Морфо-функціональний стан яйцеклітини і зиготи в процесі їх розвитку у деяких квіткових рослин

Размещено на http://allbest.ru

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

03.00.05. - Ботаніка

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Морфо-функціональний стан яйцеклітини і зиготи в процесі їх розвитку у деяких квіткових рослин

Кириленко Наталія Анатоліївна

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеському національному університеті ім. І. І. Мечникова Міністерства освіти і науки України, м. Одеса

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Бланковська Тамара Пилипівна,

Одеський національний університет

ім. І. І. Мечникова, професор кафедри генетики і молекулярної біології

Офіційні опоненти: член - кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Кордюм Єлизавета Львівна,

Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України,

завідувач відділом клітинної біології та анатомії рослин

доктор біологічних наук, професор

Паршикова Тетяна Вікторівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедрою фізіології та екології рослин

Провідна установа: Ужгородський національний університет

Захист відбудеться „_27” вересня 2005 р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, Київ - 33, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розіслано “16_”_червня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О.В. Молчанець

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Робота присвячена цитометричному дослідженню розвитку яйцеклітини та зиготи у видів Triticum durum L., Triticum aestivum L., Secale sereale L. та Helianthus annuus L. Це викликано тим, що незважаючи на велику кількість публікацій [Васильев, Плиско, 1971; Герасимова - Навашина, Гуляев, 1971; Плющ, 1986; Батыгина, 2002] деякі сторони морфології та функціонування цих клітин залишаються невивченими, а численні вже відомі факти - непоясненими.

Дослідження репродуктивної біології рослин, зокрема різних аспектів морфогенезу генеративних органів і ембріологічних процесів, є одним з важливих напрямків сучасної ботанічної науки. Вони мають вагоме значення для створення теорії індивідуального розвитку та вирішення дискусійних проблем філогенії і систематики рослин, прикладних завдань генетично-селекційних робіт.

Вивчення морфо-функціональних особливостей генеративних структур актуально. Саме фаза зиготи є критичною, такою, на якій, з одного боку, закріплюється жорстка детермінація шляху розвитку зародка, а з іншого, за впливу сукупності несприятливих умов саме на цій фазі відбувається блокування розвитку. Зигота є самою невивченою і складною фазою ембріогенезу. Так, характер змін у розмірах зиготи в період її дозрівання (збільшення або зменшення) для різних видів не однаковий і не є універсальним. Ймовірніше всього, здатність зиготи змінюватись в об'ємі у порівняні зі зрілою яйцеклітиною є видоспецифічною рисою. І, якщо для деяких ембріональних структур (антиподи, синергіди і т. д.) виявленні особливості їх становлення і еволюції [Renzaglia, Jonson, Gates, 2001], то для зиготи такі дані відсутні. Суперечливими є також дані щодо зміни розмірів зиготи, а для більшості представників рослинного світу невідомі зовсім. Недостатня вивченість цього питання свідчить про необхідність подальших цитометричних досліджень. Успіхи таких досліджень у великій мірі залежать від збільшення кількості об'єктів, знання онтогенезу та філогенетичних взаємовідносин поміж різними таксонами рослин.

На сучасному етапі розвитку ботанічної науки внаслідок багатьох фундаментальних досліджень, проведених останнім часом [Барна, 2002; Кордюм, 2003], було з'ясовано, що становлення того чи іншого виду рослинного організму, формування його конституції значною мірою визначається закономірностями та особливостями репродуктивної біології.

В.П. Баннікова та ін. [1978], які намагалися пов`язати морфологічні та цитохімічні особливості клітин зародкового мішка з інтенсивністю метаболізму, відмічають, що труднощі в цьому питанні пов`язані з недостатньою вивченістю зародкових мішків на різних стадіях їх розвитку та з різницею у структурі функціонально однакових клітин різних видів. Що стосується злаків, то для них такі дослідження тільки-но розпочаті [Бланковська, 1984, 1986, 1988, 1992, 2002]. Те ж саме можна сказати і про складноцвіті.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі генетики й молекулярної біології Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова і є складовою частиною державної бюджетної теми “Морфо-функціональні аспекти розвитку генеративних структур деяких покритонасінних” (номер реєстрації ОНУ 196, номер держреєстрації 0100 U005405).

Мета та задачі досліджень. Мета роботи - дослідити закономірності зміни об'ємів клітини, ядра і ядерця та їх співвідношень за розвитку яйцеклітини і зиготи у представників родин злакових і складноцвітих та установити структурно-функціональні особливості цих клітин на підставі морфометричних показників.

У зв`язку з наміченою метою були поставлені такі задачі:

1. Вивчити морфологічні особливості процесу запліднення у T. durum, T. aestivum, S. sereale та H. annuus на послідовних стадіях проходження цього процесу;

2. Визначити об'єми клітин, їх ядер та ядерець, величину ядерно-ядерцевого (ЯЯС) і ядерно-цитоплазматичного (ЯЦС) співвідношень та дослідити динаміку цих показників за розвитку яйцеклітини і зиготи у даних видів; яйцеклітина зигота квітковий рослина

3. Виявити характер змін морфометричних параметрів, ступінь накопичення нуклеїнових кислот і білка та особливості структурного стану хроматину в ядрах цих клітин;

4. Розробити критерії непрямої оцінки функціональної активності клітини, використовуючи інтенсивність цитохімічних реакцій, об'єм клітин, їх ядер та ядерець, а також величину співвідношень - ЯЯС та ЯЦС.

Предметом дослідження є морфометричні (зміна розмірів) параметри та функціональні особливості яйцеклітини і зиготи T. durum, T. aestivum, S. sereale та H. annuus, як початкового етапу розвитку рослинного організму.

