Удосконалення молекулярно-генетичних методів внутрішньовидового епідеміологічного типування клінічно-значущих мікроорганізмів різних таксономічних груп

Підводячи підсумок проведеного внутрішньовидового епідеміологічного фено- та генотипування культур S. aureus subsp. aureus, ізольованих в період ускладнення епідемічної ситуації з захворюваності ГСІ в Лозівській районній лікарні в січні 1998 р., можна аргументовано констатувати висновок: не встановлено формування і циркуляції єдиного (домінуючого) для цього ЛЗ внутрішньошпитального штаму.

Виділені із різних профільних відділень (ЛОР-, пологового, анестезії і реанімації) культури стафілококів являють собою окремі (відмінні) клони, які “закріпились” в екобіологічних ареалах циркуляції, кордони яких, як правило, визначаються функціонально-територіальним принципом діяльності підрозділів ЛЗ; протиепідемічний бар'єрний режим у відділеннях і між ними не є абсолютним, про це свідчать активні процеси обміну генофондом між штамами - виявлення ідентичних плазмід у культур S. aureus subsp. aureus, ізольованих в різних відділеннях. Найбільшого поширення в популяціях стафілококів набули плазміди з розміром близько 32 т.п.н., подібні до тих, з якими пов'язують резистентність цих мікроорганізмів до групи в-лактамних антибіотиків, що поряд з фенотипічними проявами підвищеної стійкості до дії цих антибіотиків робить актуальною розробку стратегії запобігання формування і обмеження циркуляції антибіотикорезистентних популяцій стафілококів в цьому ЛЗ.

При генотипуванні 50-ти штамів S. choleraesuis subsp. choleraesuis, серовар Enteritidis методом визначення ПП було встановлено, що 100% цих мікроорганізмів є господарями плазмід. У 8% штамів криптичні, низькокопійні плазміди вдалося виділити лише при застосуванні великомасштабної технології. У кожного штаму ідентифіковано 2-4 плазміди з розміром від 160 т.п.н. до 1,5 т.п.н. Всього виявлено 13 різних типів плазмід із розмірами 160, 150, 120, 85, 65, 55, 24, 8, 4,5, 4,1, 2,1 1,7, 1,5 т.п.н. Найбільш поширеними серед культур сальмонел були плазміди із розміром 55, 24, 4,1 т.п.н., які виявлені у 86%, 80, 76% штамів, відповідно. Значно рідше виділяли плазміди з розміром 150 і 120 т.п.н. (у 10% культур), 1,7 і 1,5 т.п.н (у 8%), 160 т.п.н (у 6%), 8 і 4,5 т.п.н. (у 4% культур). У окремих штамів знайдено плазміди з розмірами 85, 65 і 2,1 т.п.н. Взагалі, за результатами I-го етапу визначення ПП встановлено 12 різних ПП-типів. Штами сальмонел груп А і Б відрізнялись за своїми ПП-типами. Культури групи А характеризувались більш високим різноманіттям ПП (у них визначено 10 відмінних ПП-типів), в порівнянні із групою Б (у штамів цієї групи виявлено лише 2 ПП-типа). Оригінальними для сальмонел групи А були плазміди великого розміру - 160, 150, 120 і 85 т.п.н., тоді як плазміди меншого розміру - 55, 24, 4,1 т.п.н. (за винятком плазміди із розміром 1,5 т.п.н.), які характерні для культур групи Б, в тому чи іншому поєднанні з іншими плазмідами, виявлено і у штамів групи А. РА з використанням ендонуклеаз EcoR I і Hind III плазмід з розміром 55 т.п.н. показав їх гетерогенність: за особливостями їх рестрикційних фінгерпринтів виявлено три типи цієї плазміди. При цьому, в культурах групи А ідентифіковано два різних типи ЕФП, які відрізнялись як за кількістю смуг на треках, так і за інтенсивністю деяких із них. В групі Б плазміда цього розміру була монотипною, але її фінгерпринт відрізнявся від фінгерпринтів плазмід культур груп А. При повторному визначенні ПП-типу у всієї колекції (після трьохмісячного зберігання сальмонел в лабораторних умовах) тільки у 6-ти штамів групи А (12%) спостерігали зміну попереднього ПП-типу, що пов'язано із втратою однієї плазміди: втрачались плазміди з розміром 150 т.п.н. або 160 т.п.н.; зміна ПП-типу у культур групи Б не була зафіксована.

