Ендогенні механізми формування стійкості рослин до дії свинцю за участю аскорбат-глутатіонової системи

Очевидно, за дії іонів свинцю утворюється значна кількість АФК і каталаза бере участь у їх перетворенні. Селеніт активує каталазу за невеликої концентрації іонів свинцю, велика концентрація іонів свинцю інгібує активність каталази.

Прямої залежності між активністю пероксидази та концентрацією пероксиду водню в коренях соняшника не спостерігалось. За наявності в розчині одночасно з 10^-3М Pb(CH₃COO)₂ іонів селеніту активність пероксидази у тридобових рослин зростала, однак була значно нижчою, ніж у восьмидобових рослин.

Процес лігніфікації клітинних стінок, принаймні частково, є пероксидаза/Н₂О₂ - залежним процесом (RosBarcelo, 1999) , а механізми захисту включають активацію антиоксидантної системи за участю пероксидази (Meksongsee, Wongkaew, 1991; Reddy, Prasad, 1992). Внесок іонозв'язаної з клітинною стінкою пероксидази в загальну її активність подано в табл. 4. Високу активність спостерігали під час проростання рослин на моносольовому розчині селеніту натрію та 10^-8М Pb(CH₃COO)₂ +Na₂SeO₃ - на порядок вищу, ніж у рослин контролю. При подальшому їх рості активність ферменту в усіх варіантах досліду підвищувалась і найвищих значень досягала у варіанта 10^-8М Pb(CH₃COO)₂, у 1,7 раз менша у варіантів з іонами свинцю та іонами свинцю разом з іонами селену. Найменша активність була у восьмидобових рослин, вирощених на моносольовому розчині селеніту натрію, хоча значних відмінностей в активності ферменту між варіантами в рослин цього віку не спостерігали.

Таблиця 4

Активність пероксидази іонозв'язаної з клітинними стінками в коренях соняшника за дії іонів свинцю та впливу селеніту натрію, нмоль · (хв · г сирої маси)^-1 (M±m, n=6)

* різниця з контролем (Н₂О) вірогідна, Р < 0,05

Вміст відновленого глутатіону та активність ферментів його метаболізму у квасолі та соняшника за дії іонів свинцю. Ми показали, що концентрація відновленого глутатіону в зародкових осях та в сім'ядолях тридобової квасолі суттєво відрізняється залежно від варіанта досліду (табл. 5). Вищу концентрацію відновленого глутатіону ми спостерігали в сім'ядолях порівняно із зародковими осями в усіх варіантах досліду. При проростанні на воді вміст відновленого глутатіону в зародкових осях вдвічі менший, ніж у сім'ядолях, на розчині Кнопа він дещо вищий, хоча співвідношення між зародковими осями та сім'ядолями таке ж саме. На розчинах зі свинцем високої концентрації (10^-3 М) вміст глутатіону подібний до того, що на розчині Кнопа, співвідношення між зародковою віссю та сім'ядолями також. На низькій концентрації свинцю (10^-8 М) вміст глутатіону в зародкових осях втричі, а в сім'ядолях удвічі менший, ніж на розчині Кнопа. Найменший вміст глутатіону в зародкових осях насіння, яке пророщували на 10^-9 М селеніті, - у 7 разів порівняно з тим, що на розчині Кнопа, хоча в сім'ядолях менший лише в 1,3 раза (Р<0,05).

Відмінності вмісту відновленого глутатіону в частинах насінини при проростанні на різних поживних розчинах можуть бути пов'язані з різною інтенсивністю використання, а також зі змінами активності ферментів його синтезу. Зростання активності ГП в зародкових осях квасолі під дією 10^-9 М селеніту натрію супроводжується вичерпуванням пулу відновленого глутатіону. При сумісному впливі на проростаюче насіння іонів свинцю та селену активність глутатіонпероксидази вища від контролів та варіантів з моносольовими розчинами ацетату свинцю в зародкових осях, але нижча у сім'ядолях. Одночасно пул відновленого глутатіону у зародкових осях та сім'ядолях залишається високим.

Таблиця 5

Концентрація відновленого глутатіону в зародкових осях та сім'ядолях тридобової квасолі, мкг · г^-1 маси сухої речовини (M±m, n=6)

* різниця з контролем (Н₂О) вірогідна, Р < 0,05

Результати вивчення активності ГП у 5-16-добових проростків квасолі показали, що вона зростає в рослин контрольних і дослідних варіантів з ростом рослин. Найвища активність фермента в органах тих рослин, які росли на 10^-8 М ацетаті свинцю. Активність зростає на порядок від п'ятої до восьмої доби росту. Активність ГП в органах рослин, які росли на високій концентрації іонів свинцю, найнижча.

Дані за результатами впливу різних концентрацій ацетату свинцю на активність глутатіонпероксидази 5-, 8- і 12-добових проростків соняшника свідчать, що в період від п'ятої до восьмої доби росту рослин у коренях активність ферменту зростала вдвічі (рис. 6).

