Размещено на http://www.allbest.ru/

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА

УДК 546.18:615.281

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

АНТИМІКРОБНА ДІЯ ТА ПЕРСПЕКТИВИ ЗАСТОСУВАННЯ В МЕДИЦИНІ НОВИХ ЧЕТВЕРТИННИХ ФОСФОНІЄВИХ СПОЛУК

Малішевська Анна Вікторівна

Харків - 2005

Дисертація є рукописом.

Робота виконана на кафедрі мікробіології та вірусології Буковинського державного медичного університету МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Дейнека Святослав Євгенович, Буковинський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології та вірусології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович, Національний фармацевтичний університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

доктор медичних наук, професор Ковальчук Валентин Петрович, Вінницькій національний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України

Захист відбудеться " 13 " квітня 2006 року о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України за адресою: 61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: 61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14/16.

Автореферат розісланий " 10 " березня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої ради к.мед.н., ст.н.с. С.В. Бруснік

Анотації

Малішевська А.В. Антимікробна дія та перспективи застосування в медицині нових четвертинних фосфонієвих сполук - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України, Харків, 2005.

Дисертацію присвячено скринінгу та дослідженню перспективних протимікробних речовин серед групи четвертинних фосфонієвих сполук та обгрунтуванню доцільності створення на їх основі нових хіміотерапевтичних засобів з різноплановою дією.

Досліджено рівні протимікробної активності та спектр впливу 217 нових сполук щодо тест-культур музейних і клінічних штамів мікроорганізмів. За допомогою логіко-структурного аналізу означено закономірності зв'язку хімічної структури від протимікробної активності, що дозволило рекомендувати основні напрямки цілеспрямованого синтезу в ряду четвертинних фосфонієвих солей. У дослідах in vitro означено швидкість формування стійкості клінічних антибіотикорезистентних штамів золотистих стафілококів до фосфонієвих сполук, вплив рН живильного середовища та вмісту сироватки крові на актимікробну активність досліджених сполук. Вивчено гостру токсичність, кумулятивні ефекти та місцеву подразнюючу дію гетероциклічних фосфонієвих сполук. Використовуючи дві експериментальні моделі стафілококових інфекцій з'ясовано хіміотерапевтичну ефективність найбільш перспективних сполук.

Ключові слова: четвертинні фосфонієві сполуки, антимікробна активність, мікроорганізми, хіміотерапевтична ефективність, токсичність.

Малишевская А.В. Противомикробное действие и перспективы использования в медицине новых четвертичных фосфониевых соединений. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины, Харьков, 2005.

Диссертация посвящена проблеме поиска, скрининга и изучения перспективных соединений с группы четвертичных фосфониевых соединений. Определены уровни активности и спектр влияния 217 новых четвертичных фосфониевых соединений на тест-культуры музейных и клинических штаммов микроорганизмов.

С помощью логико-структурного анализа изучены закономерности влияния химической структуры фосфониевых соединений на их противомикробную активность. В результате чего были разработаны основные направления целенаправленного синтеза в ряду четвертичных фосфониевых соединений.

В опытах in vitro при многократных пересевах на питательных средах, содержащих возрастающее количество исследуемых веществ, изучена скорость формирования резистентности у клинических антибиотикорезистентных штаммов золотистых стафилококков. Изучено влияние рН питательной среды на антимикробную активность и установлено, что лишь при рН=6,0 наблюдается в некоторых случаях снижение антимикробной активности в 2 раза по сравнению с контрольной концентрацией вещества в среде с нейтральным рН. При исследовании влияния содержания сыворотки крови в питательной среде на активность исследуемых соединений установлено, что наблюдается снижение по сравнению с контрольной величиной противомикробной активности в 1,38 и 3,38 раза в средах с содержанием сыворотки 5 и 10%. В опытах по изучению острой токсичности доказана невысокая и умеренная токсичность найболене перспективных соединений, их малая способность к кумуляции и отсутствие местного раздражающего действия на слизистую конъюнктивы глаз.

Определена химиотерапевтическая еффективность на моделях генерализованой стафилококковой инфекции (сепсис) и локальной стафилококковой гнойно-воспалительной инфекции мягких тканей. При использовании первой модели инфекции соединение М-448 по уровню эффективности занимает промежуточное место между препаратами сравнения - этонием и декаметоксином. При второй - время полной эпителизации ран при лечении 1% мазью соединения М-230 наступает раньше, чем при лечении ран 1% мазью декаметоксина и значительно раньше, чем в контрольной группе животных.

Ключевые слова: четвертичные фосфониевые соединения, антимикробная активность, микроорганизмы, химиотерапевтическая эффективность, токсичность.

Malishevska A.V. Antimicrobial action and Perspectives of Using New Quaternary Phosphonium Compounds in Medicine. - Manuscript.

Thesis for obtaining the academic degree of a candidate of medical sciences in speciality 03.00.07. - microbiology. - I.I. Mechnikov Kharkiv Institute of microbiology and Immunology of Ukraine's AMS, 2005.

The thesis deals with the screening investigation of the perspective antimicrobial substances withing the of quaternary phosphonium compounds and the substantiation of expediency of the creation on their basis of new chemotherapeutical agents with a variously oriented action.

The antimicrobial activity levels and the spectrum influence of 217 new compounds pertaining to test - cultures of museum and clinical strains of microorganisms have been investigated. The regularitie of a connection of the chemical structure from the antimicrobial activity have been determined by means of logic - structure analysis that enabled to recomend the basic trends of a purposeful synthesis in a series of quaternary phosphonium salts. The sate of forming the persistency of clinical antibiotic - resistant strains of Staphylococcus aureus to phosphonium compounds the influence of pH medium and the blood serum contend on the antimicrobial activity of the compounds under the study have been evaluated in Vitro trials. Acute toxicity, cumulative effects and a local irritation action of heterocyclic phosphonium compounds have been studied. Chemotherapeutical efficacy of the most perspective compounds have been elucidated using two experimental models of staphylococcus infections.

