Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

ФІЛЯК ОКСАНА СТЕПАНІВНА

УДК 576.32/.36 + 616-006.6 + 577.17

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

МЕХАНІЗМИ УЧАСТІ ТРАНСФОРМУЮЧОГО ФАКТОРА РОСТУ БЕТА У ВІДПОВІДІ РАКОВИХ КЛІТИН НА ДІЮ ДЕЯКИХ ПРОТИПУХЛИННИХ ПРЕПАРАТІВ

03.00.04 - біохімія

Львів - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка МОН України. цисплатин протипухлинний метотрексат

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор, Стойка Ростислав Степанович, Інститут біології клітини НАН України, завідувач відділу регуляції проліферації клітин Львівський національний університет імені Івана Франка МОН України, професор кафедри біохімії.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, Сологуб Леонід Ілліч, Інститут біології тварин УААН, завідувач лабораторії обміну речовин;

доктор медичних наук, професор, Скляров Олександр Якович, Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, завідувач кафедри біологічної хімії.

Провідна установа - Інститут біохімії імені О. В. Палладіна НАН України, відділ молекулярної імунології, м. Київ.

Захист відбудеться “13” вересня 2005 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. Стуса, 38.

Автореферат розісланий “12” серпня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Віщур О. І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогоднішній день лікування ряду онкологічних захворювань усе ще залишається серйозною проблемою, оскільки воно важко піддається прогнозуванню. Неподоланою є проблема недостатньої ефективності дії протипухлинних препаратів внаслідок обмеженого їх проникнення у клітини, функціонування внутрішньоклітинних механізмів детоксикації, підвищення анти-апоптичного потенціалу пухлинних клітин. На цей час встановлені механізми не можуть пояснити усіх причин зниження ефективності хіміотерапії. Ще однією причиною низької ефективності протипухлинних препаратів є зміни у регуляторних шляхах цитокінів, зокрема трансформуючого фактора росту в (ТФРв). ТФРв є представником великої однойменної родини поліпептидних факторів, які регулюють ріст, диференціацію та програмовану смерть клітини (Massague J. 1998, Bartram U., et al. 2004). Передача регуляторних сигналів ТФРв здійснюється за участю рецепторів ТФРв від поверхні клітини до ядра через внутрішньоклітинні ефекторні білки Smad (Moustakas A., et al. 2001, Dennler S., et al. 2002, ten Dijke P., et al. 2004).

Відомо, що ТФРв1 посилює цитотоксичну дію чинників, що пошкоджують ДНК на клітини лінії А549 аденокарциноми легені людини (Raynal S., et al. 1997). Також показано, що ТФРв1 інгібує Rad51-залежну репарацію пошкодженої ДНК в епітеліальних клітинах лінії Mv1Lu легені норки (Kanamoto T., et al. 2002). В інших дослідженнях відзначено, що клітини лінії L1210 лейкемії миші, резистентні до цисплатину, також є нечутливими до негативної дії ТФРв на ріст клітини, на відміну від клітин сублінії, чутливих до дії згаданого чинника (Stoika R.S., et al. 2000). Встановлено, що така резистентність обумовлена порушеннями у регуляторному шляху ТФРв. На підставі цих результатів, а також даних про здатність цисплатину та цитотоксичних лектинів індукувати секрецію ТФРв клітинами-мішенями, зроблено припущення про те, що даний цитокін може опосередковувати регуляторні ефекти окремих екстремальних чинників (протипухлинні препарати, лектини, гіпертермія) (Stoika R. S., et al. 2003).

Отже, існуючі дані свідчать про важливе значення сигнального шляху ТФР у відповіді ракових клітин на дію протипухлинних препаратів і вплив цього цитокіну необхідно враховувати під час лікування, проте дане питання залишається до кінця нез'ясованим. Зміни продукції ТФРв, а також функціональної активності компонентів Smad-залежного сигнального шляху ТФРв пухлинними клітинами можуть призвести до розвитку гіперчутливості, або, навпаки, - резистентності таких клітин до цього цитокіну. У свою чергу, зміна чутливості ракових клітин до ТФРв може призвести до порушень в ефективності дії протипухлинного препарату на ракові клітини. Тому, важливим є з'ясування, які саме порушення у функціонуванні ТФРв-залежної регуляторної системи мають місце у ракових клітинах, під впливом протипухлинних препаратів. Цю проблему вирішували у дисертаційній роботі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у рамках держбюджетної теми Бх-116Б кафедри біохімії Львівського національного університету ім. І. Франка “Ензиматичні системи організму при дії іонізуючого випромінювання та інших патологічних чинників” № держреєстрації 0103V001918 (2003 - 2004 pp.), в якій автор досліджувала вплив протипухлинних препаратів на рівень експресії мРНК рецепторів (протеїн-кінази) І та ІІ типу ТФРв. За угодою про наукову співпрацю біологічного факультету Львівського національного університету ім. І. Франка та Інституту біології клітини НАН України окремі дослідження проведені у межах теми відділу регуляції проліферації клітин Інституту біології клітини НАН України “Дослідження молекулярних механізмів резистентності пухлинних клітин до дії трансформуючого фактора росту бета 1” № держреєстрації 0104V010049 (2003 - 2005 рр.), в якій автор досліджувала стан сигнальної системи ТФРв за умов дії хіміопрепаратів.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з'ясувати зміни у сигнальних механізмах трансформуючого фактора росту в1 за умов дії протипухлинних препаратів (цисплатин, доксорубіцин, метотрексат) на клітини лінії А549 аденокарциноми легені людини. Для досягнення поставленої мети у дисертаційній роботі вирішували наступні завдання:

Дослідити цитостатичний та цитотоксичний впливи цисплатину, доксорубіцину та метотрексату на клітини лінії А549, а також з'ясувати, яким шляхом гинуть ці клітини під дією використаних протипухлинних препаратів.

