Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

УДК 582.288-11+577.18

ОЦІНКА АНТИБІОТИЧНОГО ТА ТОКСИГЕННОГО ПОТЕНЦІАЛУ ДЕЯКИХ

ВИДІВ МІКРОМІЦЕТІВ РОДУ ASPERGILLUS MICH.

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ЦИГАНЕНКО КАТЕРИНА СТЕПАНІВНА

КИЇВ - 2005

АНОТАЦІЯ

Циганенко К.С. Оцінка антибіотичного та токсигенного потенціалу деяких видів мікроміцетів роду Aspergillus Mich. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2005.

Дисертацію присвячено вивченню та оцінці антибіотичного та токсигенного потенціалу деяких видів мікроміцетів роду Aspergillus, які належать до найбільш розповсюджених у природі грибів та спроможні синтезувати широкий спектр практично важливих біологічно активних речовин.

З 128 досліджуваних штамів р. Aspergillus 26 % складали штами з широким спектром антибіотичної дії та високою фітотоксичною активністю. Решта штамів проявляла різного ступеню як антибіотичні, так й фітотоксичні властивості. 5 % штамів виявилися неактивними. Скринінг антифунгальних властивостей щодо дріжджоподібних грибів виявив лише поодинокі прояви цієї активності.

У двох штамів A. parvulus досліджена фітотоксична активність щодо насіння рослин: штам 3142 пригнічує проростання насіння мишію, щириці та пшениці, гороху, огірка, а штам 1813 - мишію та злинки.

На штамі A. parvulus 3142 показано, що найбільша біологічна активність його культуального фільтрату спостерігається при глибинному культивуванні, де як джерела вуглецевого та азотного живлення використовуються глюкоза та нітрат натрію, відповідно, у співвідношенні 20 : 1, при температурі 26 ^оС, рН 4,8, масообміні з Кv = 0,3 гО₂/лгод, при наявності освітлення.

Розроблено новий підхід щодо виділення, фракціонування та очищення біологічно активного метаболіту з культурального фільтрату A. parvulus 3142, який базується на двохступеневій колонковій хроматографії. Такий підхід дозволив вперше виділити з A. parvulus біологічно активний метаболіт та охарактеризувати його за допомогою фізико-хімічних та біологічних методів. Отриманий кристалічний препарат не містив азоту, сірки та галогенів, розкладався при 273 ^оС з обвуглюванням, мав максимум поглинання в УФ частині спектру (265 нм), його МПК щодо B. subtilis 617 складала 0,14 мг/мл і не був токсичним для теплокровних.

Ключові слова: мікроміцети, Aspergillus, тест-організми, антибіотична та фітотоксична активність, спектр дії, оптимізація, колонкова хроматографія, токсичність.

АННОТАЦИЯ

Цыганенко Е.С. Оценка антибиотического и токсигенного потенциала некоторых видов микромицетов рода Aspergillus Mich. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению и оценке антибиотического и токсигенного потенциала некоторых видов микромицетов рода Aspergillus. Грибы этого рода известны как одни из наиболее распространённых в природе и обладающие уникальной способностью синтезировать широкий спектр биологически активных веществ - антибиотиков, токсинов, ферментов, органических кислот, пигментов, которые используются в различных областях деятельности человека.

128 исследованных (музейных и свежевыделенных) штаммов р. Aspergillus по биологическим свойствам синтезируемых ими метаболитов можно разделить на 6 групп: штаммы с широким спектром антибиотического действия и высокой фитотоксической активностью (26 %); штаммы с узким спектром антибиотического действия и высокой фітотоксической активностью (12 %); штаммы с широким спектром антибиотического действия и низкой фитотоксической активностью (10 %); штаммы с узким спектром антибиотического действия и низкой фитотоксической активностью (24 %); штаммы, которые проявляют одну из исследованных активностей (23 %); неактивные штаммы (5 %).

Скрининг антифунгальных свойств по отношению к дрожжеподобным грибам показал единичные случаи проявления этой активности.

У двух штаммов A. parvulus была изучена фитотоксическая активность по отношению к прорастанию семян сорняков и сельскохозяйственных растений: штамм 3142 полностью подавлял прорастание семян щетинника, на 27 % щирицы и на 40 % пшеницы, на 25 % гороха, на 27 % огурцов, а штамм 1813 - щетинника на 45 % и мелколепестника на 27 %. Также культуральные фильтраты обоих штаммов оказывали существенное влияние на прорастание и развитие проростков и корешков семян исследованных растений.

На штамме A. parvulus 3142 изучены некоторые ростовые и биосинтетические характеристики: максимальная биологическая активность культурального фильтрата этого штамма наблюдалась при глубинном культивировании, где как источники углерода и азота использовались глюкоза (30 г/л) и нитрат натрия (1,5 г/л) в соотношении 20 : 1, при температуре 26 ^оС, рН 4,8, массообмене средней интенсивности (Кv = 0,3 гО2/лч), при наличии освещения. Изучение динамики роста A. parvulus 3142 и биосинтеза активного метаболита показало, что при глубинном культивировании стационарная фаза роста наступала на 7 сутки, а при поверхностном - на 10 сутки; максимумы активности культуральных фильтратов были отмечены на 6 сутки при глубинном культивировании и на 7 - при поверхностном.

