Принципи генетичного аналізу жита посівного (Secale cereale L.) за генетично моно- або поліморфними ознаками

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Принципи генетичного аналізу жита посівного (Secale cereale L.) за генетично моно- або поліморфними ознаками

03.00.15 - генетика

Мартиненко Вікторія Сергіївна

КИЇВ - 2005

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в лабораторії геномної та хромосомної інженерії рослин Інституту агроекології та біотехнології УААН, м. Київ

Науковий керівник: академік НАНУ та УААН, професор Созінов О.О., завідувач лабораторії детекції ГМО та біобезпеки

Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Парій Федір Микитович,

Інститут цукрових буряків УААН,

провідний науковий співробітник

лабораторії селекції цукрових буряків

доктор біологічних наук

професор Коршиков Іван Іванович,

Донецький ботанічний сад НАН України,

завідувач відділу промислової ботаніки

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Захист відбудеться 22 грудня 2005 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано 22 листопада 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

схрещування короткостеблий жито ген

Актуальність теми. Інтерес до генетики культурного жита (Secale cereale L) зумовлено його значенням як кормової та хлібної культури, джерела генів стійкості до патогенів, шкідників і абіотичних факторів для м'якої пшениці. Основне ускладнення в дослідженнях з генетики жита посівного пов'язане з суворим перехресним запиленням, зумовленим генетичною системою самонесумісності. Зазвичай ці ускладнення долають шляхом створення та використання для аналізу спеціального генетичного матеріалу -- самофертильних інбредних ліній, пшенично-житніх хромосомно-доданих, заміщених та транслокованих ліній, трисомиків. Проте вивчення генетики кількісних ознак на такому матеріалі є проблематичним через наявність інбредної депресії або цитологічної нестабільності ліній. Звідси випливає, що розробка методів генетичного аналізу виду з облігатним перехресним запиленням, якими можна користуватися для вивчення генетичної структури популяцій жита за кількісними ознаками без використання примусового самозапилення, є актуальним питанням. У нашому дослідженні увагу було зосереджено на висоті рослини - кількісній ознаці, що є найважливішою в боротьбі з виляганням посівів жита у виробництві. Встановлення генетичного контролю висоти в чотирьох популяціях донорів короткостеблості жита є важливим для їх раціонального використання в селекційних програмах. Зважаючи на те, що для жита, як і для інших видів рослин, що культивуються, у останні роки прискореними темпами йде побудова молекулярно-генетичних карт його хромосом, результати генетичного аналізу зразків щодо зв'язку QTL, які впливають на висоту рослини, з певними генетичними маркерами (гени, що контролюють низку біохімічних ознак жита) можна буде використовувати для молекулярно-генетичного маркірування важливих ознак та розробки раціональних та конструктивних шляхів залучення джерел цінних генів для створення сортів та сортових популяцій жита.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Результати, на яких побудовано дисертаційну роботу, було отримано під час виконання програм “Теоретично обґрунтувати і застосувати на практиці засоби та методи генетики і біотехнології для цілей спрямованого формування генетичної компоненти сталих агроекосистем”, номер держреєстрації 0196U012975, “Теоретично обґрунтувати і застосувати на практиці засоби та методи генетики, екології та біотехнології для цілеспрямованого формування генетичної компоненти та біорізноманітності сталих агроекосистем”, номер держреєстрації 0101U003296.

Мета та завдання досліджень. Метою досліджень було встановити генетичну структуру чотирьох короткостеблих популяцій жита за генами короткостеблості та вивчити можливість застосування поліморфних генів -- біохімічних маркерів для хромосомної локалізації ідентифікованих QTL ознаки довжина стебла. Згідно до поставленої мети було вирішено наступні завдання:

Вивчити вихідні популяції жита посівного за низкою кількісних ознак та за ознаками -- біохімічними маркерами та знайти пари популяцій, контрастних за ознакою висота рослини та окремими маркерними ознаками. Оцінку за кількісними ознаками проводити три роки поспіль.

Здійснити схему циклічного схрещування за участю чотирьох популяцій жита з різною довжиною стебла, одержати від кожної комбінації схрещування F₁, F₂ та перший беккрос до кожного з батьків.

Оцінити гібридний матеріал та батьківські популяції за ознакою висота рослини та електрофоретичними спектрами бета-амілази, естерази та секалінів.

Виконати генетичний аналіз короткостеблих популяцій жита за ознакою висота рослини як ознаки з мономорфною генетичною основою.

Базуючись на засадах популяційної генетики, оцінити поліморфізм короткостеблих популяцій за білковими генами-маркерами, виявити гени, що придатні для їх застосування як маркерних у різних комбінаціях схрещування та включити їх у генетичний аналіз для виявлення можливого зчеплення з QTL короткостеблості.

Розробити алгоритми розрахунків для перевірки незалежного комбінування двох поліалельних генів у батьківських популяціях жита та при передачі гібридам у виду з перехресним запиленням, забезпеченим генами самонесумісності.

Об'єкт дослідження: Особливості успадкування ознак з поліморфною та мономорфною генетичною основою у популяціях перехреснозапильного виду жита посівного (Secale cereale L.).

