Радіоадаптивна відповідь, індукована ультрафіолетовим випроміненням, у рослин

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 57.042:575.826

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

РАДІОАДАПТИВНА ВІДПОВІДЬ, ІНДУКОВАНА УЛЬТРАФІОЛЕТОВИМ ВИПРОМІНЕННЯМ, У РОСЛИН

03.00.01 - радіобіологія

ДАНИЛЬЧЕНКО ОКСАНА ОЛЕКСАНДРІВНА

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Науковий керівник:

Гродзінський Дмитро Михайлович, доктор біологічних наук, професор, академік НАН України, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, завідувач відділу біофізики та радіобіології.

Офіційні опоненти:

Дружина Микола Олександрович, доктор біологічних наук, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу радіобіології.

Тищенко Олена Миколаївна, доктор біологічних наук, Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, завідувач відділу генетичної інженерії.

Провідна установа: Інститут гідробіології НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться "26" вересня 2005 р. о 14-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд 434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, спецрада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий "22" серпня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Забруднення атмосфери Землі речовинами типу фреонів викликає зменшення концентрації стратосферного озону і утворення озонових "дірок", що супроводжується підвищенням інтенсивності найбільш біологічно активної УФ-В (280-320 нм) компоненти спектра природної ультрафіолетової радіації на поверхні Землі [Гродзінський, 2000; Dmitriev et. al., 2003]. Відповідно спостерігається збільшення ступеня прояву негативної дії ультрафіолетових променів, що реєструється як у тварин, так і у рослин. Це зумовлює необхідність дослідження механізмів впливу УФ-випромінення на живі організми.

Адаптивна відповідь - підвищення стійкості клітин до впливу пошкоджуючих доз стресових факторів після попередньої дії тих же самих або інших агентів в суттєво менших дозах [Засухина, 1999]. Першу дозу (або концентрацію) чинника, до дії якого формується адаптивна відповідь, позначають як Д ₁, а другу (звичайно на 1-2 порядки вищу) - як тестувальну - Д ₂.

Для розвитку адаптивної відповіді між цими двома впливами має бути певний інтервал часу (?t) [Гродзінський, 2000]. В подальшому терміном радіоадаптивна відповідь позначається підвищення стійкості організму не тільки до рентгенівського, але й до УФ-В випромінення.

На цей час відомо багато гіпотез щодо можливих механізмів формування адаптивної відповіді рослин стосовно впливу різних факторів. В літературі зустрічаються дані, котрі свідчать про можливу участь у розвитку адаптивної відповіді систем детоксикації вільних радикалів, індукції експресії генів, які кодують синтез захисних білків, стимуляції процесів репарації і синтезу додаткових молекул ферментів репарації, затримки клітинного циклу [Пелевина и др., 1999; Котеров и др., 1999]. Проте, не зважаючи на велику кількість гіпотез стосовно радіоадаптивної відповіді, дискусія щодо механізмів її формування остаточно не завершена.

Значна частина дослідників [Газиев, 1986; Филиппович, 1991; Спитковский и др., 1991; Боднарчук, 2003]вважає, що адаптивна відповідь на опромінення в Д ₁ обумовлена інтенсифікацією репарації ДНК. Більшість отриманих даних стосується комбінованих впливів генотоксичних факторів хімічної природи та іонізуючого випромінення на клітини тварин. Проте в сучасній науковій літературі міститься дуже обмежена інформація щодо адаптивної відповіді рослин на вплив УФ_випромінення, хоча відомо, що біля 70 % сортів культурних рослин характеризуються високою чутливістю до дії ультрафіолетових променів [Гродзінський, 2000; Dmitriev et. al., 2003].

Тому дослідження механізмів адаптації рослинних об'єктів до дії УФ_випромінення та визначення ефективних засобів модифікації стійкості рослин до пошкоджуючого впливу ультрафіолетових променів набувають особливої актуальності.

За нашим припущенням формування реакції радіоадаптації пов'язане з появою певної порогової кількості пошкоджень ДНК. Оскільки УФ-випромінення частково відноситься до іонізуючих, котрі спричиняють пошкодження ДНК, то цим можна пояснити можливі механізми радіоадаптивної відповіді, які, швидше всього, пов'язані з індуцибельними репараційними системами. З огляду на це, важливими є питання, що торкаються участі систем репарації ДНК у формуванні радіоадаптації у рослин.