Дослідити вплив ТФРв1 на проліферацію клітин лінії А549, вирощених у моношарі.

З'ясувати вплив цисплатину, доксорубіцину та метотрексату на продукцію ТФРв1 клітинами лінії А549 на рівні експресії його мРНК, білкового продукту, а також на рівні його біологічної активності.

Дослідити експресію головних компонентів сигнального шляху ТФРв1, а саме специфічних мембранних рецепторів та внутрішньоклітинних провідників регуляторного сигналу (білки Smad), у клітинах лінії А549 під впливом цисплатину, доксорубіцину та метотрексату.

Встановити вплив досліджуваних протипухлинних препаратів на рівень фосфорилювання білків Smad2 та Smad3 під дією ТФРв1 у клітинах лінії А549.

Дослідити вплив цисплатину, доксорубіцину та метотрексату на здатність ТФРв1 активувати Smad-залежний CAGA-промотор у ракових клітинах (лінії А549 та НТ1080).

Об'єкт дослідження. Функціонування регуляторної системи трансформуючого фактора росту в у клітини лінії А549 карциноми легені людини за умов дії протипухлинних препаратів.

Предмет дослідження. Вплив протипухлинних препаратів (цисплатин, доксорубіцин, метотрексат) на експресію білків, залучених у механізми передачі регуляторних сигналів трансформуючого фактора росту в1 у клітинах лінії А549 аденокарциноми легені людини.

Методи дослідження. Для досягнення мети та виконання завдань, поставлених у роботі, було використано наступні методи дослідження: електрофорез ДНК та РНК у гелі агарози, електрофорез білків у поліакриламідному гелі, Western blot аналіз білків, RT-PCR (полімеразна ланцюгова реакція з використанням зворотної транскриптази), спектрофотометрію, метод радіоактивних ізотопів, статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі було вперше показано, що діючи на клітини лінії А549 аденокарциноми легені людини, протипухлинні препарати (цисплатин, доксорубіцин, метотрексат) викликають зміни у Smad-залежному сигнальному шляху ТФРв1, що супроводжуються: 1) зниженням рівня експресії мРНК рецептора ІІ типу ТФРв1; 2) зниженням рівня експресії білків, що переносять регуляторний сигнал ТФРв1 від поверхні клітини у ядро - білки Smad2, Smad3, Smad4; 3) зростанням рівня експресії інгібіторного білка Smad7, який перешкоджає проходженню регуляторного сигналу ТФРв1 по Smad-залежному сигнальному шляху. Вперше виявлено, що доксорубіцин пригнічує здатність ТФРв1 індукувати фосфорилювання (активування) неактивних форм білків Smad2 та Smad3 у клітинах лінії А549.

Встановлено, що доксорубіцин знижує здатність ТФРв1 активувати Smad-залежний CAGA-промотор генів-мішеней у ракових клітинах ліній А549 аденокарциноми легені людини та НТ1080 фібросаркоми людини.

Вперше показано, що доксорубіцин та цисплатин діючи на клітини лінії А549 пригнічують продукцію ними ТФРв1 на рівні білка, тоді як рівень експресії мРНК даного цитокіну при цьому суттєво не змінюється.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, представлені у дисертаційній роботі, дозволяють глибше зрозуміти роль ТФРв1 за умов дії деяких протипухлинних препаратів на ракові клітини. Отримані результати можуть бути використані для розробки ефективніших схем хіміотерапевтичного лікування ДНК-пошкоджувальними протипухлинними препаратами як чутливих, так і резистентних до їх дії ракових клітин.

Одержані результати і теоретичні узагальнення, що стосуються особливостей проходження регуляторного сигналу ТФРв у ракових клітинах за умов дії протипухлинних препаратів, використовуються при викладанні спецкурсів на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського національного університету ім. І. Франка, а також впроваджено у навчальний процес на кафедрі біохімії Львівського національного медичного університету ім. Д. Галицького при розгляді питань біохімії пухлинного росту у курсі біохімії.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацювала літературу за темою дисертаційної роботи, виконала експериментальну частину і статистично обробила отримані результати. Частина результатів, що отримані з використанням генних репортерів, була частково виконана у співпраці із Людвігівським Інститутом дослідження раку (Уппсала, Швеція). Аналіз і обговорення отриманих даних проведені спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. За матеріалами дисертації зроблені доповіді на: міжнародній конференції молодих науковців, аспірантів та студентів молекулярної біології та генетики (Київ, 2003), конференції молодих науковців Інституту біології клітини (Львів, 2003), Першому (Установчому) Українському з'їзді клітинних біологів (Львів, 2004), засіданні Наукового Товариства імені Т. Шевченка (Львів, 2004; Львів, 2005), П'ятій Парнасівській конференції “Молекулярні механізми клітинного сигналювання” (Київ, 2005), щорічних звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного університету ім. І. Франка (2004 і 2005 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, з них 7 - у фахових виданнях і 4 - у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 142 сторінках комп'ютерного набору, складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 4 розділів, присвячених викладу отриманих результатів, їх аналізу та узагальнення, висновків, списку використаної літератури. Робота містить 33 рисунки (22 сторінки). Бібліографічний список складає 215 джерел, з них 203 латиною, розташований на 23 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Проаналізовано сучасну інформацію про особливості регуляції проліферації нормальних і пухлинних клітин. Наведено інформацію про функції, біосинтез, структуру та сигнальний шлях ТФРв, а також про основні групи протипухлинних препаратів та механізми їхньої дії.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили на: 1) клітинах аденокарциноми легені людини лінії А549, отримані з колекції клітинних культур Інституту цитології РАН (Санкт-Петербург, Російська Федерація); 2) клітинах лінії НТ1080 фібросаркоми людини (стабільно трансфіковані pGL3-вектором, що містить ген люциферази під CAGA₁₂-промотором) з колекції клітин Людвігівського Інституту дослідження раку (Уппсала, Швеція). Клітини вирощували у середовищі Ігла модифікованому Дульбекко (ДМЕМ, “Sigma”, США) у присутності 10% сироватки ембріонів великої рогатої худоби (FCS, “Sigma”, США) і 50 мкг/мл гентаміцину (“Sigma”, США). Клітини інкубували у присутності одного з протипухлинних препаратів цисплатину (“Ebewe”, Австрія), доксорубіцину (“Київмедпрепарат”, Україна), метотрексату (“Leberle”, США) чи ТФРв (“Indianapolis”, США).