Key words: quaternary phosphonium compounds, antimicrobial activity, microorganisms, chemotherapeutical efficacy, toxicity.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. У боротьбі з інфекційними та гнійно-запальними захворюваннями бактеріальної, вірусної та грибкової етіології за умов сучасної клініки провідна роль належить протимікробним препаратам. Однак, широке, а в деяких випадках, безконтрольне їх застосування у медицині, сільському господарстві і побуті призводить до селекції і поширення стійких до їх дії штамів мікроорганізмів (Buxbaum A. et all., 2004; Katayama Y. et all., 2004; Волянський Ю.Л. та співавт., 2004; Данилейченко В.В., 2005). кров фосфонієвий хіміотерапевтичний

Формування стійкості збудників хвороб до антимікробних засобів, селекція та інтенсивне розповсюдження полірезистентних штамів значною мірою перешкоджають ефективному використанню цих вельми цінних ліків, як результат зростаюча резистентність бактеріальних патогенів до антибіотиків стає все більш серйозною проблемою охорони здоров'я, оскільки досить часто призводить до неефективності лікування, збільшення терміну госпіталізації, підвищення рівня смертності та значних економічних втрат (Wagenvoort J., 2001; Посснер А.Б., Фарр Б.М., 2002; Stamm W.E, 2003, Палій Г.К., Ковальчук В.П., 2004).

Розповсюдження антибіотикорезистентності, відсутність препаратів, активних по відношенню до нових збудників і природньостійких видів, незадовільна фармакокінетика та побічні реакції вже існуючих засобів спонукають до пошуку нових антибіотиків і хіміотерапевтичних препаратів з протимікробною дією (White R.L., 2002; Яковлев С.В., 2002; Палій Г.К., Бойко В.М., 2004). Тому в сучасних умовах швидкого розвитку науки постійно триває пошук нових антимікробних препаратів та розробляються шляхи та засоби направленого синтезу антибіотичних речовин (Шевелева Н.Е., 2000; Макац Є.Ф. та співав., 2002; Дикий І.Л. та співав., 2004).

Перспективними в плані пошуку таких високоактивних антимікробних препаратів є четвертинні фосфонієві сполуки, які, на відміну від четвертинних амонієвих сполук, залишаються недостатньо вивченими щодо виявлення серед них нових ефективних засобів протимікробної спрямованості.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідницької роботи кафедри мікробіології та вірусології Буковинського державного медичного університету "Проблема стафілококового назофарингеального бактеріоносійства, удосконалення методів діагностики та ефективної санації носіїв" (шифр теми за зведеним планом НДР Ін.12.13.0001.01, номер державної реєстрації 0101U005252), а також фрагментом науково-дослідницької роботи кафедр медичної хімії і мікробіології та вірусології Буковинського державного медичного університету "Синтез, хімічні властивості та біологічна активність нових типів чотири-функціоналізованих піразолів" (шифр теми за зведеним планом НДР Ін.10.00.0001.05). Автор є співвиконавцем вказаних науково-дослідницьких робіт і виконувала фрагменти, що відносяться до теми дисертації: вивчення антимікробної активності, формування стійкості у клінічних антибіотикорезистентних штамів золотистих стафілококів стосовно фосфонієвих солей, токсичності та хіміотерапевтичної ефективності четвертинних фосфонієвих сполук.

Тема дисертації затверджена РПК з спеціальностей вірусологія та мікробіологія (протокол № 14 від 06.02.2003 р.).

Мета і завдання дослідження. Пошук високоефективних в антимікробному відношенні четвертинних фосфонієвих сполук, які могли б стати основою для створення антимікробних препаратів, придатних для профілактики і лікування гнійно-запальних захворювань різної етіології.

Виходячи з поставленої мети були визначені такі основні завдання дослідження:

Провести первинний мікробіологічний скринінг серед нових четвертинних фосфонієвих сполук різних груп: з багатоядерними ароматичними фрагментами, з гетероциклічними фрагментами та заміщених метилтрифенілфосфонієвих солей, визначити при цьому залежність антимікробної активності цих сполук нового синтезу від їх хімічної структури.

Вивчити антимікробну активність четвертинних фосфонієвих сполук, відібраних у результаті первинного скринінгу, стосовно розширеного кола як музейних, так і клінічних штамів мікроорганізмів.

3. Дослідити вплив різних факторів на антимікробну активність відібраних четвертинних фосфонієвих солей та можливість формування стійкості мікроорганізмів до них.

4. В експерименті на лабораторних тваринах дослідити параметри токсичності найактивніших фосфонієвих сполук.

5. На моделях гнійно-запальних і септичних уражень визначити хіміотерапевтичну ефективність найперспективніших фосфонієвих сполук.

Об'єкт дослідження: інфекційні та гнійно-запальні захворювання.

Предмет дослідження: четвертинні фосфонієві сполуки нового синтезу, музейні та клінічні штами мікроорганізмів, лабораторні тварини.