Подібне дослідження механізмів формування радіоадаптивної відповіді має дуже важливе значення, оскільки може наблизити до розуміння механізмів стійкості організмів до несприятливих факторів не тільки радіаційної, але й іншої природи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі біофізики та радіобіології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України згідно з планом науково-дослідних робіт інституту за темою "Хронічне опромінення рослин як фактор нестабільності геному та вивчення здатності рослин до радіоадаптації, індукованої хронічним опроміненням" (№ державної реєстрації 0101U000394, шифр теми 02.12/5590).

Мета і задачі дослідження. Головною метою роботи було визначення міри специфічності радіоадаптивної відповіді у рослин при впливі стресових факторів різної природи та термінів її реалізації за даних умов; вивчення механізмів індукції стійкості рослин до пошкоджуючого впливу ультрафіолетового випромінення та аналіз участі репараційних систем рослинного організму у формуванні стану радіоадаптації. Відповідно до цього були поставлені наступні завдання:

1. Встановити можливість формування радіоадаптивної відповіді рослин до впливу іонізуючих випромінень з різними фізичними характеристиками.

2. Виявити режими опромінення та часові інтервали прояву та розвитку радіоадаптивної відповіді у паростків різушки Таля та люцерни посівної при поєднанні впливу УФ-В та рідкоіонізуючого випромінення.

3. З'ясувати участь систем репарації ДНК у прояві та розвитку радіоадаптивної відповіді у рослин та дати оцінку вкладу пошкоджень ДНК, індукованих Д ₁ стресового чинника, у її формування.

4. Проаналізувати характер формування радіоадаптивної відповіді паростків люцерни до впливу УФ-В випромінення за умови її модифікації світлом видимого діапазону (400-760 нм).

Об'єкт дослідження: міра специфічності радіоадаптивної відповіді паростків Arabidopsis thaliana (L.) Heynh та Medicago sativa L до впливу стресових факторів різної природи.

Предмет дослідження: кінетика ростових реакцій та виживаності апікальної меристеми головного кореня паростків Arabidopsis thaliana (L.) Heynh та Medicago sativa L при дії рентгенівського та УФ-В випромінення; визначення ступеня пошкодження ДНК в клітинах Arabidopsis thaliana (L.) Heynh за умов формування радіоадаптивної відповіді при поєднанні впливу рентгенівського та ультрафіолетового випромінення.

Методи дослідження: фізичні, молекулярно-біологічні та біохімічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що радіоадаптивну відповідь у рослин викликає не тільки рентгенівське, але й ультрафіолетове опромінення. Результати експериментів, отриманих на рослинах різних родин, свідчать про те, що радіоадаптивна відповідь, індукована УФ-В випроміненням, відноситься до загальнобіологічних явищ. При цьому радіоадаптація має неспецифічний характер, що знаходить свій прояв у підвищенні стійкості водночас до рентгенівського та УФ-В випромінення.

Вперше виявлені режими опромінення та часові інтервали прояву радіоадаптивної відповіді у Arabidopsis thaliana при поєднанні впливу УФ-В і рентгенівського опромінення. Доведена участь систем ексцизійної репарації ДНК у формуванні радіоадаптивної відповіді у рослин.

Вперше комбінуванням впливу УФ-В та світла видимого діапазону (400-760 нм) було показано, що фотоліазна реакція послаблює формування індуцибельної радіоадаптації у паростків Medicago sativa L по відношенню до дії тестувального гамма-випромінення.

Практичне значення роботи. Встановлені факти можуть бути корисними в селекції сільськогосподарських культур на стійкість до УФ-В. Це має практичне значення з огляду на те, що застосування заходів, які сприяють підвищенню врожайності, супроводжується зниженням стійкості рослин до впливу УФ-В випромінення. Переважна більшість сортів культурних рослин характеризуються підвищеною чутливістю до ультрафіолетового опромінення, у зв'язку з чим доцільно вести селекцію нових сортів рослин на підвищення стійкості до дії УФ-В випромінення. В наш час методи генної інженерії та біотехнології дозволяють цю задачу успішно вирішувати.

Крім того, отримані результати окреслюють коло ефективних засобів підвищення стійкості посівів сільськогосподарських культур до пошкоджуючого впливу УФ-В випромінення.