Подібна закономірність зберігалась і в пагонах, де активність ферменту зростала в 3 рази. У коренях і в пагонах восьмидобових рослин активність ГП мала найвище значення. При вирощуванні рослин на всіх застосованих концентраціях ацетату свинцю активність ГП в коренях 5-ти та 8-ми добових рослин була у 2-3 рази вищою від контролю, однак у 12-ти добових рослин активність ферменту знижувалась до мінімальних значень. Отже, найбільшу активність фермент має в період проростання та початкового росту рослин за свинцевого стресу. Наведені дані узгоджуються з одержаними нами для квасолі.

Глутатіон бере участь у регенерації відновленої аскорбінової кислоти, яке каталізується дегідроаскорбатредуктазою (ДГАР). Якщо аскорбат окиснюється до дегідроаскорбінової кислоти (ДГАК), можна було б очікувати вичерпування пулу глутатіону та підвищення активності глутатіонредуктази (ГР). У квасолі та соняшника досліджуваних варіантів виявлено високу активність ГР в органах контрольних рослин.

Рис. 6. Глутатіонпероксидазна активність у коренях соняшника під дією ацетату свинцю

Найвища активність ферменту в коренях і пагонах тих рослин, яких вирощували на 10^-8 М ацетаті свинцю (рис. 7). На високій концентрації ацетату свинцю в поживному розчині активність ферменту визначалась у зазначений період досліджень, однак була значно нижчою, ніж у рослин в інших варіантів.

Рис. 7. Глутатіонредуктазна активність у коренях і пагонах соняшника, вирощеного на різних концентраціях свинцю. Варіанти досліду: 1 -Н₂О; 2 - розчин Кнопа; 3 - 10^-8 М Pb²⁺; 4 - 10^-3 М Pb²⁺

Це свідчить, що низькі концентрації іонів свинцю в поживному розчині, які, як ми показали, проникають у рослини, спричиняють пошкодження самого ферменту. Загалом у соняшника і квасолі спостерігали подібні закономірності змін активності ГР, хоча в соняшника активність була нижчою. У 16-добових рослин соняшника активності ГР не виявленао.

Щоб з'ясувати рівень використання відновленого глутатіону іншим шляхом, ми вивчили активність глутатіон-S-трансферази (ГТ) в зародкових осях та сім'ядолях тридобової квасолі, вирощуючи її на розчинах зі свинцем. Виявлено, що зародкові осі та сім'ядолі контрольних варіантів мали найнижчу активність ГТ, варіантів зі свинцем обох застосованих концентрацій - удвічі вищу (рис. 8). Найвищу активність ГТ спостерігали в зародкових осях варіанта, де насіння пророщували на 10^-8 М Pb²⁺ + 10^-9 М SeO₃^2-. Підвищення рівня активності ферменту на поживному розчині з високою концентрацією іонів свинцю разом із селенітом було незначним. Наявність у поживному розчині АБК разом з іонами свинцю також підвищувало активність ГТ. У цьому випадку активність була значно вищою за наявності високого вмісту іонів свинцю. На розчинах з АБК також спостерігали підвищення активності ГТ, особливо в сім'ядолях.

Вивчення активності ГТ в частинах проростаючого насіння соняшника показало, що в сім'ядолях контрольних варіантів вона найвища і такого самого рівня в зародкових осях при проростанні на 10^-3 М Pb²⁺. У 8- та 16-добових проростках ГТ найбільш активна в пагонах усіх варіантів досліду.

Рис. 8. Глутатіон-S-трансферазна активність зародкових осей та сім'ядолей тридобової квасолі та вплив АБК. Варіанти досліду: 1- H₂O; 2 - розчин Кнопа; 3 - 10^-8 M Pb²⁺; 4 - 10^-3 M Pb²⁺; 5 - 10^-9 M SeO₃^2-; 6 - 10^-8 M Pb²⁺ +10^-9 M SeO₃^2-; 7 - 10^-3 M Pb²⁺ +10^-9 M SeO₃^2-; 8 - 10^-8 M Pb²⁺ + 10^-10 M AБК; 9 - 10^-3 M Pb²⁺ + 10^-10 M AБК; 10 - 10^-10 M AБК.

Вміст аскорбінової кислоти та продуктів її метаболізму в рослинах за дії іонів свинцю. Активність ферментів аскорбатного циклу. Результати проведених досліджень з визначення вмісту аскорбату в сухому насінні квасолі та соняшника показали, що в сухому насінні соняшника аскорбат був відсутнім, проте він виявився в зародкових осях та сім'ядолях квасолі. І в сухому насінні соняшника, і в сухому насінні квасолі наявна дегідроаскорбінова кислота.

У проростаючому насінні обох досліджуваних видів доволі високий вміст аскорбату. Очевидно, відсутність аскорбату в сухому насінні соняшника призводить до більш негативної дії високих доз іонів свинцю в поживному розчині на проростання та приріст біомаси порівняно з квасолею, як ми показали. У тридобових рослин квасолі індекс толерантності доволі високий при вирощуванні і на 10^-8 М, і на 10^-3 М розчині ацетату свинцю (Воробець, Микієвич, 2001). Свіжо зібране насіння квасолі перебуває в неглибокому спокої, з якого виходить у процесі сухого зберігання (Bewley, Black, 1982) , тобто є рекальцитрантним (за термінологією Tommasi, 1999). Здатність насіння квасолі краще проростати порівняно з насінням соняшника за наявності іонів свинцю в поживному розчині, очевидно, пов'язана з належністю квасолі до групи „рекальцитрантів” (Tommasi et al., 1999), насіння яких перебуває в неглибокому спокої (Bewley, Black 1982), а соняшника - до групи „ортодоксальних” рослин, у яких аскорбат у сухому насінні не нагромаджується (Таран 1956).

