосфоліпідного складу, вмісту холестеролу, ступеню ненасиченості жирних кислот, інтенсивності протікання процесів ПОЛ в мембранах тощо.

Cклад ліпідної компоненти мембран ентероцитів тонкої кишки. Фосфоліпідний склад мембрани - один з головних факторів, який визначає її структурну організацію та функціональний стан, а також обумовлює її ранню відповідь на зовнішні впливи [Коломийцева, 1989]. В гострому та хронічному дослідах вміст загальної фракції фосфоліпідів (ФЛ) в препаратах АМ зменшується за окремої дії іонізуючої радіації та сумісно з кадмієм (табл.4). Крім того, в препаратах АМ відмічено зменшення вмісту холестеролу (ХС), особливо за сумісної дії досліджуваних чинників: на 32% для гострого та 34-43% для хронічного досліду відносно відповідного контролю. В препаратах СМЧ лише за умов хронічного досліду спостерігається зростання вмісту ФЛ. Величина молярного співвідношення ХС/ФЛ, важлива характеристика мембран, яка в певній мірі пов'язана з їх структурно-функціональною активністю, зменшується в АМ за хронічної окремої та сумісної дії досліджуваних чинників, що обумовлено зниженням вмісту ФЛ і ХС. За хронічної окремої дії іонізуючої радіації чи сумісно з кадмієм також спостерігається зниження величини молярного співвідношення ХС/ФЛ для препаратів СМЧ, на відміну від росту показника за одноразової дії досліджуваних чинників (табл.4).

Встановлено, що за всіх умов впливу іонізуючої радіації та кадмію відбувається перерозподіл вмісту окремих фосфоліпідів в препаратах АМ та СМЧ. При цьому, для АМ характерним є зниження відносного вмісту основних фосфоліпідів: фосфатидилхоліну (ФХ) та фосфатидилетаноламіну (ФЕА), за окремої одноразової чи хронічної дії випромінювання. В препаратах СМЧ зниженим є вміст ФХ, ФЕА та кардіоліпіну за дії іонізуючої радіації чи сумісно з кадмієм в гострому та хронічному дослідах. Зменшення вмісту основних фосфоліпідів супроводжується перерозподілом вмісту мінорного компонента фосфоліпідів в досліджуваних мембранах. Так, одноразова та хронічна дія іонізуючої радіації чи сумісно з кадмієм призводить до зростання відносного вмісту фосфатидилсерину (ФС), а також зменшення - сфінгомієліну (СФМ) та фосфатидилінозитолу (ФІ) в АМ. Для мітохондріальної мембрани характерним є зростання відносної кількості ФІ, ФС та СФМ за даних умов впливу. Необхідно відмітити, що за одноразової та хронічної дії досліджуваних чинників в обох мембранах зростає відносний вміст лізоформ фосфоліпідів: лізофосфатидилхоліну (ЛФХ) та лізофосфатидилетаноламіну (ЛФЕА), в середньому в 1,5_2,6 разів відносно контролю. Виявлене збільшення рівня лізоформ (ЛФХ і ЛФЕА), зростання кількості вільних жирних кислот та перерозподіл в накопиченні продуктів ПОЛ (дієнових кон'югатів та малонового диальдегіду) в гострому та хронічному дослідах, вказує на активізацію процесів ПОЛ в апікальній та мітохондріальній мембранах ентероцитів за даних умов.

Таким чином, однією з причин порушення співвідношення ліпідів в складі апікальної та мітохондріальної мембран, може бути активізація процесу окиснення ліпідів, основними субстратами якого виступають фосфоліпіди. Результатом таких порушень є, ймовірно, ослаблення ліпід-ліпідних і білок-ліпідних взаємодій в мембранах, що призводить до зміни показників в'язкості, провідності, ферментативної активності та проникності.