Предмет дослідження: чотири короткостеблі популяції жита, створені тривалим добором за ознакою висота рослини.

Методи дослідження: візуальне оцінювання, гібридологічний аналіз, електрофоретичний аналіз в - амілази, зернової естерази та секалінів, методи популяційної генетики та біологічної статистики.

Наукова новизна. 1. Вперше у світовій практиці генетичного аналізу виду з перехресним запиленням припущено та доведено експериментально, що тривалий добір на певний вираз кількісної ознаки всередині популяції виду з перехресним запиленням веде до створення популяції перехреснозапильної культури, яку можна розглядати як чисту лінію щодо генів, що контролюють ознаку, за якою відбувався добір. Методи генетичного аналізу таких популяцій за критичною ознакою співпадають з методами роботи з чистими лініями. 2. Вперше показано експериментально, що єдиною умовою генетичного аналізу популяції виду з перехресним запиленням за ознакою з поліморфною генетичною основою є наявність різниці у частотах однакових алелів того самого поліморфного гену для популяцій, які схрещуються. 3. Вперше доведено можливість конструктивного та інформаційного генетичного аналізу зразків жита за селекційно-важливою ознакою за рахунок використання поліморфних генів як маркерів ознаки. 4. У досліджуваних популяціях короткостеблого жита ідентифіковано низку генів, частина з яких є новими (-Amy-R2, В, С), а інші можуть бути застосованими як генетичні маркери ознаки короткостеблості для досліджених популяцій (-Amy-R1, Sec2, Est-10, Est-12).

Практичне значення. Встановлено генетичну структуру чотирьох короткостеблих популяцій жита щодо генів, які контролюють довжину стебла, що дає змогу визначити раціональний шлях введення цих популяцій у селекційний процес у якості донору ознаки короткостеблість. Встановлено факт спільного успадкування певних алелів генів -Amy-R1, Sec2, Est-10, Est-12 та певних генів короткостеблості у вивчених популяціях жита, що робить ці гени доступними та зручними генетичними маркерами для цієї ознаки. У практиці генетичного аналізу виду з перехресним запиленням можуть стати у нагоді розроблені алгоритми розрахунків: часток різних алелів у поколіннях F₁ та F₂ за експериментально встановленими частками відповідних алелів у популяціях, які схрещуються, часток алелів, коли наявність одного і того самого компоненту електрофоретичного спектру виявляється внаслідок експресії різних алелів двох генів.

Особистий внесок здобувача. Проведення досліджень, аналіз, інтерпретація результатів та формулювання висновків було виконано автором дисертації особисто. Постановку наукових завдань, підготовку алгоритмів розрахунків здійснено спільно з д.б.н. Терновською Т.К. Особливості походження рослинного матеріалу обговорювались з оригінатором популяцій короткостеблого жита д.с.-г.н. В.В. Скориком.

Апробація роботи. Результати дисертаційної роботи доповідались на міжнародній конференції молодих вчених “Сучасні проблеми генетики, біотехнології та селекції рослин” (Харків, Україна 2001); Міжнародному Симпозіумі “Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология” (Москва-Мінськ, Росія-Білорусь, 2001), Міжнародному Симпозіумі “Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources” (Ялта, Україна, 2002), 2-й міжнародній конференції молодих вчених “Сучасні проблеми генетики, біотехнології та селекції рослин” (Харків, Україна, 2003), на науково-практичному семінарі “Озимая рожь. Селекция, семеноводство, технологии и переработка” (Киров, Россия, 2003), на міжнародній науково-практичній конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, Україна, 2003), міжнародному науковому симпозіумі “Сучасні технології селекційного процесу сільськогосподарських культур”. - Харків, 2004.

Публікація результатів досліджень. Основні результати дисертації викладено в 4 статтях у фахових виданнях та тезах доповідей 7 наукових конференцій.

Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, висновків та списку використаної літератури, що містить 236 найменувань. Роботу викладено на 144 сторінках, результати наведено в 44 таблицях та 31 рисунку.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури містить загальну характеристику виду (Secale cereale L.), особливостей генетичного аналізу жита як виду з облігатним перехресним запиленням, шляхів зменшення висоти жита та основних джерел генів короткостеблості у жита. Приділено увагу генетичній системі самонесумісності цього виду, узагальнено результати використання в генетичному аналізі інбредних самофертильних, пшенично-житніх доданих та заміщених ліній, трисомиків. Розглянуто хромосомні карти жита, зокрема, щодо локалізації генів певних білків, генів самонесумісності, деяких морфологічних ознак, а також їх зчеплення між собою та іншими маркерами.

