Інтерферон-індукована система 2',5'-олігоаденілату в лімфоїдних клітинах щурів за умов опромінення

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ІНТЕРФЕРОН-ІНДУКОВАНА СИСТЕМА 2?,5?-ОЛІГОАДЕНІЛАТУВ ЛІМФОЇДНИХ КЛІТИНАХ ЩУРІВ ЗА УМОВ ОПРОМІНЕННЯ

03.00.04 - біохімія

ПРОКОПОВА КАТЕРИНА ВАСИЛІВНА

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Остапченко Людмила Іванівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Волков Георгій Леонідович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, завідувач відділу структури і функції білка

доктор біологічних наук, професор, академік УААН Бойко Анатолій Леонідович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри вірусології

Провідна установа: Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича МОН України, м. Чернівці

Захист відбудеться “28” листопада 2005 року о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58

Автореферат розісланий “____” ____________ 2005 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

АНОТАЦІЯ

Прокопова К.В. Інтерферон-індукована система 2?,5?-олігоаденілату в лімфоїдних клітинах щурів за умов опромінення. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2005.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню ключових компонентів інтерферон-залежного месенджерного каскаду 2?,5?-олігоаденілату за умов опромінення в дозах 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 Гр у лімфоїдних клітинах селезінки та тимусу щурів, як одних з найбільш радіочутливих. Проаналізовано участь даного каскаду в регуляції циклічних нуклеотидів та іонів кальцію за дії іонізуючої радіації. Також вивчено вплив на досліджувані показники індукторів інтерферону та біологічно активної речовини сквалену при їх застосуванні in vitro та in vivo з метою корекції наслідків променевого впливу.

Встановлено, що радіація спричиняє суттєві зміни активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази та титру інтерферону в лімфоцитах. Крім того показані післяпроменеві зміни вмісту циклічних нуклеотидів та концентрації іонів кальцію, динаміка яких має характер, подібний до змін основних показників системи 2?,5?-олігоаденілату, що свідчить про тісні взаємозв'язки між інтерферон-, циклонуклеотид- та кальцій-залежним регуляторними процесами. Можна припустити, що особливістю післярадіаційних процесів у клітині є дезінтеграція взаємозв'язків між цими системами та порушення цілісності функціонування загальної регуляторної сітки. Введення індукторів інтерферону та препарату сквалену посилювало компенсаторну відповідь імунокомпетентних клітин на дію радіації, особливо за вищих із застосованих доз, що має важливе значення з точки зору доцільності практичного застосування даних препаратів як протипроменевих засобів.

Ключові слова: інтерферон, індуктори інтерферону, 2',5'-олігоаденілат-синтетаза, лімфоїдні клітини, рентгенівське випромінення.

АННОТАЦИЯ

Прокопова К.В. Интерферон-индуцированная система 2?,5?-олигоаденилата в лимфоидных клетках крыс при облучении. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2005.

Диссертационная работа посвящена исследованию ключевых компонентов интерферон-зависимого мессенджерного каскада 2?,5?-олигоаденилата при действии облучения в дозах 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 Гр в лимфоидных клетках селезенки и тимуса крыс как одних из наиболее радиочувствительных. Проанализировано участие данного каскада в регуляции циклических нуклеотидов и ионов кальция при действии ионизирующей радиации. Кроме того, изучено влияние на исследуемые показатели индукторов интерферона и биологически активного вещества сквалена при их использовании в системе in vitro и in vivo с целью коррекции последствий лучевого влияния.