Са2+-Транспортуючі властивості мембран ентероцитів тонкої кишки. Наслідком виявлених структурних змін апікальної та мітохондріальної мембран ентероцитів можуть бути порушення їх функціонування. Результати по накопиченню Са2+ везикульованими препаратами АМ ентероцитів тонкої кишки вказують на активізацію процесу трансмембранного перенесення іону за окремої одноразової дії іонізуючої радіації (рис.1, А). Це обумовлюється виявленим в роботі зростанням кількості Са2+-зв'язуючих ділянок на мембрані чи підвищенням їх доступності, а також збільшенням проникливості мембрани для іону [Хижняк та ін., 1996]. Механізм пригнічення за умов гострого досліду транспорту кальцію АМ в присутності іонів кадмію, відомого блокатора Са2+-каналів, полягає в його конкуренції за ділянки зв'язування Са2+ на мембрані. В хронічному досліді за окремої дії досліджуваних чинників спостерігаються аналогічні зміни трансмембранного перенесення Са2+. За хронічної сумісної дії іонізуючої радіації та кадмію пригнічення досліджуваного процесу відбувається за рахунок виявленого зниження кількості та/або доступності Са2+-зв'язуючих ділянок АМ, що пов'язане з більш вираженою структурною модифікацією мембрани за даних умов.

А	Б
Рис.1. Накопичення Са2+ препаратами АМ (А) та мітохондрій (Б) ентероцитів тонкої кишки за дії іонізуючої радіації та кадмію, (M±m, n=6-7)

За одноразової та хронічної дії іонізуючої радіації і кадмію спостерігаються різноспрямовані зміни процесу енергозалежного накопичення Са2+ препаратами мітохондрій (рис.1, Б). Відомо, що транспорт Ca2+ з цитозолю в мітохондрії здійснюється за участю Ca2+_уніпортера, розташованого на внутрішній мембрані цих органел, а рушійною силою цього транспорту є енергія трансмембранного електрохімічного градієнта іонів Н+ [Евтодиенко, 2000; Косенко и др., 2003]. Виявлені зміни енергозалежного транспорту іонів кальцію препаратами мітохондрій можуть відбуватися внаслідок порушення трансмембранного градієнта Н+ за рахунок роз'єднання процесів окисного фосфорилювання.

Отже, виявлені порушення Са2+-транспортуючої властивості АМ та мітохондрій ентероцитів тонкої кишки як за одноразової, так і хронічної дії іонізуючої радіації та кадмію, в першу чергу пов'язані зі структурними перебудовами мембран, порушеннями взаємодії між їх білковими та ліпідними компонентами.

Аналіз структурного стану мембран ентероцитів за методом головних компонент. Аналіз одержаних результатів дослідження одноразової та хронічної дії іонізуючої радіації і кадмію на клітинні мембрани ентероцитів тонкої кишки свідчить про складний характер їх реакції на окрему або комбіновану дію факторів фізичної та хімічної природи. Для визначення прихованих, неявних закономірностей за одночасного протікання різноманітних процесів, які об'єктивно існують, але не піддаються безпосередньому спостереженню, використовують методи багатомірного імовірнісного аналізу, зокрема метод головних компонент. Згідно цього методу множина досліджуваних параметрів може бути представлена у вигляді лінійної комбінації кількох гіпотетичних змінних - головних компонент. Метою аналізу є вибір мінімальної кількості таких перетворених змінних, котрі могли б забезпечити максимально повний опис існуючих кореляцій між досліджуваними величинами [Кучеренко та ін., 2002].

Для аналізу методом головних компонент результатів проведеного дослідження фізико-хімічних та структурно-динамічних властивостей апікальної і мітохондріальної мембран ентероцитів тонкої кишки за одноразової та хронічної дії іонізуючої радіації і кадмію обрано 18 показників, що характеризують структурний стан цих мембран. Результати отриманої кореляційної матриці свідчать, що перші чотири компоненти вичерпують близько 80% загальної дисперсії, тому надалі аналіз проводиться в просторі ознак найсуттєвіших чотирьох головних компонент (а1,а2,а3,а4). Оскільки детальний аналіз одночасно всієї сукупності досліджуваних результатів ускладнено великою кількістю представлених груп, проведено групування ознак за об'єктом досліджень (апікальна чи мітохондріальна мембрани) та за типом впливу досліджуваних чинників (гострий чи хронічний дослід).

Представлені на рис.2 результати свідчать про цілком виражене групування ознак структурного стану АМ за гострого чи хронічного дослідів. Причому, за хронічної дії іонізуючої радіації та кадмію розподіл відбувається за терміном впливу чи за дією досліджуваного чинника, а саме кадмію. Аналогічні результати по групуванню ознак структурного стану отримані для мітохондріальної мембрани (рис.3).