Разработан новый подход к выделению, фракционированию и очистке биологически активного метаболита из культурального фильтрата A. parvulus 3142, основанный на двухступенчатой колоночной хроматографии с использованием в качестве стационарных фаз оксида алюминия и Toyopearl HW-40 и как элюентов 0,1 н соляной кислоты и дистиллированной воды, соответственно. Такой подход позволил впервые выделить из A. parvulus биологически активный метаболит и охарактеризовать его при помощи физико-химических и биологических методов: полученный препарат не содержал азота, серы и галогенов, разлагался при 273 ^оС с обугливанием, имел максимум поглощения в УФ части спектра (265 нм), МПК к B. subtilis 617 составляла 0,14 мг/мл и был не токсичным для теплокровных.

Построено адекватную математическую модель процесса биосинтеза биологически активного метаболита A. parvulus 3142 по содержанию в питательной среде компонентов углеродного и азотного питания и проведено её статистическую обработку.

Ключевые слова: микромицеты, Aspergillus, тест-организмы, антибиотическая и фитотоксическая активность, спектр действия, оптимизация, колоночная хроматография, токсичность.

ABSTRACT

Tsyganenko K.S. The evaluation of antibiotic and toxigenic potential of some species micromycetes of genera Aspergillus Mich. - Manuscript.

Thesis for a candidate`s degree by a speciality 03.00.07 - microbiology. - Danilo Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

The dissertation is devoted to study and estimation of antibiotic and toxigenic potential of some micromycetes' species of the Aspergillus genera, which belong to the fungi, most widespread in a nature, and are capable to synthesize a wide spectrum of important practically bioactive substances.

128 strains of Aspergillus genera were investigated. 26 % of strains had a wide spectrum of antibiotic action and high phytotoxic activity. Others strains showed in a various degree both antibiotic and phytotoxic properties. And 5 % of strains were inactive. Screening of antifungal activity against yeast-like fungi shown only single displays of this activity.

Two strains of A. parvulus (3142 and 1813) were investigated for phytotoxic activity against plants seeds.

It was shown, that the highest bioactivity of A. parvulus 3142 cultural filtrate observed during submerged cultivation. As a source of a carbon and nitric feed glucose and NaNO₃ (in the ratio 20:1, accordingly) were used. Temperature was 26 ^oC, pH 4.8, mass transfer with Kv = 0.3 gO₂/litre per hour, at the light.

The new approach of allocation, fractionation and clearing of bioactive metabolite from cultural filtrate of A. parvulus 3142 was developed. The method is based on two-stage column chromatography. Such approach had allowed for the first time to extract bioactive metabolite from A. parvulus and to characterize it with physical-chemical and biological methods - received crystal preparation did not contain nitrogen, sulfur and halogens, destroyed at 273 ^oC, has a maximum of absorption in the UV part of spectrum (at 256 nm), its minimal suppressing concentration in relation to B. subtilis 617 was 0.14 mg/ml, and it was not toxic for animals.

Key words: micromycetes, Aspergillus, test-organisms, antibiotic and phytotoxic activity, spectrum of action, optimisation, column chromatography, toxicity.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, керівник лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

доктор біологічних наук Бухало Ася Сергіївна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, головний науковий співробітник відділу мікології

Провідна установа: Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова, кафедра мікробіології і вірусології, Міністерство освіти і науки України

Захист відбудеться “19” жовтня 2005 р. о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д 03680, Київ ДСП, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д 03680, Київ ДСП, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано “ 16 ” вересня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

Актуальність теми. На сьогодні біосинтетичні властивості різних видів р. Аspergillus вивчені досить широко і, завдяки своїй здатності продукувати цінні біологічно активні речовини, знайшли застосування в практичній діяльності людини. Поряд з цим, велика кількість виділених сполук виявилась токсичною щодо тварин і рослин, що перешкоджало їх практичному використанню. Але, завдяки досить цікавому набору властивостей, вони продовжують викликати інтерес у вчених, виходячи саме з перспектив їх застосування (Тутельян с соавт., 1985; “Mycotoxins…”, 1984; Pitt, 2000).

Інші види зайняли своє місце в біотехнології як продуценти таких біологічно активних речовин, як антибіотики, ферменти, пігменти, органічні кислоти тощо, які використовуються в різних галузях промисловості, зокрема харчової та легкої, народного та сільського господарства, медицини та ветеринарії (Билай, 1961, 1965; Козловский с соавт., 1990). Досить згадати, що промисловим продуцентом лимонної кислоти є саме A. niger (Карклинь, 1966).

Але, поряд з цим, багато з виділених та описаних видів р. Aspergillus досі залишаються поза увагою вчених щодо вивчення їх фізіологічних властивостей, в тому числі й здатності до синтезу біологічно активних речовин. Так, досі не проводилось системних досліджень щодо біологічної активності представників р. Aspergillus, а ті дані, що є в літературі, одержані переважно на окремих штамах. Яскравим прикладом недостатньо вивченого в цьому плані виду є A. parvulus Smith, який був вперше описаний Смітом у 1961 році (Билай с соавт., 1988).

Все викладене вище зумовлює актуальність проведення системних досліджень щодо вивчення біологічної активності великого набору штамів різних видів р. Aspergillus на їх здатність продукувати метаболіти, що можуть бути практично важливими. В нашій роботі було досліджено 128 штамів р. Aspergillus, які належать до 18 видів та 3 різновидностей. Така кількість об`єктів дозволяла провести саме системне дослідження цього питання та з`ясувати основні закономірності прояву біологічних властивостей. Отримані дані дали нам змогу відібрати маловивчений вид A. parvulus для подальших більш глибоких досліджень.