На основании проведенных исследований установлено, что влияние радиации вызывает существенные изменения активности 2?,5?-олигоаденилат-синтетазы и титра интерферона в лимфоидных клетках. В более радиочувствительных лимфоцитах селезенки активность фермента достигала максимального уровня при более низких дозах по сравнению с показателем в относительно более радиоустойчивых клетках тимуса. Облучение животных в максимальной из используемых доз 1,0 Гр вызывало снижение как ферментативной активности, так и титра интерферона в клетках обоих типов, что может свидетельствовать об угнетающем действии ионизирующей радиации на интерферон-зависимую систему 2?,5?-олигоаденилата при повышении дозы. Кроме того было показано, что в иммунокомпетентных клетках происходят постлучевые изменения содержания циклических нуклеотидов и концентрации ионов кальция, динамика которых имеет характер, подобный изменениям основных показателей системы 2?,5?-олигоаденилата, что свидетельствует о тесных взаимосвязях между интерферон-, циклонуклеотид- и кальций-зависимыми регуляторными процессами. Полученные данные дают основания предположить, что особенностями послерадиационных процессов в клетке являются дезинтеграция взаимосвязей между этими системами и нарушение их функционирования.

Показано, что использование индукторов интерферона в системах как in vitro, так и in vivo, а также препарата сквалена, при введении его животным in vivo, усиливало компенсаторный ответ иммунокомпетентных клеток на влияние ионизирующей радиации. Действие препаратов проявлялось в увеличении активности 2?,5?-олигоаденилат-синтетазы, титра интерферона и соотношения циклических нуклеотидов при более высоких из использованных доз (0,75 и 1,0 Гр). Результаты исследований имеют большое значение для практического использования этих веществ как противолучевых средств, а также для разработки на их основе новых препаратов с радиопротекторными свойствами.

Ключевые слова: интерферон, индукторы интерферона, 2?,5?-олигоаденилат-синтетаза, лимфоидные клетки, рентгеновское излучение.

SUMMARY

Prokopova K.V. Interferon-induced system of 2?,5?-oligoadenylate in rat lymphoid cells under the conditions of irradiation. - Manuscript.

Dissertation for the PhD degree in speciality - 03.00.04. - Biochemistry. - Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv, 2005.

The dissertation is devoted to investigation of the key components of interferon-dependent 2?,5?-oligoadenylate messenger cascade under the conditions of irradiation in 0,25; 0,5; 0,75 and 1,0 Gy doses in rat spleen and thymus lymphoid cells as ones of the most radiosensitive. Participation of given cascade in regulation of cyclic nucleotides and calcium ions under the ionizing radiation action was analyzed. Also influence of interferon inducers and biologically active substance squalene upon the investigated indexes was studied under their use in vitro and in vivo for the purpose of radiation consequences correction.

It was established that radiation caused considerable changes of 2?,5?-oligoadenylate-synthetase activity and interferon titre in lymphoid cells. Furthermore postradiation changes of cyclic nucleotides contents and calcium ions concentrations were shown. And their dynamic is similar to the changes of 2?,5?-oligoadenylate system principal indexes. The last is the evidence of close interactions between interferon-, cyclic nucleotide- and calcium-dependent regulatory processes. Obtained data let presume that decomposition of interactions between these systems and disturbance of total regulatory network functioning integrity are the peculiarities of postradiation processes in the cell. It was shown that use of interferon inducers and squalene intensified lymphoid cell response on the radiation influence especially at the higher of applied doses. The last has a high profile in the view of expediency of these preparations practical use as radioprotective means.

Key words: interferon, interferon inducers, 2?,5?-oligoadenylate-synthetase, lymphoid cells, roentgen irradiation.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з найважливіших питань сьогодні є функціонування клітинних систем передачі сигналу, особливо за умов розвитку патологічних процесів. В даному аспекті привертають увагу інтерферон-залежні регуляторні месенджерні каскади, зокрема система 2?,5?-олігоаденілату, яка залучена до таких важливих процесів, як антивірусний захист, ріст і диференціація клітин, формування онкогенної стабільності та ін. [Goodbourn, 2000, Samuel, 2001]. Відомо, що 2?,5?-олігоаденілат, як вторинний посередник системи інтерферону, є медіатором клітинної відповіді на різні стресові фактори, зокрема на вірусну інфекцію, дію канцерогенів, мітогенів тощо [Itkes, 1994]. Доведено також участь ключового ферменту даного каскаду 2?,5?-олігоаденілат-синтетази у регуляції апоптичних та пухлинних процесів [Der, 1997; Player, 1998]. Роль інтерферон-індукованих сигнальних систем у механізмах клітинної відповіді на дію іонізуючого випромінення на сьогодні є маловивченим питанням. Встановлено радіозахисні властивості самого інтерферону та його індукторів, що обумовлює їх посилене використання в якості терапевтичних засобів [Македонов, 1997, Ueta, 1998], але залишаються нез'ясованими молекулярні механізми їх дії.

