Вплив дистальних мутацій на конформаційну рухливість ВІЛ-1 протеази: дослідження методом молекулярної динаміки

Размещено на http://allbest.ru

Національна Академія наук України

Інститут молекулярної біології ТА генетики

03.00.03 - Молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вплив дистальних мутацій на конформаційну рухливість ВІЛ-1 протеази: дослідження методом молекулярної динаміки

Ковальський Дмитро Борисович

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі білкової інженерії Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор

Корнелюк Олександр Іванович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

завідувач відділу білкової інженерії.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Говорун Дмитро Миколайович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

заступник директора з наукової роботи,

завідувач відділу молекулярної біофізики;

доктор біологічних наук, професор

Кібірєв Володимир Костянтинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу структури і функцій білка.

Провідна установа: Інститут біохімії НАН України імені О.В. Палладіна, м. Київ.

Захист відбудеться 25 жовтня 2005 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Автореферат розіслано 24 вересня 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Протеаза ВІЛ-1 є ключовим білком у циклі відтворення вірусу імунодефіциту людини. Її функція полягає у розщепленні двох поліпептидів gag і gag-pol та попередника білка Nef на функціонально активні білки вірусу. Показано, що інгібування протеази ВІЛ-1 призводить до формування функціонально неактивних віріонів ВІЛ (McQuade et al., 1990). Спираючись на цей факт, було створено цілу низку інгібіторів протеази ВІЛ-1, з яких 7 ефективно використовуються у клінічній практиці для терапії ВІЛ/СНІДу (Wlodawer et al., 1998). Однак, набуття вірусом імунодефіциту людини резистентності до цих інгібіторів є основною перешкодою на шляху повного одужання хворих. Вивчення молекулярних механізмів резистентності до ліків є вкрай необхідним для створення інгібіторів протеази ВІЛ-1 нового покоління, активних як проти нативного, так і резистентних штамів ВІЛ.

Численні роботи із вивчення явища резистентності ВІЛ-1 свідчать, що нечутливість до інгібіторів протеази ВІЛ-1 спричинена появою мутацій у гені самої протеази ВІЛ-1. За положенням у структурі протеази резистентні мутації поділяють на мутації активного центру та дистальні мутації - віддалені від активного центру ферменту. Оскільки мутантні амінокислоти активного центру безпосередньо беруть участь у контактах з інгібіторами, їхній вплив можна оцінити із просторової структури комплексів інгібіторів з протеазою ВІЛ-1. Однак вплив дистальних мутацій на резистентність важко оцінити на основі кристалографічних даних, оскільки різниця між кристалічними структурами дистального мутанта та нативної протеази не перевищує похибку експерименту. Раніше, у загальноприйнятій моделі резистентності протеази ВІЛ-1 вважалось, що мутації активного центру є основними чинниками явища резистентності (первинні мутації), а роль дистальних мутантів полягає у відновленні рівня ензиматичної активності (компенсуючі мутації), зменшення якого викликано первинними мутаціями. Однак останні експериментальні роботи свідчать про те, що дистальні мутації також можуть відігравати провідну роль у появі резистентності до інгібіторів (Muzammil et al., 2003). Отже, існує нагальна потреба у вивченні механізмів впливу дистальних мутацій на резистентність ВІЛ до інгібіторів. На жаль, дотепер не існує експериментального методу, який би дозволив розкрити механізм дії дистальних мутацій. Слід зазначити, що механізм впливу мутацій через зміну внутрішньомолекулярної динаміки білка та зміну конформаційних рухів може бути суттєвим при дослідженні резистентності, особливо у випадках, коли мутації майже не впливають на просторову кристалічну структуру ферменту (як у випадку дистальних мутацій протеази ВІЛ-1). Комп'ютерний метод розрахунку молекулярної динаміки (МД) надає інформацію про конформаційні рухи білка на атомарному рівні деталізації, що має значні переваги перед іншими методами. Вивчення динаміки білка є необхідною складовою процесу дослідження каталітичного механізму чи механізму інгібування ферменту. В останні роки застосування високопотужних обчислювальних кластерів та суперкомп'ютерів для розрахунків МД біологічних макромолекул та їхніх комплексів суттєво розширило можливості структурної біології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу білкової інженерії Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (бюджетні теми 2.2.4.28 „Структурно-функціональне дослідження еукаріотичної тирозил-тРНК синтетази методами білкової інженерії”, № держреєстрації 0198U001314, 1998-2002 рр. та „Конформаційна рухливість та динамічний механізм впізнавання РНК еукаріотичною тирозил-тРНК синтетазою”, № держреєстрації 0103V000073 2003-2007 рр.).

Мета і завдання досліджень. Метою дисертаційної роботи було вивчення конформаційної рухливості нативної протеази ВІЛ-1 за різних умов середовища та дослідження впливу дистальних мутацій протеази Leu10Ile, Leu90Met, Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu та Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys на її МД.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Вивчити вплив різних розрахункових параметрів на МД протеази ВІЛ-1 з метою їхньої оптимізації та подальшого використання для розрахунку МД нативної протеази ВІЛ-1 та її мутантів.

2. Провести дослідження МД за умов експерименту ЯМР для порівняння з наявними даними ЯМР та вивчення МД при фізіологічних умовах для подальшого порівняння з результатами розрахунку МД мутантів.

3. Розробити алгоритм порівняння даних МД та ЯМР у піко- та наносекундному часових інтервалах.

4. Розробити новий алгоритм порівняльного аналізу колективних конформаційних рухів білків, придатний для порівняння МД нативної протеази та її мутантів.