Особистий внесок здобувача. Основні теоретичні та експериментальні ідеї були розроблені за допомогою наукового керівника дисертанта доктора біологічних наук, академіка НАН України Д.М. Гродзінського. Дисертант опрацював необхідну за темою наукову літературу, оволодів необхідними молекулярно-біологічними, фізичними та аналітичними методами досліджень, особисто проводив експериментальні роботи і готував матеріали до друку. Результати виконаних автором досліджень відображені у самостійних публікаціях та співавторстві з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи відображені у матеріалах і доповідались на міжнародних конференціях "12^th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology''(Будапешт, 2000); "31^th European Radiation Research Conference" (Дрезден, 2001); ЙV съезде по радиационным исследованиям (Mосква, 2001); Міжнародній науково-практичній школі для молодих вчених і спеціалістів "Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу" (Ужгород, 2001); науково - практичній конференції "Парадигми сучасної радіобіології. Радіаційний захист персоналу об'єктів атомної енергетики" (Київ-Чорнобиль, 2004).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено в 3 статтях та 5 тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 123 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення отриманих даних, висновків та списку використаних джерел літератури (159 найменувань). Текст дисертації ілюстрований 29 рисунками.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вивчення специфічності РАВ проводили на паростках Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (різушка Таля) та Medicago sativa L (люцерна посівна; сорт "Ольга").

Насіння А.thaliana стерилізували в суміші 96 % етанолу та 3 % H₂O₂ (1:1) протягом 5 хв, після чого висаджували на поживне середовище Ленгріджа-Квітко в пластикові чашки Петрі (20-25 рослин на чашку).

Чашки розміщували в термостаті з верхнім освітленням, фотоперіод - світло 18-20 год, темрява 4-6 год. Температура при світлі 22 ^оС, в темряві 20 ^оС. Насіння люцерни Medicago sativa L. скарифікували, після чого пророщували протягом трьох діб (7-10 рослин на чашку Петрі) за аналогічних умов.

Для дослідження РАВ за умов поєднання впливу рентгенівського та УФ_В випромінень, триденні паростки A. thaliana були розділені на 6 експериментальних груп:

1 групу паростків складали контрольні неопромінені рослини; 2 групу паростків опромінювали на установці "Исследователь" (Росія) гамма-променями ⁶⁰Co з потужністю дози (4,3-4,6 x 10^-2 Гр/с) та рентгенівським випроміненням на приладі РУМ-17 (Росія) (потужність дози 0,43 сГр/сек), в інтервалах доз 0,4-40 Гр з метою з'ясування значень Д ₁ та визначення напівлетальної дози (ЛД ₅₀), яку в подальшому використовували як тестувальну; 3 групу паростків опромінювали в діапазоні доз УФ-В (0,002-4,1 кДж/м ²), внаслідок чого була виявлена ЛД ₅₀ для УФ-В, яку в подальших експериментах використовували як тестувальну дозу. Опромінення проводили за допомогою лампи " Philips" TL20W/12 (Німеччина);

4 групу паростків опромінювали рентгенівськими променями в дозах 0,4-0,7 Гр, потім через певні проміжки часу піддавали впливу тестувальної дози гамма-випромінення; 5 групу паростків опромінювали УФ-В випроміненням в дозах від 0,002 кДж/м ² до 0,68 кДж/м ² з подальшим впливом тестувальної дози гамма-випромінення; 6 групу паростків опромінювали рентгенівськими променями в дозах від 0,4 до 0,8 Гр з подальшим впливом тестувальної дози УФ-В (ЛД ₅₀).

Триденні паростки Medicago sativa L. опромінювали УФ-В (0,099-10,89 кДж/м ²) для визначення діапазону Д ₁. Для дослідження умов формування РАВ у паростків Medicago sativa L., було взято інтервал доз УФ-В від 0,29 до 2,17 кДж/м ² з наступним впливом тестувальної дози гамма - випромінення (ЛД ₅₀).

Після встановлення умов, необхідних для формування радіоадаптивної відповіді, індукованої УФ-В випроміненням у паростків Medicago sativa L., проводили її модифікацію впливом світла видимого діапазону (48 мЕ/м ² хв) протягом 20 хв за допомогою приладу "Ленинград - 2 У" в комбінації: доза УФ-В + світло видимого діапазону (400-760 нм) ^_______ Д t (1 год 30 хв) ^________ ЛД ₅₀ (18 Гр).

Для перевірки ефективності функціонування систем ексцизійної репарації ДНК при формуванні РАВ експериментальні рослини між двома впливами витримувались в темряві.