Матеріали та методи. Матеріалом дослідження слугували чотири різновисоких популяції озимого жита, Болгарське короткостебле (БК) -- 120 см, Гном 1 (Г1) - 110 см, Гном 2 (Г2) - 90 см, Гном 3 -- 35 см та гібридні популяції F₁, F₂ та BC₁ до кожного з батьків від циклічного схрещування всіх чотирьох вихідних популяцій. Короткостеблі популяції жита створені д.с.-г.н. В.В. Скориком шляхом тривалого добору із зразка місцевого жита з Болгарії та надані нам для дослідження. Кількість рослин у популяціях, що не розщеплюються, варіювала від 29 до 93 рослин в різні роки для батьківських форм та від 25 до 217 рослин для F₁. Кількість рослин у популяціях, що розщеплюються, складала від 44 до 373 рослин для беккросних поколінь та від 33 до 213 рослин для F₂. Батьківські популяції вивчали протягом 2000-2002 років за основними кількісними ознаками: висота рослин, продуктивна кущистість, довжина, щільність та озерненість головного колоса, кількість квіток та зерен в головному колосі, маса зерна з рослини та маса 100 зерен. Для оцінки застосовували такі статистичні параметри: середнє значення, стандартне квадратичне відхилення, коефіцієнт варіації, ліміти. Гібридні популяції вивчали у 2002 році за висотою рослини.

Весь матеріал, який оцінювався за висотою рослин, було охарактеризовано одночасно за електрофоретичними спектрами білків -- секалінів, бета-амілази та зернової естерази. Аналізували всі індивідуальні рослини з батьківських та гібридних популяцій F₂ з дослідженням чотирьох зерен з кожної. Електрофорез в-амілази та зернової естерази проводили за модифікованою методикою Девіс (Антонюк, Терновская, 1995), а секалінів -- за модифікованою методикою Бжезінського (Антонюк, 1995). Статистичну обробку даних проводили за загальноприйнятими методиками (Рокицкий, 1974). Генетичний аналіз ознаки висота рослини виконано з застосуванням тесту сумісного шкалювання Каваллі (Mather, Jinks, 1971).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Характеристика короткостеблих популяцій жита за кількісними ознаками. За висотою рослини, масою зерна з рослини та масою 100 зерен батьківські популяції достовірно відрізнялись одна від одної в усі три роки дослідження. Середні значення цих ознак зменшуються в напрямку БК > Г1 > Г2 > Г3. Для популяції Гном 3 характерна менша довжина колоса та більша щільність, інші три популяції не відрізняються одна від однієї за цими ознаками. Загалом такі ознаки як довжина, щільність головного колоса та кількість квіток у ньому не залежали від умов довкілля і середні значення майже не змінювались протягом трьох вегетаційних періодів. Отже, популяції Гном у якості джерела ознаки короткостеблість можуть бути використані у селекційних програмах без загрози суттєвого негативного впливу на ознаки -- основні компоненти урожайності.

Генетичний аналіз вихідних популяцій за висотою рослини. Вивчення батьківських популяцій за ознакою висота рослини показало відповідність розподілу відхилень варіант від середнього значення нормальному закону, хоча абсолютні величини змінюються з року в рік залежно від погодних умов. Розподіл за висотою рослин гібридів F₁ теж відповідав нормальному, що свідчить про однорідність батьківських популяцій за генами, які роблять суттєвий внесок у генетичний контроль ознаки висота рослини. Невідповідність нормальному закону розподілів у гібридів F₂ та беккросів, що проявляється як двогорбий розподіл або відхилення середніх значень в бік однієї з батьківських форм показує, що батьківські форми відрізняються одна від одної невеликою кількістю генів з суттєвим внеском у фенотиповий вираз ознаки (табл. 1).

Результати оцінки показують, що багаторічний добір за певною висотою рослини, в результаті якого було створено Гноми, призвів до гомозиготизації кожної популяції відносно генів, що впливають на висоту, а специфічний розподіл в популяціях, що розщеплюються, показує, що у контролі ознаки бере участь невелика кількість генів. Таким чином, метод сумісного шкалювання Каваллі, що використовується для аналізу чистих ліній за ознаками з неперервною мінливістю, виявляється придатним для роботи з нашим рослинним матеріалом. Результати тесту свідчать, що різна висота рослини батьківських популяцій зумовлена, переважно, генами з адитивними ефектами. Оскільки популяції Болгарське короткостебле та Гноми походять від одного зразка місцевого жита з Болгарії, ми вважаємо, що цей зразок мав кілька різних алелів гену, що зменшує довжину стебла, з адитивною міжалельною взаємодією, і різна висота рослин популяцій Гном 1, 2 та 3 є результатом фіксації різних алелів адитивного гену короткостеблості, який позначено нами умовно як ген А.

Таблиця 1

Статистичні характеристики досліджених популяцій за висотою стебла: х  m_x і (останнє тільки для беккросів)

Примітка. Жирним шрифтом виділено характеристики батьківських форм

За результатами сумісного шкалювання популяціям можна присвоїти певні генотипи за цим геном. Внесок адитивних алелів А₁ - А₄ у висоту батьківських популяцій складає від 8 до 43 см.

Оскільки тест сумісного шкалювання крім адитивних ефектів встановив наявність неповного домінування, ми порівняли дисперсії в беккросах до обох батьків, щоб встановити, який з компонентів схрещування має домінантні алелі цього гену: дисперсія ознаки у беккросному поколінні менша, коли рекурентним компонентом є популяція з домінантним алелем гену. За результатами порівняння популяції Гном 1 та 2 мають напівдомінантний ген, умовно позначений В, який зменшує висоту рослини. Домінантні алелі гена, що збільшує висоту, позначеного С, притаманні популяціям Болгарське короткостебле, Гном 1 та 2, а Гном 3 має рецесивні алелі цього гена. Таким чином, ми виконали попередню ідентифікацію генотипів щодо QTL довжини стебла (табл. 2) та визначили рівень гетерогенності між ними.