Методи дослідження: робота ґрунтується на мікробіологічних дослідженнях 217 четвертинних фосфонієвих сполук нового синтезу, вивченні спектру їх антибактеріальної та протигрибкової активності щодо збудників інфекційних та гнійно-запальних захворювань. З метою математичної обробки отриманих результатів для визначення вірогідності виявлених змін, зв'язків між показниками, явищами застосовано статистичний метод.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше означена антибактеріальна та протигрибкова активність 217 нових оригінальних сполук та її залежність від хімічної структури цих речовин, у результаті чого виявлені фосфонієві сполуки з багатоядерними ароматичними фрагментами, з гетероциклічними фрагментами та заміщені метилтрифенілфосфонієві солі, які є перспективними для подальшого вивчення з метою розробки антимікробних засобів медичного призначення.

Розроблені основні напрямки цілеспрямованого синтезу в ряду четвертинних фосфонієвих солей, що містять конденсовані багатоядерні ароматичні, гетероциклічні та заміщені ароматичні фрагменти.

Встановлено, що формування резистентності стафілококів до четвертинних фосфонієвих сполук відбувається повільно, їх антимікробна активність незначно змінюється під впливом різних факторів (pH, білки сироватки) і залишається досить високою для пригнічення росту і розмноження збудників захворювань, тому слід очікувати і позитивного профілактичного та лікувального ефекту в процесі їх клінічного застосування.

Вивчені параметри токсичності, ефекти кумуляції, подразнююча дія найперспективніших фосфонієвих сполук та їх хіміотерапевтична ефективність при генералізованій і локалізованій формі стафілококової інфекції.

Наукова новизна та цінність роботи підтверджені деклараційними патентами "Четвертинна трифенілфосфонієва сіль" (Пат. № 6377 (Укр) 7 А 61К 31/00 / Листван В.М., Листван В.В., Малішевська А.В., Дейнека С.Є. З. № 20040705327 від 05.07.04. Опубл. Бюл. № 5, 2005) та "Бенз[а]антрацен-7,12-хінону" (Пат № 6378 (Укр) 7 С 07F9/54 / Листван В.В., Малішевська А.В., Листван В.М, Дейнека С.Є. З. № 20040705339 від 05.07.04. Опубл. Бюл. № 5, 2005).

Практичне значення одержаних результатів. Результати виконаних досліджень являють собою первинний етап вивчення хімічних сполук нового синтезу з протимікробним спрямуванням. Доведено виражену антимікробну активність окремих четвертинних фосфонієвих сполук, у т.ч. і у відношенні антибіотикорезистентних штамів золотистих стафілококів, що дає можливість конструювати на основі цих нових сполук засоби попередження і лікування інфекційних та гнійно-запальних захворювань.

Основний зміст роботи

У вступі в стислій формі подано актуальність проблеми боротьби з інфекційними та гнійно-запальними хворобами мікробного генезу, означено проблеми сучасної хіміотерапії, у т.ч. неухильне зниження потенціалу хіміотерапевтичних препаратів на тлі інтенсивного формування стійкості патогенів до них, проаналізовано стан проблеми пошуку нових протимікробних сполук і викладено суть мети та наукових завдань, які розв'язувались при виконанні дисертаційної роботи, обгрунтовано актуальність теми дисертації, визначено зв'язок роботи з державними науковими програмами, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів, наведено дані щодо апробації результатів дослідження.

У першому розділі подано огляд літератури, в якому стисло викладено проблему гнійно-запальних захворювань в сучасній клініці, у т.ч. формування стійкості їх збудників до хіміотерапевтичних препаратів, а також означено поширення, причини виникнення та шляхи подолання антибіотикорезистентності. На основі чисельних даних літератури доведено доцільність і перспективу пошуку нових високоефективних протимікробних препаратів серед нових четвертинних фосфонієвих сполук.

Об'єкти, методи і обсяг досліджень наведено у другому розділі. У роботі використано 217 нових вперше синтезованих хімічних сполук з групи четвертинних фосфонієвих сполук - 89 фосфонієвих солей з багатоядерними ароматичними фрагментами, 64 заміщені метилтрифенілфосфонієві сполуки та 64 фосфонієві сполуки з гетероциклічними фрагментами, які були синтезовані на кафедрі органічної та фармацевтичної хімії Чернівецького національного університету ім. Ю. Федьковича (к.х.н., доцент Букачук О.М.), кафедрі хімії Житомирського державного педагогічного університету ім. І.Франка (к.х.н., доцент Листван В.М., к.х.н., доцент Листван В.В.) та у відділі хімії біологічноактивних гетероциклічних основ Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (д.х.н., професор Драч Б.С., к.х.н., старший науковий співробітник Смолій О.Б., аспірант Музичка Л.В.).

Для порівняння антимікробної активності (терапевтичної ефективності) наведених вище сполук використовувалися також лікарські засоби з групи четвертинних аммонієвих сполук - декаметоксин (декаметилен-1,10-біс(N,N-диметилкарбментоксиметил-амоній) дихлорид) та етоній (дихлорид етилен-1,2-біс (N-диметилкарбодецоксиметил) амоній), що широко використовуються в медичній практиці.

Як мікробні тест-культури в роботі використовувалися штами патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів, отримані із музею живих культур лабораторії загальної мікробіології Інституту епідеміології та інфекційних хвороб АМН України, музею живих культур кафедри мікробіології та вірусології Буковинського державного медичного університету, музею живих культур бактеріологічної лабораторії Чернівецької обласної санітарно-епідеміологічної станції, а також виділені з організму хворих, які лікувалися в Чернівецькій обласній клінічній лікарні.

Протимікробна активність 217 нових сполук щодо вказаних тест-культур різних за таксономічним положенням мікроорганізмів досліджувалася відповідно методології і методів, що відповідають вимогам Державного науково-експертного центру лікарських засобів МОЗ України щодо експериментального вивчення протимікробних препаратів.