Ми виявили високу активність аскорбатпероксидази у проростаючих та запасаючих частинах насіння квасолі і соняшника. Так, у насіння квасолі, яке проростає на воді та розчині Кнопа, активність АскП в зародкових осях у кілька разів вища, ніж у сім'ядолях, а при проростанні на розчинах зі свинцем активність у кілька разів вища як в зародкових осях, так і в сім'ядолях порівняно з контрольними варіантами.

При проростанні на розчинах зі свинцем активність АспП в 2- 2,5 раза вища, ніж у контрольних варіантів. Отже, насіння соняшника та квасолі проростає за наявності в поживному розчині іонів свинцю різної концентрації. Це можливо завдяки достатньо високому пулу відновленого глутатіону та аскорбату, які утворюються внаслідок активності низки ферментів.

Однак можливість проростання насіння ще не забезпечує рослині подальший ріст і розвиток, якщо дія токсиканта не припиняється. Проникнення великої кількості іонів свинцю в зародкові осі та сім'ядолі спричиняє незворотні зміни метаболізму. Зародкові осі та сім'ядолі тридобових рослин соняшника містять аскорбат, однак його вміст значно нижчий, ніж у квасолі. Незважаючи на високу активнсть АскП, як в зародкових осях, так і в сім'ядолях соняшника та квасолі з ростом рослин вона знижується на 10^-3 М Pb²⁺, особливо в коренях соняшника, і не забезпечує подальшого виживання рослин.

Під дією іонів свинцю в органах рослин змінюється вміст аскорбінової кислоти та співвідношення її до дегідроаскорбінової й дикетогулонової кислот у соняшника та квасолі протягом 7-12 діб росту навіть в тому випадку, коли вони пересаджені на свинецьвмісні розчини у віці трьох діб (II варіант досліду). Найнижчі рівні всіх трьох кислот у коренях і пагонах семидобових рослин контрольних варіантів, а також рослин, які пересаджені на 10^-8 М ацетат свинцю. На 10^-3 М ацетаті свинцю в коренях і пагонах рослин рівні всіх кислот значно вищі. Важливо, що з підвищенням вмісту АскК зростає вміст ДГАК та ДКГК. У 12-добових рослин найвищий вміст суми досліджуваних кислот також на 10^-3 М ацетаті свинцю в коренях і пагонах. Виявлено, що вміст АскК в коренях і пагонах досить високий і приблизно однаковий у 7- та 12-добових рослин. Проте від сьомої до дванадцятої доби вирощування спостерігається високий вміст ДГАК та ДКГК. На середовищі з високою концентрацією іонів свинцю (10^-3 М) концентрація АскК була значно вищою, ніж на середовищі з низькою (10^-8 М).

Відзначене підвищення концентрації АФК в рослинах, які росли на свинецьвмісних субстратах з одночасним підвищенням умісту ДГАК, очевидно, також є відображенням участі аскорбатної системи у протистоянні їх дії. З огляду на це метою наступного дослідження було вивчити, як різна кількість іонів свинцю, який надходять у рослину соняшника з поживного розчину, впливає на активність аскорбатпероксидази (АскП) та монодегідроаскорбатредуктазу (МДГАР) у її органах і чи змінює селеніт їх активність.

У рослин, які росли на 10^-3 М концентрації ацетату свинцю, де активність АскП менш висока, спостерігається і нижча ростова активність. Висока активність АскП в пагонах рослин дає змогу їм ще деякий час протистояти дії високих концентрацій іонів свинцю. Сумісна дія іонів свинцю 10^-8- 10^-5 М з іонами селеніту спричинила до підвищення активності АскП і в коренях, і в пагонах, хоча на моносольовому розчині селеніту такого не спостерігалося. Значне зменшення активності ферменту було в коренях рослин, які вирощувались на 10^-3 М ацетаті свинцю + 10^-8 М селеніті натрію протягом 4 діб - у 1,6 раза, а в пагонах лише в 1,4 раза.

У період, протягом якого ми проводили дослідження, значення активності МДГАР в органах рослин, які і в подальшому нормально росли і розвивались, не набагато вищі від тих, що в рослин варіантів, які в подальшому загинули. Щоб виявити, чи відбувається перетворення ДГАК в АскК за участю ДГАР, вивчили активність ферменту (табл. 6).

Активність ДГАР в зародкових осях 3-добової квасолі набагато вища, ніж у соняшника. Підвищення активності в 5-6 разів спостерігається при проростанні насіння квасолі на поживних розчинах з іонами свинцю. За подібних умов вирощування соняшника такого значного підвищення активності ДГАК в нього не спостерігалось. Можливо, висока активність ДГАР в перші доби проростання також є особливістю насіння “ортодоксальних” видів. Результати свідчать, що і в період початкового росту активність ДГАР доволі висока.