Таблиця 2

Генотипи досліджених популяцій і рівень гетерогенності між ними

Генетичний аналіз популяцій жита за біохімічними ознаками. Для хромосомної локалізації ідентифікованих QTL довжини стебла ми провели пошук білкових маркерів, придатних для наших досліджень. Ними виявились запасні білки жита - секаліни, бета-амілаза та зернова естераза.

Ці білки мають високий рівень поліморфізму, генетику їх досить добре вивчено, хромосомна локалізація багатьох генів відома. Визначали частоти кожного компоненту електрофоретичного спектру в батьківських популяціях. Компоненти, частоти яких були занадто високі або низькі, або не відрізнялись у батьківських популяцій з подальшого розгляду виключали. Оскільки нам нічого не було відомо про успадкування окремих компонентів, ми виходили з біному (p+r)², де p - частота алелю a₁, що контролює наявність компоненту, а r - частота нуль-алелю а₀ (нема компоненту). На основі частот певних компонентів спектру за формулою р = (2-v4-4g)/2, де g - частота компоненту спектру, визначали частку алелю, що контролює індивідуальний компонент спектру. Вихідною гіпотезою було припущення, що всі компоненти спектру певного білку контролюються алелями різних генів. Для її перевірки розробили алгоритм порівняння емпіричного розподілу кожної пари компонентів спектру (наприклад, фенотипові класи для компонентів 1 та 2 спектру будуть: 1, 2, 1+2 та 0) з теоретичним, розрахованим з припущення, що компоненти контролюються незалежними генами (табл. 3).

Таблиця 3

Алгоритм розрахунку частот фенотипових класів у популяції з вільним перехресним запиленням за умов дигенного контролю ознаки

Величину ² розраховували за алгоритмом для двох емпіричних вибірок, тому що очікувані частоти базуються на вибіркових даних експерименту, а не на оцінках генеральних параметрів, як належить теоретичним частотам.

Якщо значення ² не перевищувало табличного значення критерію для рівня значущості 0,01, вважали, що розглянуті компоненти спектру контролюються алелями, які належать різним генам та комбінуються вільно, тобто не є зчепленими.

Коли значення ² перевищувало відповідне табличне, гіпотезу про незалежність (незчепленість) генів, що контролюють розглянуті компоненти, відкидали і розглядали одну з наступних гіпотез:

1) При нестачі у фенотиповому класі зі сполученням двох компонентів спектру проти очікуваного, ми припускали, що це наслідок алельності генів, що досліджувались. Тоді визначали частки трьох алелів одного гену та вивчали відповідність розподілу у популяції часток генотипів, що складаються з різних алелів, поліному (p+q+r)². Якщо між фактичними та розрахованими обсягами фенотипових класів розбіжностей не було, гіпотезу про контроль двох компонентів спектру одним геном з трьома алелями приймали.

2) При надлишку у фенотиповому класі зі сполученням двох компонентів спектру, та нестачі класу з відсутністю компонентів припускали, що ген має кластерну природу, тобто один чи декілька алелів цього гену є кластерними. Кластерна структура алелів вимагає спеціальних розрахунків для визначення кількості алелів, за якими розщеплюється дана поліморфна популяція. Базовою моделлю залишається алгоритм Бернштейна (Ли, 1978), який випливає із розкриття поліному (p+q+u+r)² :

r =  f/G

p = (-2r+4r²+4d/G)/2

q = (-2r+4r²+4e/G)/2

u = [-2(p+q+r)+4(p+q+r)²-4(2pq-h/G)]/2

де G -- обсяг вибірки, f, d, e та h -- обсяги певних фенотипових класів. Кількість членів поліному (алелів) необмежена за наявності в популяції фенотипового класу, гомозиготного за 0-алелем. Точність розрахунків визначається насамперед обсягом досліджуваної вибірки.

Для перевірки гіпотези, прийнятої за даними вивчення батьківських популяцій, аналізували розподіл зерен F₂ за фенотиповими класами за такою ж схемою. Частоти компонентів спектру у гаметах рослин F₁ визначали, виходячи з їх частот в батьківських популяціях. Якщо ці частоти зберігалися у F₂, що встановлювалось порівнянням теоретичних частот, розрахованих для гамет F₁ з емпіричними, які визначались за даними вивчення популяцій F₂, то, з одного боку, це підтверджувало наші висновки щодо генетичного контролю певної біохімічної ознаки, а з іншого -- свідчило про відсутність добору у поколіннях стосовно цієї ознаки.

При вивченні спектрів бета-амілази було ідентифіковано два гени, -Amy-R1 (кластерний) та -Amy-R2. Дослідження популяцій F₂ показало відповідність частот генотипів за геном -Amy-R2 закону Харді-Вайнберга, на відміну від -Amy-R1. Для цього гену характерна нестача у F₂ генотипів з такими компонентами спектру, які мали високу частоту у батьків, та різні результати реципрокних схрещувань.