Для вивчення протимікробної активності хімічних сполук застосовано мікрометод з використанням одноразових полістиролових планшет та мікротитраторів Такачі (Тец В.В., 2002). Проведено вивчення впливу різних концентрацій (5%, 10%, 20%, 40%) сироватки в живильних середовищах та впливу різної концентрації іонів водню на антибактеріальну та протигрибкову активність досліджуваних сполук. Швидкість формування стійкості до протимікробних засобів досліджено шляхом багаторазових пасажів золотистого стафілококу на живильних середовищах, вміщуючих зростаючі дози солей.

Гостру токсичність найактивніших з досліджуваних сполук вивчали шляхом їх внутрішньоочеревинного введення в організм білих неінбридних мишей-самців віком 2,0-2,5 місяці і масою тіла 18-22 г та оцінювали за показниками середньосмертельних доз (ДЛ 50), максимально переносимих доз (ДМТ), абсолютно смертельних доз (ДСЛ). На основі даних, отриманих в гострому експерименті, вивчено і ефекти кумуляції - розраховано індекс кумуляції (Icum) та середній час загибелі дослідних тварин (ЕТ 50). Місцева подразнююча дія вивчалась шляхом внесення досліджуваної сполуки в кон'юнктиву ока кроля (Kasparov A.A., Sanotsky I.V. - 1986).

Усі тварини відповідали 4 класу чистоти за мікробіологічним, вірусологічним та паразитологічним статусом. Вони знаходились на стандартному раціоні віварію та в стабільних умовах утримання (температура повітря 18-200 С), відносна вологість - 50-60%, світловий режим 12С:12Т. У роботі з ними керувались ОСТ 42 1-88 "Тварини лабораторні. Технологічний процес" з дотриманням основних положень Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовуються в експериментах та інших наукових цілях від 18.03.1986 р., Директиви ЄЕС № 609 від 24.11.1986 р. і наказу МОЗ України № 281 від 01.11.2000 р.

Хіміотерапевтичні властивості відібраних сполук вивчали на моделях генералізованої септичної форми стафілококової інфекції білих мишей та моделі локальної стафілококової інфекції м'яких тканин у морських свинок.

Всі числові результати досліджень підлягали статистичній обробці, яку проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики. Ймовірність можливої помилки кожного показника визначали із застосуванням критерію достовірності відмінностей. Математичну обробку отриманих даних проводили на персональному комп'ютері за допомогою програм "Statgraphics" та "АРМТОКС".

Результати власних досліджень наведено у 3-му - 5-му розділах.

У третьому розділі наведені результати скринінгового дослідження антимікробної активності 217 нових четвертинних фосфонієвих сполук трьох різних груп: з багатоядерними ароматичними фрагментами, з гетероциклічними фрагментами та заміщених метилтрифенілфосфонієвих солей. Антибактеріальна активність нових фосфонієвих сполук досліджувалась при цьому стосовно 5 тест-культур як грампозитивних, так і грамнегативних бактерій, різних за таксономічним положенням - S.aureus АТСС 25923, E. coli АТСС 25922, P. аureginosa АТСС 27853, B.subtilis 8236 F-800, E.faecalis АТСС 29213. Противогрибкова дія цих сполук вивчалась на тест-культурі дріжджоподібного гриба роду Candida - C.albicans АТСС 885-653.

При скринінгових дослідженнях з використанням вказаних штамів встановлено, що фосфонієві солі проявляють антимікробну активність, вираженність якої залежить як від виду тест-мікроорганізму, так і структури самої сполуки (табл. 1).

Найвищу антибактеріальну активність, як це видно на прикладі нафталеновмісних фосфонієвих солей (табл. 1)

Таблиця 1 Граничні значення мінімальних інгібуючих концентрацій різних груп фосфонієвих сполук (мкг/мл)

Мінімальні інгібуючі концентрації у відношенні S.aureus знаходились у широких межах від 0,48 до 31,2 мкг/мл, а у відношенні B. subtilis - від 0,24 до 62,5 мкг/мл. Значно меншу чутливість до дії цих сполук виявили E.faecalis та C.albicans - мінімальні інгібуючі концентрації переважної більшості з цих досліджених солей знаходилися в межах від 31,2 до 125 мкг/мл. Грамнегативні мікрооганізми (E. coli і P. аureginosa) виявилися значно стійкішими до дії нафталеновмісних фосфонієвих солей - їх мінімальні інгібуючі концентрації становили в переважній більшості випадків лише від 125 до 500 мкг/мл.

Вказані закономірності антимікробної активності характерні і для інших груп досліджених фосфонієвих сполук, а також для всіх фосфонієвих сполук разом (табл. 1).

З метою оптимізації пошуку високоактивних речовин серед четвертинних фосфонієвих солей та створення передумов для цілеспрямованого синтезу сполук з оптимальними властивостями паралельно ми вивчали і залежність антимікробної активності від структури цих сполук. Встановлені при цьому закономірності виявилися загальними для фосфонієвих похідних ряду бензену, нафталену, антрацену та біфенілу і характеризуються наступними ознаками. Відповідальною за антибактеріальну активність цих сполук є трифенілфосфонієва група. Характер аніону практично не впливає на антибактеріальну активність досліджених солей. Підвищення активності зумовлює введення: електронодонорних метильних замісників у фенільні ядра трифенілфосфонієвої групи, ненасичених замісників в ароматичне ядро, гідразонної, оксимної, тіосемі- та семікар-базонної груп замість ацетильної групи, метильної групи в ароматичне ядро (при цьому із збільшенням кількості метильних груп відбувається підвищення активності). Навпаки, зниження активності зумовлює введення: триалкілфосфонієвої чи трис(диметиламінофеніл)фосфонієвої групи замість трифенілфосфонієвої, карбонільної групи між метилтрифенілфосфонієвим угрупуванням та ароматичним ядром чи гетероциклом, ацетильної, нітро- та метоксильної груп в ароматичне ядро, ацетильної групи в гетероциклічний фрагмент фосфонієвої солі.