У зв'язку з цим важливим є дослідження ключових компонентів інтерферон-індукованої системи 2?,5?-олігоаденілату за умов дії випромінення у лімфоїдних клітинах, які є найбільш радіочутливими.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та виконана згідно з тематичним планом НДР № д.р. 0101U002291 “Розробка наукових основ пошуку біологічно активних сполук радіозахисної дії” в рамках комплексної наукової програми “Здоров'я людини”.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідити особливості функціонування інтерферон-залежної системи 2?,5?-олігоаденілату і участь в її регуляції циклічних нуклеотидів та іонів кальцію в лімфоїдних клітинах щурів в умовах тотального рентгенівського опромінення тварин у дозах 0,25; 0,5; 0,75 і 1,0 Гр. Для досягнення мети були поставлені такі завдання.

Визначити активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази та титр інтерферону в лімфоцитах тимусу та селезінки щурів за умов опромінення, а також на фоні обробки клітин індукторами інтерферону in vitro.

Дослідити рівень активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази в лімфоцитах щурів за дії радіації на фоні введення препаратів циклоферону та сквалену in vivo.

Визначити рівень циклічних нуклеотидів (цАМФ та цГМФ) та вміст іонів кальцію в лімфоїдних клітинах тимусу і селезінки щурів за умов опромінення та введення препаратів циклоферону та сквалену in vivo.

Проаналізувати основні механізми реалізації відповіді імунокомпетентних клітин на дію променевого фактора за участю інтерферон-індукованого каскаду 2?,5?-олігоаденілату і роль у його функціонуванні циклічних нуклеотидів та іонів кальцію.

Об'єкт дослідження: особливості функціонування інтерферон-індукованого каскаду 2?,5?-олігоаденілату і його регуляція циклічними нуклеотидами та іонами кальцію.

Предмет дослідження - активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази, титр інтерферону, рівень циклічних нуклеотидів та іонів кальцію.

Методи дослідження - біохімічні (визначення активності ферменту), радіоізотопні (визначення вмісту циклічних нуклеотидів), вірусологічні (визначення титру інтерферону), флуоресцентні методи (визначення вмісту кальцію) та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведене дослідження впливу іонізуючої радіації на інтерферон-залежний шлях проходження сигналу в лімфоїдних клітинах тварин і залучення до регуляції вищезазначених процесів циклічних нуклеотидів та іонів кальцію. Показана післярадіаційна стимуляція 2?,5?-олігоаденілат-синтетази та підвищення внутрішньоклітинного вмісту інтерферону в лімфоцитах, виділених з тимусу і селезінки щурів після рентгенівського опромінення в дозах 0,25; 0,5; 0,75 і 1,0 Гр. Встановлений вплив циклічних нуклеотидів та кальцію на активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази. Результати про особливості функціонування інтерферон-індукованої системи 2?,5?-олігоаденілату за умов впливу іонізуючого випромінення сприятимуть розумінню механізмів участі вищезазначеної системи у формуванні радіоіндукованої відповіді лімфоїдних клітин та можливих регуляторних впливів на неї циклонуклеотид-залежного та Са2+-залежного каскадів.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлено, що різні індуктори інтерферону посилюють стимулюючий ефект опромінення на активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази та рівень інтерферону при їх застосуванні in vivo та in vitro. Введення тваринам in vivo індуктора інтерферону циклоферону та біологічно активної речовини сквалену приводило до корекції променевого впливу на рівень циклічних нуклеотидів та кальцію. Виявлене зростання функціональної активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази за умов дії радіації та особливо посилення післяпроменевої стимуляції даного ферменту при застосуванні індукторів інтерферону та біологічно активних речовин має важливе значення для розробки нових підходів у пошуку засобів протипроменевого захисту клітини та організму в цілому.