Такі закономірності властиві генам, зчепленим з генами самонесумісності, а оскільки з літератури відомо про локалізацію одного з генів бета-амілази (-Amy-R1) та гену самонесумісності S5 на хромосомі 5R (Voylokov et al., 2002), ми вважаємо ідентифікований нами ген ідентичним йому. Ген -Amy-R1 представлений у нашому рослинному матеріалі 13 алелями, а -Amy-R2 - чотирма.

При дослідженні спектрів зернової естерази для ідентифікації окремих генів ми скористались тим же алгоритмом, що і для бета-амілази. Було ідентифіковано шість генів, з яких три є кластерними, що кодують по два компоненти. Перевірка генів на зчеплення з генами самонесумісності показала, що гени Est-10, Est-12, імовірно, зчеплені з генами самонесумісності та локалізовані, згідно з літературними даними, на хромосомах 2R та 5R. Гени Est 2, 4, 5, 6 передаються відповідно до закону Харді-Вайнберга. Кластерний ген Est-2, з огляду на літературні дані, розташований на хромосомі 3R.

Дослідження спектрів секалінів виконано, за тією ж схемою, що й для спектрів бета-амілази. Виявлено 3 гени, що вільно комбінуються у батьківських популяціях.

За нашими даними, всі вони зчеплені з генами самонесумісності. На рис. 3 наведено приклад однієї з комбінацій схрещування. Добре видно, що результати реципрокних схрещувань завжди різні й емпіричні частоти алелів у F₂ не відповідають теоретичним та відхиляються у бік частот батьківського компоненту схрещування. Це збігається з даними попередніх досліджень (Bцrner, Korzun, 1998), де гени Sec1 та Sec3 та ген самонесумісності S локалізовано на хромосомі 1R, а ген Sec2 - на хромосомі 2R, де знаходиться і ген Z.

Взаємозв'язок між ознакою висота рослини та біохімічними ознаками. Основною метою дослідження було встановити генетичний контроль ознаки довжина стебла у чотирьох короткостеблих популяцій та локалізувати гени короткостеблості, застосовуючи біохімічні гени-маркери деяких хромосом жита. За даними нашого дослідження, у контролі довжини стебла в вивчених популяціях бере участь три гени з вираженим впливом на середнє значення ознаки, тобто QTL. Два з них, напівдомінантні, В та С, мають протилежну спрямованість: перший зменшує довжину стебла, другий її збільшує. Ген А, що сприяє розвитку короткого стебла, виявився мультиалельним з адитивним типом міжалельної взаємодії. За алелями гену А всі чотири популяції жита, що вивчалися, відрізняються одна від одної. Щоб дізнатися, чи існує зв'язок між геном, що впливає на довжину стебла, та певним біохімічним геном, всі рослини популяції розділяли на дві групи: 1) рослини, електрофоретичний спектр насіння яких має компонент, що характеризує певний ген-маркер; 2) рослини, електрофоретичний спектр насіння яких таким компонентом не характеризується. Для кожної з груп розраховували середнє значення за довжиною стебла, статистичну похибку та порівнювали середні значення за критерієм Ст'юдента. Якщо різниця між середніми значеннями статистично значуща, вважали, що біохімічний ген-маркер асоційований з геном, який контролює довжину стебла.

Результати такого аналізу свідчать, що жодний з ідентифікованих нами трьох QTL довжини стебла не зчеплений з геном в-Amy-R2. Коли групи формуються за ознакою присутність/відсутність компонентів спектру, що характеризують ген в-Amy-R1 (компоненти спектру 9, 1, 2), характерним є суттєве зменшення довжини стебла у рослин, на електрофореграмі амілази насіння яких наявні компоненти, що характерні для гена в-Amy-R1 у рослин популяцій з найменшою довжиною стебла Гном 2 та Гном 3. Отже, один з ідентифікованих нами QTL довжини стебла зчеплений з геном в-Amy-R1, тобто розташований у хромосомі 5R, а у цій хромосомі локалізований ген Ddw1. Із трьох ідентифікованих нами QTL довжини стебла найбільш схожим на ген Ddw1 виявився ген А. Це єдиний із трьох генів, за яким всі чотири популяції жита відрізняються одна від одної, а за даними табл. 4 зв'язок гена короткостеблості з геном в-Amy-R1 демонструють всі чотири популяції. Гном 1 та Гном 2 мають ген В з неповним домінуванням, який зменшує висоту стебла. Можливо, він розташований у хромосомі 2RS, оскільки групи, сформовані за наявністю компонентів спектру секалінів, властивих, судячи з їх розташування на спектрі, гену Sec2, вирізняються меншою довжиною стебла. У хромосомі 2D пшениці локалізовано напівдомінантний ген Rht8. Можливо, ідентифікований нами ген В з напівдомінантним ефектом короткостеблості є житнім гомеологом цього гену. Популяції Гном 1 та Гном 2 з одного боку та Болгарське короткостебле та Гном 3-- з іншого, характеризуються різними алелями цього гену. Болгарському короткостеблому, Гному 1 та Гному 2 властивий ген С, домінантний алель якого збільшує висоту стебла (домінування неповне). Групи рослин, об'єднані за наявністю компонента спектру, властивого гену Sec3, характеризуються у популяціях Гном 1 та Гном 2 достовірно більшою довжиною стебла, ніж групи рослин без маркерного компонента гену Sec3. Можна припустити, що ген С розташований на хромосомі 1R, однак жодних підтверджень у літературі такому висновку ми не знайшли.