Арилметильні трифенілфосфонієві солі показали більш високу антибактеріальну активність у порівнянні з ацилфосфонієвими та фосфорілідами. Антибактеріальна активність фосфонієвих солей, що містять нафтангідридне угрупування значно нижча, а фосфонієвих солей з хіноновими фрагментами суттєво вища порівняно з активністю відповідних нафтален- та антраценфосфонієвих солей. Фосфонієві похідні насичених гетероциклів - піперидинового і піролідинового - не проявляють антимікробної активності, у той час, як похідні ароматичних гетероциклів проявляють протимікробну активність у різній мірі. При цьому, фосфонієві солі, в яких між метилтрифенілфосфонієвою групою та гетероциклом є карбонільна група проявляють меншу антимікробну активність. Введення в гетероциклічний фрагмент фосфонієвої солі ацетильної групи призводить до суттєвого зниження антимікробної активності. Заміщення трифенілфосфонієвої групи на трис (диметиламінофеніл)фосфонієву також викликає зменшення протимікробної активності.

Проведений нами логіко-структурний аналіз дозволив рекомендувати основні напрямки цілеспрямованого синтезу в ряду четвертинних фосфонієвих солей і таким чином зосередити зусилля хіміків-синтетиків на отриманні найбільш перспективних препаратів. Вказані рекомендації надані та використовуються в лабораторіях органічного синтезу Чернівецького національного університету ім. Ю. Федьковича, Житомирського державного педагогічного університету ім. І. Франка та Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України. Так, наприклад, згідно наших рекомендацій проведено цілеспрямований синтез n-толілфосфонієвої солі на основі 2-хлорметил-9,10-антрахінону і дослідження її антимікробної активності (мінімальні інгібуючі концентрації цієї сполуки стосовно S.aureus становлять 0,03 мкг/мл, B.subtilis - 0,48 мкг/мл, E.faecalis - 15,6 мкг/мл, C.albicans становлять 31,2 мкг/мл) підтвердили ефективність розроблених нами основних напрямків цілеспрямованого синтезу в ряду цих четвертинних фосфонієвих солей.

У четвертому розділі вивчені властивості щодо розширеного спектру музейних та клінічних штамів мікроорганізмів 37 найефективніших в антимікробному плані фосфонієвих сполук, які відібрано на основі результатів первинного скринінгу. Для вивчення антибактеріальної та протигрибкової активності вказаних сполук стосовно музейних штамів мікроорганізмів були вибрані 14 тест-культур як грампозитивних, так і грамнегативних бактерій, різних за таксономічним положенням, а також дріжджоподібні гриби роду Candida.

При цьому встановлено, що відібрані в результаті скринінгових досліджень четвертинні фосфонієві сполуки проявляють антимікробну активність, вираженість якої залежить як від виду тест-мікроорганізму, так і структури самої сполуки. Наприклад, похідні 6-алкілтіопіримідин-5-ілфосфонієвих солей проявляють найвищу активність у відношенні грампозитивних мікроорганізмів - коків (у більшості випадків меншу стосовно S.aureus 209 і більшу стосовно M. luteus ATCC 3941) та вегетативних клітин споротворних бацил (B. cereus ATCC 10702). Мінімальні інгібуючі концентрації цих солей у відношенні вказаних коків знаходяться в межах від 0,03 до 7,8 мкг/мл, а у відношенні B. cereus ATCC 10 702 - від 0,06 до 7,8 мкг/мл. Грамнегативні мікроорганізми виявилися значно стійкішими до дії цих солей, які, крім того, значно розрізнялися за ступенем антибактеріальної дії стосовно окремих представників родини ентеробактерій - їх мінімальні інгібуючі концентрації коливалися у широких межах - від 7,8 до >500 мкг/мл. Похідні 6-алкілтіопіримідин-5-ілфосфонієвих солей володіють також вираженою протигрибковою активністю - їх мінімальні інгібуючі концентрації у відношенні C. utilis ЛИА - 01 знаходяться в межах від 0,97 до 31,2 мкг/мл.

Встановлено, що в 24,32 % випадків мінімальні інгібуючі концентрації нових четвертинних фосфонієвих сполук у відношенні музейного штаму S.aureus 209 були нижчими, ніж відповідна концентрація декаметоксину, а в 24,32 % випадків - рівними їй. 18 нових четвертинних фосфонієвих сполук (48,65 %) проявили у відношенні музейного штаму M. luteus ATCC 3941 вищу антибактеріальну активність, ніж препарат порівняння декаметоксин. Крім того 3 сполуки мали величини мінімальних інгібуючих концентрацій у відношенні цього штаму рівні відповідній концентрації декаметоксину. Більшість (51,35 %) досліджених фосфонієвих сполук переважали декаметоксин і за дією на B. cereus ATCC 10702, а четверта частина з них проявляли активність у відношенні цієї тест-культури на рівні вказаного лікувального засобу.

Ще демонстративніша ефективність нових четвертинних фосфонієвих сполук виявлена нами при проведенні порівняння з іншим лікувальним засобом - етонієм. Так, у відношенні S.aureus 209 та B. cereus ATCC 10702 всі відібрані для поглибленого дослідження четвертинні фосфонієві сполуки, а у відношенні M. lueus ATCC 3941 89,18 % з них були активніші, ніж етоній. При порівнянні протигрибкової дії нових сполук з такою в етонію встановлено, що 48,65 % сполук діяли краще, ніж він, а 16,2 % - на рівні з ним. Що вказує на їх достатньо виражену як антибактеріальну (переважно на грампозитивні мікроорганізми), так і протигрибкову дію.