Актуальною є також розробка методів, які використовувались для виділення нового біологічно активного метаболіту, зокрема це застосування двохступеневої колонкової хроматографії з різними нерухливими фазами та елюентами, що раніше не використовувалось для виділення антибіотиків та токсинів з культуральних фільтратів мікроміцетів.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за темами “Оцінка потенціалу біологічно активних речовин з малодосліджених видів роду Aspergillus для подальшого практичного застосування” (2004 - 2006 рр., держ. реєстраційний № 0104V003298), “Пошук нових біологічно активних сполук серед малодосліджених видів мікроміцетів для подальшого практичного застосування” (2005 - 2009 рр., держ. реєстраційний № 0105V001248) та “Збереження належного стану і функціонування об`єкту, що становить національне надбання - Колекцію мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного” (постанова Кабінету Міністрів України № 1709 від 19.12.2001 р.).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи була оцінка антибіотичних та токсигенних властивостей різних недостатньо досліджених видів р. Aspergillus з наміром виділення нових біологічно активних метаболітів, їх ідентифікації та вивчення деяких аспектів біологічної дії.

Досягнення поставленої мети передбачало вирішення ряду завдань:

– провести скринінг досліджуваних штамів р. Aspergillus за антибіотичними та фітотоксичними властивостями щодо широкого загалу тест-організмів та на його основі відібрати найбільш перспективні з них для подальшого поглибленого вивчення;

– дослідити фітотоксичну активність відібраних штамів щодо насіння бур`янів та культурних рослин;

– дослідити особливості росту штаму-продуцента та визначити оптимальні умови культивування для підвищення активності культурального фільтрату;

– ізолювати та очистити біологічно активний метаболіт та отримати його у кристалічному вигляді;

– вивчити деякі фізико-хімічні та біологічні характеристики виділеного метаболіту, а також, по можливості, провести його ідентифікацію;

– вивести математичну модель процесу біосинтезу за заданими умовами.

Об`єктом дослідження були 128 штамів мікроміцетів р. Aspergillus, а також набір тест-організмів, зокрема 3 штами дріжджоподібних грибів, 7 штамів бактеріальних тест-культур та 16 штамів зелених водоростей.

Предметом дослідження була оцінка антибіотичного та токсигенного потенціалу досліджуваних штамів р. Aspergillus щодо різних систематичних груп: грампозитивних і грамнегативних, в тому числі фітопатогенних, бактерій, дріжджоподібних грибів, зелених водоростей та насіння рослин.

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували ряд методів дослідження, серед яких для визначення антибіотичних та фітотоксичних властивостей та для культивування об`єктів дослідження застосовували мікробіологічні та мікологічні методи, для виділення біологічно активного метаболіту - біохімічні методи, для вивчення властивостей отриманого кристалічного препарату - біологічні та фізико-хімічні методи. На всіх етапах роботи також використовували математичні методи статистичної обробки отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що:

– вперше з використанням значної кількості музейних та свіжовиділених штамів був досліджений антибіотичний та фітотоксичний потенціал різних видів мікроміцетів р. Aspergillus;

– вперше визначено здатність виду A. parvulus продукувати біологічно активну речовину, яка проявляє антибіотичні, фітотоксичні та гербіцидні властивості і не є токсичною для лабораторних тварин;

– відпрацьовані оптимальні умови біосинтезу досліджуваної речовини,

– здійснено виділення у кристалічному вигляді та часткову ідентифікацію біологічно активного метаболіту з A. parvulus 3142.

Практичне значення одержаних результатів. Вивчення антибіотичних та токсигенних властивостей мікроміцетів р. Aspergillus дозволяє реально оцінити потенціал цього роду в плані пошуку серед їх метаболітів нових біологічно активних речовин, перспективних щодо практичного використання в різних галузях життєдіяльності людини.

Досліджуваний в нашій роботі вид A. parvulus продукує біологічно активні метаболіти, що проявляють різного спектру антибіотичні і фітотоксичні властивості, серед яких важливе місце займає гербіцидна активність щодо насіння мишію, щириці та інших бур`янів. Ці властивості можуть бути перспективними щодо практичного використання отриманої сполуки в сільському господарстві, медицині і ветеринарії. Розроблена схема виділення нової біологічно активної речовини з культурального фільтрату A. parvulus 3142 може бути використана як типова у подальших дослідженнях, спрямованих на виділення та ідентифікацію нових, перспективних для різних галузей народного господарства та медицини метаболітів.

Поряд з цим, отримані в ході роботи дані можуть суттєво поповнити фундаментальні знання щодо фізіології представників р. Aspergillus в цілому та деяких його видів зокрема. Результати роботи можуть бути використані у підручниках та методичних посібниках з мікології та біотехнології для учбових закладів різних рівнів.

Особистий внесок здобувача. Робота проведена в лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Основна частина експериментального матеріалу, викладеного в дисертації, отримана автором самостійно під керівництвом д.б.н., проф. Зайченка О.М. Особиста участь дисертанта полягала в критичному аналізі даних літератури, розробці методичних підходів щодо виконання поставлених завдань, узагальненні одержаних результатів, статистичній обробці цифрового матеріалу.

Автором самостійно проведено скринінг 128 штамів р. Aspergillus за антибіотичними та фітотоксичними властивостями; встановлена фітотоксична активність A. parvulus 3142 та 1813 щодо насіння культурних рослин та бур`янів; розроблені оптимальні умови для підвищення біологічної активності культурального фільтрату A. parvulus 3142; ізольована та очищена біологічно активна сполука “препарат АР 3142” та вивчені її властивості, а також побудовано математичну модель процесу біосинтезу за заданими умовами.