За нашими даними, гени естерази Est-10 та Est-12 зчеплені з генами самонесумісності. У хромосомі 1R (ген самонесумісності S) до сьогоднішнього дня не локалізовано жодного гена естерази. За даними табл. 5, у хромосомі 5R (ген самонесумісності S5) розташований ген Est-10: групування рослин за ознакою наявність /відсутність компонента спектру 10, що характеризує ген Est-10 впливає на середні значення довжини стебла у трьох популяціях з чотирьох. Очевидно, існує зчеплення між геном А (Ddw1) та геном Est-10. Слабке зчеплення гену Ddw1 з геном естерази було продемонстровано раніше (Войлоков та ін., 1994). Ген Est-12, імовірно, розташований у хромосомі 2R (ген самонесумісності Z): групування рослин за ознакою наявність/відсутність компоненту спектру естерази 12, властивого гену Est-12 впливає на висоту рослин тільки у популяціях Гном 1 та Гном 2, які мають напівдомінантний ген короткостеблості В, що, за нашими даними, розташований у хромосомі 2R. На середньої сили зчеплення між геном Z та генами естерази також вказують дослідження групи А. Войлокова.

Результати нашої роботи з урахуванням оприлюднених у літературі даних інших дослідників дають змогу вважати, що можна визначити хромосомну локалізацію двох із трьох ідентифікованих нами QTL довжини стебла, що контролюють цю ознаку у чотирьох короткостеблих популяціях жита: ген А у хромосомі 5R та ген В у хромосомі 2R. Щодо гену С, його локалізацію ще не визначено.

Таблиця 4

Перевірка на зв'язок між ознакою довжина стебла та компонентами електрофоретичного спектру бета - амілази

Таблиця 5

Перевірка на зв'язок між ознакою довжина стебла та компонентами електрофоретичного спектру секалінів

Примітки: 1. У таблицях 4 та 5 фактичне значення критерію t перевищує табличне на рівні значущості * 0,05; **0,01; ***0,001. 2. Групу не сформовано через занизьку чи зависоку частку відповідного компоненту у популяції

Перевірку генів з різних систем (наприклад, Est-Sec) на незалежне комбінування (відсутність зчеплення) було виконано за тим же алгоритмом, що й генів з однієї білкової системи (Est-Est).

Результати перевірки виражено у значеннях ч² при порівнянні розподілу обсягів емпіричних фенотипових класів за двома генами та теоретичних, розрахованих на основі встановлених у дослідженні часток певних алелів цих генів (табл. 6). Дані таблиці свідчать про незалежне комбінування у всіх чотирьох популяціях жита всіх генів, які було досліджено. Цей результат добре збігається з літературними даними, адже у жодній роботі не було показано зчеплення між генами, що контролюють синтез секалінів, бета-амілази та естерази.

Таблиця 6

Результати перевірки (значення ч²) на незалежне комбінування у популяціях жита генів, що контролюють синтез секалінів, бета-амілази та зернової естерази

Примітка. Для пар двохалельних генів (всі крім Est-10, Est-12) df = 3, t_{st 0,05} = 7,81; t_{st 0,01} = 11.34; коли один з генів має три алеля, df = 5, t_{st 0,05} = 11,07; t_{st 0,01} = 15,04.

Наші дослідження з генетичного аналізу популяцій за ознакою висота стебла дають змогу зробити деякі рекомендації стосовно перспективності короткостеблих популяцій для залучення їх у селекційний процес як джерела генів короткостеблості. За нашими даними, такою популяцією слід вважати Гном 2. Притаманний йому алель гену А (Ddw1) має оптимальний вплив на вираз ознаки (13 см різниці з Болгарським короткостеблим) порівняно з алелем гена А Гнома 3 (43 см різниці з Болгарським короткостеблим). Крім того, ген В, який також діє в бік зменшення висоти, у Гнома 2, на відміну від Гнома 3, є напівдомінантним, а вести селекцію з використанням домінантного гена для виду-перехресника більш зручно порівняно з селекцією на рецесивний ген. Гном 1 має алель гена А з невеликим впливом на ознаку (8 см різниці з Болгарським короткостеблим) і тільки в цьому поступається Гному 2, від якого не відрізняється за двома іншими генами, що беруть участь у контролі короткостеблості. Щодо виявленого у дослідженні явища сумісного успадкування гену А та гену в-Amy-R1, важливим є те, що Гном 1, Гном 2 та Гном 3 відрізняються один від одного за частотами алелів 1, 2 та 9 цього гена, так що маркерами алелю А₂ (Гном 1) є компонент 2, алелю А₃ (Гном 2) -- алелі 2 та 1, алелю А₄ (Гном 3) -- алелі 9 та 1. Наскільки ефективним буде застосування алелів гена в-Amy-R1для маркірування, залежить від сили зчеплення між цими генами.