Вплив протипухлинних препаратів на ріст і виживання клітин визначали за допомогою фарбування клітин 0,1% розчином трипанового синього та підрахунком зафарбованих (мертві) і незафарбованих (живі) клітин. Дію ТФР1 на синтез ДНК у клітинах лінії А549 вивчали за їх здатністю змінювати інтенсивність включення ³Н-тимідину (Amersham Biosciences). Дію протипухлинних препаратів на біосинтез білка у клітинах лінії НТ1080 вивчали за їх здатністю змінювати інтенсивність включення ³⁵S-метіоніну (“Sigma”, США).

Апоптоз клітин визначали за рівнем фрагментації ДНК, яку виділяли згідно методу (Кудрявец Ю. И, и др., 1996) та фракціонували електрофорезом у гелі 1% агарози, використовуючи Тріс-ацетатний електродний буфер (рН 8,0).

Рівень експресії білків вивчали за допомогою методу Western blot аналізу із використанням поліклональних анти-Smad1, Smad2, Smad3, Smad4, Smad7, Smad2-Р, Smad3-Р (Людвігівський Інститут Ракових Досліджень, Швеція), Erk2, Erk1-Р, Erk2-Р антитіл (“Santa Cruz”, США), або моноклональних анти-р53, б-актину антитіл (“Sigma”, США). Отримані дані щодо рівня експресії Smad-білків були проаналізовані та оцифровані за допомогою програми Gel Pro Analyzer 3.1.

Продукцію ТФР клітинами лінії А549 визначали методом біотестування кондиціонованого середовища. Біотестування здійснювали на клітинах лінії CCL64 епітелію легені норки і оцінювали методом, який базується на використанні сульфородаміну В (Skehan P., et. al., 1990). Кількісно концентрацію ТФР1 визначали за допомогою набору Quantikine (“R&D Systems”, США). Вміст ТФР1 у кондиціонованому середовищі визначали за калібрувальною кривою.

Для вивчення експресії мРНК ТФРв1, ТФРв2, рецепторів І та ІІ типів ТФРв виділяли сумарну РНК з клітин лінії А549, використовуючи реагент Trizol (“Life Technologies”, США). Отримання першого ланцюга кДНК для RT-PCR аналізу проводили за допомогою набору “RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit” (“Fermentas”, Литовська Республіка). Відбирали рівні кількості (2 - 4 мкл) продуктів зворотної транскрипції і проводили полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) їх із різними парами праймерів. Продукти ПЛР візуалізували на 2% агарозному гелі за допомогою броміду етидію (0,5 мкг/мл). Кількісний аналіз проводили за допомогою програми Gel Pro Analyzer 3.1. Стандартом для нормалізації був рівень експресії в-актинової мРНК.

Для вимірювання активності ТФРв/Smad-залежної транскрипційної відповіді, клітини лінії А549 тимчасово трансфікували pGL3-вектором, що містив ген люциферази під CAGA₁₂-промотором, або без такого промотора (під мінімальним транскрипційним промотором) із використанням поліетиленіміну (“Sigma”, США). Кількість продукту гену люциферази вимірювали, використовуючи люциферазний метод (Alam J., Cook J.L., 1990, Dennler S., et al., 1998). Паралельно проводили ко-трансфекцію клітин лінії А549 вектором pCH110, що містив ген в-галактозидази під конститутивним промотором, для вирівнювання ефективності трансфекції.

Варіаційно-статистичне опрацювання отриманих результатів проводили з використанням критерію Стьюдента за допомогою комп'ютерної програми Microsoft Excel 2002.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив протипухлинних препаратів та ТФР1 на ріст та виживання клітин лінії А549. Доксорубіцин у концентрації 5 мкг/мл володіє практично такими самими цитотоксичним і цитостатичним ефектами як цисплатин і метотрексат у концентрації 10 мкг/мл. У вищій концентрації (25 мкг/мл) доксорубіцин викликає 100% загибель клітин, тоді як цисплатин і метотрексат проявляють таку дію лише при 100 мкг/мл.

На основі отриманих даних було обрано ефективні концентрації (загибель 40 - 50% клітин при дії препарату протягом 24 год) протипухлинних препаратів для подальшого їх використання у дослідженнях: 5 мкг/мл для доксорубіцину, 10 мкг/мл для цисплатину та метотрексату.

Відомо, що ТФР1 інгібує ріст клітин лінії А549 (Фильченков А. А., Стойка Р.С., Быко-рез А. И. 1994) і цей факт було враховано у подальших дослідженнях сигнального шляху ТФР. Враховуючи отримані дані щодо впливу цього цитокіна на клітини лінії А549, надалі використовували ТФР1 у концентрації 5 - 10 нг/мл.