Методом АПДФЕР ХрДНК проведено генотипування 25-ти культур сальмонел (15-ти штамів групи А і по 5 штамів із підгруп Б1 і Б2). Для сайт-специфічного РА використовували едонуклеази EcoR I, Hind III, Sma I. При застосуванні EcoR I і Hind III спостерігали утворення високодискримінантних, складних для “ручної” обробки фінгерпринтів з більш ніж 60-ма смугами на треках. Ендонуклеазна Sma I рестрикція давала більш прості ЕФП, саме цей фермент ми використовували для дослідження вищезазначених 25 культур сальмонел. При цьому було виявлено 5 (I-V) відмінних ЕФП-типів (рис. 2) з 14-19-ма смугами. Близько 55% цих рестриктних фрагментів були видотиповими або, навіть, родотиповими, - вони присутні у фінгерпринтах всіх культур, а фрагменти з розмірами 36, 30, 25, 19, 17, 12, 9,2, 7,0, 5,0, 4,4, 2,0, 1,8, 1,0, 0,6, 0,5 т.п.н. були штамотиповими. Близько 18% смуг, що спостерігались на треках, суттєво відрізнялись за потужністю, що було нами додатково використано для диференціації ЕФП-типів. Культури групи А виявились генетично гетерогенними, у них виявлено 4 відмінних ЕФП-типи (I-IV), а штамам групи Б був притаманний один ЕФП-тип (V).

Повторний АПДФЕР ХрДНК, який був проведений через 6 місяців зберігання культур в лабораторних умовах, не виявив у них зміни ЕФП-типів. Зіставлення результатів внутрішньовидового епідеміологічного фено- і генотипування сальмонел показало відсутність кореляційної залежності між фенотипами і генотипами.

Аналіз результатів внутрішньовидового епідеміологічного фено- і генотипування сальмонел свідчить, що в період спорадичної захворюваності на сальмонельозну інфекцію в 1998 р. в Харківській обл. домінував серовар Enteritidis виду (підвиду) S. choleraesuis subsp. choleraesuis. Фенотипування цих штамів показало їх однотипність за результатами біотипування і виражену гетеротипність за визначенням у них антибіотикорезистенсграм. Генотипування цих культур методами оцінки ПП та АПДФЕР ХрДНК показало їх генетичну різноманітність. Це свідчить про активні процеси змін на генетичному рівні в популяції збудника, які часто не вдається виявити традиційними методами фенотипування (в нашому випадку - методами серо- і біотипування). Про наявність динамічного генетичного обміну між штамами сальмонел в зазначений період епідемічного процесу вказує наявність у них ідентичних за розміром і даними РА плазмід. Всі ж досліджені культури групи Б, ізольовані під час спалаху групової захворюваності на харчову токсикоінфекцію в дитячому оздоровчому таборі “Берізка” в 2003 р., були генетично однотипними, мали ЕФП-тип V, відмінний від усіх інших ЕФП-типів (I-IV), які були визначені у штамів сальмонел, ізольованих від хворих людей п'ятьма роками раніше. Можна припустити, що ЕФП-тип V сформувався в популяції збудника в період 1998-2003 рр.

Застосування методів визначення ПП і АПДФЕР ХрДНК дозволило провести внутрішньовидове типування груп штамів S. aureus subsp. aureus і S. choleraesuis subsp. choleraesuis серовар Enteritidis в різні періоди розвитку епідемічного процесу в якісно відмінних епідеміологічних ситуаціях: в період передепідемічного підйому спорадичної захворюваності та під час спалаху групової захворюваності. За допомогою удосконалених методів генотипування, які характеризувались достатнім рівнем дискримінантності, уніфікованості технології проведення досліджень і більш високим рівнем відтворюваності результатів, в порівнянні із використаними методами фенотипування, вдалося виявити клональні генетичні маркери у досліджених штамів та згрупувати останні за їх генетичною спорідненістю. Показано, що клони збудників інфекційних захворювань із осередків групових захворювань характеризуються особливостями генотипів, які відмінні від генотипів інших клонів в популяції цих мікроорганізмів.

ВИСНОВКИ

1. Із семи експериментально апробованих технологій руйнування клітин мікроорганізмів найбільш ефективними (за показниками: % зруйнованих клітин бактерій, концентрація звільненої ДНК, рівень цілісності молекул плазмідної та хромосомної ДНК) для застосування з метою генотипування є методи швидкого міні-лізису (МШМЛ), тритонового лізису (МТЛ) та лізису в агарозних блоках (МЛАБ).

2. За результатами досліджень удосконалено методи генотипування мікроорганізмів - визначення плазмідного профілю (ПП) і аналізу поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК (АПДФЕР ХрДНК), які доцільно використовувати для внутрішньовидового епідеміологічного типування мікроорганізмів різних таксономічних груп.