5. Провести розрахунки МД мутантів протеази ВІЛ-1 та охарактеризувати механізми впливу дистальних мутацій на конформаційну рухливість протеази.

Об'єкт досліджень: явище впливу дистальних мутацій протеази ВІЛ-1 на резистентність до інгібіторів.

Предмет досліджень: МД протеази ВІЛ-1; механізм впливу дистальних мутацій Leu10Ile, Leu90Met, Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu та Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys на резистентність, опосередковану зміною конформаційних рухів протеази ВІЛ-1 через порівняння динаміки мутантів і нативної протеази; вивчення конформаційного простору рухів протеази ВІЛ-1 у наносекундному часовому інтервалі .

Методи досліджень: метод МД для комп'ютерного моделювання конформаційної динаміки білків; розрахунок узагальненого параметра впорядкування; неемпіричний квантово-хімічний метод ab initio на рівні теорії HF/6-31G(d,p) для розрахунку геометрії активного центру; створений в роботі власний алгоритм співставлення колективних конформаційних рухів білків.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Досліджено конформаційну рухливість протеази ВІЛ-1 за різних умов, в тому числі фізіологічних, що дозволяє скласти повне уявлення про конформаційний простір протези ВІЛ-1 в наносекундному часовому інтервалі.

2. На основі розрахунку та аналізу МД резистентних дистальних мутантів та порівняння з МД нативної протеази ВІЛ-1 зроблено висновок про існування двох механізмів впливу резистентних мутацій - через перерозподіл амплітуди узгоджених рухів та через зміну доступних конформаційних рухів.

3. Розроблено алгоритм порівняння даних МД з даними ЯМР з використанням загального параметра впорядкування амідних зв'язків пептидних груп, S2, що дає краще узгодження в порівнянні з існуючими методами.

4. Розроблено метод порівняння колективних конформаційних рухів між двома системами (КР-ДККМ або Карти різниць).

Практичне значення одержаних результатів. Результати та методи, що були отримані та розроблені в даній роботі, можуть бути застосовані у науково-дослідній практиці: дистальний мутація протеаза молекулярний

1. Досліджені мутанти протеази ВІЛ-1 є найпоширенішими, тому наведені спостереження можуть бути використані для розробки лікарських препаратів - інгібіторів протеази ВІЛ-1 нового покоління, активних до нативної протеази та її мутантів, які є резистентними до інгібіторів.

2. Розроблений алгоритм порівняння результатів розрахунку МД з результатами експериментів ЯМР може бути застосований для вивчення динаміки інших білків. Методика визначення параметра впорядкування, S2, застосовується у новому алгоритмі для розрахунку параметрів ЯМР Т1, Т2 та ядерного ефекту Оверхаузера з даних МД, який створюється в нашому відділі.

3. Загальний метод порівняння узгоджених рухів двох систем на основі даних моделювання їхньої МД є універсальним і може бути застосований для вивчення зміни колективних рухів біомакромолекул внаслідок будь-яких пертурбацій як внутрішніх, так і зовнішніх.

Особистий внесок здобувача. В усіх опублікованих у співавторстві наукових працях за темою дисертації особистий внесок здобувача полягає: у власноруч проведених розрахунках МД нативної протеази ВІЛ-1 та її мутантів; моделюванні структури мутантів; визначенні умов проведення розрахунків; встановленні та налагодженні програмного забезпечення для швидкісного паралельного розрахунку МД; проведенні квантово-хімічних розрахунків; координації та співучасті у розробці алгоритмів порівняння даних МД з даними ЯМР та колективних рухів двох систем (КР-ДККМ); аналізі та інтерпретації отриманих результатів та їх зіставленні з літературними даними; обговоренні результатів; написанні наукових праць та оприлюдненні результатів на наукових конференціях. О.С. Іванова виконувала часткове написання коду програми із співставлення даних МД та ЯМР. Д.С. Каніболотський брав участь у розробці алгоритму із співставлення даних МД та ЯМР, аналізі даних МД нативної протеази при різних станах протонування каталітичної діади. Аналіз узгоджених рухів як нативної протеази, так і всіх дистальних мутантів, розробка КР-ДККМ, вдосконалення коду та алгоритму розрахунку параметра впорядкування, S2, виконані спільно з В.М. Дубиною. Автор висловлює подяку професору Алану Е. Марку (університет м.Гронінген, Нідерланди) за допомогу при підготовці розрахунків МД мутантів та обговоренні результатів МД за фізіологічних умов. Автор щиро вдячний д.б.н., професору О.І. Корнелюку за керівництво роботою, корисні поради в плануванні розрахунків та при обговоренні результатів. Одержані результати висвітлено в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на конференціях молодих вчених (Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, Україна 2001, 2003), курсах програми WHATIF (CMBI, Неймеген, Нідерланди, 2001), на наукових семінарах групи біоінформатики Інституту біофізики та біохімії ПАН (Варшава, Польща, 2001), на наукових семінарах відділу білкової інженерії Інституту молекулярної біології та генетики НАН України, наукових семінарах групи молекулярної динаміки Університету міста Гронінген, Нідерланди (2002), І Українській науковій конференції „Проблеми біологічної та медичної фізики” ПБМФ-2004 (Харків, Україна, 2004), V Міжнародній конференції з біологічної фізики ICBP-2004 (Гетеборг, Швеція, 2004).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковано у 5 статтях у фахових наукових журналах та тезах 5 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження, узагальнення результатів дослідження, висновків, списку цитованої літератури, який нараховує 149 найменувань. Загальний обсяг дисертації складає 136 сторінок, вона містить 44 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи. Для проведення розрахунків МД та моделювання структур мутантів використано просторові моделі напіввідкритої (PDB ID: 1ННР) та закритої (PDB ID: 1G6L) конформацій протеази ВІЛ-1. Напіввідкриту конформацію протеази ВІЛ-1 (1ННР) використовували для проведення розрахунків тільки нативної протеази за різних умов із подальшим порівнянням з літературними даними ЯМР. В свою чергу, закриту конформацію використовували для моделювання просторової структури мутантів, моделювання МД нативної протеази та змодельованих мутантів із подальшим порівнянням результатів розрахунку МД між собою.