Індукція апоптозу в клітинах лінії А549 під впливом протипухлинних препаратів. Для оцінки можливих механізмів цитотоксичного впливу протипухлинних препаратів на клітини лінії А549, було вивчено здатність досліджуваних препаратів індукувати апоптоз. Відомо, що під час апоптозу в клітині діють специфічні нуклеази, які розщеплюють ДНК переважно в її міжнуклеосомних ділянках, унаслідок чого утворюються фрагменти ДНК, які дорівнюють довжині однієї, двох, трьох і т.д. нуклеосом (Фильченков А. А., Стойка Р.С., 1999). Тому після електрофоре-тичного розділення ДНК апоптичних клітин у гелі агарози виявляється “ДНК-драбина”. Показано, що цисплатин (10 мкг/мл), доксорубіцин (5 мкг/мл) і метотрексат (10 мкг/мл) викликають фрагментацію ДНК типову для апоптозу.

Окрім дослідження фрагментації ядерної ДНК, визначено рівень експресії про-апоптичного білка р53. Оскільки ефекти досліджу-ваних препаратів можуть реалізувати-ся шляхом безпосереднього чи опосе-редкованого пошкодження структури ДНК клітин, а білок р53 бере активну участь у клітинній відповіді на такі пошкодження, доцільно було визначити рівень експресії р53 у клітинах лінії А549, оброблених протипухлинними препаратами. Встановлено, що рівень експресії білка р53 суттєво зростає у клітинах, оброблених цисплатином та доксорубіцином. Таким чином, можна припустити, що цисплатин та доксорубіцин індукують апоптоз шляхом активації р53-залежного регуляторного шляху. Проте, цього не можна сказати про дію метотрексату, оскільки експресія білка р53 не змінювалася під впливом цього протипухлинного препарату.

Продукція ТФР клітинами лінії А549 під дією протипухлинних препаратів. Оскільки зміна рівня продукції клітинами ТФРв може впливати як на розвиток злоякісності пухлин, так і на ефективність їх хіміотерапевтичного лікування, вивчено вплив досліджуваних препаратів на продукцію даного цитокіну клітинами лінії А549. Вивчення експресії ТФРв здійснювали як на рівні експресії його мРНК, так і на рівні експресії самого цитокіну та на рівні тестування його біологічної активності. Для вивчення експресії мРНК ТФРв використовували метод RT-PCR. Виявлено, що під дією метотрексату (10 мкг/мл) і доксорубіцину (5 мкг/мл) кількість мРНК ТФРв1 незначно зменшується у той час, як цисплатин майже не змінював кількість мРНК ТФРв1.

Методом біотестування було досліджено експресію ТФРв на рівні його біологічної активності. Відомо, що клітини лінії А549 продукують велику кількість латентної форми ТФР (Wakefield L. M., et al., 1987). Враховуючи цей факт, було активовано латентну форму ТФР, використовуючи тимчасове закиснення середовища, в якому перебували клітини. Виявлено, що протипухлинні препарати індукують клітини лінії А549 до продукції ТФР.

Крім того, визначено експресію ТФР на рівні білка. Концентрацію цього цитокіна у культуральному середовищі, кондиціонованому клітинами лінії А549, інкубованих протягом 24 год із цисплатином (10 мкг/мл), метотрексатом (10 мкг/мл) чи доксорубіцином (5 мкг/мл), вимірювали за допомогою імуно-ензимного методу (ELISA).

Встановлено, що загальний рівень ТФР1 у культуральному середовищі клітин лінії А549, оброблених препаратами, є нижчим, ніж у контролі.

Загальна кількість ТФР1, продукованого клітинами лінії А549, що не піддавалися дії проти-пухлинних препаратів, становить 733 пг/мл/10⁶ клітин. Клітини оброблені доксорубіцином, продукують у 1,5 раз менше ТФР1 (472 пг/мл/10⁶ клітин), а цисплатином - у 5,5 раз менше даного цитокіна (133 пг/мл/10⁶ клітин), ніж у контролі. У випадку дії метотрексату (10 мкг/мл) виявлено лише тенденцію до зниження загального рівня ТФР1, проте ці дані не були статистично достовірними.

Існують дані про знижений рівень продукції ТФРв клітинами пухлин, резистентних до хіміотерапевтичних препаратів (Teicher B. A., et al., 1997). Таким чином, резистентність ракових клітин до протипухлинних препаратів може супроводжуватися резистентністю до ТФРв-індукованого інгібування росту та активації апоптозу. Значення такої ко-резистентності може полягати у тому, що, “виключивши” регуляторний шлях ТФРв, клітина уникне дії одного з інгібіторів репарації і підсилювача цитотоксичної дії ДНК-пошкоджувальних агентів. Як наслідок у такої клітини порушиться регуляція репаративних процесів і з'явиться можливість запускати механізми репарації пошкодження ДНК, незалежно від ТФРв. Ймовірно, що така ко-резистентність сприяє виживанню ракових клітин під час хіміо- або радіотерапії.

Дослідження експресії компонентів сигнального шляху ТФР у клітинах лінії А549 під дією протипухлинних препаратів. Після виявлення зниження рівня експресії ТФРв у клітинах лінії А549 під впливом досліджуваних препаратів, було доцільно дослідити їх вплив на експресію компонентів Smad-залежного шляху передачі регуляторного сигналу ТФРв.

Експресія мРНК рецепторів І та ІІ типів ТФР у клітинах лінії А549. Першою ланкою у ТФРв-сигналюванні є активація рецепторів цього цитокіну на поверхні клітини, після чого відбувається трансдукція регуляторного сигналу всередину клітини-мішені. Порушення, які можуть виникнути на цьому рівні, призводять до змін у дії ТФРв на функціонування клітини.

За допомогою RT-PCR-аналізу досліджено рівень експресії мРНК рецепторів І та ІІ типів ТФРв1. Встановлено, що цисплатин та доксорубіцин через 24 год інкубації викликали зниження рівня експресії мРНК рецепторів ІІ типу, тоді як метотрексат не впливав на рівень експресії мРНК цього типу рецептора у клітинах лінії А549.