Постановка завдань, обговорення одержаних результатів та підготовка публікацій за результатами досліджень проводились спільно з науковим керівником д.б.н., проф. Зайченком О.М.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на Міжнародній науково-теоретичній конференції молодих вчених “Молодь і досягнення у вирішенні проблем сучасності” (м. Чернівці, 31 жовтня - 1 листопада 2003 р.), на Десятому з`їзді Товариства мікробіологів України (м. Одеса, 15 - 17 вересня 2004 р.), на Третьому Всеросійському конгресі з медичної мікології (м. Москва, 24 - 25 березня 2005 р.), а також двічі доповідалися на конференціях молодих вчених Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України “Конкурс експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ” (м. Київ, 10 - 12 грудня 2002 р. та 25 - 26 листопада 2003 р.) аspergillus антибіотичний фітотоксичний бур`ян

Публікації. Результати дисертаційної роботи представлені в 6 статтях, опублікованих в наукових профільних журналах та в 2 тезах, опублікованих за матеріалами з`їзду та конгресу.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 134 сторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали і методи дослідження”, “Антибіотичний та фітотоксичний потенціал деяких видів мікроміцетів роду Aspergillus”, “Виділення та деякі властивості біологічно активного метаболіту з A. parvulus 3142”, “Заключення”, “Висновки”, “Список використаних джерел”, який містить 193 посилання (з яких 145 іноземних авторів). Робота містить 23 таблиці та 13 рисунків.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з 2 підрозділів, в першому з яких розглядаються питання історії розвитку та загальної характеристики процесу скринінгу різних організмів для пошуку нових біологічно активних речовин, аналізу схеми цього процесу. Другий підрозділ присвячений біологічно активним речовинам мікроміцетів р. Aspergillus в цілому, а також докладному розгляду властивостей антибіотиків, мікотоксинів та фітотоксинів, продуцентами яких гриби цього роду.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об`єктами дослідження були 128 штамів мікроміцетів р. Aspergillus, які належать до 18 видів та 3 різновидностей, які були виділені з 1988 по 2003 роки з ґрунтів різних областей України, повітря приміщень, лісової підстилки, а також з зони відчуження ЧАЕС. В наше розпорядження вони були надані з музею відділу фізіології і систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології НАН України, за що ми щиро вдячні.

Поряд з цим, об`єктами дослідження як тест-організми слугували 3 штами дріжджоподібних грибів, отриманих з відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАНУ, 7 штамів бактеріальних тест-культур, з яких 3 штами грампозитивних бактерій, отриманих з відділу антибіотиків, та 4 штами грамнегативних, в тому числі фітопатогенних, бактерій, отриманих з відділу фітопатогенних бактерій цього ж Інституту, а також 16 штамів зелених водоростей р. Chlorella, отриманих з відділу фікології Інституту ботаніки НАНУ. Поряд з цим, в роботі використовували насіння культурних рослин, яке було комерційного походження, та насіння бур`янів, яке збирали влітку 2002 року.

Методи культивування грибів. Для дослідження антибіотичних, фітотоксичних та антифунгальних властивостей використовували культуральні фільтрати мікроміцетів, які отримували при поверхневому культивуванні на стандартному середовищі Чапека з 20 г/л глюкози як джерела вуглецю і 1 г/л NaNO₃ як джерела азоту. Засів проводили суспензією конідій (1 • 10⁸ кл/мл) з пробірок зі скошеним агаризованим суслом. Культивування здійснювали при 26 ^оС впродовж 14 діб (“Методы...”, 1982; ).

При дослідженні динаміки накопичення біологічно активного метаболіту також використовували глибинне культивування на круговій качалці зі швидкістю 220 об/хв. Культивування здійснювали при 26 ^оС, проби відбирали кожні 24 години впродовж 14 діб. Питому швидкість росту (м) розраховували за методом Ієрусалімського (1963).

Скринінг різних штамів р. Aspergillus за біологічними властивостями здійснювали за допомогою методу лунок у агарі, який для визначення антибіотичної активності містив бактеріальні тест-культури, антифунгальної активності - дріжджоподібні гриби, фітотоксичної активності - зелені водорості. Фітотоксичну активність культуральних фільтратів штамів A. parvulus 3142 і 1813 щодо рослин визначали методом біопроби на насінні рослин (“Методы...”, 1982).

Метод виділення та очистки біологічно активного метаболіту. Перед виділенням біологічно активного метаболіту нами були оптимізовані умови культивування штаму A. parvulus 3142 для підвищення активності його культурального фільтрату. Поживне середовище оптимізували за вмістом джерел вуглецевого та азотного живлення та їх співвідношення, а також за вихідним значенням показника рН. При визначенні умов культивування A. parvulus 3142 вирощували поверхнево впродовж 14 діб при різних значеннях температури, в різних умовах аерації, наявності та відсутності освітлення, а також в динаміці при глибинному культивуванні.

На стадії виділення біологічно активного метаболіту культуральний фільтрат A. parvulus 3142 упарювали під зниженим тиском до маслянистого стану, який наносили на колонку і фракціонували. В роботі використовували двохступеневу колонкову хроматографію, де при фракціонуванні на першому етапі як нерухливу фазу застосовували окис алюмінію ІІ ст. активності за Брокманом (“Reanal”, Угорщина) та 0,1 н розчин соляної кислоти як елюент, а на другому етапі - як нерухливу фазу Toyopearl HW-40 (“Toyo Soda MFG”, Японія) та дистильовану воду як елюент (Лурье, 1978).

Очистку отриманої речовини здійснювали шляхом перекристалізації із суміші метанол : н-гексан. Чистоту отриманих кристалів було підтверджено даними тонкошарової хроматографії в трьох різних системах розчинників, яку здійснювали на пластинах “Silufol” UV 254 (“Kavalier”, Чехія). При візуалізації активної речовини та біоавтографічних даних була отримана одна пляма.