Таблиця 6

Активність дегідроаскорбатредуктази в зародкових осях тридобових рослин, нмоль дегідроаскорбінової кислоти (хв г маси сирої речовини)^-1 (M±m, n=6)

* різниця з контролем (Н₂О) вірогідна, Р < 0,05

Виявлена найвища активність АскО в зародкових осях квасолі та соняшника при проростанні їх на воді менша на розчині Кнопа і ще менша на розчині зі свинцем. Низька активність ферменту в зародкових осях квасолі та соняшника спостерігалась при більшому вмісті в них АскО. Подібні закономірності виявили інші автори в зародкових осях гороху (Pallanca, Smirnoff, 2000).

Таким чином, ми встановили, що за умов дії на рослини іонів свинцю в них змінюється активність ферментів азотного обміну, концентрація фотосинтетичних пігментів, у тому числі пігментів віолаксантинового циклу. Активність аскорбат-глутатіонової антиоксидантної системи стимулюється низькими концентраціями Pb²⁺ та інгібується високими, а низькі концентрації селеніту та абсцизової кислоти сприяють антиоксидантному захисту рослин.

Висновки

У дисертації подано теоретичне узагальнення й нове розв'язання наукової проблеми, що виявляється в з'ясуванні біохімічних механізмів формування стійкості рослин до дії іонів свинцю за участю аскорбат-глутатіонової системи та пошуку ефективних екзогенних чинників для корекції виявлених порушень.

Установлено, що під дією іонів свинцю на рослини в їх органах відбувається порушення фізіологічних і біохімічних процесів, яке проявляється передусім у підвищенні концентрації продуктів ПОЛ та пероксиду водню.

Гістохімічне дослідження розподілу дитізонатів у квасолі і соняшника показало, що іони свинцю проникають й починають нагромаджуватись у клітинах соняшника та квасолі від першої доби вирощування. Клітинна стінка клітин протодерми, ендодерми та лігніфікованих клітин є бар'єром для пересування іонів свинцю за наявності його в поживному середовищі в концентрації 10^-8 - 10^-5 М, клітини камбію та перициклу залишаються вільними. У поживному середовищі з іонами свинцю у концентрації 10^-3 М іони проникають у всі зони та тканини кореня.

Іони селеніту (10^-8 М), за наявності їх у поживному розчині, сприяють зменшенню рівня ПОЛ та пероксиду водню, кількості відкладених дитізонатів. Іони селеніту в моносольовому розчині та разом з іонами свинцю позитивно впливають на проростання й початковий ріст соняшника і квасолі, активуючи ферменти антиоксидантного захисту.

Починаючи від першої доби пророщування насіння соняшника на розчинах ацетату свинцю (10^-3 М) іони свинцю проникають до зародкової частини, під час росту в коренях проявляються ознаки деструкції внутрішньої частини осьового циліндра - клітини лізовані, проте паренхіма кори та ендодерма без змін. Хід диференціювання клітин та лігніфікації в рослин соняшника, які проростають і ростуть на розчині 10^-8 М ацетату свинцю, не порушений. Лігніфікація клітин ендодерми може обмежувати пересування свинцю симпластом. У квасолі на розчині ацетату свинцю (10^-8 М) вже через одну добу проростання виявляється лігнін у покривній тканині, окремих клітинах паренхіми та метаксилеми; на розчині ацетату свинцю високої концентрації (10^-3 М) лігнін виявлявся у клітинах ендодерми, паренхіми та метаксилеми.

Абсцизова кислота в поживному розчині разом з іонами свинцю не перешкоджає його накопиченню органами квасолі, проте сприяє адаптації рослин до дії іонів свинцю. Це проявляється у збільшенні ростової активності коренів і пагонів, підвищенні активності ферментів асиміляції аміаку.

Сумарна концентрація пігментів віолаксантинового циклу менша в сім'ядольних листках тих рослин, які вирощуються на поживних розчинах зі свинцем. На 10^-8 М концентрації іонів свинцю найбільша частка віолаксантину, а на 10^-3 М - зеаксантину. Іони селеніту збільшують величину віолаксантинового пула в рослин, вирощених на 10^-3 М ацетаті свинцю.

Під дією іонів свинцю (10^-3 М) порушується водний статус коренів, гіпокотилів та листків рослин - зменшується відносний вміст води та водний потенціал. Абсцизова кислота, додана до поживного розчину з іонами свинцю, сприяє відновленню водного статусу, однак на 10^-3 М ацетаті свинцю він не досягає оптимальних значень для росту та розвитку.

При проростанні рослин на поживних розчинах з ацетатом свинцю інтенсивно використовується відновлений глутатіон, вміст якого в зародкових осях насіння, яке проростає на низькій концентрації іонів свинцю (10^-8 М) у поживному розчині, у кілька разів нижчий, ніж за проростання на високій його концентрації (10^-3 М). Збільшений пул відноаленого глутатіону в сім'ядолях при додаванні до поживного розчину зі свинцем (10^-8 М) селеніту (10^-9 М) сприяє нормалізації метаболізму в зародковій осі та проходженню рослинами наступних фаз онтогенезу.

Висока активність глутатіонпероксидази та глутатіон-S-трансферази в зародкових осях, яка спостерігається під дією іонів свинцю, сприяє проростанню та початковому росту рослин. Селеніт натрію (10^-9 М) активує глутіонпероксидазу та глутатіон- S-трансферазу рослин унаслідок дії на них іонів свинцю.