Показано, що досліджувані протипухлинні препарати не впливали на рівень експресії мРНК рецептора І типу. Важливо відмітити, що у випадках коли при онкологічних захворюваннях виявляється інактивація рецепторів ТФРв1, це найчастіше трапляється саме із рецептором ІІ типу (Marcowitz S. et al. 1995), тоді як інактивація рецепторів І типу ТФРв1 спостерігається рідше.

Отже, деякі протипухлинні препарати (доксорубіцин та цисплатин) здатні інгібувати сигналювання ТФРв у ракових клітинах унаслідок порушення відповідного сигнального шляху на різних рівнях, зокрема, шляхом зниження експресії мРНК ТФРв-рецепторів ІІ типу.

Дослідження експресії білків Smad у клітинах лінії А549. Вивчено експресію різних Smad-білків, які є компонентами ТФРв1 сигнального шляху на пострецепторному рівні. Білки Smad2 і Smad3 безпосередньо взаємодіють з активованими рецепторами і фосфорилюються ними. Білок Smad4 взаємодіє із фосфорильованими Smad2 і Smad3, утворюючи комплекс, який переноситься в ядро й активує експресію специфічних генів. Функцію інгібіторів регуляторного сигналу ТФР в клітині виконують білки Smad6 і Smad7 (Moustakas A., et al. 2001, Dennler S., et al. 2002, ten Dijke P., et al. 2004). Порушення експресії білків Smad у клітинах, подібно, до порушення експресії рецепторів ТФРв, може бути важливою причиною розвитку резистентності таких клітин до негативної дії ТФРв.

Результати досліджень показали, що рівень експресії Smad2-, Smad3- і Smad4-білків знижується при дії цисплатину, доксорубіцину та метотрексату. Найбільший вплив на експресію білка Smad2 виявлено при дії доксорубіцину і метотрексату, тоді як вплив на експресію білка Smad3 - при дії цисплатину і доксорубіцину, а вплив на експресію білка Smad4 - при дії доксорубіцину і метотрексату. Отже, доксорубіцин знижував експресію цих білків найефективніше. Очевидно, це можна пояснити тим, що доксорубіцин, цисплатин та метотрексат викликають різні пошкодження ДНК, до відновлення яких залучені різні репараційні механізми, які в свою чергу можуть бути по-різному пов'язані із регуляторною системою ТФРв. Рівень експресії Smad7, який інгібує проведення в клітини сигналів ТФРв1, підвищений у випадку дії цисплатину і доксорубіцину, але не у випадку дії метотрексату. Тому просте механістичне пояснення зниження рівня експресії Smad2, Smad3 та Smad4 білків внаслідок зупинки біосинтетичних процесів у клітині під дією протипухлинних препаратів малоймовірне.

ТФРв1 є членом родини поліпептидних факторів росту до якої, крім ТФРв, належать фактори ВМР (Фильченков А. А., Стойка Р. С., Быкорез А. И. 1994). Виявлено, що Smad-білки також залучені до передачі регуляторних сигналів цих факторів росту (ten Dijke P., et al. 2002). Було досліджено вплив протипухлинних препаратів на експресію Smad1-білка, який бере участь у внутрішньоклітинній трансдукції регуляторних сигналів BMP-факторів, діє подібно, як Smad2 у сигнальному шляху ТФРв. Встановлено, що доксорубіцин та метотрексат знижують експресію Smad1-білка, тоді як цисплатин та ТФРв1 викликають незначне зниження рівня Smad1 у клітинах лінії А549. Отримані результати показують, що дія окремих протипухлинних препаратів може опосередковуватись не лише сигнальним шляхом ТФРв, але й сигнальним шляхом інших членів родини ТФРв-подібних факторів. Для остаточного підтвердження ролі ВМР-факторів у дії протипухлинних препаратів необхідні додаткові дослідження.

Вплив протипухлинних препаратів на фосфорилювання білків Smad2 та Smad3. Для детальнішого вивчення змін у Smad-залежному сигнальному шляху ТФРв, було досліджено активування білків Smad2 та Smad3 шляхом фосфорилювання під впливом доксорубіцину, який найбільш ефективно пригнічує цей шлях. Показано часову залежність (0, 3, 6, 12, 24 та 36 год) впливу доксорубіцину (5 мкг/мл) на експресію білків Smad2 і Smad3 та рівень фосфорилювання цих білків під дією ТФРв1 (6 нг/мл) у клітинах лінії А549. Як позитивний контроль на фосфорилювання цих білків використовували клітини, які піддавали дії ТФРв1 (6 нг/мл). Встановлено, що ТФРв1 стимулював фосфорилювання білків Smad2 та Smad3, яке зростало з часом. Доксорубіцин через 3 год дії на клітини посилював у фосфорилювання Smad2 та Smad3 під впливом ТФРв1. Проте, починаючи з 12-ої години інкубації клітин, було виявлено зменшення кількості фосфорильованої форми Smad3, тоді як кількість Smad2-Р залишалася на рівні позитивного контролю. Значне зменшення рівня Smad2-Р виявлено при інкубації клітин із доксорубіцином на 24 год, причому, цей ефект посилювався через 36 год інкубації. Виявлено, що зменшення кількості Smad2-Р та Smad3-Р позитивно корелювало із зменшенням кількості загального вмісту білків Smad2 та Smad3 у клітинах. Отже, зменшення кількості фосфорильованих Smad2 та Smad3 не обов'язково є наслідком порушень трансдукції регуляторного сигналу ТФРв1 і може відбуватися через пригнічення експресії загального білка Smad2 та Smad3.