Математична модель процесу біосинтезу біологічно активного метаболіту з A. parvulus 3142 була побудована за вмістом компонентів вуглецевого та азотного живлення у поживному середовищі за допомогою методу повного факторного експерименту (ПФЕ) другого порядку (Бондарь с соавт., 1976).

Біологічні та фізико-хімічні методи аналізу. Як кількісну характеристику біологічної активності на кожній стадії фракціонування визначали мінімальну пригнічуючу концентрацію (МПК), яку знаходили методом двохкратних серійних розведень. Як тест-культуру використовували суспензію (5 • 10⁶ кл/ мл) Bacillus subtilis 617, як рідке поживне середовище - картопляний бульйон.

Токсичність препарату з культурального фільтрату A. parvulus 3142 щодо теплокровних визначали методом шкірної проби на кролику (“Ветеринарно-санитарная...оценка кормов”, 1987) та при підшкірному та внутрішньобрюшинному введенні мишам (“Методы...”, 1982).

Елементний склад, який включав визначення азоту, сірки та галогенів, визначали методом сплавлення з натрієм (Черонис, 1960).

Температуру плавлення отриманої кристалічної речовини визначали за Кофлером та обчислювали як середні значення з 5 - 6 вимірювань (Лазуревский с соавт., 1966).

УФ-спектри та спектри видимого світла розчину досліджуваного препарату у дистильованій воді реєстрували на спектрофотометрі “Specord” (Німеччина).

Всі досліди були виконані в 3 - 6 повторностях, і дані представлені як середні показники. Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою прикладного пакету Microsoft Excel 2000 та Sigma Stat 2.0.

РОЗДІЛ 3. АНТИБІОТИЧНИЙ ТА ФІТОТОКСИЧНИЙ ПОТЕНЦІАЛ ДЕЯКИХ ВИДІВ МІКРОМІЦЕТІВ РОДУ ASPERGILLUS

Результати скринінгу 128 штамів р. Aspergillus за антибіотичними, фітотоксичними та антифунгальними властивостями представлені в таблиці 1.

Як видно з наведених даних, переважна більшість досліджених штамів р. Aspergillus пригнічує ріст тест-культур. При цьому їх можна розділити на декілька груп, зокрема: за антибіотичними властивостями - штами з широким та вузьким спектром антибіотичної дії; за фітотоксичними властивостями - штами з високою та низькою фітотоксичною активністю; штами, які проявляють антифунгальні властивості та неактивні штами.

Так, до мікроміцетів з широким спектром антибіотичної дії щодо бактеріальних тест-культур можна віднести майже всі досліджені штами A. ochraceus, A. niger, більшість штамів A. terreus, половину досліджених штамів A. parvulus та поодинокі штами A. versicolor, A. terreus var. aureus, A. ustus, A. fumigatus, A. alliaceus, A. clavatus та A. niveus, які проявляли активність майже щодо всіх досліджених бактеріальних тест-культур.

Всі інші досліджені штами мали вузький спектр антибіотичної дії. Так, деякі штами A. parvulus, A. ustus, A. alliaceus, A. versicolor, A. flavipes, A. flavus, A. candidus, A. fruticulosus, A. fischeri, A. terreus та A. ochraceus проявляли активність лише щодо грамнегативних бактеріальних тест-культур; виключно щодо всіх грампозитивних тест-культур були активними по одному з штамів A. ustus та A. flavipes. Деякі штами з цієї групи проявляли вибіркову активність лише щодо однієї з бактеріальних тест-культур, які з успіхом можуть бути використані при розробці нових методик визначення речовин як індикаторні культури.

Слід зазначити, що незначна кількість штамів A. versicolor, A. terreus var. africanus, A. ustus, A. flavipes та A. sydowii не проявляла антибіотичної активності щодо жодного тест-організму.

Більшість досліджених штамів проявляла переважно бактеріостатичну дію щодо грамнегативних бактеріальних тест-культур. В той же час, прояв бактерицидної дії був характерним щодо грампозитивних тест-культур.

В таблиці 1 наведені також результати скринінгу досліджуваних мікроміцетів за антифунгальними властивостями щодо трьох штамів дріжджоподібних грибів. Отримані дані свідчать, що переважна більшість штамів р. Aspergillus не проявляє антифунгальної активності. Ця властивість була притаманна лише поодиноким штамам A. versicolor, A. ochraceus, A. terreus, A. clavatus, A. fumigatus, A. parvulus, A. ustus та A. alliaceus.

Таблиця 1

Антибіотична активність культуральних фільтратів досліджуваних штамів р. Aspergillus щодо різних тест-організмів

№ п/п	Види, різновидності	Кількість дослід- жених штамів	Кількість штамів, що проявляють активність
			антибіотичну, спектру дії	фітотоксичну	анти- фунгальну
			широкого	вузького	високу	низьку
1	Aspergillus candidus	2	0	2	0	1	0
2	A. clavatus	1	1	0	1	0	1
3	A. deflectus	1	0	1	0	0	0
4	A. flavipes	10	0	9	5	3	0
5	A. flavus	4	0	4	1	1	0
6	A. flavus var. columnaris	1	0	1	0	1	0
7	A. fumigatus	5	1	4	4	1	1
8	A. niger	5	5	0	3	0	0
9	A. ochraceus	13	12	1	9	4	6
10	A. parvulus	20	9	11	10	10	2
11	A. sydowii	5	0	2	0	3	0
12	A. terreus	12	8	4	9	3	4
13	A. terreus var. africanus	3	0	1	0	2	0
14	A. terreus var. aureus	1	1	0	1	0	0
15	A. ustus	14	3	10	0	10	5
16	A. versicolor	19	1	14	1	7	6
17	Emericella fruticulosa (A. fruticulosus)	1	0	1	0	0	0
18	E. nidulans (A. nidulans)	2	0	2	0	1	0
19	Fennellia nivea (A. niveus)	1	1	0	0	1	0
21	Neosartorya fischeri (A. fischeri)	2	0	2	0	1	0
20	Petromyces alliaceus (A. alliaceus)	5	1	4	0	2	2