Здатність насіння квасолі порівняно з насінням соняшника краще проростати за наявності іонів свинцю пов'язана з належністю квасолі до групи “рекальцитрантів”, насіння яких перебуває в неглибокому спокої і має базовий пул аскорбінової кислоти, а соняшника - до групи рослин з “ортодоксальним” насінням, яке має глибокий спокій і не має базового пулу аскорбату.

Виявлено високу активність аскорбатпероксидази та монодегідроаскорбатредуктази в органах квасолі та соняшника за проростання та початкового росту в умовах свинцевого стресу. З ростом рослин на середовищі з великим вмістом іонів свинцю (10^-3 М) активність ферментів у коренях знижується настільки, що не забезпечує подальшого використання аскорбінової кислоти та відновлення її достатнього пулу.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Воробець Н.М. Активність ферментів азотного обміну в зародковій осі квасолі при набряканні // Укр. ботан. журн. - 1989. - Т.46, №6 - С. 68-70.

Воробець Н.М. Активність аспартат- та аланін амінотрансфераз у соняшника за дії різних доз свинцю // Физиол. и биохим. культ. раст. - 2002. - Т.34, № 2. - С. 147-151.

Воробець Н.М., Пацула О.І. Функціонування ферментів глутатіонового циклу в насінні квасолі при проростанні за дії іонів свинцю та селену // Физиол. и биохим. культ. раст. - 2002. - Т.34, № 4. - С. 326-332. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті).

Воробець Н.М. Взаємозв'язок між пероксидом водню та пероксидазною активністю коренів рослин // Вісник проблем біол. та мед. - 2003. - № 6. - С. 8-12.

Воробець Н.М., Григорюк І.П. Водний статус насіння соняшника при проростанні за наявності іонів свинцю у поживному розчині // Доповіді НАН України. - 2003 - №8. - С.156-158. (Дисертантові належить виконання експериментальних робіт, участь в аналізі результатів, формулювання висновків та написання статті).

Воробець Н.М. Вплив свинцю на активність деяких амінотрансфераз у проростках рослин // Вісник проблем біол. та мед. - 2003. - № 7/8. - С. 50-53.

Воробець Н.М., Григорюк І.П. Роль абсцизової кислоти у регуляції водного режиму квасолі за дії іонів свинцю // Доповіді НАН України. - 2004. - № 1. - С. 18-21. (Дисертантові належить виконання експериментальних робіт, участь в аналізі результатів, формулювання висновків та написання статті).

Воробець Н.М., Григорюк І.П. Формування і функціонування пігментного апарату проростків квасолі за стресової дії свинцю // Физиол. и биохим. культ. раст. - 2004. - Т.36, № 1. - С. 43-47. (Дисертантові належить виконання експериментальних робіт, участь в аналізі результатів, формулювання висновків та написання статті).

Воробець Н.М., Микієвич І.М., Романюк Н.Д., Терек О.І. Нагромадження свинцю рослинами соняшника та квасолі залежно від його вмісту в поживному розчині // Вісник Ужгородського держ. ун-ту. Серія біол. - 2000. - №8. - С. 65-68. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, підготовка зразків для аналізу, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті).

Воробець Н.М., Микієвич І.М. Сумісна дія свинцю і селену на проростання та ріст соняшника // Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. - 2000. - Вип. 26. - С. 159-165. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті).

Воробець Н.М. Вплив абсцизової кислоти на активність ферментів антиоксидантного захисту у насінні квасолі при проростанні за дії різних концентрацій іонів свинцю // Науковий вісник УжНУ. Серія біол. - 2001. - №9. - С. 316-319.

Воробець Н.М., Микієвич І.М. Фізіологічна оцінка стійкості рослин квасолі до дії свинцю // Науковий вісник Львівської держ. академії ветеринарної медицини. - 2001. - Т. 3, №1. - С. 3-6. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, виконання експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті).

Воробець Н.М., Микієвич І.М. Вміст аскорбінової, дегідроаскорбінової, дикетогулонової кислот у проростках соняшника за дії іонів свинцю // Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. - 2001. - Вип.27. - С. 244-252. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті).

Воробець Н.М. Пероксидазна активність коренів соняшника за дії іонів свинцю та селену // Наукові записки Тернопільського педун-ту. Серія біол. - 2002. - № 3 (18). - С. 148-153.

Воробець Н.М., Мусієнко М.М. Інтоксикація ґрунтів сполуками свинцю та їх фіторемедіація // Науковий вісник Національного аграрного ун-ту. - 2002. - Т.58. - С. 202-216. (Дисертантові належить опрацювання даних літератури і власних результатів, участь в аналізі і написання статті).

Воробець Н.М., Брайон О.В., Мусієнко М.М. Ефекти різних доз свинцю на лігніфікацію клітинних стінок у проростків соняшника // Науковий вісник УжНУ. Серія біол. - 2002. - № 11. - С. 72-74. (Дисертантові належить виконання експериментальних робіт, участь в аналізі результатів, формулюванні висновків та написання статті).