Об'єктом дослідження є яйцеклітина і зигота T. durum, T. aestivum, S. sereale та H. annuus, як представників найбільш еволюційно розвинутих родин одно- і дводольних рослин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено морфометричне дослідження яйцеклітини і зиготи у представників родини злакових і складноцвітих. Визначення об`ємів клітин, їх ядер і ядерець дозволило виявити коливальний характер (біоритми) змін розмірів зиготи. Визначення співвідношень об'ємів ядра і цитоплазми та ядра і ядерець, а також проведення цитохімічних реакцій дало можливість скласти морфо-функціональну характеристику яйцеклітини і зиготи у різні періоди їх дозрівання.

Вперше виявлено взаємозв'язок між тривалістю періоду дозрівання зиготи і періодом коливання величини об'єму клітини, ядра та ядерця (ритмом змін).

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження поповнили перелік видів, для яких є дані про зміни розмірів зиготи під час її дозрівання. Вони є внеском в ембріологію T. durum, T. aestivum, S. sereale та H. annuus і в загальну ембріологію квіткових рослин, зокрема в еволюційну ембріологію.

Дані про ритми зміни об`єму зиготи, її ядра та ядерець у порівнянні з яйцеклітиною у видів, які вивчались, будуть сприяти розвитку уявлень про хронобіологічну норму та виявленню відхилень від неї.

Характеристики функціонального стану яйцеклітини і зиготи, які складені на основі цитохімічних та морфометричних досліджень, місце і час відкладення запасних речовин або їх відсутність, можуть бути використані в селекційно-генетичних роботах, зокрема при аналізі відхилень від нормального розвитку гібридів та мутантів. Це дозволить вести оцінку вихідного матеріалу на ранніх етапах селекційного процесу.

Одержані дані також використовуються при читанні лекцій із загальних курсів “Анатомії та фізіології рослин”, зі спецкурсу “Біологія індивідуального розвитку”, зокрема у розділі “Ембріологія рослин” в Одеському національному університеті.

Особистий внесок здобувача. Дисертанткою самостійно проведені: пошук та оцінка літературних джерел, виготовлення постійних мікротомних препаратів, морфометричні та цитохімічні дослідження, аналіз отриманих даних. За допомогою наукового керівника визначені задачі дослідження та методи їх вирішення. Автором проведена інтерпретація та узагальнення отриманих даних, сформульовані висновки.

Апробація результатів дослідження. Результати досліджень, викладені в дисертації, були представлені на Всеукраїнській конференції „Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация” (Одеса, 2005 р.), Всеукраїнській конференції „Актуальные проблемы ботаники и экологии” (Одеса, 2003 р.), II Міжнародній конференції по анатомії та морфології рослин (Санкт-Петербург, 2002 р.), XI з'їзді Українського ботанічного товариства (Харків, 2001 р.), Всеукраїнській конференції молодих вчених “Актуальные вопросы современного естествознания” (Сімферополь, 2001 р.), Всеукраїнській конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Біорізноманіття природних та біотехногенних біотопів України” (Донецьк, 2001 р.), конференції молодих вчених - ботаніків України “Актуальні проблеми ботаніки та екології” (Чернігів - Седнів, 2000 р.) та на підсумковій конференції професорсько - викладацького складу і наукових працівників ОНУ (Одеса, 2000 р.)

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 робіт: 5 журнальних статей у фахових виданнях і 5 публікацій у матеріалах наукових конференцій та з'їзду Українського ботанічного товариства.

Об'єм та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 122 сторінках машинописного тексту, включає 13 таблиць, 23 рисунка, складається із 3 розділів, заключення та висновків. Список використаної літератури включає 260 джерел, із них 96 - іншомовних.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. Наведено дані літератури щодо будови зародкового мішка Polygonum-типу, його форми та розмірів, викладено існуючу інформацію про морфологію, ультраструктуру та функцію клітин зародкового мішка. Один із підрозділів присвячено процесу запліднення у квіткових рослин, а саме у злаків та складноцвітих. Особлива увага звертається на процес утворення зиготи як початкової фази онтогенезу, її структури і складу, зміни розмірів. На підставі викладених даних обґрунтовано вибір теми дисертаційної роботи, основні напрямки досліджень.

Загальна методика й основні методи. У розділі викладено інформацію про матеріали: зав'язі рослин озимої м'якої пшениці (T. aеstivum) сорту Безоста 1 та озимої твердої пшениці (T. durum) сорту Парус, озимого жита (S. cereale) сорту Харківське 60 та гібридів - (T. durum х T. aеstivum, T. durum х S. cereale), а також зав'язі соняшника (H. annuus) сорту Одеський 128; Описано загальну методику виконання експериментальної частини й конкретні методи, що були застосовані в роботі.

Підготовку суцвіття до запилення, кастрацію та штучне запилення проводили за загальноприйнятою методикою [Попова, Абрамова, 1968]. Проведена темпоральна фіксація зав`язей до запилення та через різні проміжки часу після штучного запилення. Так, зав'язі T. aеstivum, T. durum і S. cereale фіксували сумішшю Навашина та Чіаччіо на протязі доби через кожні дві години після запилення. Приймаючи до уваги неоднорідність і нерівномірність розвитку квіток у різних частинах колоса, у злаків запилювали і фіксували тільки нижні квітки колосків середньої частини головного колоса, коли пиляки були жовті. Контролем слугували зав'язі кастрованих незапилених квіток одного і того ж колосу. Для T. aеstivum, T. durum та S. cereale було досліджено по 200 зав'язей з 60 різних рослин.