Оцінка виживаності апікальної меристеми та відносної швидкості росту (ВШР) головного кореня рослин. Виживаність апікальної меристеми та відносну швидкість росту головного кореня визначали на 10 день після опромінення. Ці параметри оцінювали по відношенню до контролю неопромінених рослин та рослин, які опромінювали в тестувальній дозі стресового фактору.

Відносну швидкість росту кореня розраховували як відношення приросту опромінених рослин за певний проміжок часу до приросту контрольних рослин за той же час.

F_i(D)= (?L_i/?t_i)_{опр D}/(?L/?t_i)_k

де, ?t_i (і=1, 2, 3…) послідовні проміжки часу, за який визначають лінійний приріст кореня (?L) опроміненої (?L_i/?t_i)_опр і, відповідно, неопроміненої (?L/?t_i)_k (контрольної) рослини.

Виділення ДНК з рослин. Виділення ДНК проводили відразу ж після дії опромінення в Д ₁ рентгенівськими або УФ-В променями. У варіантах з тестувальним опроміненням, виділення ДНК проводили після 30 хв післярадіаційної інкубації паростків в темряві. Виділення ДНК з паростків A.thaliana проводили за допомогою додецилсульфата натрію (ДСН) та протеїнази К згідно методики [Драйпер и др., 1991].

Лужна денатурація ДНК із розділенням фракцій одно- та двониткової ДНК на гідроксилапатиті. Для кількісної оцінки ступеня ушкодженості ДНК використовували метод лужної денатурації з подальшим розділенням фракції однониткової та двониткової ДНК на колонці з гідроксилапатитом за методикою, що описана [Решетников и др., 1996].

Кількість ДНК визначали на спектрофотометрі Specord M 40 згідно [Maniatis et. al., 1982]. Частка однониткової ДНК в загальному вмісті біополімеру відображала ступінь ушкодженості і була виражена у відносних одиницях: N=M/M_k, де M-відношення кількості однониткової ДНК до загальної кількості ДНК зразку, M_k - відношення кількості однониткової ДНК в контролі до загальної кількості ДНК в контролі.

Для отримання достовірних даних досліди повторювали 8-10 разів. На графіках нанесені величини довірчих інтервалів, які відповідають 95 %-вому рівню достовірності.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Радіоадаптивна відповідь, індукована рентгенівським випроміненням у паростків Arabidopsis thaliana. З аналізу отриманих експериментальних даних встановлено, що за виживаністю апікальної меристеми (рис 1) ЛД ₅₀ для другої групи рослин становить 17 Гр. Цю дозу використовували в подальшому як тестувальну (Д ₂).

При опроміненні паростків в дозі 17 Гр спостерігалась повна зупинка росту та побуріння верхівки кореня приблизно у половини рослин на 8-10 день експерименту. При опроміненні паростків в дозі 0,4 Гр за всіх часових інтервалів між Д ₁ і Д ₂ індукції адаптивної відповіді за виживаністю апікальної меристеми не спостерігали (рис. 2.А).

При дозі попереднього опромінення 0,5 Гр адаптивна відповідь за виживаністю апікальної меристеми головного кореня була відсутня при інтервалі 1 год між Д ₁ і Д ₂, проте реєструвалась (14-28 %) при його збільшенні до 1 год 30 хв - 1 год 45 хв. (рис. 2.Б).

Отже доза 0,4 Гр є недостатньою для формування радіоадаптації в опромінених рослинах. При збільшенні Д ₁ до 0,5 Гр кількість пошкоджень ДНК досягає певного порогового значення, яке клітини сприймають як сигнал до індукції та реалізації адаптивних реакцій, в тому числі активізації репаративних систем. При опроміненні паростків A. thaliana в дозі 0,6 Гр радіоадаптивна відповідь спостерігалась при інтервалі часу між дозами 1 год (рис. 2 В).

Найбільший прояв адаптивної реакції було зафіксовано при інтервалах між Д ₁ і Д ₂ 1 год 30 хв та 1 год 45 хв. За даних умов виживаність апікальної меристеми головного кореня опромінених рослин підвищувалась до 72 % та 63 %, а при збільшенні проміжку часу між сеансами опромінення до 2-х год - лише до 57 %.

При збільшенні дози попереднього опромінення до 0,7 Гр, спостерігалося суттєве зменшення виживаності апікальної меристеми головного кореня A. thaliana до 48-37 % при часових проміжках між Д ₁ і Д ₂ 1,5-2 год. (рис. 2.Г).