Воробець Н.М. Пігментний апарат проростків соняшника за дії різних доз свинцю // Науковий вісник УжНУ. Серія біол. - 2003. - №12. - С. 69-73.

Воробець Н.М. Функціонування аскорбатпероксидази та вміст аскорбінової і дегідроаскорбінової кислот у проростаючого насіння соняшника та квасолі за дії різних доз свинцю // Науковий вісник УжНУ. Серія біол. - 2003. - Вип.13. - С. 53-56.

Воробець Н.М. Пігменти віолаксантинового циклу проростків соняшника за дії різних доз іонів свинцю та селену // Науковий вісник Київського нац. ун-ту імені Т.Шевченка. - 2003. - Вип. 39. - С.33-35.

Воробець Н.М., Микієвич І.М. Функціонування аскорбатпероксидази та монодегідроаскорбатоксидази у проростків соняшника за дії надлишкових кількостей свинцю // Наукові записки. Тернопільський педун-т. Серія біол. - 2003. - № 1 (20) - С.81-86. (Дисертант є автором ідеї, покладеної в основу статті, їй належить аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті).

Воробець Н.М. Утворення малонового діальдегіду та пероксиду водню при вирощуванні соняшника на поживних середовищах з різною концентрацією іонів свинцю // Науковий вісник Чернівецького нац. ун-ту. - 2004. - Вип. 194. - С. 9-15.

Микієвич І.М., Воробець Н.М., Калинович Н.О. Локалізація свинцю у тканинах кореня соняшника і модифікація селеном його токсичної дії // Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії і сільського господарства. Серія мед. і біол. -2001. - Вип.5. - С. 77-81. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, виконання експериментальних робіт, аналіз результатів та написання статті).

Vorobets N., Mykiyevich I. Single and combined effects of lead and selenium on sunflower seedlings // Scientific works. Horticulture and vegetable growing. - 2000. - V. 19, N3. - P. 390-395. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті).

Пацула О.І., Воробець Н.М. Реакція соняшника на дію свинцю за участю глутатіонпероксидази // Наукові основи збереження біотичної різноманітності. - 2001. - Вип.3. - С. 150-155. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті).

Воробець Н.М. Активність ключових ферментів асиміляції аміаку у рослин квасолі на перших етапах росту за дії свинцю // Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм рослин. Матеріали Міжнародної наукової конференції. - Тернопіль, 2001. - С. 150-153.

Пацула О.І., Воробець Н.М. Участь каталази у механізмах захисту рослин до дії свинцю // Ведення лісового і садово-паркового господарства та охорона довкілля. Матеріали 53-ої науково-технічної конференції студентів та аспірантів УкрДЛТУ. - Львів, 2001. - С. 81-85. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті).

Воробець, Н.М., Шидловська І.Я., Підковко Н.О., Микієвич І.М., Терек О.І. Вплив різних концентрацій ацетату свинцю на вміст білків у різних видів рослин на ранніх етапах онтогенезу // Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі. Львів: Cполом, 1998. - С. 194-195.

Воробець Н.М., Микієвич І.М. Аскорбінова кислота в органах квасолі при дії на рослини свинцю // Матеріали I Всеукраїнської наукової конференції Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах. - Тернопіль: Вид-во Терноп. держ. пед. ун-ту, 1998. - С. 43-44.

Воробец Н.Н., Мыкиевич И.М. Поступление свинца в растения подсолнечника и фасоли при экспонировании их на растворах ацетата свинца / Международная конференция “Физиология растений - наука 111 тысячелетия” - Москва, 1999. - С.340-341.

Пацула О.И., Воробец Н.Н., Мыкиевич И.М. Формирование глутатионпероксидазной системы защиты у фасоли в условиях действия свинца // Тезисы V11 Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге, 2000. - С.143.

Воробець Н.М., Микієвич І.М., Калинович Н.О. Розподіл свинцю у органах рослин соняшника та квасолі при вирощуванні їх на різних концентраціях ацетату свинцю // Тези міжнародної конференції "Проблеми сучасної екології”. -Запоріжжя, 2000. - С.17.

Воробец Н.Н. Влияние экзогенной абсцизовой кислоты на устойчивость фасоли к действию ацетата свинца // Шестая международная конференция “Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях”. - М.: Изд-во МСХА, 2001. - С.20.

Воробець Н. М. Вплив абсцизової кислоти та іонів селену на активність пероксидних ферментів у рослин квасолі (Phaseolus vulgaris L.) за дії свинцю // Матеріали I з'їзду Українського ботанічного товариства. - Харків, 2001. - С. 72-73.

Микієвич І.М., Воробець Н.М. Співвідношення аскорбінової кислоти та продуктів її окиснення у рослин соняшника (Helianthus annuus L.) за дії іонів свинцю // Матеріали I з'їзду Українського ботанічного товариства. - Харків, 2001.- С. 242-243.

Воробець Н.М. Антиоксидантний захист у рослин соняшника за дії на них іонів свинцю // Укр. біохім. журнал. - 2002. - Т.74, №4б. - С. 120-121.

Воробець Н.М. Утворення активних видів кисню у проростків соняшника за експозиції їх на середовищах з іонами свинцю // Тези доповідей III з'їзду Українського біофізичного товариства. - Львів, 2002. - С. 122.