Зав'язі H. annuus фіксували сумішшю Карнуа через кожні 15 хв. після штучного запилення на протязі 8 годин. Оскільки за великого об'єму досліджень доводилося фіксувати зав'язі з багатьох суцвіть, треба було мати впевненість про коректність зіставлення розмірів яйцеклітини і зиготи з різних суцвіть. У зв'язку з цим проводили додаткові дослідження з порівняння цитометричних показників яйцеклітини і зиготи в різних суцвіттях. Контролем у цьому випадку слугували зав'язі незапилених квіток того ж суцвіття, отже всі зав'язі були одного віку і знаходилися на однаковій відстані від центру. Як відомо, у суцвітті складноцвітих дозрівання квіток відбувається у радіальному напрямку, від периферії до центру кошика. Всього було досліджено 1000 зав'язей з 10 різних рослин.

Зафіксований за методом Навашина матеріал промивали у проточній воді, а за методом Карнуа - 70о спиртом. Для збезводнювання зав`язі проводили через серію спиртів, концентрація яких збільшувалась: 20о, 40о, 60о, 80о, 96о, абсолютний спирт [Роскин, Левинсон, 1957; Паушева, 1974].

Збезводнені зав`язі проводили через суміші толуолу з абсолютним спиртом, через толуол та просочували парафіном за загальноприйнятою методикою [Паушева, 1974].

Для різки на мікротомі готували парафінові блоки методом закапування. Зрізи товщиною 10-15 мкм отримували на санному мікротомі, наклеювали їх на предметні скельця розчином альбуміну, приготованого з білка курячого яйця.

Скельця зі зрізами залишали у термостаті при температурі 38о С на декілька діб для висушування, після чого депарафінували, поміщуючи у ксилол, ксилол видаляли шляхом заміщення його на 96 % спирт, останній видаляли промиваючи зрізи у воді.

Препарати забарвлювали із застосуванням цитохімічних реакцій:

на сумарні білки - з бромфеноловим синім за Мезіа [Паламарчук, Веселова, 1965];

на нуклеїнові кислоти - за Фьольгеном, а також з метиловим зеленим-піроніном за Треваном і Шарроком [Роскин, Левинсон, 1957];

на ліпіди - з суданом чорним Б за Мак-Манусом [Джапаридзе, 1953; Дженсен, 1965].

на полісахариди - ШИК - реакція за Шабадашем [Роскин, Левинсон, 1957].

Крім того застосовували морфологічне забарвлення гематоксиліном за Гейденгайном [Роскин, Левинсон, 1957].

Всього було виготовлено 1600 постійних препаратів.

Поряд з цитохімічними проводили і цитометричні дослідження зародкового мішка. Вимірювали діаметри клітини, ядер та ядерець (по 15 - 20 на кожний строк фіксування), а також обчислювали величини ядерно - ядерцевого та ядерно-цитоплазматичного співвідношень.

Отримані результати обробляли варіаційно-статистичними методами [Плохинский, 1980].

Результати досліджень та їх обговорення

Формування та дозрівання яйцеклітини. Злаки. По каріометричному вивченню зародкових мішків на ядерній фазі розвитку (ініціаль яйцеклітини) маємо замало даних [Банникова, 1986, Чоботар, 1972]. Наші дослідження показали, що у T. aеstivum та S. cereale різниця поміж ядрами в межах кожної полярної групи спостерігається вже у чотириядерному зародковому мішку, в середньому за розмірами халазальні ядра більші ніж мікропілярні, вони проявляють більш інтенсивну реакцію Фьольгена. Невеликі показники ядерно-ядерцевого співвідношення, інтенсивне забарвлення ядерець за реакцій на РНК та білки дозволяють зробити висновок, що в ценоцитних зародкових мішках злаків відбувається інтенсивний процес утворення рибосом, але внесок окремих ядер в цей процес різний.

Середні об'єми ядер і ядерець в яйцеклітинах сформованого зародкового мішка (незріла яйцеклітина) у T. aеstivum, T. durum та S. cereale розрізняються. Так, найменший об'єм ядра був у S. cereale, а найбільший - у T. durum. Ядро яйцеклітини в щойно сформованому зародковому мішку дає чітку реакцію Фьольгена і забарвлюється метиловим зеленим. Ця кількість ДНК, ймовірно, і забезпечує необхідний рівень метаболічної активності яйцеклітини.

У зрілому зародковому мішку, йому відповідає стадія зрілої яйцеклітини в момент запилення, об'єми ядер і ядерець відрізнялись між собою більше, ніж в сформованому. За дозрівання зародкового мішка інтенсивність реакції на ДНК зменшується; і в ядрі зрілої яйцеклітини вона майже непомітна. Таким чином, ступінь вияву ДНК знижується, досягаючи мінімуму в зрілому зародковому мішку.

Дослідження вмісту РНК і білків в цитоплазмі зрілої яйцеклітини показало, що у злаків їх кількість незначна. Зниження ступеню вияву нуклеїнових кислот і білку пов'язано зі зміною фізико-хімічного стану нуклеопротеїдів, що робить їх недоступними для цитохімічних реакцій. Тенденція до зменшення вияву найважливіших біополімерів свідчить про зміну метаболічних процесів.

Об'єм ядерця в процесі формування та дозрівання яйцеклітини у злаків змінювався майже відповідно об'єму ядра. Невелика величина ЯЯС в яйцеклітинах сформованого зародкового мішка свідчить про їх високу фізіологічну активність. Величина ЯЯС в яйцеклітинах зрілого зародкового мішка була теж порівняно невеликою. Звідси витікає, що фізіологічна активність в цих клітинах в ході дозрівання зародкового мішка залишалась високою.

Таким чином, отримані результати можуть слугувати основою для висновків про метаболічний стан зрілої яйцеклітини. Дійсно, синтетичні процеси в яйцеклітині менш різноманітні, ніж в інших клітинах зародкового мішка, в той же час вона не являється клітиною в стані „спокою”, так як в ній протікають процеси, які готують її подальшу диференціацію. В ході життєдіяльності яйцеклітини акумулюються запасні речовини, іншими словами, створюється система енергозабезпечення для активних синтетичних процесів після запліднення.