Результати групування у просторі головних компонент ознак структурного стану мембран ентероцитів за одноразової дії іонізуючої радіації та кадмію вказують на чітке відокремлення двох кластерів, які характеризують стан апікальної чи мітохондріальної мембран.

За хронічної дії досліджуваних чинників більш зручно аналізувати розподіл ознак структурного стану мембран у трьохмірному просторі головних компонент а1, а2, а3 (рис.4). В залежності від терміну дослідження, виявлено розмежування

Таким чином, аналіз отриманих результатів свідчить про відмінні шляхи реалізації радіаційно-індукованих порушень структури апікальної та мітохондріальної мембран ентероцитів за одноразової чи хронічної дії іонізуючої радіації, як окремо, так і сумісно з кадмієм.

ВИСНОВКИ

1. Результати дослідження дії іонізуючої радіації, окремо чи сумісно з іонами кадмію, одноразово (1,0 Гр; 1,0 мг Сd2+/кг) та хронічно протягом 42, 84, 145 діб (0,72 сГр/добу; 0,25 мкг Сd2+/добу) свідчать про відмінності в шляхах реалізації впливу досліджуваних чинників на структурно-функціональні властивості плазматичної (апікальної) та мітохондріальної (внутрішньої) мембран ентероцитів тонкої кишки щурів. За умов хронічного досліду не виявлено монотонної залежності радіаційно-індукованого ефекту від величини дози іонізуючої радіації.

2. Встановлено, що одноразове опромінення, окремо чи сумісно з кадмієм, призводить до структурної модифікації апікальної мембрани ентероцитів тонкої кишки щурів, яка полягає в зміні фізичних властивостей поверхневих ділянок мембрани, зменшенні структурної жорсткості білкових молекул та мікров'язкості анулярних ліпідів. Структурні перебудови мітохондріальної мембрани ентероцитів за даних умов дослідження характеризуються, в основному, конформаційними змінами білкових молекул та порушенням білок-ліпідних взаємодій.

3. Хронічна дія іонізуючого випромінювання, окремо чи сумісно з надходженням кадмію, викликає більш виражені різнобічні структурні зміни як ліпідного, так і білкового компонента апікальної та мітохондріальної мембран ентероцитів, в порівнянні з гострим дослідом. Для апікальної мембрани характерними є зміни фізичних властивостей поверхневих ділянок, зменшення структурної впорядкованості як анулярних ліпідів, так і загальної ліпідної фази. Деструктивні зміни мітохондріальної мембрани полягають в зниженні структурної впорядкованості ліпідної фази, порушенні динамічних властивостей білкових молекул та просторової організації білок-ліпідних комплексів.

4. Результати порівняльного дослідження якісного та кількісного складу ліпідів апікальної та мітохондріальної мембран ентероцитів вказують на відмінності їх вмісту за одноразової чи хронічної дії досліджуваних чинників. Для апікальної мембрани характерним є зниження вмісту холестеролу, основних фосфоліпідів (фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноламіну) та перерозподіл у вмісті мінорного компонента фосфоліпідів в умовах експерименту. Для мітохондріальної мембрани встановлені зміни окремих фосфоліпідів фракцій: зниження вмісту фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну та кардіоліпіну поряд із зростанням вмісту мінорних фосфоліпідів за одноразової та хронічної дії випромінювання чи сумісно з кадмієм. Виявлене в досліджуваних мембранах зростання вмісту лізоформ фосфоліпідів та перерозподіл у накопиченні продуктів ПОЛ свідчить про активізацію процесу окиснення ліпідів за одноразової чи хронічної дії випромінювання та кадмію.

5. Виявлено порушення Са2+_транспортуючих властивостей апікальної та мітохондріальної мембран в умовах експерименту. Сумісна хронічна дія іонізуючої радіації та кадмію, на відміну від одноразової, призводить до інгібування процесу трансмембранного перенесення Са2+ апікальною мембраною та зростання енергозалежного накопичення Са2+ мітохондріями ентероцитів.

6. Методом головних компонент виявлено групування ознак структурно-функціонального стану мембран ентероцитів у просторі головних компонент, як за типом мембрани (апікальна чи мітохондріальна), так і за типом впливу досліджуваних чинників (окремому чи сумісному; одноразовому чи хронічному). В хронічному досліді найбільш виражені зміни спостерігаються за сумісної дії іонізуючої радіації та кадмію.