Очевидно, при даному режимі опромінення перевищення певної порогової кількості пошкоджень ДНК, які виникли внаслідок дії Д ₁ та ініціювали РАВ, веде до виснаження репаративних ресурсів клітини. В цій ситуації частина пошкоджень залишається, і в клітині може відбуватися активізація інших програм, зокрема апоптозу, що супроводжується зменшенням виживаності рослин.

Отже, найбільша інтенсифікація ростових реакцій рослин спостерігалася при Д ₁ 0,5-0,6 Гр та часовому інтервалі між Д ₁ і Д ₂ 1 год 30 хв - 1 год 45 хв (рис. 3).

При великих значеннях Д ₁ формування адаптивної реакції відбувається лише у відносно ранні терміни. Характер дозових залежностей ефектів при формуванні РАВ до впливу рентгенівського випромінення свідчить про існування певних значень Д ₁, за яких зменшується радіостійкість рослин.

На участь систем репарації ДНК у формуванні радіоадаптивної відповіді вказує також збіг часових проміжків між опроміненнями, при яких спостерігається РАВ і тривалістю репарації.

Формування радіоадаптивної відповіді, індукованої УФ-В випроміненням у паростків A.thaliana. При опроміненні паростків A. thaliana УФ-В (0,002 кДж/м ^2-0,05 кДж/м ²) (рис. 4.A) спостерігалося незначне зменшення виживаності апікальної меристеми головного кореня. При збільшенні дози до 0,1 кДж/м ² виживаність помітно зменшувалася (рис. 4.A). Тестувальна доза (ЛД ₅₀) за виживаністю склала 0,17 кДж/м ² (рис. 4.Б).

Найбільш виразно РАВ за виживаністю апікальної меристеми кореня у паростків A.thaliana спостерігали при впливі доз УФ-В: 0,034-0,068 кДж/м ² та часових інтервалах 1,5-2 год між Д ₁ і Д ₂ (рис. 5).

У опромінених рослин відмічалось підвищення виживаності апікальної меристеми на 12-24 % та інтенсифікація ростових реакцій при певних режимах опромінення.

Отримані результати вказують на те, що неспецифічність радіоадаптивної відповіді у рослин проявляється не тільки відносно факторів, котрі її індукують, але й до впливу інших пошкоджуючих чинників. Функціонування репараційних систем клітини посилюється внаслідок пошкоджень ДНК і, відповідно, залежить від величини дози опромінення. Активізації репараційних систем не спостерігалось при впливі невеликих доз УФ-В випромінення та впродовж 1-1,5 год після Д ₁.

Результати аналізу змін виживаності апікальної меристеми та ВШР головного кореня рослин за умов РАВ до впливу УФ-В, індукованої рентгенівським випроміненням представлені на рис. 6. При опроміненні паростків в Д ₁ 0,4 Гр при малих часових інтервалах між Д ₁ і Д ₂ спостерігалось зменшення виживаності до 42-47 %. Можливо, що при опроміненні рослин в зазначеній дозі, ємності конститутивної системи репарації не вистачає для репарації виниклих пошкоджень ДНК, а активізації індуцибельної репарації не відбувається. радіоадаптивна відповідь стійкість ультрафіолетове

Прояв РАВ у паростків A.thaliana при поєднанні впливу УФ-В та рентгенівського випромінення був більше вираженим, коли в якості Д ₁ застосовували УФ-В. Пояснити цю ситуацію можна тим, що фотопродукти у вигляді циклобутанових піримідинових димерів (ЦПД), індуковані Д ₁ УФ-В, під впливом УФ - ендонуклеаз переходять в однониткові розриви, які, в свою чергу, можуть бути активаторами систем ексцизійної репарації.

Низький прояв РАВ, індукованої рентгенівським випроміненням у паростків A.thaliana до впливу масивної дози УФ-В радіації, пояснюється тим, що пошкодження ДНК, які сформувались унаслідок дії Д ₁, активують специфічні для рентгенівського випромінення ферменти репарації. При використанні УФ-В в якості Д ₂ відбувається утворення великої кількості ЦПД. За цих умов системи ексцизійної репарації, що налаштовані на "специфічні" для рідкоіонізуючої радіації пошкодження ДНК, функціонують з меншою ефективністю, що знижує прояв радіоадаптивної відповіді.