H. annuus. Вивчення постійних мікротомних препаратів насінних зачатків H. annuus до цвітіння [Кириленко, 2002, Кириленко, Давиденко, 2002] показало, що об'єм яйцеклітини інтенсивно збільшується. При цьому кожній стадії дозрівання останньої відповідають певні значення морфометричних характеристик. Так, за 3 - 4 доби (незріла яйцеклітина) цей об'єм був удвічі меншим за об'єм зрілої яйцеклітини в день цвітіння. А за 24 години - він майже досягав об'єму зрілої яйцеклітини в день цвітіння. Розмір клітини початково визначає кількісні особливості ходу її розвитку.

Об'єм ядра яйцеклітини збільшувався рівномірно, приблизно на 400 мкм3 на добу і досягав максимуму напередодні дня цвітіння. Провівши виміри ядерець яйцеклітини H. annuus за дозрівання зародкових мішків виявили, що їх об'єми теж рівномірно зростають на 7 - 9 мкм3 за добу. У щойно сформованому зародковому мішку величина ЯЯС була нижча, ніж у зрілому, що свідчить про більш високу фізіологічну активність клітин першого.

За морфометричних досліджень зав'язей H. annuus, які були зафіксовані в різні часові терміни, а також взяті із різних суцвіть в день цвітіння але до запилення, не спостерігали значних коливань розмірів зрілої яйцеклітини, її ядра та ядерця. Виходячи з відомої ролі ядерця в створені білок-синтезуючої активності клітини, можна припустити, що відсутність збільшення його розмірів свідчить про те, що за дозрівання яйцеклітини не відбувається активації загального метаболізму. Таку активність можна інтерпретувати по різному. На ранніх етапах онтогенезу метаболічна активність може бути спрямована на формування і розвиток в клітині основних компонентів цитоплазми. При відсутності різниць об'ємів ядра і ядерця яйцеклітини в межах одного суцвіття наявність коливань величини ЯЯС свідчить про більшу чутливість цього показника. Показник ЯЦС змінюється залежно від фази розвитку клітини, ступеню її диференціації та функціонального стану. Таким чином, в результаті функціональної спеціалізації яйцеклітини відбувається детермінація зміни внутрішньоклітинного метаболізму. Вузловим моментом є запліднення, яке призводить до перебудови цього процесу.

Запліднення у T. aеstivum, T. durum, S. cereale та H. annuus. Вивчення постійних мікротомних препаратів показало, що у видів, які вивчались, ядро яйцеклітини у щойно сформованому зародковому мішку дає чітку реакцію Фьольгена і забарвлюється метиловим зеленим. За дозрівання зародкового мішка інтенсивність реакції на ДНК зменшується; і в ядрі зрілої яйцеклітини вона майже не помітна. Така ж динаміка інтенсивності реакції Фьольгена спостерігається і у H. annuus з тією різницею, що в яйцеклітині зрілого зародкового мішка вона майже негативна.

Через 1 годину після штучного запилення у злаків вміст пилкової трубки уже знаходиться у зародковому мішку. При цьому в більшості препаратів була зруйнована одна синергіда. Таким чином, наші дослідження підтверджують дані Т.Б. Батигіної [1974, 1987], О.А. Хвединіч та ін. [1978] про те, що у злаків пилкова трубка проникає в зародковий мішок, як правило, через синергіду.

На деяких препаратах зустрічались зародкові мішки, в які проникли пилкові трубки, але обидві синергіди лишались незруйнованими. Це свідчить, що пилкова трубка проникає в щілину поміж яйцевим апаратом і центральною клітиною, пройшовши поміж синергідами та яйцеклітиною.

В наших дослідженнях у T. aеstivum, T. durum і S. cereale через 1,5 години після запилення спермій уже потрапив в одне із полярних ядер центральної клітини. В цей час другий спермій знаходиться ще в цитоплазмі яйцеклітини. Причому, у T. aеstivum і T. durum він розташовується на більшій відстані від ядра, ніж у S. cereale. В цей період яйцеклітина характеризується Фьольген - позитивною реакцією ядра, що свідчить про часткову конденсацію хроматину, основна маса якого дифузно розташовується по всьому ядрі або біля його оболонки у вигляді еухроматинових ниток та невеликої кількості гетерохроматинових гранул.

Через 2 години після запилення спермій уже знаходиться в ядрі яйцеклітини, де починається його часткова деспіралізація. Через 4 години після запилення спермій продовжує розрихлюватися, тому менш інтенсивно забарвлюється за Фьольгеном. Через 6 годин після запилення відбувається майже повна деконденсація хроматину спермію в ядрі яйцеклітини. В цей час з'являється ядерце, частіше - два, що співпадає з даними інших дослідників [Банникова, 1986 та ін.], які спостерігали процес запліднення у злаків. Хроматизація ядра яйцеклітини не змінюється. У T. durum, S. cereale та гібриду T. durum х S. cereale сингамія закінчується через 6 годин після штучного запилення, а у T. aеstivum - через 8 годин. Після цього наступає період дозрівання або “спокою” зиготи. Стадія “спокою” продовжується 10-12 годин. Таким чином, через 18 годин після штучного запилення зигота. T. aеstivum, S. cereale та гібриду T. durum х S. cereale починає поділ. У T. durum зигота вступає в фазу “спокою” раніше ніж у T. aеstivum, тому початок поділу зиготи у неї наступає через 16 годин після запилення. Через такий же термін часу ділиться і гібридна зигота T. durum х T. aеstivum. Час дозрівання зиготи у різних видів варіює і залежить не тільки від погодних умов, але й від часу та способу запилення [Чабан, 1975; Поддубная - Арнольди, 1976]. В зиготі після об'єднання хроматину яйцеклітини і хроматину спермію реакція Фьольгена посилюється; хроматин забарвлюється також метиловим зеленим.