З наведених у таблиці 1 даних можна бачити, що не всі досліджувані штами проявляють фітотоксичну активність щодо зелених водоростей. Велику групу складали штами з високою фітотоксичною активністю, а саме: A. parvulus, A. terreus, A. ochraceus, A. flavipes, A. fumigatus, A. niger, A. versicolor, A. terreus var. aureus, A. flavus та A. clavatus, які були активними майже щодо всіх водоростевих тест-культур.

Інші штами проявляли незначну фітотоксичну активність. Серед цієї групи слід виділити штами A. parvulus, A. versicolor, A. terreus, A. terreus var. africanus, A. ochraceus, A. ustus, A. flavipes, A. sydowii, A. fumigatus, A. flavus var. columnaris, A. alliaceus, A. candidus, A. flavus, A. nidulans, A. niveus та A. fischeri. А деяка кількість штамів A. versicolor, A. terreus var. africanus, A. ustus, A. flavipes, A. sydowii, A. flavus, A. niger, A. alliaceus, A. nidulans, A. candidus, A. deflectus, A. fruticulosus та A. fischeri взагалі не проявляли фітотоксичної активності щодо досліджених водоростевих тест-культур.

При порівнянні антибіотичних та фітотоксичних властивостей досліджуваних штамів р. Aspergillus можна зробити висновок, що у більшості випадків широкий спектр антибіотичної дії та висока фітотоксична активність притаманна різним штамам. Поряд з цим, 26 % штамів мають як антибіотичну активність широкого спектру дії, так й високу фітотоксичну активність; 10 % штамів - антибіотичну активність вузького спектру дії та високу фітотоксичну активність; 12 % штамів - антибіотичну активність широкого спектру дії та низьку фітотоксичну активність; 24 % штамів - низьку як антибіотичну, так і фітотоксичну активність. Окрім цього, 23 % складали штами, що проявляли лише антибіотичну або фітотоксичну активність. 5 % досліджуваних штамів виявилось неактивними.

На основі наведених даних можна зробити висновок, що загал досліджених представників р. Aspergillus характеризується досить високим як антибіотичним, так й фітотоксичним потенціалом, що дійсно зумовлює перспективність подальшої роботи з ними на предмет виявлення нових біологічно активних речовин.

Особливо цікавими видаються нам подальші дослідження штамів A. parvulus, оскільки цей вид досі не був об'єктом пошуку біологічно активних речовин, але, як свідчать одержані нами дані, представлений досить широким спектром активностей. Окрім цього, цей вид у нашій роботі був представлений найбільшою кількістю штамів (20), виділених з радіоактивних ґрунтів та лісової підстілки зони відчуження ЧАЕС.

Для подальшого дослідження фітотоксичних властивостей щодо насіння рослин ми відібрали штами A. parvulus 3142 та 1813, які проявляли антибіотичну активність широкого спектру дії та високу фітотоксичну активність щодо зелених водоростей. Дані, наведені у таблиці 2, засвідчують, що культуральний фільтрат A. parvulus 3142 повністю пригнічує проростання насіння мишію та пригнічує проростання насіння щириці на 27 %. В той же час, він пригнічує також проростання насіння деяких культурних рослин, зокрема, пшениці на 40 %, гороху на 25 % та огірків на 27 %, в той час як культуральний фільтрат A. parvulus 1813 пригнічує проростання насіння лише таких бур'янів як мишій (на 45 %) та злинка (на 27 %), не впливаючи при цьому на проростання насіння культурних рослин.

Поряд з цим, в ході роботи було з`ясовано, що культуральні фільтрати, які проявляють фітотоксичну активність впливають також на проростання та розвиток проростків та корінців насіння досліджених рослин. Так, культуральний фільтрат A. parvulus 3142 хоч і не виявив значного впливу на кількість пророслого насіння злинки, галинсоги та редису, але значно впливав на ріст проростків злинки та корінців галинсоги і редису, а також справляв суттєвий негативний вплив на ріст проростків і корінців пшениці, гороху та огірка, до яких проявляв фітотоксичну активність. В той же час, культуральний фільтрат A. parvulus 1813 значно впливав на ріст проростків щириці, кукурудзи, гороху і огірка та корінців полину, щириці, редису і огірка, кількість пророслого насіння яких не давала нам змоги зробити висновок щодо наявності фітотоксичної активності до насіння цих рослин, а також пригнічував ріст проростків злинки, до якої проявляв високу фітотоксичну активність.

Таблиця 2

Фітотоксична активність A. parvulus 3142 та 1813 щодо насіння рослин

	Контроль	Кількість насіння (%), що проросла після обробки культуральними фільтратами
Насіння рослин	росту,
	%	A. parvulus 3142	A. parvulus 1813
		Бур'яни
Полин	100	93 ± 1,6	93 ± 1,2
Щириця	100	73 ± 1,2	99 ± 0,7
Мишій	100	0	55 ± 1,3
Плоскуха	100	80 ± 1,6	100
Галинсога	100	79 ± 1,9	100
Злинка	100	96 ± 1,4	73 ± 0,8
		Культурні рослини
Капуста	100	81 ± 1,6	99 ± 1,0
Редис	100	100	100
Кукурудза	100	100	100
Пшениця	100	60 ± 1,4	100
Горох	100	75 ± 1,0	100
Огірок	100	73 ± 1,2	77 ± 0,8

Виявлення фітотоксичної активності культуральних фільтратів у двох штамів A. parvulus щодо насіння рослин, зокрема бур`янів, може свідчити про перспективність вивчення їх фізіологічних властивостей з метою отримання сполук з гербіцидною активністю, практично важливих для сільського господарства.