3. Уніфікована нами технологія генотипування збудників інфекційних захворювань методом визначення ПП включає проведення поетапних досліджень для встановлення факту наявності у штамів плазмід і їх наближеного розміру з допомогою модифікованого варіанту МШМЛ (перший етап визначення ПП) та наступне визначення ідентичності плазмід за результатами їх сайт-специфічної ендонуклеазної рестрикції (другий етап визначення ПП).

4. Технологія генотипування збудників методом АПДФЕР ХрДНК включає п'ять послідовних уніфікованих етапів дослідження: накопичення біомаси мікроорганізмів шляхом їх вирощування на стандартних поживних середовищах; вилучення, очищення та іммобілізацію ХрДНК з допомогою модифікованого варіанту МЛАБ; проведення сайт-специфічної рестрикції ХрДНК ендонуклеазами з оптимально підібраними сайтами впізнавання; розділення рестрикційних фрагментів ХрДНК за допомогою електрофорезу в пульсуючому полі; візуалізація електрофоретичних профілів (ЕФП) і визначення генетичної спорідненості штамів з використанням уніфікованих критеріїв оцінки ідентичності (відмінності) фінгерпринтів.

5. За результатами вивчення біологічних властивостей (морфологічних, тінкторіальних, культуральних, біохімічних) 17 штамів стафілококів, ізольованих в осередку шпитальної ГСІ, віднесено до виду S. aureus subsp. aureus. Між парами основних біологічних властивостей (лецитовітелазною, коагулазною, ДНК-азною, фосфатазною, гемолітичною активністю, ферментацією маніта в анаеробних умовах, резистентністю до новобіоцину) виявлено слабкий кореляційний зв'язок (із значенням rф від -0,06 до 0,35). Вказане підтверджує доцільність застосування при дослідженні біологічних властивостей стафілококів принципу поєднання декількох позитивних результатів тестів для їх ідентифікації або міжвидової диференціації.

6. Культури сальмонел, ізольовані від хворих людей при спорадичній захворюваності на гостру кишкову інфекцію (15 штамів) та в осередку групової захворюваності на сальмонельозну харчову токсикоінфекцію (35 штамів), за вивченням морфологічних, тінкторіальних, культуральних, біохімічних, серологічних властивостей віднесено до виду S. choleraesuis subsp. choleraesuis серовар Enteritidis. Всі 50 штамів характеризувались високим рівнем монотипності біохімічних властивостей, 95% із них були однотипними в тестах ферментації цукрів, спиртів, амінокислот. Культури сальмонел різного походження відрізнялись за здатністю ферментувати арабінозу, L,D-тартрат, чутливістю до сальмонельозного індикаторного О-фагу та полікомпонентного лікувального сальмонельозного бактеріофагу груп А, В, С, D, Е.

7. Застосування для внутрішньовидового епідеміологічного типування клінічно-значущих мікроорганізмів різних таксономічних груп методів фенотипування (фаго-, антибіотикорезистенстипування для стафілококів, та біо- і антибіотикорезистенстипування для сальмонел), а також генотипування (визначення ПП і АПДФЕР ХрДНК) дозволяє диференціювати штами і групувати їх за подібністю фено- та генотипу, визначати епідемічно-домінуючі клони та взаємозв'язки між ними. Між фено- і генотипами, що були визначені у штамів стафілококів і у штамів сальмонел, не виявлено чіткого кореляційного зв'язку.

8. На теперішній час співвідношення між методами фено- і генотипування слід оцінювати в площині взаємодоповнення, а не протиставлення. Удосконалені методи генотипування (визначення ПП, АПДФЕР ХрДНК) при порівнянні із традиційними методами фенотипування характеризуються вищою уніфікованістю технології проведення досліджень, достатнім рівнем чутливості, дискримінантності, більш високим рівнем відтворюваності результату.

9. Широкомасштабне прикладне застосування методів генотипування для тестування клінічно-значущих мікроорганізмів, що ізольовані в різні періоди перебігу епідемічного процесу, дозволить виявити особливу групу генетичних ознак - маркерів формування епідемічних варіантів збудників інфекційних захворювань.

1. Тимченко О.М. Фено- та генотипування шпитальних штамів Staphylococcus aureus // Вісник СумДУ. -2001. -№1. -С. 143-147.

2. Тимченко О.М. Генотипування госпітальних штамів Staphylococcus aureus subsp. aureus за допомогою аналізу поліморфізму довжини фрагментів рестрикції хромосомної ДНК // Експериментальна і клінічна медиц.-2004.-№2. -С. 72-75.