радіація кадмій мембрана ентероцити

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Хижняк С.В., Бублик А.А., Кисиль Е.А., Войцицкий В.М., Кучеренко Н.Е. Влияние ионизирующей радиации на структуру и функциональные свойства базолатеральной мембраны энтероцитов тонкого кишечника // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1999. - Т.39, № 6. - С.644-647. (Здобувачем проаналізовано літературу, особисто отримано препарати базолатеральної мембрани ентероцитів та досліджено їх структурний стан з використанням зонду пірену; проведено математичну обробку та аналіз результатів)

2. Хижняк С.В., Ващенко І.В., Бублик А.А., Кисіль О.О., Войціцький В.М. Вплив сублетальних доз іонізуючої радіації на структурно-динамічні властивості білкових молекул апікальної мембрани ентероцитів // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Сер. Біологія. - 1999. - Вип.29. - С.21-23. (Здобувачем проаналізовано літературу, особисто отримано препарати апікальної мембрани ентероцитів та досліджено інтенсивність триптофанової флуоресценції білків мембран у відсутності та присутності акриламіду, здійснено математичну обробку та обговорення результатів, підготовлено матеріали до друку)

3. Клепко А.В., Хижняк С.В., Кисіль О.О., Бабич Л.В., Прохорова А.О., Войціцький В.М. Дослідження хронічної дії малих доз іонізуючої радіації та кадмію на різні тканини щурів // Проблеми радіаційної медицини та радіобіології. - Київ: НЦРМ АМН України, 2003. - Вип. 9. - С.39-45. (Здобувачем проаналізовано літературу, проведено визначення вмісту продуктів ПОЛ, здійснено математичну обробку та обговорення результатів, підготовлено матеріали до друку)

4. Хижняк С.В., Клепко А.В., Кисіль О.О., Бабич Л.В., Міщук Д.О., Войціцький В.М., Кучеренко М.Є. Біологічні ефекти хронічної дії йонізувальної радіації та йонів кадмію // Український радіологічний журнал. - 2003. - Т.11, Вип.3. - С.298-304. (Здобувачем проаналізовано літературу, досліджено вміст ліпідів та продуктів ПОЛ, проведено інтерпретацію отриманих експериментальних даних, їх математичну обробку, підготовлено матеріали до друку)

5. Войцицкий В.М., Хижняк С.В., Курашов А.В., Кисиль Е.А., Бездробна Л.К. Использование метода главных компонент при оценке сочетанного действия на организм антропогенных факторов окружающей среды // Екологічний вісник. - 2003. - Спец. вип. - С.176-185. (Здобувачем проаналізовано літературу, здійснено експериментальну частину, обговорено і написано статтю, участь у математичній обробці та узагальненні результатів)

6. Войціцький В.М., Хижняк С.В., Гаврилей В.І., Кисіль О.О. Фізичні властивості плазматичної мембрани ентероцитів тонкої кишки при дії іонізуючої радіації // Тези доп. ІІ з'їзду Укр. біофіз. товариства. - Харків: Вид-во ХДУ, 1998.-С. 251.

7. Войцицький В.М., Кисиль Е.А., Клепко А.В., Хижняк С.В., Кучеренко Н.Е. Сочетанное влияние ионов кадмия и ионизирующей радиации на функциональные свойства тонкого кишечника // Тез. Междунар. конф. Биорад-2001 "Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды".- Сыктывкар: Коми научный центр УКОРАН, 2001.- С.5-6.

8. Hizhnyak S.V., Klepko A.V., Kysil O.O., Stepanov U.V., Voitsitskiy V.M. Influence of ionizing radiation on microviscosity of the small intestine enterocyte plasma membrane // Abstr. International Conference “Physics of liquid matter: modern problems”. - Kyiv: Ed. L.Bulavin, 2001. - 10-3P. - P.181.

9. Кисиль Е.А., Быць Н.В. Структурное состояние клеточных мембран энтероцитов тонкого кишечника при сочетанном действии ионизирующего излучения и кадмия// Сб.тез. 6-й Пущинской школы-конф. молод. ученых "Биология - наука XXI века".-Тула: Изд-во ТГПУ им. Л.Н.Толстого, 2002.- Т.1.- С.14.

10. Клепко А.В., Бабич Л.В., Кисіль О.О. Біологічні ефекти сумісної хронічної дії малих доз іонізуючої радіації та іонів кадмію // Матеріали ІІ всеукраїнської конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні”. - Київ: Укр.фітосоц.центр, 2002. - Вип.1. - С.21-23.