РОЗДІЛ 4. ВИДІЛЕННЯ ТА ДЕЯКІ ВЛАСТИВОСТІ БІОЛОГІЧНО

АКТИВНОГО МЕТАБОЛІТУ З A. PARVULUS 3142

З метою поглиблення знань щодо фізіології A. parvulus 3142 нами була проведена серія досліджень, спрямованих на досягнення умов, за яких активність культурального фільтрату A. parvulus 3142 набувала б максимального значення. В якості факторів, значущих для біосинтезу біологічно активної речовини, були відібрані наступні: вплив хімічних факторів - показника рН поживного середовища, джерел вуглецевого та азотного живлення і їх співвідношення; вплив фізичних факторів - температури, освітлення, умов масообміну та способу культивування.

Отримані дані свідчать, що культуральний фільтрат A. parvulus 3142 набував максимальної біологічної активності при наступних умовах: глибинне культивування, глюкоза (30 г/л) і нітрат натрію (1,5 г/л) як джерела вуглецевого та азотного живлення у співвідношенні 20 : 1, температура 26 ^оС, рН поживного середовища 4,8, масообмін 0,30 гО₂/л·год, наявність освітлення.

Результати вивчення динаміки росту A. parvulus 3142 та накопичення активного метаболіту при різних способах культивування наведені на рисунках 1 і 2.

Було з`ясовано, що в перші дві доби як при поверхневому, так і при глибинному культивуванні спостерігається досить незначний приріст міцелію, який складав у середньому 0,05 мг/мл. Стаціонарна фаза росту наступала при поверхневому культивуванні (рис. 1) на 10 - 11 добу, а при глибинному культивуванні (рис. 2) на 7 добу. Після цього концентрація біомаси поступово знижувалась, що можливо пов`язано з процесами автолізу після використання джерел живлення. Питома швидкість росту культури сягала свого максимального значення в експоненціальній фазі росту (на 3 добу) як при поверхневому (м = 0,172 год^-1), так і при глибинному (м = 0,272 год^-1) культивуванні. В наступний період цей показник поступово знижувався і набував мінімального значення на стадіях автолізу в обох випадках культивування.

Що стосується накопичення біологічно активного метаболіту, то збільшення його синтезу було пропорційним збільшенню біомаси у обох випадках культивування, але, як видно з даних, наведених на рис. 1 і 2, зміщувалось відносно доби культивування. Так, при поверхневому культивуванні максимальний рівень накопичення біологічно активного метаболіту спостерігався на 7 добу та після розрахунків становив 27,5 мг/мл, а при глибинному методі культивування - на 6 добу і становив 28,8 мг/мл.

Окрім вище згаданих показників, ми вивчали також динаміку зміни показника рН в середовищі при поверхневому та глибинному культивуванні, а також вміст сухих речовин у середовищі, який складається з маси компонентів речовин поживного середовища та маси синтезованих під час росту метаболітів. Було показано, що в процесі як поверхневого, так і глибинного культивування показник рН підвищується до значень 6,24 і 6,41, відповідно, що може свідчити про наявність основних груп у молекулах синтезованої активної речовини.

Разом з цим, при обох способах культивування прослідковується однакова закономірність вмісту у середовищі культивування сухих речовин, де впродовж всього часу культивування концентрація сухих речовин поступово знижується. зокрема при поверхневому культивуванні до 5,64 мг/мл, а при глибинному - до 5,72 мг/мл.

Метою наступного етапу роботи було виділення у кристалічному вигляді біологічно активного метаболіту A. parvulus 3142. На 8 добу культивування досліджуваного мікроміцету збирали культуральну рідину та фільтрували за допомогою вакуум-фільтру, після чого отриманий культуральний фільтрат концентрували.

При спробі сконцентрувати культуральний фільтрат шляхом діалізу за допомогою поліетиленгліколю-6000, нами був встановлений факт втрати активної речовини, що могло свідчити про її невисоку молекулярну масу. З огляду на це, культуральний фільтрат A. parvulus 3142 упарювали під зниженим тиском до маслянистого стану. Отриманий розчин наносили на колонку з окисом алюмінію і фракціонували.

Було встановлено, що після першої стадії фракціонування на колонці з окисом алюмінію (рис. 3) сконцентрованого культурального фільтрату найбільш активними щодо B. subtilis 617 виявились фракції №№ 6 - 9, а максимум цієї активності був характерним для фракції № 7, яка в той же час була представлена і максимумом вмісту сухих речовин. Інший максимум, характерний для фракції № 3, був зумовлений наявністю в ньому пігментних сполук, які не проявляли біологічної активності.

При визначенні МПК найбільш антибіотично активної фракції, отриманої після першої стадії фракціонування ріст тест-культури не спостерігався при розведенні 1 : 6, для якого характерна концентрація сухих речовин активної фракції 2 мг/мл, тобто МПК досліджуваної сполуки складає 2 мг сухих речовин/мл.