Програмне забезпечення.

Для розрахунку параметра впорядкування, S2, розроблено власну програму на основі шаблону GROMACS. Для створення карт різниць динамічних крос-кореляційних матриць використовували програму MathCad. Для розрахунку МД у вакуумі використовували програму HyperChem.

Розрахунок МД проводили за допомогою програми GROMACS за загальним протоколом: просторову модель білка розміщували у центрі усіченого октаедра з мінімальною відстанню атомів білка до стінки бокса 1 нм. Потім проводили мінімізацію енергії протягом 200 кроків. Після цього бокс заповнювали молекулами води (модель SPC216) та, де було необхідно, вводили в систему відповідну кількість іонів шляхом заміщення певних молекул води. Потім проводили мінімізацію енергії і потім здійснювали розрахунок МД протягом 50 пс з гармонійною прив'язкою важких атомів протеази ВІЛ-1 до їхніх положень. Розрахунок МД проводили з кроком 2 фс, та інтегрування за алгоритмом Верлета. Результати через кожну 1 пс записували у вихідний файл.

Для оптимізації геометрії методом ab initio на рівні теорії HF/6-31G+(d,p) використовували програму PC-GAMESS. Для конструювання моделі активного центру використовували координати залишків Leu24(тільки карбонільна група)-Asp25-Thr26-Gly27 з обох субодиниць (PBI ID: 1HHP). Літичну молекулу води було розміщено над карбоксильними киснями згідно з літературними даними. При моделюванні депротонованої протеази іон натрію поміщали у положення атома кисню літичної молекули води.

Розрахунки проводили на базі таких комп'ютерних кластерів: TGV, Entry та HPC. Кластер TGV було створено на базі трьох комп'ютерів відділу білкової інженерії Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, кластер Entry був люб'язно запропонований компанією Entry (м.Київ www.entry.kiev.ua), доступ до кластеру HPC було надано університетом м.Гронінген, Нідерланди.

Результати дослідження та їх обговорення.

1. МД нативної протеази та порівняння з даними ЯМР. Для вивчення впливу мутацій на МД протеази ВІЛ-1 необхідно мати чітке уявлення про конформаційну рухливість нативної форми білка. З цією метою було проведено цілу низку розрахунків МД нативної протеази ВІЛ-1 з метою вивчення впливу розрахункових параметрів на її рухливість, а також МД за фізіологічних умов та в умовах експерименту ЯМР.

Для швидкого виявлення найбільш рухливих фрагментів білка було розраховано МД протеази ВІЛ-1 у вакуумі протягом 100 пс. Показано утворення так званої „динамічної кишені” на 20-й пс МД, яка формувалась амінокислотними залишками Val32, Lys45, Ile47, Gly48, Gly49, Ile50, Gly51, Gly52, Ile54, Val56, Leu76, Gly78, Pro79, Thr80 та Pro81. Завдяки шарнірному руху флепів (в-шпильки з кожної субодиниці, що накривають активний центр та контролюють доступ лігандів) у ділянці біля залишків Ile46 та Ile54 „кишеня” збільшувала свій об'єм до 1365 Е2. У цих розрахунках динаміки нами підтверджені експериментальні дані про нерівномірний розподіл конформаційної гнучкості у структурі протеази ВІЛ-1, отримані методами мікрокалориметрії (Todd et al., 1998).

1.1. Вплив методу розрахунку електростатичних взаємодій на МД протеази ВІЛ-1. Нами вперше показано, що конформаційна рухливість флепових доменів контролюється електростатичними взаємодіями, а курові та димеризаційний домени (нижня частина) більше залежать від ван-дер-ваальсового типу взаємодії. Для цього проведено два окремих розрахунків МД гідратованої протеази ВІЛ-1 з різними методами врахування далеких електростатичних взаємодій: радіус подвійного відсікання (РПВ, cut-off) та узагальнене реакційне поле (УРП, Generalized Reaction Field). У процесі МД за методом РПВ (9 Е та 14 Е) спостерігалось зміщення флепів до активного центру протеази і його екранування від розчинника. Таку поведінку можна пояснити неповним врахуванням далеких електростатичних взаємодій у методі РПВ. На противагу, в розрахунку МД за методом УРП спостерігалось повне відкриття флепів на 2-й нс розрахунку. Відстань між кінцями флепів становила 11 Е, що є достатнім для можливого входження субстрату до активного центру

Отже, для характеристики динаміки протеази ВІЛ-1 і необхідного відкриття активного центру ферменту критичним етапом є врахування далеких електростатичних взаємодій.

1.2. Вплив рН на МД протеази ВІЛ-1. Нами вперше було досліджено вплив зміни рН на МД протеази ВІЛ-1. У нейтральному середовищі каталітична діада Asp25/Asp25' є депротонованою, а у слабокислому - монопротонованою. Було проведено два ідентичних розрахунки з єдиною різницею у протонованому стані каталітичної діади (монопротонована система - надалі AspH_RF, та депротонована система - надалі AspH_RF).