11. Хижняк С.В., Кисіль О.О., Вечеря О.О. Функціональний стан мітохондрій ентероцитів тонкого кишечника щурів за сумісної дії іонізуючого випромінювання та кадмію // Укр.біохім.журнал. - 2002. - Т.74, №4б(додаток2) Мат. VIII Укр. біохім. з'їзду. - С.237.

12. Хижняк С.В., Клепко А.В., Кисіль О.О., Бабич Л.В., Рудич В.В., Войціцький В.М. Окислювально-антиоксидантний гомеостаз організму щурів при хронічній дії іонізуючої радіації та кадмію // Тези доп. Всеукр. наук. конф. “Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі та патології”. - Київ: Укр.фітосоц.центр, 2002. - С.115.

13. Хижняк С.В., Кисіль О.О., Биць Н.В., Клепко А.В., Войціцький В.М. Модифікація клітинних мембран тонкої кишки при сумісній дії іонізуючого опромінення та кадмію // Тези доп. III з'їзду Укр. біофіз. товариства. - Львів: СП "Євросвіт", 2002. - С.82.

14. Клепко А.В., Кисиль О.О., Левченко Л.В. Вплив іонізуючої радіації та кадмію на стан мітохондрій ентероцитів // Тез. Всеукр. конф. молод. ученых “Актуальные вопросы современного естествознания - 2003” - Симферополь: Новая эра, 2003. - С.43-44.

15. Войціцький В.М., Хижняк С.В., Кисіль О.О., Клепко А.В., Кучеренко М.Є. Структурний стан мітохондріальних мембран ентероцитів за дії іонізуючої радіації // Тези III з'їзду з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія). - Київ: Укр.фітосоц.центр, 2003. - С.24.

АНОТАЦІЯ

Кисіль О.О. Структурні особливості плазматичної та мітохондріальної мембран ентероцитів тонкої кишки щурів за дії іонізуючої радіації та кадмію. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01_радіобіологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2003.

Дисертація присвячена порівняльному дослідженні одноразової (1,0 Гр) та хронічної (в сумарно поглинутих дозах 0,3 Гр, 0,6 Гр і 1,0 Гр, потужність дози 0,72 сГр/добу) дії іонізуючої радіації, окремо чи сумісно з низькими дозами кадмію, на фізико-хімічні властивості плазматичної, а саме апікальної мембрани (АМ), та внутрішньої мітохондріальної мембрани (ММ) ентероцитів тонкої кишки. Показано більш виражену модифікацію фізичних властивостей поверхневого шару АМ на відміну від ММ; порушення структурної впорядкованості ліпідної компоненти та структурної жорсткості білкових молекул обох мембран за умов хронічної дії іонізуючої радіації та кадмію. В умовах експерименту спостерігається перебудова білок-ліпідних комплексів в ММ ентероцитів. Виявлено різноспрямовані кількісні зміни вмісту холестеролу, окремих фосфоліпідів, підвищення рівня лізоформ, перерозподіл в накопиченні продуктів ПОЛ за одноразової та хронічної дії іонізуючої радіації та кадмію. Встановлено порушення трансмембранного переносу Са2+ АМ та ММ ентероцитів тонкої кишки за дії досліджуваних чинників. З використанням методу головних компонент підтверджено відмінності в шляхах реалізації порушень структури АМ та ММ ентероцитів, які індуковані одноразовою чи хронічною дією іонізуючої радіації, окремо та сумісно з кадмієм.

Ключові слова: іонізуюча радіація, кадмій, сумісна дія, тонка кишка, структура мембран

АННОТАЦИЯ

Кисиль Е.А. Структурные особенности плазматической и митохондриальной мембран энтероцитов тонкого кишечника крыс при действии ионизирующей радиации и кадмия. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01_радиобиология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2003.

Диссертация посвящена сравнительному исследованию однократного

(в дозе 1,0 Гр) и хронического (в суммарно поглощенных дозах 0,3 Гр, 0,6 Гр и 1,0 Гр, мощность дозы 0,72 сГр/сутки) действия ионизирующей радиации, в отдельности или совместно с поступлением низких доз кадмия, на физико-химические и структурно-динамические свойства плазматической, а именно апикальной мембраны (АМ), и внутренней митохондриальной мембраны (ММ) энтероцитов тонкого кишечника крыс.