Воробець Н.М., Чонка І.І., Бойко Н.В., Ніколайчук В.І. Активність глутатіон- S-трансферази та вміст важких металів у рослинах квасолі, вирощеної на ґрунтах прируслових ділянок ріки Тиса Виноградівського району Закарпатської області // Матеріали IV Міжнар. наук. конф. „Промислова ботаніка: стан та перспективи розвитку” - Донецьк: ТОВ „Лебідь”, 2003. - С.98-99.

Vorobets N. Lead accumulation in different organs of beans and sunflower in response to lead stress / International Symposium on Plant Biotechnology. - Kyiv, 1998. - P.145.

Vorobets N., Kravchischin V., Terek O. Responses of higher plants GDH and GS activities to lead // 2^nd Conference on progress in plant sciences. - Mosonmagyarуvбr, Hungary, 1998 - P. 37.

Kravchischin V., Terek O., Vorobets N. Effect of lead on transaminases activities of higher plants with different types of metabolism // 2^nd Conference on progress in plant sciences. - Mosonmagyarуvбr, Hungary, 1998 - P. 48.

Vorobets N., Terek O., Kravchichin V. Responses of higher plants nitrogen metabolism enzymes to lead // Bulgarian J. Plant Physiology. The 11^th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. - Varna, Bulgaria, 1998. - P. 271.

Vorobets N. Glutathione peroxidase and catalase activity responses to lead in bean and sunflower seedlings // Plant Physiology and biochemistry. 12^th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. - Budapest, 2000. - V.38. - P.181.

Mykiyevich I.M, Vorobets N. The effect of lead on early stages of bean growth // Plant Physiology and biochemistry. 12^th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. - Budapest, 2000. - V.38. - P. 181.

Vorobets N.M. ABA as adaptive responses mediator to lead stress during seed germination / International Symposium Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems. Programme and Abstracts. - Kyiv, 2001. - P. 110.

Vorobets N. Medium applied ABA regulation lead resistance and antioxidant enzymes activity in Phaseolus vulgaris L. seedlings // 17^th International Conference on Plant Growth Substances. - Brno, Czech Republic, 2001. - P. 135.

Vorobets N.M. Involvement of ABA in antioxidant defense of bean under lead influence // Fifth conference on Oxygen, free radicals and oxidative stress in plants. - Nice, France, 2001. - P. 70.

Vorobets N. M. Abscisic acid increases lead tolerance in bean seedlings // 4^th Parnas Conference Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and Their Target Enzymes. - Wrocіaw, 2002. - P. 126.

АНОТАЦІЇ

Воробець Н.М. Ендогенні механізми формування стійкості рослин до дії свинцю за участю аскорбат-глутатіонової системи. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Чернівці, 2004.

Дисертація присвячена вивченню особливостей функціонування антиоксидантної системи проростків квасолі та соняшника як складової ендогенних механізмів формування стійкості рослин до дії іонів свинцю, а також можливостям екзогенної регуляції цього процесу іонами селеніту та абсцизовою кислотою.

Установлено, що за умов дії на рослини іонів свинцю в них відбувається накопичення свинцю, порушення метаболічних процесів, що супроводжується збільшенням концентрації малонового діальдегіду та пероксиду водню. При цьому змінюється активність ферментів азотного обміну (глутамінсинтетази, глутаматдегідрогенази, аспартатамінотрансферази та аланінамінотрансферази), концентрація фотосинтетичних пігментів, у тому числі пігментів віолаксантинового циклу. Іони селеніту (10^-9 - 10^-8 М) та абсцизова кислота (10^-10 М) позитивно впливають на ріст та розвиток рослин, знижують рівень пероксидного окиснення ліпідів та пероксиду водню. Абсцизова кислота не перешкоджає проникненню іонів свинцю в рослини, однак сприяє пристосуванню до їх дії.

Показано, що водний статус рослин залежить від впливу на них іонів свинцю - на високих концентраціях свинцю відносний вміст води та водний потенціал в період проростання насіння перебувають у межах, які не перешкоджають проростанню, однак у подальшому знижується до рівня, недостатнього для нормального перебігу реакцій.

У період проростання та початкового росту рослин низькі концентрації свинцю (10^-8 М) активують антиоксидантну аскорбат-глутатіонову систему, а високі (10^-3 М) - пригнічують її. При проростанні насіння на поживних розчинах зі свинцем активно використовується відновлений глутатіон, змінюється співвідношення аскорбінової, дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот.

Імовірність проростання насіння рослин за наявності в середовищі іонів свинцю залежить і від рівня їх вимушеного спокою та наявності пулу аскорбінової кислоти.

Ключові слова: свинець, антиоксидантна система, водний статус, соняшник, квасоля, віолаксантиновий цикл, адаптація, селеніт, абсцизова кислота.

Воробец Н.Н. Эндогенные механизмы формирования устойчивости растений к действию свинца при участии аскорбат-глутатионовой системы. - Рукопись.Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Черновицкий национальный университет имени Юрия Федьковича, Черновцы, 2004.

Диссертация посвящена изучению функционирования антиоксидантной системы проростков фасоли и подсолнечника, как составляющих эндогенных механизмов формирования устойчивости растений к действию ионов свинца, а также возможностям эндогенного регулирования этого процесса ионами селенита и абсцизовой кислотой.