Щоб довести специфічність дії доксорубіцину на Smad-залежний шлях сигналювання ТФРв, було досліджено вплив цього препарату на рівень експресії та фосфорилювання кіназ Erk1 та Erk2, які є однією з ланок MAP-кіназного регуляторного шляху. Цей Ras-залежний сигнальний шлях може також брати участь у передачі регуляторних сигналів ТФРв (Derynck R., Zhang Y.E., 2003), хоча головним шляхом сигналювання ТФРв є Smad-залежний. Показано, що під впливом доксорубіцину кількість Erk2 та фосфорилювання кіназ Erk1, Erk2 з часом не змінюється у клітинах лінії А549. Таким чином, було встановлено, що доксорубіцин (5 мкг/мл) специфічно діє саме на Smad-залежний сигнальний шлях ТФРв.

Вплив протипухлинних препаратів на здатність ТФР1 активувати Smad-залежний CAGA-промотор. Продовжуючи з'ясовувати молекулярні механізми залучення регуляторного шляху ТФРв у дію протипухлинних препаратів, було вивчено здатність цих препаратів впливати на транскрипційну активність Smad-залежного промотору. Для цього клітини лінії А549 були трансфіковані pGL3-вектором, який містив ген люциферази під контролем CAGA-промотору. До цієї регуляторної ділянки ДНК приєднується Smad2/3(фосфорильовані)/Smad4-комплекс, який активує транскрипцію гена, що регулюється цим промотором. Клітини лінії А549 інкубували з доксорубіцином (5 мкг/мл), цисплатином (10 мкг/мл), метотрексатом (10 мкг/мл) протягом 2 год, після чого до культурального середовища додавали ТФРв1 (8 нг/мл) та інкубували ще протягом 2 год.

Щоб продемонструвати специфічність дії доксорубіцину на активність CAGA-промотору, клітини лінії А549 трансфікували вектором без CAGA-промотору (ген люциферази був під контролем промотору, не залежного від Smad-активуючого комплексу). У цьому випадку доксорубіцин не знижував рівня експресії гена люциферази. Подібні результати були отримані нами при визначенні в-галактозидазної активності у лізатах А549 клітин, ко-трансфікованих pCH110 вектором, що містив ген в-галактозидази під контролем конститутивного промотору. Отже, наведені дані є доказом, що інгібування Smad-залежного CAGA-промотору є специфічним і не пов'язане із загальним інгібуванням транскрипційної активності в клітині.

Зроблені висновки підтверджено, використовуючи іншу клітинну модель, а саме клітини лінії НТ1080 фібросаркоми людини, які інкубували у присутності досліджуваних препаратів 2 год після чого додавали ТФРв1 (5 нг/мл) та інкубували ще протягом 22 год. Встановлено, що під впливом доксорубіцину та метотрексату знижувався рівень активації CAGA-промотору, на відміну від цисплатину, який не володів такою дією.

Щоб з'ясувати, як швидко доксорубіцин починає інгібувати активацію CAGA-промотору під впливом ТФРв, клітини лінії НТ1080 ко-інкубували із доксорубіцином (5 мкг/мл) та ТФРв (5 нг/мл) протягом 1, 3 та 6 год. Виявлено, що вже на 1-у годину доксорубіцин знижує рівень активації CAGA-промотора під впливом ТФРв, а на 3-ю та 6-у години інкубації цей ефект був ще більший.

У цілому, результати наших досліджень, свідчать про те, що у пухлинній клітині, на яку діє цитотоксичний препарат, можуть включатися захисні механізми покликані зупинити цитодеструктивні процеси. Важливу роль у цих процесах може відігравати ТФРв1, який здатний інгібувати репарацію ДНК і посилювати цитотоксичну дію препаратів (Raynal S., et al. 1997, Kanamoto T., et al. 2002). Саме тому інгібування ТФРв-сигналювання усуває цю “перешкоду” в протидії клітини хіміотерапевтичним препаратам.

ВИСНОВКИ

У роботі отримані нові дані відносно змін у функціонуванні регуляторної системи трансформуючого фактора росту в1, що мають місце у клітинах лінії А549 аденокарциноми легені людини під впливом протипухлинних препаратів (цисплатин, доксорубіцин, метотрексат). Показано, що у пухлинних клітинах, які вижили після дії сублетальних доз цих протипухлинних препаратів, відбувається зниження продукції ТФРв та функціональної активності його внутрішньоклітинної ефекторної системи.

1. У клітинах лінії А549 під впливом протипухлинних препаратів цисплатину, доксорубіцину чи метотрексату індукується апоптоз, що виявляється у фрагментації ядерної ДНК.

2. Обробка клітин лінії А549 цисплатином чи доксорубіцином веде до зростання рівня експресії проапоптичного білка р53 відповідно у 7,7 раз та 6,5 раз, порівняно контролем.

3. Доксорубіцин та цисплатин пригнічують відповідно у 1,5 та 5,5 раз продукцію ТФРв1 на рівні білка у клітинах лінії А549, тоді як рівень експресії мРНК даного цитокіну при цьому суттєво не змінюється. Експресія мРНК ТФРв2 у клітинах лінії А549 не змінюється під впливом доксорубіцину, але інгібується метотрексатом і цисплатином у 1,45 та 1,35 раз, відповідно.

4. Експресія мРНК рецептора ІІ типу ТФРв у клітинах лінії А549 інгібується цисплатином у 6,6 раз та доксорубіцином у 2 рази, але не змінюється під дією метотрексату. Рівень експресії мРНК рецептора І типу ТФРв під впливом досліджуваних протипухлинних препаратів залишається на рівні, характерному для інтактних клітин.