ВИСНОВКИ

Основну складність генетичного аналізу жита Secale cereale обумовлено біологією його розмноження: облігатне перехресне запилення забезпечується трьома генами самонесумісності, локалізованими у трьох з семи хромосом жита. Це є підставою для отримання різних результатів з генетичного аналізу жита за одними і тими ж ознаками залежно від того, якого роду деформації піддається геном жита перед його вивченням (інбредні лінії, житньо-пшеничні хромосомно-заміщені або додані лінії, трисомики).

1. Доведено, що тривалий добір (до 30 поколінь) на певний кількісний вираз однієї ознаки з неперервною мінливістю (висота рослини) в популяції жита з вільним запиленням усередині перетворює популяцію на чисту лінію стосовно головних генів, QTL, що контролюють критичну ознаку. Для генетичного аналізу таких популяцій придатні звичайні методи гібридологічного аналізу чистих ліній.

2. Визначено, що за генами, які не підлягали добору (гени бета-амілази, зернової естерази, секалінів), в популяції зберігаються співвідношення між різними генотипами, які властиві поліморфній популяції з вільним схрещуванням усередині, відповідно до закону Харді-Вайнберга.

3. Показано, що всі випадки порушення закону Харді-Вайнберга для окремих батьківських популяцій жита, а також невідповідність емпіричних часток генотипів у популяціях F₂ теоретично очікуваним на основі частот алелів у батьківських популяціях пов'язані зі зчепленням відповідних генів з генами самонесумісності.

4. Встановлено, що вирішальним показником ефективності застосування поліморфних генів у популяційно-генетичному аналізі як генів-маркерів є частки окремих алелів, що не повинні наближатися до 1 або до 0.

5. Визначено генотипи чотирьох короткостеблих популяцій жита за головними генами (QTL) висоти рослини. Різниця між популяціями контролюється трьома генами: ген А (Ddw1) з адитивною міжалельною взаємодією та напівдомінантні гени В і С з протилежним впливом на фенотип.

6. Сумісна передача QTL короткостеблості з ідентифікованими в нашому дослідженні генами-маркерами (-Amy-R1, -Amy-R2, Sec1, Sec2, Sec3, Est1- Est7) вказує на хромосомну локалізацію QTL: 5R -- ген А (Ddw1), 2R -- ген В.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мартыненко В.С., Скорик В.В., Антонюк М.З. Генетический анализ короткостебельных популяций ржи (Secale cereale L.) по признаку высота растений // Цитология и генетика. - 2003. - Т. 37, № 5. - С. 21-29.

2. Мартиненко В.С., Скорик В.В. Спадкова основа короткостеблих сортів жита як чинник формування сталих агроекосистем // Агроекологічний журнал. - 2003. - №4. - С. 46-50.

3.  Martynenko V.S., Yegorova T.V., Ternovskaya T.K. Genetic analysis of a cross-pollynated species, Secale cereale L., for the character with polymorphyc genetic basis // Цитология и генетика. - 2003. - Т. 38, № 3. - С. 29-37.

4. Мартыненко В.С., Антонюк М.З., Терновская Т.К. Наследование генов эстеразы в популяциях ржи (Secale cereale L.) // Цитология и генетика. - 2004. - Т. 38, № 5. - С. 16-23.

5. Martynenko V., Lyashuk O.Е., Antonyuk M. Cross-pollinated plant species for assessment and genetic analysis: methodical approaches // Abstracts of International Symposium “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources.” - Yalta, 2002. - p. 12.

6. Мартыненко В.С., Антонюк М.З. Полиморфизм некоторых образцов ржи (Secale cereale L.) по генам, кодирующим синтез ферментов //Сб. тезисов международной конференции молодых ученых “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений.” --Харьков, 2001.-- С. 45-46.

7. Мартиненко В.С., Скорик В.В. Успадкування висоти рослин у нового донора карликовості озимого жита // Сб. тезисов П международной конференции молодых ученых (19-23 мая 2003 г.). -- Харьков, 2003. -- С. 45-46.

8. Мартыненко В.С., Скорик В.В. Наследственная основа короткостебельности у донора Гном 3 и перспективы его использования в селекции ржи // Сборник тезисов научно-практической конференции "Озимая рожь. Селекция, семеноводство, технологии и переработка." - Киров, 2003. - С. 87-89.

9. Martynenko V.S., Antonyuk M.Z. Investigation of uncommon rye population for assessment of the polymorphism permanency with respect to some molecular genetic markers // Proc. International Symposium “Molecular Mechanisms of Genetic Processes and Biotechnology.” Moscow - Minsk, 2001.- P. 93-94.

10. Мартиненко В.С., Антонюк М.З. Генетична основа короткостеблості карликового жита Гном 3 // Збірник наукових праць "Фактори експериментальної еволюції організмів". - Київ: Аграрна наука. - 2003. - С. 158-162.