Аналіз виходу ушкоджень ДНК клітин паростків A. thaliana за умов індукції та формування специфічної та неспецифічної радіоадаптивної відповіді. Аналіз отриманих даних продемонстрував, що при впливі Д ₁ рентгенівського випромінення частка однониткової ДНК у опромінених паростків A.thaliana була вищою, ніж у контрольних рослин, що свідчить про підвищення ступеня ушкодженості. При впливі тестувальної дози - 17 Гр спостерігалося різке зростання частки однониткової ДНК, зумовлене збільшенням кількості радіаційно-індукованих пошкоджень. У випадку формування специфічної радіоадаптивної відповіді, вихід однониткової ДНК після Д ₂ зменшувався, що вказує на інтенсифікацію репараційних процесів у опромінених рослин (рис 7).

Дещо іншу картину спостерігали у варіантах радіоадаптивної відповіді, формування якої відбувалося після дії УФ-В та рентгенівського випромінення (рис. 8).

З представлених результатів видно, що у рослин, опромінених тільки в Д ₁ УФ_В (рис. 8.А), спостерігалось незначне збільшення виходу однониткової ДНК відносно контрольного рівня. Можемо припустити, що при дії Д ₁ УФ-В утворюється певна кількість ЦПД і дуже незначний рівень прямих чи опосередкованих розривів ДНК. Тому при хроматографічному аналізі ДНК, що була виділена з рослин після опромінення УФ-В в дозі 0,05 кДж/м ², частка однониткової ДНК несуттєво відрізнялася від неопроміненого контролю. У рослин, що були опромінені в дозі 0,05 кДж/м ² та знаходились в темряві 1 год 30 хв з подальшим впливом Д ₂ гамма-квантів, спостерігалось зниження частки однониткової ДНК у порівнянні з рослинами, які були опромінені тільки у тестувальній дозі (рис. 8.А).

При опроміненні паростків A.thaliana рентгенівським випроміненням в дозі 0,6 Гр з подальшим впливом через 1 год 30 хв тестувальної дози УФ-В 0,17 кДж/м ² при інкубації паростків між двома впливами в умовах темряви спостерігалось мінімальне зниження частки однониткової ДНК у адаптованих рослин у порівнянні з попередніми варіантами формування радіоадаптивної відповіді (рис. 8.Б). На основі отриманих нами експериментальних даних можна припустити, що системи ексцизійної репарації ДНК беруть активну участь у формуванні радіоадаптивної відповіді у рослин.

Неспецифічна радіоадаптивна відповідь, індукована УФ-В випроміненням у паростків Medicago sativa L. за умови модифікації її світлом видимого діапазону (400-760 нм). З аналізу дозової залежності виживаності паростків Medicago sativa L, очевидно, що діапазон доз УФ-В випромінення, в межах якого спостерігалось мінімальне зниження виживаності опромінених рослин, складає 0,099-1,089 кДж/м ² (рис. 9.) Виживаність апікальних меристем після опромінення в зазначеному дозовому діапазоні складала: 96-75 %.

Радіоадаптивна відповідь у опромінених рослин за виживаністю апікальної меристеми головного кореня та ростовими реакціями була найбільш виразною при впливі Д ₁ УФ-В - 0,89 кДж/м ² та 1,089 кДж/м ² при інтервалі між Д ₁ і Д ₂ опроміненнями 1 год 30 хв. За таких умов спостерігалось підвищення виживаності апікальних меристем рослин на 25-33 % у порівнянні з паростками, які опромінювались тільки в тестувальній дозі гамма - випромінення. (рис. 10.)

З метою перевірки нашої робочої гіпотези стосовно ролі пошкоджень ДНК у формуванні підвищеної радіорезистентності у рослин, був проведений дослід по модифікації світлом видимого діапазону РАВ, індукованої УФ-В у паростків Medicago sativa L. Отримані результати показують, що при впливі світла видимого діапазону (48 мЕ/м ²хв) протягом 20 хв одразу ж після опромінення в Д ₁ УФ-В в подальшому реєструвалось ослаблення адаптивної відповіді, як за виживаністю апікальної меристеми (рис. 11 А), так і за ростовими реакціями опромінених рослин (рис. 11 Б).

Зменшення прояву РАВ за виживаністю апікальної меристеми та ВШР головного кореня рослин при застосуванні модифікуючого впливу видимого світла можна пояснити елімінацією частини ЦПД, необхідних для індукції РАВ.

ВИСНОВКИ

1. Доведено, що радіоадаптивну відповідь у рослин викликає не тільки рентгенівське опромінення, але й УФ-В у відповідних дозах, що свідчить про неспецифічність формування цієї реакції.