Представники родини ентеробактерій виявилися в більшості випадків менш чутливими до дії відібраних для поглибленого дослідження четвертинних фосфонієвих сполук, ніж до дії препарату порівняння декаметоксину. Однак, при проведенні порівнянь антимікробної дії на грамнегативні мікроорганізми нових четвертинних фосфонієвих сполук з іншим препаратом - етонієм виявлена протилежна картина. Так, більше 70 % відібраних для поглибленого дослідження четвертинних фосфонієвих сполук проявляли у відношенні Е. coli , H. alvei 3168, S. flexneri la, P. vulgaris 4636 та P. mirabilis 410 антибактеріальну активність вищу, ніж препарат порівняння етоній. Мали вищу чи рівну етонію антимікробну дію 56,75 % солей у відношенні E. coli O 55 та 51,31 % у відношенні S. typhimurium 441.

Таким чином, проведені нами порівняння антимікробної активності відібраних нових четвертинних фосфонієвих сполук та широко вживаних у медичній практиці лікувальних засобів декаметоксину та етонію засвідчили перспективність ряду найактивніших солей і вказали на необхідність подальших досліджень, насамперед вивчення чутливості до них антибіотикорезистентних клінічних штамів золотистих стафілококів, виділених з організму хворих з різними гнійно-запальними захворюваннями.

З цією метою використано клінічні антибіотикостійкі штами S. аureus. Всі вони проявляли стійкість до пеніциліну, ампіциліну та оксациліну. До лінкоміцину та цефазоліну були стійкі відповідно 75,0 % та 66,7 % стафілококів, а решта лише помірно чутливі. Значну стійкість проявляли більшість стафілококів і до доксацикліну (73,0 %) та тетрацикліну (60,0 %). 40 відсотків штамів золотистих стафілококів проявляли стійкість до цефоперазону, 33,3 % - до канаміцину і стрептоміцину, 25,0 % - до гентаміцину. Від 20 до 40 відсотків досліджених штамів стафілококів були помірно чутливими до ципрофлоксацину, цефтріаксону та цефтазидіну. Звертає на себе увагу, що третина досліджених штамів стафілококів була стійкою до переважної більшості вивчених антибіотиків (% стійкості коливається в межах від 71,4 до 83,3).

При вивченні чутливості антибіотикорезистентних клінічних штамів золотистих стафілококів до відібраних нами четвертинних фосфонієвих сполук встановлено, що практично всі вони проявляють виражену антибактеріальну дію на ці штами. Більшість з них гинуло в присутності сполук у середніх концентраціях від 0,17 мкг/мг до 4,48 мкг/мг, величини яких є близькими до відповідних граничних концентрацій етонію та декаметоксину - від 0,12 мкг/мг до 7,8 мкг/мг та від 0,12 мкг/мг до 3,9 мкг/мг. При цьому встановлено, що всі 100 % вказаних фосфонієвих сполук у середньому мають вищу антибактеріальну дію на антибіотикорезистентні штами золотистого стафілокока, ніж препарат порівняння етоній та 57,89 % - ніж декаметоксин. Таким чином, полірезистентні до антибіотиків штами золотистих стафілококів володіли високою чутливістю до відібраних нами четвертинних фосфонієвих солей, що є свідченням відсутності в них перехресної стійкості до цих нових антимікробних сполук.

Оскільки у процесі застосування антимікробних препаратів має місце вплив на їх протимікробні лікувальні властивості таких факторів як реакція середовища, наявність білків та ряд інших, нами вивчено вплив різних умов, які здатні підвищувати або зменшувати властивості антимікробних засобів. При цьому встановлено, що переважна кількість сполук зберігала достатню антимікробну активність при вмісті 5% та 10% білків крові - спостерігалося зменшення антимікробної активності лише відповідно в 1,38 та 3,38 раза. Зміна pH живильного середовища суттєво не впливала на антимікробну активність сполук - лише у 27 % випадків при pH 6,0 вона була не більше ніж у два рази нижча ніж у середовищах з pH 7,2, тому лікувальний ефект, на нашу думку, буде однаковим у вогнищах запалення з кислим і лужним pH.

Рис. 1. Швидкість формування резистентності S.aureus до фосфонієвих сполук, етонію та декаметоксину

Оскільки основним фактором, що обмежує ефективність антибіотиків, є формування і поширення стійкої мікрофлори, нами за умов багаторазових пересівів клінічного антибіотикорезистентного штаму золотистого стафілококу на середовищах з наростаючою концентрацією досліджуваних сполук визначена швидкість формування стійкості до них. Встановлено, що після 30 пасажів чутливість клінічного антибіотикорезистентного штаму золотистого стафілокока до досліджених сполук зменшувалась лише у 4-8 разів, що є свідченням повільного формування резистентності цього мікроорганізму до нових фосфонієвих солей (рис. 1).

У п'ятому розділі наведені результати вивчення in vivo токсичності та хіміотерапевтичної ефективності найбільш перспективних четвертинних фосфонієвих сполук.