В результаті розрахунку Asp_RF ми спостерігали перехід у відкриту конформацію подібно до попереднього розрахунку МД (середньоквадратичне відхилення (СКВ) кінцевої конформації становить 5,48 Е), але у випадку системи AspH_RF протеаза ВІЛ-1 залишилась подібною до напіввідкритої конформації (СКВ кінцевої конформації складає 2,31 Е).

Показано, що в системі Asp_RF на 5-й пс МД молекула води вклинюється між каталітичними амінокислотними залишками Asp25/Asp25', щоб утворити максимальну кількість водневих зв'язків і тим самим зменшити електростатичне відштовхування між негативно зарядженими карбоксильними групами. У кінцевому підсумку вклинювання молекули води є причиною відкриття флепів за даних умов.

На противагу до цього розрахунку, у випадку системи AspH_RF, спостерігали не відкриття флепів, а тільки високу конформаційну рухливість флепового домену.

Таким чином, ми показали, що МД протеази ВІЛ-1 суттєво залежить від рН середовища, що узгоджується з наявними даними про залежність загальної стабільності та ензиматичної активності протеази ВІЛ-1 від величини рН.

1.3. Порівняння МД протеази ВІЛ-1 за умов експерименту ЯМР та фізіологічних умов. Вперше проведено розрахунок МД вільної протеази ВІЛ-1 за умов експерименту ЯМР та в фізіологічних умовах. Отримані дані порівняно з експериментальними даними ЯМР.

Було проведено розрахунок МД протеази за умов, що найточніше описують умови експерименту ЯМР (AspH_cions) та умови клітини (Asp_salt) протягом 8,5 нс. Для цього в систему AspH_cions було введено 5 іонів Cl -, каталітична діада була монопротонованою, а в систему Asp_salt було введено 29 іонів Na+ та 33 іони Cl - (що відповідає 0,15 М концентрації солі NaCl у розчині). Для досягнення високої точності розрахунку електростатичні взаємодії розраховували методом частко-граткового додавання за Евальдом (PME).

Аналіз результатів розрахунку (СКВ, радіус обертання, вторинна структура та ін.) свідчить про високу ідентичність поведінки протеази ВІЛ-1 в обох системах. СКВ між їхніми кінцевими конформаціями є нижчим, відносно початкової структури (1,4 Е та 2,5 Е, відповідно).

Аналіз конформації активного центру протеази ВІЛ-1 у системі Asp_salt виявив, що іон натрію вбудовується між карбоксильними групами каталітичних аспартилових амінокислотних залишків Asp25/Asp25' .

Таке зв'язування призводить до нейтралізації електростатичного відштовхування та загалом стабілізує систему. Проведена оптимізація геометрії активного центру методом ab initio цих двох систем та накладання їх на кристалічну структуру показали високу схожість отриманих конформацій.

Механізм стабілізації протеази ВІЛ-1 через зв'язування з іоном натрію ми вважаємо дуже ймовірним, а можливе конкуренте зв'язування молекули води (як у попередніх розрахунках) пояснює факт зниження загальної стабільності та активності протеази у нейтральному рН порівняно із слабокислим.

Розрахований з МД параметр впорядкування, S2, для зв'язку N-H пептидної групи узгоджується з отриманим із даних ЯМР як якісно, так і кількісно.

Для цього нами було розроблено та використано програму для розрахунку параметра впорядкування, S2, для N-H зв'язку пептидної групи, який можна отримати незалежно як із даних ЯМР, так і МД, і який є індикатором рухливості білка в наносекундному часовому діапазоні. Узагальнений параметр упорядкування S2, є мірою рухливості амідних N-H зв'язків амінокислотних залишків. Ця величина може бути визначена з даних ЯМР-релаксації, але також може бути розрахована з траєкторій МД. В даній роботі такий розрахунок для кожного амінокислотного залишку здійснювали за відомою формулою (Chandrasekhar et al., 1992):

,

де цij - кут між напрямками орієнтації амідного N-H зв'язку в моменти часу i та j, P2(x) - поліном Лежандра 2 ступеня, N - кількість пар моментів часу, які сумуються. Усереднення проводили двома способами. За першим способом траєкторію розбивали на відрізки тривалістю TR пс. Вищевказану формулу застосовували до всіх пар конформацій в даному часовому відрізку. Одержані значення S2 за всіма відрізками усереднювали. За другим способом усереднення проводили за всіма парами конформацій, для яких різниця у часі була меншою, ніж TR. Показано, що значення S2, одержані неалежно двома способами, мало відрізняються між собою. При значенні TR=100-200 пс результати розрахунку задовільно узгоджуються з експериментальними даними, одержаними методом ЯМР (Freedberg et al., 2002).

2.2. Матриця різниць. Складність вивчення впливу дистальних мутацій полягає у тому, що їхній вплив практично неможливо оцінити звичайними методами аналізу розрахунків МД. З цією метою було розроблено метод порівняння колективних рухів двох систем. Суть методу полягає у тому, що порівнюється набір тільки узгоджених рухів двох білків. У останніх теоретичних працях (Piana et al., 2002) показано, що колективні рухи протеази ВІЛ-1 впливають на взаємодію з лігандом та її каталітичну функцію. Ми припустили, що дистальні мутації можуть впливати саме на такі рухи, не змінюючи суттєво загальний фолдинг протеази. Кожен білок, що порівнювали, проходив такі етапи. Спочатку для траєкторії протеази ВІЛ-1 було проведено коваріаційний аналіз, результатом якого було розкладання рухів протеази за власними векторами. Напрям та власне значення векторів відображають напрям та амплітуду відповідного колективного руху атомів протеази. Після цього траєкторію відфільтровували тільки по перших чотирьох „найвагоміших” власних векторах, тобто в отриману траєкторію вносять вклад тільки ці обрані вектори. Далі будували динамічну крос-кореляційну матрицю (ДККМ) для відфільтрованої траєкторії, яка відображає попарну узгодженість рухів атомів білка в цьому розрахунку МД. На останньому етапі такі матриці двох систем віднімали одну від одної та проводили оцінку їх розбіжності

Проведене тестування цього алгоритму свідчить про те, що вибір чотирьох власних векторів є оптимальним для даного білка. Цей алгоритм також дозволяє визначити амінокислотні залишки, для яких відбуваються зміни їхніх корельованих рухів.