2. Неспецифічність РАВ проявляється не тільки відносно факторів, що викликали індукцію радіоадаптивної відповіді, але й до впливів тестувальних доз пошкоджуючих чинників.

3. Часові інтервали (1,5-2 год), що необхідні для найбільшого прояву та розвитку специфічної та неспецифічної радіоадаптації при впливі УФ-В та рентгенівського випромінення у паростків Arabidopsis thaliana співпадають з максимальною функціональною здатністю репаративних ферментних систем клітини.

4. При наявності як специфічної, так і неспецифічної радіоадаптації спостерігається зменшення рівню пошкоджень ДНК у вигляді однониткових розривів в клітинах паростків Arabidopsis thaliana, що вказує на активізацію систем її репарації.

5. Аналіз ступеня ушкодженості ДНК клітин паростків A. thaliana за умов формування радіоадаптивної відповіді, індукованої УФ-В та рентгенівським випроміненням, може пояснюватися тим, що активізація систем репарації ДНК при розвитку радіоадаптації у рослин відбувається шляхом індукції синтезу ферментів репарації de novo під впливом пошкоджень ДНК, які виникли внаслідок дії відповідного чинника.

6. Подібність процесів, отриманих на представниках різних родин рослин, свідчить про те, що радіоадаптивна відповідь, індукована УФ-В випроміненням є проявом загальнобіологічної реакції.

7. Уперше поєднанням впливу УФ-В та світла видимого діапазону було показано, що фотоліазна реакція послаблює формування індуцибельної радіоадаптації у паростків Medicago sativa L по відношенню до тестувального впливу гамма-випромінення.

CПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Данильченко О.О., Гродзінський Д.М. Радіоадаптивна відповідь у Arabidopsis thaliana // Доповіді Національної академії наук України. - 2001. - № 3. - С. 165-168.

2. Данильченко О.А., Гродзинский Д.М. Влияние УФ-В излучения на индукцию радиоадаптивного ответа у растений // Збірник наукових праць інституту ядерних досліджень. - 2002. - Т. 2, №8. - С. 176-179.

3. Данильченко. О.А., Гродзинский Д.М., Власов В.Н. Значение ультрафиолетового излучения в жизнедеятельности растений // Физиология и биохимия культурных растений. - 2002. - Т.34. №3. - С. 187-198. (Здобувачем поставлено завдання, проаналізовано літературу, здійснено обговорення сучасних літературних даних по темі дисертаційних досліджень, написано статтю).

4. Danilchenko O.A. Influence of low doses of ionizing radiation on adaptive response induction of Arabidopsis thaliana. // Abstracts of 12 th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. - Budapest (Hungary). - 2000. - P. 209.

5. Данильченко О.О. Підвищення стійкості рослин до УФ-B під впливом малих доз іонізуючого випромінювання // Науковий вісник Ужгородського університету. - Ужгород (Україна). - 2001. - С. 363-364.

6. Danilchenko O.A. Arabidopsis thaliana's adaptive response under combined influence UV_B and -radiation // Abstracts of 31 ^st Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology - Dresden (Germany). - 2001. - P. 191.

7. Данильченко О.А. Адаптивный ответ к -радиации, индуцированный УФ-В излучением у Arabidopsis thaliana // ЙV съезд по радиационным исследованиям. - Москва (Россия). - 2001. - С. 346.

8. Данильченко О.О., Гродзінський Д.М. Участь систем репарації ДНК у формуванні РАВ у рослин // Науково практична конференція Парадигми сучасної радіобіології. - Київ - Чорнобиль (Україна). - 2004 - С. 15-16.

АНОТАЦІЯ

Данильченко О.О. Радіоадаптивна відповідь, індукована УФ-випроміненням, у рослин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01 - радіобіологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка. Київ, 2005.

У дисертації було проведено дослідження міри специфічності радіоадаптивної відповіді у рослин при впливі стресових факторів різної природи та термінів її реалізації за даних умов. Показано, що формування радіоадаптивної відповіді у рослин на прикладі Arabidopsis thaliana і Medicago sativa L. відбувається після Д ₁ рентгенівського та УФ-В випромінень, що свідчить про її неспецифічність. Встановлено характер дозових залежностей виживаності апікальних меристем та ВШР головного кореня паростків експериментальних рослин.