С использованием флуоресцентного зонда АНС показано более выраженную модификацию физических свойств поверхностного слоя АМ по сравнению с ММ в условиях хронического действия ионизирующей радиации и кадмия. Выявлены конформационные изменения белковой компоненты мембран энтероцитов в условиях острого и хронического опытов. При однократном воздействии исследуемых факторов показано уменьшение структурной жесткости белковых молекул АМ и ММ, а при хроническом действии ионизирующей радиации и кадмия - увеличение для ММ. При всех сроках хронического действия ионизирующей радиации и кадмия выявлены пространственные перестройки белок-липидных комплексов в мембране митохондрий, на что указывают изменения эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии в парах флуорофоров разной мембранной локализации. В условиях хронического действия исследуемых факторов, в отличие от однократного, установлены более глубокие нарушения структурной упорядоченности липидной компоненты исследуемых мембран, о чем свидетельствует уменьшение микровязкости как общей липидной фазы, так и анулярных липидов АМ и ММ энтероцитов.

Выявлены разносторонние изменения в содержании холестерола и отдельных фосфолипидов в АМ и ММ энтероцитов тонкого кишечника. Для АМ при однократном и хроническом воздействии ионизирующей радиации и кадмия наблюдалось уменьшение содержания холестерола и основных фосфолипидов (фосфотидилфолина и фосфотидилэтеноламина), а также перераспредерение в содержании минорных фосфолипидов. Для ММ в условиях эксперимента характерным оказалось уменьшение, относительно контрольных групп, содержания фосфотидилхолина, фосфотидилэтаноламина, кардиолипина, а также увеличение содержания минорных фосфолипидов Повышение уровня лизоформ фосфотидилхолина и фосфотидилэтаноламина в исследуемых мембранах, наряду с перераспределением в накоплении продуктов ПОЛ, указывает на активацию процессов ПОЛ в АМ и ММ при всех условиях исследования.

Показано нарушение трансмембранного переноса Са2+ АМ энтероцитов в условиях действия исследуемых агентов. Выявленное уменьшение количества Са2+_связывающих участков и/или их доступности обуславливает угнетение трансмембранного переноса ионов кальция АМ при сочетанном действии облучения и кадмия в хроническом эксперименте. Установлены разнонаправленные изменения процесса энергозависимого накопления Са2+ митохондриями при одноразовом и хроническом действии ионизирующей радиации и кадмия.

Методом главных компонент подтверждено выявленное различие в путях реализации нарушений структуры АМ и ММ энтероцитов тонкого кишечника, индуцированных однократным или хроническим действием ионизирующей радиации, в отдельности и в сочетании с кадмием. В хроническом эксперименте наиболее выраженные изменения наблюдались при сочетанном действии исследуемых факторов.

Ключевые слова: ионизирующая радиация, кадмий, сочетанное действие, тонкий кишечник, структура мембран

SUMMARY

Kysil O.O. Structure peculiarities of plasma and mitochondria membranes of rat small intestine enterocytes at action of ionizing radiation and cadmium. - Manuscript.

The thesis for PhD degree (Biology) in speciality 03.00.01 - Radiobiology. - Taras Shevchenko National University of Kyiv , Kyiv, 2003.

The thesis is devoted to the comparative investigation of one-time (1,0 Gy) and chronic (in integral absorbed doses 0,3 Gy, 0,6 Gy and 1,0 Gy, dose rate 0,72cGy/day) ionizing radiation, separately or together with low doses of cadmium, on the physicochemical properties of plasma, namely apical membrane (АM), and inner mitochondria membrane (MM) of small intestine enterocytes. The expressed modification of physical properties of AM surface layer as against MM and breaking of lipid component of these two membranes are shown under ionizing radiation and cadmium chronic activity. MM protein - lipid complex reconstruction is observed under these research conditions. АМ and MM structural state changes and the intramolecular dynamics of these membrane protein molecules are revealed under different conditions of research. Content versatile changes of cholesterol and phospholipids, rising of lysoforme level, redistribution in accumulation of lipid peroxidation products are exposed for АМ and MM at one-time and chronic activity of ionizing radiation and cadmium. Breaking of small intestine enterocyte АМ and MM transmembrane Са2+ transfer is shown at activity of investigated factors.

...