Аналіз даних МД нативної протеази за різних умов з використанням КР-ДККМ підтверджує модель будови протеази ВІЛ-1, що складається з 5 доменів (Rose, 1998). Обидві субодиниці утворюють димеризаційний домен, що містить каталітичну діаду Asp25/25' та є основою для узгоджених рухів протеази

3. МД мутантів протеази ВІЛ-1 та порівняння з нативною протеазою. Мутанти протеази ВІЛ-1, які були вивчені в даній роботі, умовно поділено за назвами доменів: Leu10Ile та Leu90Met - димеризаційний домен, Ala71Val, Gly73Ser та Ile93Leu - корові домени, Met36Ile, Glu35Gln, Ser37Asp та Arg57Lys - флепові домени. Для розрахунків МД мутантів було обрано закриту конформацію вільної протеази ВІЛ-1 (найбільш точна структура PDB ID: 1G6L). Як для нативного ферменту, так і для мутантів протеази було розраховано МД протягом 10-ти нс за умов слабокислого рН та 0,15 М концентрації NaCl. У розрахунку МД нативної протеази ВІЛ-1 виявлено високу рухливість флепових доменів (СКВ=3,16 Е), що підтверджує пологий профіль їхнього конформаційного простору. МД усіх досліджених мутантів протеази ВІЛ-1 було порівняно з цією МД нативної протеази як референтної.

3. 1. МД Leu10Ile та Leu90Met мутантів протеази ВІЛ-1. Виявлено, що поведінка цих 2 мутантів у процесі МД відрізняється кардинально: конформація мутанта Leu10Ile залишилася близькою до початкової (СКВ=2,01 Е), а мутант Leu90Met виявив найвищу серед вивчених мутантів конформаційну рухливість (СКВ=3,30 Е). Поведінка мутанта Leu10Ile залишалась стабільною протягом усього розрахунку МД, орієнтація доменів один відносно іншого залишалась майже незмінною, а також не відбувається суттєвих рухів всередині самих доменів. Під час вивчення динаміки мутанта Leu10Ile виявлено зниження локальної гнучкості сусідніх до мутантної амінокислоти залишків. Це унеможливлює конформаційний перехід залишку Pro9 та всієї N-кінцевої петлі протеази ВІЛ-1 у повністю відкриту конформацію

В свою чергу ми показали, що повне відкриття з конформаційним переходом Pro9 N-кінцевої петлі чітко корелює з глобальним рухом на відкриття флепів нативної протеази. Отже, мутація Leu10Ile перешкоджає рухам, необхідним для відкриття активного центру протеази та стабілізує закриту конформацію протеази ВІЛ-1. З іншого боку, у мутанта Leu10Ile значно посилюються глобальні рухи протеази (від л1=0,38 у нативної протеази, до 0,76 у мутанта), що сприяє каталітичній функції ферменту. Це спостереження збігається з даними про те, що мутант Leu10Ile виявляє більшу каталітичну ефективність, ніж нативна протеаза (Ohtaka et al., 2003). За допомогою конформаційного аналізу та карт різниць ДККМ показано, що мутант Leu90Met вносить певні пертурбації до димеризаційного домену протеази шляхом підвищення щільності локальної білкової упаковки. Вони суттєво не впливають на загальну конформацію протеази порівняно з нативною формою (СКВ С-б атомів кінцевої конформації мутанта Leu90Met відносно кінцевої конформації нативної протеази складає 1,97 Е). Однак, аналіз узгоджених рухів свідчить про те, що ця мутація збільшує залежність колективних рухів кінцевих амінокислот та каталітичної петлі від рухів б-спіралі, у кожній субодиниці окремо

Як наслідок, це приводить до часткової дестабілізації узгодженості рухів амінокислот цілого димеризаційного домену та переходу від структури з п'яти до структури з двох доменів (рис. 7в). З іншого боку, спостерігається посилення узгодженості рухів всередині нижньої та верхньої частин кожної субодиниці. У нативної протеази корельовані рухи амінокислот, що складають димеризаційний домен, чітко відокремлені від рухів корових доменів; узгодженість рухів всередині димеризаційного домену необхідна для стабільності димеру протеази. Ці дані повністю корелюють із спостереженнями, що кристалічна структура мутанта Leu90Met має мінорну різницю з нативним білком, але є менш стабільною та менш активною, ніж нативна протеаза.