У результаті токсикологічних досліджень встановлено, що сполука М-230 (ДЛ 50 при внутрішньоочеревенному способі введення 106,44 мг/кг) у 1,94 раза менш токсична, ніж етоній (ДЛ 50 55 мг/кг) та в 2,6 раза менш токсична ніж декаметоксин (ДЛ 50 41 мг/кг). За класифікацією токсичних речовин при введенні в очеревинну порожнину (Сидоров К.К., 1973) сполука М-230 належить за ступенем токсичності до малотоксичних речовин (IV клас токсичності), тоді як препарати порівняння - етоній та декаметоксин - до помірно токсичних речовин (III клас токсичності). Інша фосфонієва сполука з гетероциклічними фрагментами - М-448 (ДЛ 50 46,37 мг/кг) за ступенем токсичності займає проміжне положення між декаметоксином та етонієм і як і вони належить до помірно токсичних речовин (III клас токсичності). Досліджені сполуки володіють слабковираженими кумулятивними властивостями - середній час загибелі дослідних тварин при їх введенні знаходиться в межах від 24,28 до 39,19 години, а індекс кумуляції наближався до 0 і знаходився в межах від 0,03 до 0,21. Сполуки М-230 та М-448 не володіють подразнюючою дією на слизову оболонку ока.

Для з'ясування хіміотерапевтичної ефективності сполук М-230 та М-448 використали дві експериментальні моделі. Перша з них - генералізованої септичної форми стафілококової інфекції, яку створювали шляхом внутрішньоочеревинного введення 1,5 DLM (3*109 бактеріальних клітин) клінічного антибіотикостійкого штаму золотистого стафілококу білим мишам. За умов цієї експериментальної моделі сполука М-448 у вибраному дозуванні (5 мг/кг) один раз на день за ступенем хіміотерапевтичної активності (вижило 70 % інфікованих тварин) займала проміжне положення між декаметоксином (вижило 80 % інфікованих тварин) та етонієм (вижило 60 % інфікованих тварин). За умов локалізованої стафілококової гнійної інфекції м'яких тканин у морських свинок час повної епітелізації тварин, які лікувались 1 % маззю сполуки М-230, був меншим, а сполуки М-448 рівним такому при лікуванні декаметоксином і вірогідно відрізнявся від часу епітелізації ран у тварин контрольної групи.

У розділі аналізу та узагальнення результатів дослідження в стислій формі наведено підсумки виконаної роботи, обговорено основні результати експериментів, які дозволили реалізувати мету і задачі дисертації, обгрунтувати висновки.

Таким чином, отримані в дисертаційній роботі експериментальні дані дозволили виявити у четвертинних фосфонієвих сполук з гетероциклічними фрагментами ряд цінних з медичної точки зору якостей і зробити висновок про перспективність цієї групи хімічних сполук для медицини.

Проведені поглиблені дослідження, у т.ч. і на експериментальних моделях генералізованої та локальної стафілококових інфекцій, двох найбільш перспективних нових препаратів з вказаної групи четвертинних фосфонієвих солей (сполуки М-230 і M-448) підтвердили їх лікувальну ефективність і малу токсичність та дозволяють рекомендувати подальші, у т.ч. і клінічні дослідження з метою розробки на їх основі нових засобів, які могли б стати основою для створення антимікробних препаратів, придатних для профілактики і лікування гнійно-запальних захворювань різної етіології.

Висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукового завдання пошуку високоефективних в антимікробному відношенні четвертинних фосфонієвих сполук, які могли б стати основою для створення протимікробних засобів, придатних для профілактики і лікування гнійно-запальних захворювань різної етіології.

1. При вивченні спектру протимікробної дії 217 нових оригінальних вперше синтезованих хімічних сполук з групи четвертинних фосфонієвих солей - фосфонієвих сполук з багатоядерними ароматичними фрагментами, заміщених метилтрифенілфосфонієвих сполук та фосфонієвих сполук з гетероциклічними фрагментами - встановлено, що найвищу антибактеріальну активність вказані солі проявляють у відношенні грампозитивних мікроорганізмів - золотистих стафілококів та вегетативних клітин споротворних бацил, а також володіють значною протигрибковою активністю стосовно дріжджоподібних грибів роду Candida.

2. У фосфонієвих похідних ряду бензену, нафталену, антрацену та біфенілу виявлено загальні закономірності впливу будови на їх протимікробну активність. Так, відповідальною за антибактеріальну активність є трифенілфосфонієва група, а характер аніону практично не впливає на неї. Підвищення активності зумовлює введення: електронодонорних метильних замісників у фенільні ядра трифенілфосфонієвої групи, ненасичених замісників в ароматичне ядро гідразонної, оксимної, тіосемі- та семікарбазонної груп замість ацетильної групи, а також метильної групи в ароматичне ядро (при цьому із збільшенням кількості метильних груп відбувається підвищення активності). Навпаки, зниження активності зумовлює введення: триалкілфосфонієвої чи трис (диметиламінофеніл)фосфонієвої групи замість трифенілфосфонієвої карбонільної групи між метилтрифенілфосфонієвим угрупуванням та ароматичним ядром чи гетероциклом, а також ацетильної, нітро- та метоксильної груп в ароматичне ядро і ацетильної групи в гетероциклічний фрагмент фосфонієвої солі.

3. Антибактеріальна активність фосфонієвих солей, що містять нафтангідридне угрупування, значно нижча, а фосфонієвих солей з хіноновими фрагментами - суттєво вища порівняно з активністю відповідних нафтален- та антраценфосфонієвих солей, аналогічно як і арилметильних трифенілфосфонієвих солей порівняно з ацилфосфонієвими та фосфорілідами. Фосфонієві похідні насичених гетероциклів - піперидинового і піролідинового - не проявляють антимікробної активності, водночас, похідні ароматичних гетероциклів її проявляють різною мірою.