3. Тимченко О.М., Похил С.І., Федоров Е.І., Деркач С.А., Подаваленко А.П., Волянська Н.П., Мішукова Т.А., Осолодченко Т.П. “Епідеміологічне, внутрішньовидове генотипування енте-робактерій - збудників інфекційних захворювань” (методичні рекомендації) -Харків, 2003. -43 с. (Здобувач - відповідальний за видання цієї роботи. Удосконалив і уніфікував молекулярно-гене-тичні методи ЕТ мікроорганізмів (МШМЛ, ВТВП, МЛАБ та ін.), розробив критерії оцінки результатів ЕТ з використанням методів АПП і АПДФЕР ХрДНК. Підготував матеріали до друку).

4. Тимченко Е.Н., Волянский Ю.Л., Похил С.И. Анализ рестрикционного картирования ДНК как метод современного типирования возбудителей инфекционных заболеваний // Вісник проблем біології та медицини.- 1997. - Вип. 32. -С. 78-86. (Тимченко О.М. проаналізувала і узагальнила дані наукової літератури щодо внутрішньовидового ЕТ мікроорганізмів методом АПДФЕР ХрДНК, обґрунтувала уніфікований протокол досліджень та запропонувала критерій для вибору ендонуклеаз для сайт-специфічного РА ХрДНК).

5. Цыганенко А.Я., Тимченко Е.Н., Похил С.И. Рестрикционное картирование ДНК - как современный метод классификации бактерий // Вісник проблем біолог. та медицини. -1998. -Вип. 2. -С. 16-26. (Здобувач вивчив і систематизував дані наукової літератури стосовно існуючих принципів класифікації бактерій, в т. ч. методів геносистематики. Обґрунтував доцільність використання для ідентифікації та типування мікроорганізмів порівняльного аналізу їх геномів методом сайт-специфічної рестрикції ХрДНК).

6. Федорова Л.Г., Ліман Н.Г., Яковлева З.І., Тищенко Т.В., Тонкошкур Т.І., Бондаренко А.В., Тимченко О.М., Похил С.І., Козюпа С.М. Фено- та генотипування клінічних штамів Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis (Salmonella Enteritidis) // Сб. матер. 6-ой итоговой региональной науч.-практ. конф. посвящ. 80-летию санэпидслужбы МОЗ Украины. - Харьков, 2003. - Часть I. -С. 137-145. (Здобувач виконав експериментальну роботу - вивчив біологічні властивості та провів фено- і генотипування клінічних ізолятів сальмонел, підготовив матеріали до публікації).

7. Циганенко А.Я., Тимченко О.М., Похил С.І. Завдання і шляхи подальшого удосконалення генотипування збудників інфекційних захворювань за допомогою аналізу поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК // Експеримент. і клінічна медиц. -2002. -.№3. -С. 79-83. (Здобувач провів підбір і аналіз наукової літератури з даної проблеми, обґрунтував напрямки досліджень для подальшого удосконалення методу АПДФЕР ХрДНК з метою визначення генетичної спорідненості мікроорганізмів, підготовив матеріали до публікації).

8. Похил С.И., Красовский В.В., Тимченко Е.Н. Определение объема (веса) инокулята, наносимого с использованием репликатора Семенихиной // Клин. лаб. диагн. (Москва). - 1998. - №7. -С. 34-36. (Здобувач виконав експериментальну частину роботи та провів статистичну обробку результатів досліджень).

9. Похил С.І., Лиманський О.П., Тимченко О.М., Юдін І.П., Волянська Н.П. Спосіб епідеміологічного, внутрішньовидового генотипування збудників інфекційних захворювань за допомогою аналізу поліморфізма довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК // Інформаційний бюлетень (Додаток до “Журналу Академії медичних наук України”). -Київ, 2002. -Випуск 15. -С. 30. (Здобувач розробив уніфікований протокол проведення АПДФЕР ХрДНК для ЕТ ЗІЗ, обґрунтував критерії оцінки результатів їх генотипування).

10. Технологія визначення плазмідного профілю у культур бактерій - сучасний метод епідеміологічного типування збудників гострих кишкових інфекцій (ГКІ)/ Похил С.І., Тимченко О.М., Бондаренко А.В., Волянська Н.П. // Реєстр галузевих нововведень. - МОЗ України, УкрЦНМІПЛР. -Київ, 2000. -Вип. 12-13. -Реєстр. № 118/13/00. -С. 62-63. (Здобувач удосконалив технологію визначення ПП у мікроорганізмів різних таксономічних груп та провів експеримен-тальне випробовування цього методу генотипування при ЕТ ентеробактерій - збудників ГКІ).

Размещено на Allbest.ru