На другому етапі фракціонування сконцентрованого культурального фільтрату на колонці з Toyopearl HW-40 (рис. 4) було встановлено, що найбільш активними виявились фракції №№ 2 - 5 з максимумом у фракції № 2, представленої також і максимумом вмісту сухих речовин. Після упарювання цієї фракції нами було отримано речовину, яка при подальшій очистці шляхом перекристалізації із суміші метанол : н-гексан була виділена у вигляді пластинчатих кристалів світложовтого кольору. В подальшому для цієї речовини ми вводимо умовну назву - “препарат АР 3142”.

МПК найбільш активної фракції, отриманої після другого етапу фракціонування, відповідала розведенню 1 : 4, для якого характерна концентрація активного метаболіту 0,14 мг/мл, тобто МПК досліджуваного “препарату АР 3142” становила 0,14 мг кристалічної речовини/мл і, таким чином, після другої стадії фракціонування була досягнута його очистка в 14 разів.

Чистоту отриманих кристалів було підтверджено також даними тонкошарової хроматографії в трьох різних системах розчинників (бутанол, насичений водою; мурашина кислота : вода (1 : 1); етанол : вода (1 : 1)). При візуалізації активної речовини та біоавтографічних даних була отримана одна пляма.

Слід зазначити, що застосування двохступеневої колонкової хроматографії з двома різними системами нерухлива фаза-елюент для виділення та очистки антибіотичної речовини є новим підходом, оскільки раніше для цієї мети застосовували виключно одноступеневу хроматографію з постійною нерухливою фазою та набором органічних розчинників як елюентів.

На основі наведених раніше даних щодо фракціонування біологічно активного метаболіту можна представити наступну узагальнену схему отримання цієї речовини у кристалічному вигляді (рис. 5).

Хімічну ідентифікацію кристалічного “препарату АР 3142” проводили за допомогою елементного аналізу. Було з`ясовано, що ця речовини складається лише з основних компонентів органічних сполук, зокрема вуглецю, водню та кисню. Досліди щодо виявлення інших елементів, які, найчастіше присутні в складі органічних речовин, дали негативний результат. Так, якісними реакціями була підтверджена відсутність азоту та сірки, в складі досліджуваної речовини не було виявлено також елементів групи галогенів.

Було з`ясовано також, що кристали “препарату АР 3142” при визначенні температури плавлення при температурі 52 <sup>о</sup>С перетворювались у білу непрозору речовину, що, найбільш вірогідно, було пов`язано з їх дегідратацією. При цьому речовина не втрачала біологічної активності. Подальше нагрівання супроводжувалось обвуглюванням, яке спостерігалось при температурі 273 ^оС. Таким чином, характерною температурою для цієї сполуки можна вважати температуру розкладу - 273 ^оС.

Отримання посівного матеріалу A. parvulus 3142

(скошений сусло-агар, 10 діб)

v

Культивування на рідкому середовищі

(220 об/хв., Т = 26 ^оС, 8 діб)

v

Вакуум-фільтрація > біомаса

v

Вакуум-упарювання

(культуральний фільтрат)

v

Очищення від пігментів > пігмент

(колонкова хроматографія на Al₂O₃

з елюцією 0,1 н HCl)

v

Вакуум-упарювання

(найбільш активна фракція)

v

Фракціонування

(колонкова хроматографія на Toyopearl HW-40

з елюцією H₂O дист.)

v

Вакуум-упарювання

(фракція з активною речовиною)

v

Перекристалізація

(суміш метанол : н-гексан)

v

кристалічний “препарат АР 3142”

Рис. 5. Загальна схема отримання кристалічного препарату з A. parvulus 3142.

Поряд з цим, аналіз спектральних характеристик водного розчину “препарату АР 3142” у видимій та в ультрафіолетовій областях спектру засвідчує наявність чіткого максимуму в УФ частині спектру при довжині хвилі 265 нм (Е = 37800) (рис. 6). Порівнюючи це значення з табличними значенням максимумів поглинання основних класів органічних сполук в області 200 - 800 нм можна зробити припущення, що в структурі молекули досліджуваної сполуки можуть міститись від 3-х до 6 спряжених подвійних зв'язків, атоми йоду, азоту та карбоксильна група. Однак, елементний аналіз цієї речовини показав відсутність в структурі атомів азоту та галогенів. Таким чином, можна зробити висновок, що ця речовина може бути ненасиченою поліеновою сполукою, яка містить карбоксильну групу.

У видимій частині спектру нами не було відмічено максимумів поглинання, що може характеризувати також і відсутність забарвлення.

Дослідження біологічних властивостей отриманого “препарату АР 3142” показало досить високу антибіотичну активність, яку засвідчує значення мінімальної пригнічуючої концентрації щодо B. subtilis 617 (0,14 мг/мл), та нетоксичність даного препарату для лабораторних тварин.

Дослідження токсигенних властивостей препарату методом шкірної проби на кролях засвідчило його безпечність. Водний розчин “препарату АР 3142” в жодному випадку не спричиняв навіть гіперемії.

Підшкірне введення мишам культуральної рідини також не справляло ніякої дії. Але, як при підшкірній, так і при внутрішньобрюшинній ін`єкції водного розчину “препарату АР 3142” у дозі 500 мг/кг на 3 добу спостереження у 50 % мишей в місцях введення з`являлась область гіперемії ІІІ ступеню діаметром 6 - 7 мм, яка характеризувалась зникненням покрову шерсті, набряком, інколи виразками. Поряд з тим, дослідні миші не втрачали апетиту та були активними, а вже на 6 добу спостереження область гіперемії вкривалась суцільною кірочкою. Загиблих мишей в досліді не було. Таким чином, на даній стадії дослідження препарат можна вважати умовно не токсичним для теплокровних.

...