У H. annuus через 45 хвилин після запилення вміст пилкової трубки потрапляє в зародковий мішок. Через 3 - 3,5 години спермій вже повністю деконденсувався в ядрі яйцеклітини, в ньому утворилося додаткове ядерце. А в центральній клітині спостерігається рання профаза.

Спермії, в протилежність ядру яйцеклітини і центральної клітини, дають чітку реакцію на ДНК. При деконденсації хроматину сперміїв в ядрах цих клітин зародкового мішка його ДНК спермію переходить в низькополімерний стан: спермій дає реакцію Фьольгена, але не забарвлюється метиловим зеленим. Перші два ядра ендосперму майже не дають позитивної реакції Фьольгена на ДНК. Їх великі ядерця дають інтенсивну реакцію на РНК.

За інтенсивністю реакції на РНК і білки структурні компоненти яйцеклітини ізлаків, і соняшника розрізняються. Вона найбільша в ядерці, дещо менша в ядрі; цитоплазма забарвлюється бромфеноловим синім і піроніном нерівномірно - найбільш інтенсивно навколо ядра. В зиготі реакція на РНК і білки інтенсивніша, ніж в яйцеклітині. На ранніх етапах процесу запліднення в ядрі яйцеклітини спостерігається зменшення кількості РНК, що пов'язано з виходом її в цитоплазму. Синтез РНК в ядрі яйцеклітини починається на більш пізніх етапах запліднення, коли хроматин спермію уже значно деконденсувався. Це відбувається поступово, тому в кінці процесу запліднення кількість РНК помітно збільшується.

Через 5 - 6 годин зигота ще в мітотичному спокої, в зародковому мішку є 2 - 8 ядер ендосперму. В цей час ядра ендосперму дають чітку реакцію Фьольгена на ДНК. Поділ зиготи відбувається через 8 годин після штучного запилення.

Реакція на полісахариди виявила наявність крохмальних зерен в цитоплазмі яйцеклітин злаків. Вони локалізуються навколо ядра. В зиготі більшість крохмальних зерен розміщена в цитоплазмі мікропілярної частини клітини. У H. annuus і в яйцеклітині, і в зиготі крохмаль відсутній. Ліпідні краплі виявлено в яйцеклітинах усіх досліджуваних видів. За розмірами вони дрібні, набагато менші, ніж в центральній клітині. В зиготі ліпідних крапель більше і вони крупніші, ніж в яйцеклітині. Щодо запасних речовин, то в яйцеклітині і зиготі злаків запасними речовинами є, головним чином, крохмаль, а у H. annuus - ліпіди, більш енергетично багаті.

Середні об`єми клітини, ядра і ядерця в ході дозрівання зиготи. Злаки. Визначення об`ємів клітини, ядра і ядерця на різних етапах дозрівання зиготи порівнювали з відповідними показниками незаплідненої яйцеклітини, умовно прийнятими за 100 %. Як видно з наведених у табл. 1 даних, по закінченню сингамії (6 годин після запилення) об`єм зиготи T. durum був майже вдвічі більшим за об`єм незаплідненої яйцеклітини. Слід зазначити, що на протязі всього періоду дозрівання зиготи її об`єм був достовірно більшим за об`єм яйцеклітини. Спочатку (до 10 години після запилення) він плавно збільшувався, потім зменшувався і знову збільшувався.

У T. aеstivum зміни об`єму зиготи більш виражені, ніж у T. durum. Наприкінці сингамії (8 годин після запилення) зигота у неї більша за яйцеклітину (Р 0,01), а через 10 і 16 годин після запилення менша (Р 0,05 і Р 0,001 відповідно).

Протягом усього періоду дозрівання (окрім 6 години після запилення) об`єм зиготи S. cereale був більшим за об`єм незаплідненої яйцеклітини. Спочатку (до 8 години після запилення) її об'єм збільшувався, потім зменшувався (10 година після запилення) і знову збільшувався (12, 14 години), і так ще двічі (зменшення об'єму - 16 година, збільшення - 18 година).

Таблиця 1

Середній об`єм (мкм3) клітини в ході дозрівання зиготи і процентне співвідношення її до об'єму незаплідненої яйцеклітини у T. durum, T. aеstivum та S. cereale (M m, n = 15-20)

Годин після запилення	Види
	T. durum	T. aеstivum	S. cereale
	М m	%	М m	%	М m	%
0 (яйцеклі- тина)	124631280	100	33390812	100	6369326	100
2	-	-	302472555	91	-	-
4	-	-	276483915	83	-	-
6	238801596***	192	341271608	102	7255650	114
8	252831697***	203	444403281**	133	112921244**	177
10	267161979***	214	289522106*	87	102491366*	160
12	214851935**	172	302161817	90	157071239***	247
14	282971302**	227	378634502	113	172591015***	271
16	253842513***	204	28079908***	84	11915687***	187
18	-	-	314821561	94	156972455***	246

Примітка. *- Р 0,05; ** - Р 0,01; *** - Р 0,001

Наші дослідження показали, що у T. durum зміни об'єму ядра зиготи відбувалися подібно змінам об'єму клітини (табл. 2). Так, по закінченню сингамії він був більшим, ніж у яйцеклітини і залишався таким, перевищуючи об'єм ядра яйцеклітини з різним ступенем вірогідності. Об'єм ядра зиготи T. aеstivum був більшим за об'єм ядра яйцеклітини (табл. 2) через 8, 14 і 18 годин після запилення (Р 0,01). Зміни відбувалися і з об'ємом ядра зиготи у S. cereale (табл. 2): збільшення розмірів до 8 години після запилення, пізніше (10 година) зменшення та знову збільшення (12, 14, 16 та 18 години).