5. Клітини лінії А549, оброблені цисплатином, доксорубіцином чи метотрексатом, характеризуються змінами у рівні експресії компонентів сигнального шляху ТФР порівняно з інтактними клітинами цієї лінії. Виявлено зниження рівня експресії білків Smad2, Smad3 та Smad4, які є позитивними регуляторами у сигнальному шляху ТФР, та показано підвищення рівня експресії Smad7 білка, що є інгібітором передачі регуляторного сигналу ТФР.

6. Під дією цисплатину, доксорубіцину та метотрексату в клітинах лінії А549 має місце зниження експресії рівня Smad1 білка, залученого у сигнальний шлях фактора дозрівання кісток.

7. Діючи на клітини лінії А549, доксорубіцин пригнічує ТФРв1-залежне фосфорилювання білків Smad2 та Smad3. У той же час цей препарат не викликає у цих клітинах змін в експресії протеїнкінази Erk2 та фосфорилюванні протеїнкіназ Erk1 та Erk2, що свідчить про специфічність дії доксорубіцину саме на регуляторну систему ТФРв1.

8. Доксорубіцин пригнічує ТФРв1-індуковану активацію Smad-залежного CAGA-промотору у клітинах лінії А549 карциноми легені людини та у клітинах лінії НТ1080 фібросаркоми людини. Інгібувальна дія доксорубіцину на активацію Smad-залежного CAGA-промотору виявляється вже на першу годину інкубації клітин у присутності цього препарату. Цисплатин та метотрексат суттєво не впливають на активацію даного промотору в клітинах ліній А549 та НТ1080.

ОСНОВНІ ПУБЛІКАЦІЇ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вплив протипухлинних препаратів на експресію мРНК рецепторів трансформуючого фактора росту в у клітинах лінії А549 карциноми легені людини / Федоренко О. В., Філяк О. С., Філяк Є. З., Стойка Р. С. // Клінічна та експериментальна патологія. - 2004. - Т. 3, № 4. - С. 77 - 79. (Дисертанту належить підготовка зразків для дослідів, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

2. Філяк Є., Філяк О., Стойка Р. Вплив протипухлинних препаратів на експресію компонентів сигнального шляху трансформувального фактора росту в у клітинах лінії А549 карциноми легень людини // Вісник Львів. університету. Серія біологічна. - 2004. - Вип. 35. - С. 60 - 65. (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду та проведення їх Western-blot аналізу, участь в аналізі результатів).

3. Вплив протипухлинних препаратів на експресію ТФРв клітинами лінії А549 карциноми легені людини / Філяк О., Федоренко О., Філяк Є., Стойка Р. // Біологія тварин. - 2004. - Т. 6, № 1 - 2. - С. 231 - 237. (Дисертанту належить визначення цитотоксичного та цитостатичного ефектів протипухлинних препаратів на досліджувані клітини, виділення апоптичної ДНК та її електрофорез у гелі агарози, визначення продукції ТФРв клітинами лінії А549 методом біотестування, підготовка зразків для роботи з мРНК ТФРв, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

4. Філяк О., Філяк Є., Стойка Р. Часова залежність фосфорилювання білка Smad2 сигнального шляху ТФР1 під дією доксорубіцину у клітинах лінії А549 карциноми легені людини // Експериментальна та клінічна фізіологія та біохімія. - 2005. - № 1. - С. 47 - 50. (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду та проведення їх Western-blot аналізу, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

5. Філяк О., Філяк Є., Стойка Р. Вплив доксорубіцину на фосфорилювання білка Smad3, задіяного у сигнальному шляху ТФР- у клітинах лінії А549 аденокарциноми легені людини // Медична хімія. - 2005. - № 1. - С. 63 - 67. (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду та проведення їх Western-blot аналізу, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

6. Filyak O., Stoika R. Comparative study of p53 expression in human carcinoma cell lines A549 and MCF7 under anticancer drug treatment // Український біохімічний журнал. - 2005. - Т. 77, № 2. - С. 136 - 140. (Дисертанту належить отримання результатів досліджень, підготовка матеріалів до друку, участь в аналізі результатів та написання статті).

7. Вплив протипухлинних препаратів на здатність трансформуючого фактора росту в активувати Smad-залежний CAGA-промотор у ракових клітинах / Філяк Є., Філяк О., Сушельницький С., Стойка Р. // Доп. НАН України. - 2005. - № 7. - С. 172 - 177. (Дисертанту належить підготовка зразків для дослідів, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

8. Osmak (Filyak) O., Filyak Ye., Boyko M. Effect of anticancer drug treatment on TGFв signaling pathway in A549 human lung carcinoma cells // Abstr. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. - Kyiv. - September 25-27, 2003. - P. 251. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

9. Filyak O. S., Filyak Ye. Z., Stoika R. S. Effect of anticancer drugs on transforming growth factor в signaling in A549 human lung carcinoma cells // Abstr. First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv. - April 25 - 28, 2004. - P. 31. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

10. Transforming growth factor beta in cell response to stressing actions / Stoika R. S., Yakymovych I. A., Yakymovych M. Ya., Korchynsky O. G., Filyak Ye. Z., Filyak O. S., Chorna I. V. // Abstr. First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv. - April 25 - 28, 2004. - P. 340. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних).

11. Transforming growth factor в1 (TGFв1) enhances proapoptotic action of DNA-damaging agents although these agents inhibit Smad-dependent TGFв-signaling / Filyak Ye., Filyak O., Fedorenko O., Souchelnytskyi S., Stoika R. // Український біохімічний журнал (Спеціальний випуск). - 2005. - Т. 77, № 2. - Р. 107. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичній обробці даних та аналізі експериментальних даних).

АНОТАЦІЯ

Філяк О. С. Механізми участі трансформуючого фактора росту бета у відповіді ракових клітин на дію деяких протипухлинних препаратів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія, Інститут біології тварин УААН, Львів, 2005.