3.2. МД потрійного мутанта Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu протеази ВІЛ-1. Завдяки збільшенню об'єму бокових ланцюгів залишків 71 та 73 у потрійному мутанті Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu відбувається посилення ван-дер-ваальсових контактів між амінокислотами корових доменів. Окрім того, гідроксильна група мутантного залишку Ser73 утворює новий водневий зв'язок із гідроксильною групою залишку Thr31, що посилює міждоменні взаємодії корових доменів. Показано, що зменшення вільного об'єму у нижній частині корового домену (внаслідок мутації Ala71Val) призводить до зменшення гнучкості інтерфейсу між коровими та димеризаційним доменами та порушення узгодженого руху корових доменів, яке необхідне для колективного руху на відкриття флепів, що має місце у випадку нативної протеази

Аналіз карт різниць КР-ДККМ свідчить, що відбувається збільшення залежності рухів всередині корових доменів протеази ВІЛ-1, особливо між амінокислотами різних субодиниць (рис. 8а,б). Цей ефект спостерігається завдяки утворенню тісного ван-дер-ваальсового контакту мутантного Leu93 з Phe99' з протилежної субодиниці. Таким чином, потрійний мутант Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu стабілізує закриту конформацію через зменшення гнучкості між коровими та димеризаційним доменами, а також збільшення стабільності самого димеризаційного домену.

3.3. МД мутанта Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys протеази ВІЛ-1. Мутації флепового домену мають, в основному, полярний характер (Glu35Gln, Ser37Asp і Arg57Lys) , і відповідні залишки експоновані до розчинника. Показано, що характер рухів даного мутанта несуттєво відрізняється від рухів нативної протеази. Поведінка та конформаційний простір мутантних амінокислот є подібними до відповідних залишків нативної протеази. Аналіз корельованих рухів мутанта Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys протеази ВІЛ-1 свідчить, що основні корельовані рухи збігаються з такими нативної протеази.

Це також підтверджується картами КР-ДККМ, що засвідчують високу подібність МД нативної протеази та мутанта Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys. Отже, суттєвий вплив мутацій в Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys на зміни конформаційної рухливості протеази методом МД встановити не вдалося . Цей факт може бути пояснений тим, що всі ці мутації знаходяться у високорухливому домені протеази ВІЛ-1 та експоновані до розчинника. Беручи до уваги той факт, що мутантні амінокислотні залишки мають схожі фізико-хімічні властивості, можна припустити, що сукупний ефект таких мутацій або є несуттєвим і виявляється лише у комбінаціях з мутаціями в інших доменах, або може виявитися при довших часових інтервалах МД.

ВИСНОВКИ

Методом МД проведено систематичне вивчення впливу дистальних мутацій протеази ВІЛ-1 на її конформаційну рухливість і проведено порівняння з нативним ферментом. Показано, що механізми впливу дистальних мутацій на просторову структуру та МД протеази ВІЛ-1 можна поділити на стабілізуючі (мутанти Leu10Ile та Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu) та дестабілізуючі (мутант Leu90Met).

1. Вперше обґрунтовано і доведено, що конформаційна стабільність димеру протеази ВІЛ-1 критично залежить від стану протонування каталітичної діади Asp25/Аsp25'.

2. Розроблено та застосовано універсальний алгоритм розрахунку параметра впорядкування амідних зв'язків пептидних груп, S2, з даних МД для порівняльного аналізу з експериментальними даними ЯМР. Проведений порівняльний аналіз свідчить про кореляцію даних МД та експериментальних даних ЯМР для протеази ВІЛ-1.

3. Виявлено існування двох механізмів впливу дистальних мутацій амінокислотних залишків на зміну конформаційної рухливості протеази ВІЛ-1 - через перерозподіл амплітуди узгоджених рухів та через зміну доступних конформаційних рухів. Одночасне співіснування цих двох механізмів пояснює роль дистальних мутацій у профілі резистентності до інгібіторів протеази ВІЛ-1.

4. Розроблено універсальний алгоритм порівняння колективних конформаційних рухів двох білків шляхом побудови карт різниць динамічних крос-кореляційних матриць (КР-ДККМ), які ґрунтуються на розрахунках їхньої МД.

5. Отримані методом МД дані про вплив дистальних мутацій на просторову структуру та динаміку протеази ВІЛ-1 можуть бути використані для розробки інгібіторів протеази ВІЛ-1 нового покоління, активних як до нативної протеази, так і до мутантів, резистентних до інгібіторів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ковальский Д.Б., Корнелюк А.И. Конформационные изменения ВИЧ-1 протеазы в области „флэпов”: изучение методом молекулярной динамики в пико- и наносекундном временных интервалах// Біополімери і клітина.-- 2002. - Т.18, № 2.-- С.117-123.

Особистий внесок здобувача - автором проведено вибір та підготовку структури протеази ВІЛ-1 для розрахунку МД. Підбір параметрів МД у вакуумі, проведення розрахунків МД, аналіз результатів.

2. Ковальский Д.Б., Каниболоцкий Д.С., Дубина В.Н., Корнелюк А.И. Конформационные изменения ВИЧ-1 протеиназы: влияние протонированности активного центра на конформацию ВИЧ-1 протеиназы в воде// Український біохімічний журнал. - 2002. - Т.74, № 6. - С. 100-103.

Особистий внесок здобувача - підготовка системи до розрахунку (конвертація, мінімізація енергії системи сольватація, проведення МД для врівноваження ВІЛ-1 у водному розчині), проведення розрахунку МД, аналіз даних.

3. Ковальский Д.Б., Иванова О. С., Дубина В. Н., Каниболоцкий Д. С., Корнелюк А. И. Обобщенный параметр упорядочения S2 для связи N-H пептидной группы как мера конформационной подвижности белка: сравнение алгоритмов расчета S2 из данных симуляции молекулярной динамики// Український біохімічний журнал. - 2004. - Т.76, № 2. - С. 128-132.

Особистий внесок здобувача - підготовка системи до розрахунку та проведення розрахунку МД, планування програми по розрахунку S2, порівняння даних МД з даними ЯМР.