Таблиця 3

Середній об'єм ядерця (мкм3) в ході дозрівання зиготи у T. durum

(M m, n = 15-20)

Годин після запилення	Ядерце
	яйцеклітини	спермію	сумарне
	М±m	М±m	М±m	%
0 (яйцеклітина)	145±6	-	145±6	100
6	163±6	39±1	202±7***	139
8	149±7	42±2	191±8***	132
10	170±14	39±2	209±13***	144
12	152±9	50±6	202±13***	139
14	176±7**	60±2	236±7***	163
16	185±9**	57±6	242±9***	167

Примітка. ** - Р ? 0,01; *** - Р ? 0,001

Так, ядерце яйцеклітини в зиготі T. durum поступово збільшувалось (табл. 3). Різниця об'ємів ядерець незаплідненої яйцеклітини і зиготи стає достовірною тільки під кінець дозрівання останньої. Об'єм ядерця спермію і сумарний об'єм ядерець зиготи теж значно збільшуються перед її поділом. Об'єми ядра і ядерець зиготи змінюються не завжди синхронно і не в однаковій мірі.

Об'єм ядерця яйцеклітини в зиготі T. aеstivum змінювався незначно і тільки через 12 годин після запилення зменшувався (Р ? 0,05); з ядерцем спермію це відбувалося через 16 годин після запилення. Перед поділом зиготи сумарний об'єм її ядерець зростав порівняно з вихідним (Р ? 0,001).

У S. cereale ядерце яйцеклітини в зиготі періодично то збільшується, то зменшується, залишаючись більшим за ядерце незаплідненої яйцеклітини.

Таким чином, дослідження зиготи злаків на різних етапах її дозрівання дало можливість виявити періодичність коливань цитометричних показників, що пов'язано зі зміною рівня метаболічної активності.

H. annuus. Оскільки у H. annuus всі ці процеси проходять швидше, ніж у злаків, то були проведені дослідження через кожні 15 хвилин після штучного запилення. З`ясувалося, що через 030, 115, 130 та 330 годин після штучного запилення об`єм зиготи був меншим порівняно з об`ємом незаплідненої яйцеклітини.

Об'єм ядра протягом першої години періоду дозрівання зиготи майже не змінювався. Через 115 годин після запилення спостерігали збільшення (Р ? 0,05) об'єму ядра. На наступних етапах дозрівання зиготи (215, 315 годин після запилення) її ядро залишалося більшим за ядро яйцеклітини. Починаючи з 5-ї години ядро зиготи стає значно більшим і залишається таким до поділу зиготи, який спостерігався через 8 годин після запилення.

На ранніх етапах дозрівання зиготи (до 115 годин після запилення) її ядерце за своїм об'ємом достовірно не відрізнялося від ядерця яйцеклітини. Це свідчить про те, що в цей час не відбувається істотних змін в інтенсивності синтезу рРНК і утворення рибосом. На наступних етапах розвитку зиготи ядерце яйцеклітини в ній то збільшувалось, то зменшувалось, залишаючись більшим за ядерце яйцеклітини. Недостовірною різниця була через 130, 200, 400, 415, 430, 530 та 800 годин після штучного запилення. Об'єм ядерця спермію в зиготі коливався в незначних межах (від 48 до 76 мкм3). Сумарна величина ядерець яйцеклітини та спермію в зиготі збільшується перед її поділом (Р ? 0,001).

Оскільки кількість ядерець в зиготі в процесі її дозрівання не змінюється, цей показник не може бути критерієм метаболічної активності зиготи в різні періоди її дозрівання. Об'єм же ядерець як яйцеклітини, так і спермію і, особливо, сумарний, змінювався. Зміна об'єму ядерець пов'язана з інтенсивністю утворення рибосомних субодиниць.

Таким чином, проведені дослідження показали, що об'єм клітини, ядра та ядерця в процесі дозрівання зиготи T. durum, T. aеstivum, S. cereale та H. annuus змінюється. Характер змін у цих видів різний.

Величина ЯЯС та ЯЦС в ході дозрівання зиготи. Злаки. Результати наших досліджень показали, що об'єми ядра і ядерець зиготи змінюються не завжди синхронно і не в однаковій мірі. Це відображають значення ЯЯС (табл. 6). За дозрівання зиготи T. durum це значення змінюється. Величина ЯЯС у зиготі T. aеstivum є досить стабільною, лише через 14 годин після запилення цей показник зростає у порівнянні з яйцеклітиною (Р ? 0,01). Протягом дозрівання зиготи S. cereale величина ЯЯС коливається в значних межах, і перевищує відповідний показник в яйцеклітині через 8 (Р ? 0,01), 12 та 16 годин (Р ? 0,05) після запилення.

Зростання показника ЯЯС в зиготі в порівнянні з яйцеклітиною ніяк не можна пов'язувати зі зниженням активності внутріклітинного метаболізму. Як було показано, об'єми і ядра, і ядерець за дозрівання зиготи T. durum, T. aеstivum та S. cereale зростали. Це саме по собі свідчить про активізацію функції ядра. До зростання ЯЯС привели різні темпи росту і неспівпадіння у часі коливань об'ємів ядра та ядерець.

Результати наших досліджень показали, що об'єм ядра у S. cereale змінюється майже відповідно змінам об'єму клітини і як слідство цього величина ЯЦС в яйцеклітині та зиготі достовірно не розрізняються. Слідством збільшення кількості цитоплазми є зменшення ядерно - цитоплазматичного відношення. З останньою подією корелює зміна параметрів мітотичного циклу жіночих статевих клітин, які розвиваються.

H. annuus. У H. annuus величина ЯЯС у ранні строки дозрівання зиготи змінювалась в незначних межах порівняно з ЯЯС яйцеклітини. На послідуючих етапах розвитку зиготи ця величина була меншою (Р ? 0,001) за величину ЯЯС незаплідненої яйцеклітини, окрім 200 години після запилення. Зниження даної величини в зиготі у порівнянні з яйцеклітиною може бути свідоцтвом посилення формування рибосомних субодиниць. Таким чином, окрім об'ємів клітини, ядра та ядерця, величина ЯЯС теж може бути використана в якості інтегрального показника для характеристики функціонального стану зиготи рослин, у яких темпи зміни об'ємів ядра і ядерця співпадають, як це спостерігається у H. annuus.