Дисертацію присвячено дослідженню впливу протипухлинних препаратів (цисплатин, доксорубіцин, метотрексат) на Smad-залежну регуляторну систему трансформуючого фактора росту в у клітинах лінії А549 аденокарциноми легені людини, які вижили після їх інкубації із сублетальними дозами цих препаратів. Показано, що досліджувані протипухлинні препарати знижують рівень продукції ТФРв1, а також пригнічують функціональну активність компонентів Smad-залежного сигнального шляху в клітинах-мішенях. Таким чином, досліджувані протипухлинні препарати блокують біологічну дію цього цитокіну, що, у кінцевому результаті, може призвести до розвитку резистентності таких клітин до ТФРв1. Втрата чутливості ракових клітин до дії ТФРв1 може призвести до зниження ефективності дії протипухлинних препаратів на такі клітини, що з часом може сприяти розвитку резистентності трансформованих клітин до хіміотерапевтичних препаратів.

Ключові слова: клітини лінії А549 аденокарциноми легені людини, цисплатин, доксорубіцин, метотрексат, трансформуючий фактор росту , Smad-залежний сигнальний шлях.

АННОТАЦИЯ

Филяк О. С. Механизмы участия трансформирующего фактора роста бета в ответе раковых клеток на действие некоторых противоопухолевых препаратов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия, Институт биологии животных УААН, Львов, 2005.

Диссертация посвящена исследованию влиянию противоопухолевых препаратов (цисплатин, доксорубицин, метотрексат) на Smad-зависимую регуляторную систему трансформирующего фактора роста в в клетках линии А549 аденокарциномы легкого человека, которые выжили после их инкубации с сублетальными дозами этих препаратов. Показано, что исследуемые противоопухолевые препараты понижают уровень продукции ТФРв1, а также ингибируют функциональную активность компонентов Smad-зависимового сигнального пути в клетках-мишенях. Таким образом, исследуемые противоопухолевые препараты блокируют биологическое действие этого цитокина, что, в итоге, может привести к развитию резистентности таких клеток к ТФРв1. Потеря чувствительности раковых клеток к действию ТФРв1 может привести к снижению эффективности действия противоопухолевых препаратов на такие клетки, что со временем может способствовать развитию резистентности трансформируемых клеток к химиотерапевтическим препаратам.

Ключевые слова: клетки линии А549 аденокарциномы легкого человека, цисплатин, доксорубицин, метотрексат, трансформирующий фактор роста , Smad-зависимый сигнальный путь.

SUMMARY

Filyak O. S. Mechanisms of involvement of transforming growth factor beta in response of cancer cells on action of some anticancer drugs. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree in the field of biological sciences in specialty 03.00.04 - biochemistry, Institute of animal biology UAAS, Lviv, 2005.

The thesis is devoted to the investigation of the effect of anticancer drugs (cisplatin, doxorubicin, methotrexate) on Smad-dependent transforming growth factor signaling system in human lung adenocarcinoma cells A549 line that survived after treatment with sub-lethal doses of these drugs.

It was shown that studied anticancer drugs decrease the level of TGF1-expression, and inhibit the functional activity of Smad-dependent signaling pathway components in target-cells. Semiquantative RT-PCR analysis was used for estimation of expression of mRNA coding for TGFв receptors in human lung carcinoma A549 cells under their treatment with cisplatin, doxorubicin, or methotrexate. The reaction products obtained with primer pairs, specific to TGFв receptors types I and II cDNAs, were quantified. The expression of mRNA for TGFв receptor type II, but not type I, was decreased upon treatment with doxorubicin and cisplatin. Thus, tumor cell treatment with specific anticancer drugs may cause impairment in TGFв-signaling pathway on different levels. It can either decrease an expression of TGFв receptors mRNA, or change the character of expression of Smad proteins involved at the postreceptor level of TGF signal transduction. The detection of Smad proteins, which form the main pathway of signaling of TGFв and TGFв-liked (Bone Morphogenic Protein) bioregulators of proliferation, migration, differentiation and apoptosis in normal and cancer cells, was performed by means of Western Blot analysis. The decrease of Smad1 (BMP signaling), Smad2, Smad3 and Smad4 (TGFв signaling) proteins expression was affected by used anticancer drugs (cisplatin, doxorubicin, methotrexate). Besides, the up-regulation of Smad7 protein, which is a negative regulator in BMP and TGFв signaling, was found. TGFв-induced phosphorylation of Smad2 and Smad3 proteins is very important for realization of regulatory effects of this cytokine. It was established that doxorubicin reduces amount of phosphorylated Smad 2 and Smad3 in human lung carcinoma A549 cells. Reduced these proteins phosphorylation correlated with decreasing of the amount of Smad2 and Smad3 proteins in treated cells. This reduction of Smad2 and Smad3 phosphorylation can be one of the reasons of decreased anti-proliferative and pro-apoptotic effects of TGFв on tumor cells. We also showed that doxorubicin inhibits TGF1-induced activation of Smad-dependent CAGA-promoter in gene reporter system in human lung carcinoma A549 cells and in human fibrosarcoma HT1080 cells. Doxorubicin starts to inhibit activation of Smad-dependent CAGA-promotor on first hours of incubation. Cisplatin and methotrexate did not show statistically significant changes of TGFв-induced activation this promotor in A549 and HT1080 cells.

Thus, studied anticancer drugs may block a biological action of TGFbeta-1. Finally, these cells can develop the resistance to TGF1. A loss of sensitivity of tumor cells to action of TGF1 can decrease the effectiveness of anticancer action of these drugs. After some period, it may promote the development of the resistance of tumor cells to the anticancer drugs action.

Key words: human lung adenocarcinoma cells A549 line, cisplatin, doxorubicin, methotrexate, transforming growth factor , Smad-dependent signaling pathway.

Размещено на Allbest.ru