Виявлені режими опромінення та визначені часові інтервали, необхідні для прояву та розвитку радіоадаптивної відповіді при поєднанні впливу УФ-В та рентгенівського випромінень у паростків A. thaliana. Встановлена участь систем ексцизійної репарації ДНК в формуванні радіоадаптивної відповіді у рослин.

Комбінуванням впливу УФ_В та світла видимого діапазону (400-760 нм) було показано, що фотоліазна реакція послаблює формування індуцибельної радіоадаптації у паростків Medicago sativa L по відношенню до тестувального впливу гамма-випромінення.

Ключові слова: радіоадаптивна відповідь, ультрафіолетове випромінення, рослини, ДНК, репарація.

АННОТАЦИЯ

Данильченко О.А. Радиоадаптивный ответ, индуцированный ультрафиолетовым излучением, у растений. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01- радиобиология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко. Киев, 2005.

Диссертационная работа посвящена исследованию радиоадаптивного ответа у растений при влиянии рентгеновского и ультрафиолетового излучений.

Загрязнение атмосферы Земли веществами типа фреонов вызывает разрушение стратосферного озона, что приводит к увеличению интенсивности УФ-В (280-320 нм) радиации на поверхности Земли. Данный процесс сопровождается повышением степени проявления негативных эффектов УФ-В, которые наблюдаются как у животных, так и у растений. В связи с этим, изучение механизмов адаптации растительных объектов к влиянию ультрафиолета и определение эффективных способов модификации устойчивости растений к повреждающему воздействию УФ-В особенно актуальны. В диссертации было проведено исследование влияния УФ-В излучения на формирование радиоадаптивного ответа у проростков A.thaliana и Medicago sativa L.

Анализ полученных результатов показал, что индукция радиоадаптации у растений на примере Arabidopsis thaliana и Medicago sativa L. происходит как после облучения в Д ₁ рентгеновским излучением, так и после воздействия ультрафиолета, что свидетельствует о неспецифичности этой реакции.

Установлен характер дозовых зависимостей выживаемости апикальных меристем и относительной скорости роста главного корня проростков растений. Определены режимы облучения и временные интервалы между Д ₁ і Д ₂ облучением, необходимые для формирования и развития радиоадаптивного ответа, который сопровождается повышением устойчивости проростков A.thaliana к УФ-В и рентгеновскому излучениям.

Результаты экспериментов показали, что в формировании радиоадаптивного ответа у растений принимают участие системы эксцизионной репарации ДНК. Установлено, что при радиоадаптации, индуцированной как ультрафиолетовым, так и рентгеновским излучением, наблюдается уменьшение количества однонитевых разрывов ДНК в клетках проростков A.thaliana, что указывает на активизацию репарационных процессов.

Комбинированием влияния УФ-В излучения и света видимого диапазона (400-760 нм) на проростки Medicago sativa L. показано, что фотолиазная реакция уменьшает формирование индуцибельной радиоадаптации у проростков Medicago sativa L по отношению к тестирующему влиянию гамма - излучения.

Ключевые слова: радиоадаптивный ответ, ультрафиолетовое излучение, растения, ДНК, репарация.

ANNOTATION

Danilchenko O.А. Plants' radioadaptive response, inducted by the ultraviolet irradiation. - Manuscript.

Thesis for a Ph.D. degree of biological science by speciality 03.00.01 - radiobiology. - National Taras Shevshenko University of Kyiv. Kyiv, 2005.

Thesis represents the research results of the plants' radioadaptive response to impact of irradiation stress factors. Demonstrated the formation of the plant radioadaptive response in example of Arabidopsis thaliana and Medicago sativa L., as after irradiation of сonditioning doses of X-radiation as after treatment by the ultraviolet, that indicated nonspecific nature of this reaction. Established the character of the dose dependences for survival of apical meristem and relative growth speed of the main root of plant seedlings. Determined the irradiation regimes and time intervals between сonditioning and challenging irradiation. Irradiation regimes and time intervals are important to producing and development of radioadaptive response, leading to increasing of resistance of A.thaliana seedlings to UV- В and X- irradiation.

Established the fact that formation of plant radioadaptive response is involving the excisional DNA repair system. With the help of photolyasa reaction in combination of UV-B and visible light treatment to the seedlings of Medicago sativa L the decrease of plants' radioadaptive response formation was shown.

Key words: radioadaptive response, ultraviolet irradiation, plants, DNA, repair.

Размещено на Allbest.ru

...