Проведені нами дослідження показали, що величина ЯЦС в процесі дозрівання зиготи H. annuus, як правило, достовірно не відрізняється від такого показника в яйцеклітині, і що як слідство цього, зміну величини ЯЦС не можна вважати причиною поділу зиготи.

Висновки

1. У роботі вперше досліджено закономірності зміни об'ємів клітини, ядра і ядерця та їх співвідношень за розвитку яйцеклітини і зиготи у представників родин злакових і складноцвітих та встановлено структурно - фукціональні особливості цих клітин.

2. Встановлено, що види T. durum, T. aеstivum, S. cereale та H. annuus розрізняються за тривалістю прогамної фази запліднення, сингамії і періоду дозрівання зиготи: у H. annuus всі ці процеси проходять швидше, ніж у злаків, що пов'язано зі ступенем деконденсації хроматину зрілої яйцеклітини.

3. Під час прогамної фази запліднення, а також сингамії у злаків і H. annuus суттєвих змін об'єму яйцеклітини, її ядра і ядерця не спостерігається. В період дозрівання зиготи відбуваються коливальні зміни об'єму клітини та її структурних компонентів. У злаків період коливань дорівнює 4 - 6 годинам, а у соняшника - близько години, що можна пов'язати із тривалістю періоду дозрівання зиготи, систематичним положенням об'єкту, а також його хронобіологічною реакцією.

4. Встановлено, що періоди зниження і підйому темпів росту зиготи і її структурних компонентів у досліджуваних видів були неоднакової тривалості, що свідчить про генетичну обумовленність процесу дозрівання зиготи і про вплив метаболічних шляхів на періодичність процесу в цілому: в яйцеклітині і зиготі злаків запасними речовинами є, головним чином, крохмаль, а у соняшника - ліпіди, більш енергетично багаті.

5. Величина ядерно-ядерцевого співвідношення у T. durum, T. aеstivum і S. cereale протягом більшої частини періоду дозрівання зиготи була вищою, ніж в яйцеклітині, що свідчить про активізацію функції ядра, а у H. аnnuus - нищою.

6. Величина ядерно-цитоплазматичного співвідношення у зиготі T. durum нижча, ніж в яйцеклітині, а у T. aеstivum - вища; у S. cereale та H. annuus ці величини в яйцеклітині та зиготі не розрізняються. Це свідчить, що поділ зиготи не пов'язаний зі зміною величини ЯЦС.

7. Встановлені нами цитометричні показники можуть бути використані для характеристики морфо-функціонального стану яйцеклітини і зиготи у різні періоди їх дозрівання.

Список наукових робіт, опублікованих за темою дисертації

1.Бланковська Т. П., Кириленко Н. А. Цитометричні параметри зиготи пшениці за її дозрівання // Вісник Одеського державного університету.-2000.- Т. 5, Вип. 1.- С. 279-283.

2.Кириленко Н. А. Цитометричне вивчення розвитку зиготи у жита // Вісник Одеського національного університету.-2001.- Т. 6, Вип. 1.- С. 210-213.

3. Кириленко Н. А. Цитометричне вивчення зиготи у соняшника // Учёные записки Таврического национального университета.-2001. - Т. 14 (53), №1.- С. 97-100.

4.Кириленко Н. А. Морфометричне дослідження розвитку яйцеклітини та зиготи у соняшника // Вісник Одеського національного університету.-2002.- Т. 7, Вип. 1.- С. 254-259.

5.Бланковская Т. Ф., Кириленко Н. А. Морфометрический анализ зиготы пшеницы и ржи в процес се ёё созревания // Цитология и генетика.- 2002.- Т. 36, № 3.- С. 12-16.

6.Кириленко Н. А. Цитометричне дослідження розвитку зиготи у жита // „Актуальні проблеми ботаніки та екології в Україні”. Тез. допов. - Чернігів, 2000. - С. 91-92.

7.Бланковська Т. П., Кириленко Н. А. Цитометричне вивчення зиготи у соняшника // Матеріали XI з'їзду Українського ботанічного товариства (Харків, 25-27 вересня, 2000 р.). Тез. допов. - Харків, 2001. - С. 41 - 42.

8.Кириленко Н. А., Давиденко В. Л. Морфометрические параметры яйцеклетки и зиготы подсолнечника (Helianthus annuus L.) // II Международная конференция по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 14-18 октября, 2002 г.). Тез. докл. - Санкт - Петербург, 2002 . - С. 151 - 152.

9. Кириленко Н. А. Цитохімічна характеристика яйцеклітини і зиготи деяких покритонасінних // „Актуальные проблемы ботаники и экологии”. Тез. допов. - Одеса, 2003.- С.128 - 129.

10.Кириленко Н. А. Формування та дозрівання яйцеклітини у злаків // “Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация”. Тез. допов. - Одеса, 2005. - С.127.

Анотації

Кириленко Н.А. Морфо-функціональний стан яйцеклітини і зиготи в процесі їх розвитку у деяких квіткових рослин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук, 03.00.05. - ботаніка. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, 2005 р.