4. Полірезистентні до антибіотиків клінічні штами золотистих стафілококів володіють високою чутливістю до відібраних у результаті первинного мікробіологічного скринінгу четвертинних фосфонієвих солей - більшість з них гинуло в присутності фосфонієвих сполук у середніх концентраціях від 0,17 мкг/мг до 4,48 мкг/мг. При цьому встановлено, що всі вказані сполуки в середньому мають вищу антибактеріальну дію на антибіотикорезистентні штами золотистого стафілокока, ніж препарат порівняння етоній та 57,89 % сполук - ніж декаметоксин.

5. Формування резистентності стафілококів до четвертинних фосфонієвих сполук відбувається повільно (після 30 пасажів чутливість клінічного антибіотикорезистентного штаму золотистого стафілокока до досліджених четвертинних фосфонієвих сполук зменшувалась лише у 4-8 разів), їх антимікробна активність незначно змінюється під впливом різних факторів (pH, білки сироватки) і залишається досить високою для пригнічення росту і розмноження збудників захворювань.

6. Фосфонієва сполука з гетероциклічними фрагментами М-230 (середньосмертельна доза при внутрішньоочеревинному введенні 106,44 мг/кг) у 1,94 раза менш токсична, ніж етоній та в 2,6 раза менш токсична, ніж декаметоксин, і за ступенем токсичності належить до малотоксичних речовин (IV клас токсичності). Фосфонієва сполука М-448 (середньосмертельна доза при внутрішньоочеревинному введенні 46,37 мг/кг) за ступенем токсичності займає проміжне положення між декаметоксином та етонієм і, як і етоній та декаметоксин, належить до помірно токсичних речовин (III клас токсичності). Вказані сполуки володіють слабко вираженими кумулятивними властивостями (індекс кумуляції відповідно 0,21 та 0,13) і не володіють подразнюючою дією на слизову оболонку ока.

7. Сполука М-448 за ступенем хіміотерапевтичної активності в умовах генералізованої стафілококової інфекції займає проміжне положення між декаметоксином та етонієм, а час повної епітелізації шкірно-м'язових ран (13,25±0,57 днів) при лікуванні нею однаковий, як і при лікуванні ран декаметоксином, і вірогідно (p < 0,05) відрізняється від часу епітелізації ран у тварин контрольної групи (19,25±0,55 днів). Водночас, час повної епітелізації ран (11,25±0,55 днів), лікування яких проводилось 1 % маззю сполуки М-230 вірогідно (p < 0,05) менший, ніж при їх лікуванні декаметоксином та вірогідно (p < 0,01) відрізняється від часу епітелізації ран у тварин контрольної групи.

8. Виражена протимікробна активність і лікувальна ефективність за умов експериментальних моделей генералізованої та локальної стафілококових інфекцій, низька токсичність і відсутність кумуляції, а також доступність напівпродуктів та малостадійність синтезу дозволяють вважати четвертинні фосфонієві сполуки з гетероциклічними фрагментами М-230 і M-448 перспективними щодо розробки на їх основі профілактичних та лікувальних протимікробних засобів.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Малішевська А.В., Букачук О.М., Дейнека С.Є. Синтез та антимікробна активність нових нафталеновмісних четвертинних фосфонієвих сполук // Букувинський медичний вісник. - 2003. - Т.7, №3. - С. 123-127 (Автор провела вивчення антимікробної активності нових нафталеновмісних четвертинних фосфонієвих сполук, оформлення матеріалів до друку).

2. Антимікробна дія нафтилметильних трифенілфосфонієвих солей /Малішевська А.В., Листван В.М., Дейнека С.Є., Листван В.В. // Буковинський медичний вісник. - 2003. - Т.7, №4. - С. 159-163. (Автор провела експериментальні дослідження по вивченню антимікробної дії нафтилметильних трифенілфосфонієвих солей та оформлення матеріалів до друку).

3. Малішевська А.В. До питання про антимікробну активність четвертинних фосфонієвих сполук // Клінічна та експериментальна патологія - 2003. - Т. II, №2. - С. 51-54.

4. Хінонні трифенілфосфонієві солі як потенційні антимікробні засоби /Малішевська А.В., Листван В.В., Листван В.М., Дейнека С.Є. //Вісник Сумського державного університету. - 2004. - Т. 66, №7. - С. 28-31 (Автор вивчила антимікробну дію хінонних трифенілфосфонієвих солей, оформила матеріали до друку).

5. Малішевська А.В., Букачук О.М., Дейнека С.Є. Пошук антимікробних сполук у ряду похідних нафталевого ангідриду // Фармацевтичний журнал. - 2005. - №1. - С. 64-69. (Автор провела дослідження по вивченню антимікробної активності похідних нафталевого ангідриду, оформила матеріали до друку).

6. Малішевська А.В. Антибактеріальна та протигрибкова активність нових трифенілфосфонієвих солей з хінонним та нафтилметильним ядром // Клінічна та експериментальна патологія. - 2005. - Т. 4, №2. - С. 62-64.

7. Малішевська А.В. Вплив будови на антимікробну активність ряду нових нафталеновмісних четвертинних фосфонієвих сполук // Хист. - Чернівці, 2005. - № 7. - С. - 98.

8. Пат № 6377 Україна, МКИ 7 А 61К 31/00. Четвертинна трифенілфосфонієва сіль: Пат. 6377 Україна, МКИ 7 А 61К 31/00 Листван В.М., Листван В.В., Малішевська А.В., Дейнека С.Є. - № 20040705327; Заявл. 05.07.04; Опубл. 16.05.2005, Бюл. № 5. - 2005 (Автор провела експериментальні дослідження по вивченню антибактеріальної та протигрибкової активності досліджуваної сполуки, провела оформлення матеріалів).