11. Мартиненко В.С. Генетический анализ популяций ржи, Secale cereale L., по електрофоретическому спектру бета-амилазы. // Збірник тез міжнародного наукового симпозіуму “Сучасні технології селекційного процесу сільськогосподарських культур”. - Харків, 2004. -- С. 161-162.

АНОТАЦІЯ

Мартиненко В.С. Принципи генетичного аналізу жита посівного (Secale cereale L.) за генетично моно- або поліморфними ознаками. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2005.

Дисертаційну роботу присвячено розробці принципів генетичного аналізу виду рослин з генетично обумовленою складною системою самонесумісності (Secale cereale L.) за ознаками, які контролюються генами з мономорфною та поліморфною основою у популяціях, що аналізуються. Вивчено 4 короткостеблих популяції жита, походження яких пов'язано з 30-річним спрямованим добором на певну висоту стебла. У дослідженні показано, що за генами, що контролюють висоту стебла, вивчені популяції жита є гомозиготними та мономорфними і відрізняються одна від однієї різною кількістю генів із загальної їх кількості три: один адитивний та два напівдомінантних. Структура всіх популяцій за генами, які контролюють бета-амілазу, зернову естеразу та запасні білки (секаліни) є поліморфною та такою, що відповідає закону Харді-Вайнберга. Вивчення динаміки частот алелів та генотипів за цими генами у гібридних популяціях F₂ від циклічних схрещувань короткостеблих популяцій надало можливість локалізувати гени короткостеблості у певних хромосомах через встановлення зчеплення цих генів з генами біохімічних ознак та зробити прогноз щодо перспективи їх використання у якості донорів ознаки коротке стебло.

Ключові слова: жито посівне, генетичний аналіз, тест сумісного шкалювання, гени короткостеблості, біохімічні маркери, гени-маркери, частоти генів, закон Харді-Вайнберга.

АННОТАЦИЯ

Мартиненко В.С. Принципи генетического анализа ржи посевной (Secale cereale L.) по генетически моно- или полиморфными признакам. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертационная работа посвящена разработке принципов генетического анализа вида растений с генетически обусловленной сложной системой самонесовместимости (Secale cereale L.) по признакам, которые в изученных популяциях имеют мономорфное (высота растения) или полиморфное (биохимические признаки) генетическое обеспечение. Изучены 4 короткостебельных популяции ржи, происхождение которых связано с 30-летним направленным отбором на определенное выражение признака длина стебля. Высота родительских популяций составляла от 35 см у Гнома 3 до 120 см у Болгарской короткостебельной. Были проведены циклические скрещивания между исходными формами, получены поколения F₁, F₂ и беккроссы к каждой из родительских форм. Наше исследование показало, что по генам, контролирующим высоту стебля, изученные популяции ржи являются гомозиготными и мономорфными. Они отличаются друг от друга одним, двумя или тремя генами из трех идентифицированных в этих популяциях: один аддитивный, два -- с неполным доминированием. Генетические различия между популяциями установлены с использованием теста совместного шкалирования Кавалли на данных оценки родительских и ряда гибридных популяций, полученных от циклических скрещиваний. Кроме изучения количественных признаков производили електрофоретическое изучение растительного материала по ряду ферментных систем и запасным белкам с целью поиска биохимических маркеров для генов количественных признаков. Выявлен внутри- и межпопуляционный полиморфизм короткостебельных популяций по генам, контролирующим бета-амилазу, зерновую эстеразу и запасные белки (секалины). Соотношение аллелей полиморфных генов и соответствующих генотипов соответствует закону Харди-Вайнберга. Изучение динамики частот аллелей и генотипов по полиморфным генам в популяциях F₂ от циклических скрещиваний популяций позволило локализовать гены короткостебельности в определенных хромосомах путем установления сцепления между ними и биохимическими генами-маркерами, хромосомная локализация которых из литературы известна: сцепление идентифицированных QTL высоты стебля с генами -Amy-R1, -Amy-R2, Sec1, Sec2, Sec3 и Est1- Est7) указывает на их локализацию на хромосомах 1R, 2R и 5R. Результаты исследования позволяют прогнозировать перспективность использования изученных популяций в качестве источника генов короткостебельности в селекционных программах.

Ключевые слова: рожь посевная, генетический анализ, тест совместного шкалирования, гены короткостебельности, биохимические маркеры, гены-маркеры, частоты генов, закон Харди-Вайнберга.

SUMMARY

Martynenko V.S. Genetic Analysis Principles of Rye Cultivated (Secale cereale L.) for genetically mono- or polymorphous characters. - Manuscript.

Thesis for PhD degree (Biology) by the speciality 03.00.15 - genetics. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences, Kyiv, 2005.

The thesis is devoted to elaboration of genetic analysis principles for plant species with genetically caused complicated system for self-incompatibility (Secale cereale L.) depending from character type, for which rye populations are analyzed. Four short-stem rye populations derived from direct selection out the initial rye population during 30 years for fixed volume of the trait are investigated. The populations studied were shown to be homozygous and monomorphous as for genes controlling stem height. They differ from each other for one; two or three genes of a list of three genes, one of which is additive and two are semi-dominant. The populations studied were shown to agree with Hardy-Weinberg low as to genes for beta-amylase, seed esterase, and storage proteins...