Вивчено морфологічні особливості процесу запліднення у T. durum, T. aеstivum, S. cereale, та H. annuus на послідовних стадіях проходження цього процесу. Визначено об'єми клітин, їх ядер та ядерець, величину ядерно-ядерцевого (ЯЯС) і ядерно-цитоплазматичного (ЯЦС) співвідношень та досліджено динаміку цих показників за розвитку яйцеклітини і зиготи у даних видів. Виявлено, що об'єми клітини, ядра та ядерець, а також значення величин ЯЯС і ЯЦС в період дозрівання зиготи у цих видів змінюються. За спрямованістю змін об'ємів зиготи і її структурних компонентів у порівнянні з яйцеклітиною досліджувані види розрізняються. Криві, які відбивають процентне співвідношення цих об'ємів до відповідних об'ємів яйцеклітини у T. durum, T. aеstivum та у S. cereale - двовершинні. У них період коливань дорівнює 4 - 6 годинам, а у H. аnnuus - близько години. Морфометричні параметри зиготи розглядаються як інтегральні показники функціонального стану цієї клітини за її розвитку.

Досліджено характер змін морфометричних параметрів, ступінь накопичення нуклеїнових кислот і білка та особливості структурного стану хроматину в ядрах цих клітин. В яйцеклітині і зиготі цитохімічні реакції на конститутивні речовини (білки, нуклеїнові кислоти) схожі, а на запасні - розрізняються: в яйцеклітині і зиготі злаків запасними речовинами є, головним чином, крохмаль, а у H. annuus - ліпіди, більш енергетично багаті.

Розроблено критерії непрямої оцінки функціональної активності клітини, використовуючи інтенсивність цитохімічних реакцій, об'єм клітин, їх ядер та ядерець, а також величину співвідношень - ЯЯС та ЯЦС.

Ключові слова: яйцеклітина, зигота, морфометрія, T. durum, T. aеstivum, S. cereale, H. annuus.

Кириленко Н. А. Морфо-функциональное состояние яйцеклетки и зиготы в процессе их развития у некоторых цветковых растений. - Рукопись.

Дисертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук, 03.00.05. - ботаника. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченка, 2005 г.

Выявлены морфологические особенности процесса оплодотворения у T. durum, T. aеstivum, S. сereale и H. annuus на последовательных этапах прохождения этого процесса. Использование темпоральной фиксации позволило установить, что эти виды различаются по продолжительности прогамной фазы оплодотворения, гамогенеза и периода созревания зиготы: у H. annuus все эти процесы проходять быстрее, чем у злаков. Определены объёмы клетки, ядра и ядрышек, а также величина ядерно-ядрышковых (ЯЯО) и ядерно-цитоплазматических (ЯЦО) отношений, прослежена динамика этих показателей во время созревания яйцеклетки и зиготы у даных видов.

Установлено, что объёмы клетки, ядра и ядрышек, а также значения величин ЯЯО и ЯЦО в период созревания зиготы у изучаемых видов изменяются. По характеру изменений объёмов зиготы и её структурных компонентов по сравнению с яйцеклеткой исследованые виды различаются. Так, объёмы клетки, её ядра и ядрышек на всём протяжении периода созревания зиготы у T. durum были больше по сравнению с яйцеклеткой, а у H. annuus - меньше. Объём зиготы T. aеstivum во время созревания колебался в более широких пределах, а объём её ядра был больше, чем в яйцеклетке. Объём ядрышка яйцеклетки в зиготе изменялся незначительно. У S. cereale объём зиготы, её ядра и ядрышка колебательно изменялся, периодически то увеличиваясь, то уменьшаясь. Кривые, отражающие процентное соотношение этих объёмов к соответственным объёмам яйцеклетки у T. durum, T. aеstivum и S. cereale - двувершинные. Морфометрические параметры зиготы рассматриваются как интегральные показатели функционального состояния этой клетки при её созревании.

Показатели ядерно-ядрышкового и ядерно-цитоплазматического соотношений при созревании зиготы у исследованых видов изменяются в незначительных пределах.

Выявлен характер изменений морфометрических параметров, степень накопления нуклеиновых кислот, белка и особенности структурного состояния хроматина в ядрах этих клеток. Разработаны критерии непрямой оценки функциональной активности клетки, используя интенсивность цитохимических реакций, объём клеток, их ядер и ядрышек, а также величину соотношений - ЯЯО и ЯЦО.

В яйцеклетке и зиготе исследованных видов цитохимические реакции на конститутивные вещества (белки, нуклеиновие кислоты) сходны, а на запасные - различаются: у злаков выявлен, по большей части, крохмал, а у H. annuus - липидные капли, наиболее энергетически богатые.

Ключевые слова: яйцеклетка, зигота, морфометрия, T. durum, T. aеstivum, S. cereale, H. аnnuus.

Kirilenko N. A. Morfo-functional characteristics of development of egg cell and zygote of some angiosperms. - Manuscript.

A thesis on competition for the scientific degree of the candidate of biological sciences, 03.00.05. - botany. Kiev, National University after Taras Chevchenko, 2005 .

The sizes of diameters of cell, nucleus and nucleolus of T. durum, T. aеstivum, S. cereale and H. annuus zygote during its maturation have been measured; also the value of nucleus-to-nucleolus and nucleus-to-cytoplasmic ratio has been determined.

Fluctuation of the cell, its nucleus and nucleolus volumes, also the value of nucleus-to-nucleolus and nucleus-to-cytoplasmic ratio during the period zygote maturation were detected. The investigation species is distinguished in zygote volume and it structural components unlike egg cell. The curves, showing percent ratio of these volumes to corresponding volumes of the egg cell, have two peaks. Fluctuation' period of T. durum, T. aеstivum and S. cereale are 4 - 6 hours, and the same period of H. annuus is near one hour. The investigated morfometrical parameters of zygote are discussed as integral factors of functional condition of the zygote development.

Cytochemical reactions on albumins and nucleic acids similar in the egg cell and zygote of investigation species. But reactions on store substance- different; starch and lipids were revealed in T. durum, T. aеstivum and S. cereale, and only lipids in H. аnnuus.

Key words: egg cell, zygote, morfometry, T. durum, T. aеstivum, S. cereale, H. annuus.

Размещено на Allbest.ru

...