Установлено, что при действии ионов свинца на растения в их органах нарушаются физиологические процессы, что проявляется прежде всего в повышении концентрации продуктов пероксидации липидов и пероксида водорода. Показано, что начиная от первых суток выращивания подсолнечника на растворах ацетата свинца (10^-3 М) ионы металла проникают в зародышевую часть, по мере роста в корнях проявляются признаки деструкции внутренней части осевого цилиндра - клетки лизированы, хотя паренхима коры и эндодерма без изменений. При прорастании на растворе низкой концентрации ацетата свинца (10^-8 М) дифференцировка клеток и процессы лигнификации не изменяются.

По-видимому лигнификация может ограничивать передвижение свинца симпластом. У фасоли при прорастании на растворе свинца (10^-8 М) уже через одни сутки выявляется лигнин в покрывной ткани, отдельных клетках паренхимы и метаксилемы, на более высокой концентрации ацетата свинца (10^-3 М) лигнин выявляется в клетках эндодермы, паренхимы и метаксилемы. При прорастании и начальном росте на растворах ацетата свинца (10^-8 М-10^-3 М) в органах растений подсолнечника и фасоли накапливается свинец. Добавление к растворам ацетата свинца абсцизовой кислоты (10^-10 М) не препятствует накоплению растениями фасоли данного металла, однако способствует адаптации к действию ионов свинца. Показано, что при действии на растение ионов свинца изменяется активность ферментов азотного обмена (глутаминсинтетазы, глутаматдегидрогеназы, аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы), концентрация фотосинтетических пигментов, в частности участников виолаксантинового цикла. Ионы селенита при одновременном действии на растения с ионами свинца (10^-3 М) повышают уровень виолаксантинового пула. в-каротин выполняет функции антиоксиданта при прорастании семян в условиях свинцового стресса. Показано, что водный статус растений зависит от влияния на них ионов свинца - на высоких концентрациях относительное содержание воды и водный потенциал в период прорастания семян изменяются в пределах не препятствующих прорастанию, в последующий период роста снижается до уровня, не достаточного для нормального протекания реакций. Абсцизовая кислота, добавленная в питательные растворы со свинцом, способствует возобновлению водного статуса, однак на високой концентрации свинца (10^-3 М) водный статус снижается до значений при которых нормальная жизнедеятельность растений невозможна.

В период прорастания и начального роста семян низкие концентрации свинца (10^-8 М) активируют антиоксидантную аскорбат-глутатионовую систему, а высокие (10^-3 М) - угнетают ее. При прорастании семян на питательных растворах со свинцом активно используется восстановленный глутатион. Высокая активность глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, аскорбатпероксидазы, монодегидроаскорбатредуктазы в органах растений способствуют их прорастанию и начальному росту на питательных растворах со свинцом. Вероятность прорастания семян растений зависит и от уровня их вынужденного покоя и базового пула аскорбиновой кислоты.

Ключевые слова: свинец, антиоксидантная система, водный статус, подсолнечник, фасоль, виолаксантиновый цикл, адаптация, селенит, абсцизовая кислота.

Vorobets N. Endogenous mechanisms in plant to lead detoxification by the ascorbate-glutathione system participation. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of the Doctor of Biological Sciences by speciality 03.00.04 - biochemistry. - Yuriy Fedkovych Chernivtsi National University, Chernivtsi, 2004.

The dissertation is devoted to a problem of plant tolerance to lead and possibility of selenite and abscisic acid to regulate this process.

It is shown, that the presence of lead ions in concentration 10^-3- 10^-8 M in medium conduct to changes in metabolic process, increases of malondialdehyde and hydrogen peroxide content. It is established the inhibitory effect of high dose of lead (10^-3 M) on glutamate dehydrogenase, glutamine synthetase, aspartate amino transferase and alanine amino transferase. Pool and correlation between violaxanthin cycle pigments change in exceed lead ions level. Perhaps this cycle is implicated in protection against damage by lead.

The decrease in water status of the plant takes place in high dose lead medium supplied condition (10^-3 M).

A high ascorbic acid content during the first stages of germination and growth is a strategy developed in seed of plants to cope with an increased level of reactive oxygen species induced by lead ions. Analysis of enzymes activity proved that the ascorbic acid-glutathione cycle (especially ascorbate peroxidase activity) is stimulated to counteract the injurious effects of lead in sunflower and bean under germination and early growth period. Dehydroascorbate reductase and glutathione reductase contribute to maintaining a high level of ascorbic acid and to avoiding the accumulation of dehydroascorbic acid.

Lead (10^-3 M) in medium resulted in significant increment of dehydroascorbic and diketogulonic acids concentration in roots. The increase of antioxidant stress enzyme activities in response to lead exposure may be taken evidence for an enhanced detoxification capacity of P. vulgaris and H. annuus plants toward reactive oxygen species (and derivates) that might be generated in the stress plants.

Medium-applied abscisic acid doesn't reduce lead uptake and accumulation by plants but provide for their adaptation to it.

Key words: lead, antioxidative system, water status, sunflower, bean, violaxanthin cycle, adaptation, selenite, abscisic acid.

Размещено на Allbest.ru