4. Ковальский Д.Б., Дубина В. Н., Корнелюк А. И. Исследование влияния консервативной мутации Leu10Ile на внутримолекулярную подвижность ВИЧ-1 протеазы методом молекулярной динамики// Біополімери і клітина.-- 2004. - Т.20, № 4.-- С. 321-324.

Особистий внесок здобувача - підготовка системи до розрахунку та проведення розрахунку МД, моделювання мутантів, розробка карт різниць, аналіз даних.

5. Kovalskyy D.B., Dubyna V.М., Mark A.E., Kornelyuk A.I. A molecular dynamics study of the structural stability of HIV-1 protease under physiological conditions: The role of Na+ ions in stabilizing the active site// Proteins. - 2005. - Vol. 58, №2. - P. 450-458.

Особистий внесок здобувача - підготовка системи до розрахунку та проведення розрахунку МД, проведення розрахунків методом ab initio, розрахунок параметра S2, порівняння МД при нейтральному та слабокислому рН.

6. Kovalskyy D.B., Kornelyuk A.I. Molecular dynamic simulation of HIV-1 protease and its drug resistant mutants// Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Abstract book. - Kyiv (Ukraine). - 2001. - P. 48.

Особистий внесок здобувача - автором проведено вибір та підготовку структури протеази ВІЛ-1 та відповідних мутантів для розрахунку МД. Підбір параметрів МД у розчині, проведення розрахунків МД, аналіз результатів.

7. Ковальський Д.Б., Дубина В.М., Каніболотський Д. С., Корнелюк О.І. Комп'ютерне моделювання конформаційних станів протеази вірусу імунодефіциту людини методом молекулярної динаміки// Тези доповідей ІІІ з'їзду Українського біофізичного товариства. - Львів (Україна). - 2002. - C. 167.

Особистий внесок здобувача - підготовка системи до розрахунку та проведення розрахунку МД, аналіз корельованих рухів протеази ВІЛ-1.

8. Kovalskyy D.B., Dubyna V.М., Mark A.E. and Kornelyuk A.I. A molecular dynamics study of the effect of distal drug resistant mutations on HIV-1 protease dynamics// Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Abstract book. - Kyiv (Ukraine). - 2003. - P. 88.

Особистий внесок здобувача - все планування та проведення розрахунку МД, моделювання мутантів, порівняння корельованих рухів мутантів з нативною протеазою.

9. Ковальський Д.Б., Дубина В.М., Корнелюк О.І. Вивчення впливу дистальних мутацій Leu10Ile/Leu90Met та Ala71Val/Gly3Ser/Leu93Ile на конформаційну рухливість ВІЛ-1 протеази методом молекулярної динаміки// Тези доповідей І Української наукової конференції „Проблеми біологічної та медичної фізики” ПБМФ-2004. - Харків (Україна). - 2004. - С. 79.

Особистий внесок здобувача - все планування та проведення розрахунку МД, моделювання мутантів, аналіз змін конформаційного простору узгоджених рухів до і після мутацій.

10. Dubyna V.М., Kovalskyy D.B., Ivanova O.S. and Kornelyuk A.I. The improvement of the algorithm for S2 order parameter calculation from molecular dynamics simulation using the correlation motion function// The 5th International Conference on Biological Physics (ICBP-2004), Abstract book.-Gothenburg (Sweden). - 2004. - P. 141.

Особистий внесок здобувача - проведення розрахунку МД, корекція методики розрахунку S2.

АНОТАЦІЯ

Ковальський Д.Б. Вплив дистальних мутацій на конформаційну рухливість ВІЛ-1 протеази: дослідження методом молекулярної динаміки. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2005.

Проведено розрахунки МД нативної протеази з метою повніше вивчити конформаційну рухливість нативного білка. Отримані результати МД порівнювали з даними ЯМР. Показано, що за фізіологічних умов іон Na+ вбудовується до каталітичної діади, що суттєво стабілізує просторову структуру димеру протеази. Проведено розрахунок МД чотирьох мутантів: Leu10Ile, Leu90Met, Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu и Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys. Показано, що мутант Leu10Ile стабілізує закриту конформацію протеази шляхом зменшення гнучкості сусідньої N-кінцевої петлі. Мутант Leu90Met змінює пакування амінокислотних залишків у димеризаційному домені, що призводить до зменшення доступного конформаційного простору протеази. Доведено, що потрійний мутант Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu негативно впливає на взаємну рухливість доменів, що призводить до стабілізації закритої конформації протеази ВІЛ-1. У мутанта Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys не виявлено суттєвих змін просторової конформації протеази ВІЛ-1 та її колективних рухів у процесі МД.

Ключові слова: молекулярна динаміка, протеаза ВІЛ-1, резистентні мутанти, колективні рухи, узагальнений параметр впорядкування S2, ЯМР.

АННОТАЦИЯ

Ковальский Д.Б. Влияние дистальных мутаций на конформационную подвижность ВИЧ-1 протеазы: исследование методом молекулярной динамики - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2005.

Проведены расчеты МД с целью наиболее подробно изучить конформационную подвижность нативного белка. Полученные данные МД сравнивалась с данными ЯМР. Показано, что при физиологических условиях ион Na+ встраивается к каталитической диаде, что существенно стабилизирует пространственную структуру димера протеазы. Проведен расчет МД четырёх мутантов: Leu10Ile, Leu90Met, Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu и Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys. Показано, что мутант Leu10Ile стабилизирует закрытую конформацию протеазы путем уменьшения локальной гибкости соседней N-концевой петли. Мутация Leu90Met приводит к переупаковке аминокислот димеризационного домена, что существенно уменьшает доступное конформационное пространство. Показано, что тройной мутант Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu негативно влияет на подвижность доменов относительно друг друга, что приводит к стабилизации закрытой конформации белка. У мутанта Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys не обнаружено существенного влияния на пространственную конформацию протеазы ВИЧ-1 и ее коллективных движений в процессе МД.

Ключевые слова: молекулярная динамика, коллективные движения, обобщенного параметра упорядочения S2, резистентные мутанты, протеаза ВИЧ-1, ЯМР.

SUMMARY

Kovalskyy D. B. Effect of Distal Mutations of Conformational Behavior of HIV-1 Protease: Molecular Dynamics Simulations Study. - Manuscript.

Thesis for Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.03 -Molecular Biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of Ukrainian National Academy of Sciences, Kyiv, 2005.

Drug resistant mutations within HIV-1 protease structure are the main obstacle on the way of successful patients recovery treated with HIV1- protease inhibitors. Numerous studies revealed the existence of active site and distal drug resistant mutations of HIV-1 protease. Effect of active site mutations could be readily understood from the spatial structure of the enzyme and its interaction mode with inhibitors. In turn, impact of distal mutations on atomic level is not so apparent: X-ray structures of such mutants a very similar to the native one and the observed deviation could not be attributed to a particular distal mutation. Dissertation is devoted to the theoretical investigation of the effect of point and multiple distal mutations on the conformational flexibility of the HIV-1 protease. Molecular Dynamics (MD) simulation technique was chosen as relevant and efficient tool.

The goal assumes extensive comparison of data from Molecular Dynamics (MD) simulations runs of mutants with corresponding data of the native protease as a reference. For this purpose an extensive investigation of conformational behavior of native HIV-1 protease as a function of simulation conditions was performed using MD simulation technique. MD of the native HIV-1 protease under weak acidic and physiological conditions was computed. Comparative analysis of these two runs reveals that Na+ ions binds to deprotonated catalytic dyad shielding repulsion of negatively charged carboxylic groups. It serves as a substitutor of the proton and stabilize the dimmer structure under physiological conditions. Therefore, salt (i.e. Na+ and Cl-- ions) must be included into the simulated system under physiological in order to obtain stable conformational behavior of the enzyme.

In order to compare results of the MD simulations results with available NMR data a program to compute generalized order parameter S2 was developed. A good agreement of S2 computed from MD simulations and NMR derived data suggests correctness of the selected simulation protocol.

A general approach “difference map of dynamic cross correlation matrixes” (DM-DCCM) for correlated motions was developed in order to compare Molecular Dynamics of two systems through the analysis of their collective motion (Essential dynamics, ED) changes. According to the approach the DCCM maps are constructed for two systems to be compared based on the ED analysis. Due to the contribution to overall global motions only first 4 eigenvectors are considered. The evaluation of the difference between the reference and mutant DCCMs results in DM-DCCM. A coefficient of identity is estimated which indicates the ratio of difference between correlated motions of two proteins. The general procedure is further applied to study effects of single or multiple drug resistant distal mutations on MD of HIV-1 protease.

The following mutants were selected in this study: Leu10Ile, Leu90Met, Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu and Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys.

Leu10Ile mutant largely effects conformational dynamics comparing to native protease by stabilizing the closed conformation of the HIV-1 protease. The effect is mediated by the decrease of flexibility of adjacent residue Pro9. For the native protease we have shown that conformational transition of the Pro9 facilitates curling outward of the N-terminal loop that, in turn, is strongly correlated with global flap opening motions. Therefore inability to flip out of the Pro9 immediately results in inability to open the flap of the protease spontaneously. From the dynamical point of view in the Leu10Ile mutant the redistribution of the amplitude of correlated motions occurs. Largest eigenvector appears to be catalytic assisted motion over the flap opening motion in the native protease. This results coincides with the observation that the mutant Leu10Ile is more enzymatically effective than the native protease.

Mutation at position 90 to methionine led to redistribution in the local packing density of the dimerization domain. Leu90Met mutant is shown to have small effect on changes of snapshot conformations. However, it effects the correlated motions by disturbing the flexibility of catalytic loop residues in the dimerization interface of the protease. Essential dynamics analysis reveal decreased coupling of amino acid residues within dimerization domain that led to fewer interaction between two subunits. Such destabilization mistunes correlated motion of the entire HIV-1 protease. The last that may impact on decreased protein stability observed in experimental studies.

Triple mutant Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu has larger van der Waals contacts of the dimerization domain with core domains than in native form of the enzyme. Increased volume of the residue 71 fills the space required for the flap opening event. As shown with DM-DCCM changes occur in correlated motions of the dimerization domain also. Shape of Leu93 sidechain allows better interaction with Phe99' from the opposite subunit. This increases dependency of the motion of core and dimerization domains. As results these mutation solidify closed conformation of the protease similar the effect to Leu10Ile mutant. Also the increase in amplitude of the catalytic assisted motion is observed.

Quaternary mutant Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys did not expressed any distinct effect on HIV-1 protease molecular dynamics. Theoverall conformational analysis as well as DM-DCCM suggest almost identical behavior of the mutant comparing the the reference native dynamics. The observation is rationalized by the facts that these mutations are conservative solvent exposed and situated on the flexible loops of HIV-1 protease.

Keywords: molecular dynamics, correlated motions, HIV-1 protease, drug-resistant mutations, generalized order parameter S2, DM-DCCM algorithm, NMR.

Размещено на Allbest.ru

...