Особистий внесок здобувача. Пошук та аналіз літературних джерел, проведення експерименту, обробка результатів досліджень виконані дисертантом особисто. Планування роботи, її теоретичне обґрунтування та розробка методичних підходів щодо проведення досліджень здійснені разом з науковим керівником. Науковим керівником здійснювались перевірка та редагування матеріалів, підготовлених до друку, а також розділів дисертації. Досліди на вірусологічних моделях проводились сумісно зі співробітниками відділу молекулярної генетики д.б.н. Карповим О.В. та відділу імуномодуляторів та інтерферонів к.б.н. Жолобак Н.М. Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації викладались на Всеукраїнській конференції молодих вчених “Актуальные вопросы современного естествознания” (Сімферополь, 2003), ІІІ з'їзді радіаційних досліджень (Київ, 2003), ІV Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 2004), Установчому З'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), Російській науковій конференції “Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты” (С.-Петербург, 2004), Х Конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Чернівці, 2004), IV Міжнародній конференції “Біоресурси і віруси” (Київ, 2004), “Міжгалузевій конференції молодих науковців” (Київ, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Шевченківська весна” (Київ, 2004), І Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005), 5-th PARNAS conference Molecular mechanisms of cellular signaling (Kyiv, 2005).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 статей у фахових виданнях та 13 тез у матеріалах і тезах вітчизняних та міжнародних конференцій і з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, висновків та списку літературних джерел (235 найменувань). Роботу викладено на 153 сторінках друкованого тексту, проілюстровано 24 рисунками та 8 таблицями.

Матеріали та методи дослідження

В дослідах використовували щурів лінії Вістар обох статей масою 130±10 г. Тварин опромінювали на установці РУМ-17 у дозах 0,25; 0,5; 0,75 та 1,0 Гр. Умови опромінення: потужність дози 17 сГр / хв, фільтри 0,5 мм Сu + 1 мм Аl, напруга на трубці 200 кВ, сила струму 5 мА, відстань до поверхні шкіри тварин 50 см. Тварин декапітували через 12 годин після опромінення та видаляли селезінку і тимус. Лімфоцити селезінки отримували за методом [Boyum, 1968]. Тимоцити із суспензії клітин тимусу виділяли за методом [Морозов, 1985].

Індукцію інтерферону проводили in vitro на моделі лімфоцитів селезінки і тимусу контрольних та опромінених щурів з використанням препаратів “Циклоферон” (“Полісан”, Росія), полі(І)полі(Ц) (“Sigma”, США), галогенпохідних сполук серії “Тилорони” (розробки Одеського ФХІ ім. О.В. Богатського) згідно рекомендацій [Коваленко, 2000, Chacko, 2000, Суетина, 1990]. Крім того, in vivo застосовували циклоферон шляхом інтраперитонеальних ін'єкцій [Popovich, 2000], а також сквален шляхом перорального введення [Чернов, 1992].

Титр інтерферону визначали шляхом мiкротитрування в перевивнiй культурі клітин проти 100 ТЦД50 вірусу-індикатора за методом [Ершов, 1999]. Активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази визначали спектрофотометрично і виражали в нмоль ФФн • хв-1 • мг-1 білка [Justensen, 1992]. Вміст білка в пробі визначали за методом Лоурі [Lowry, 1951].

Вміст циклічних нуклеотидів визначали згідно методичних рекомендацій [Steiner, 1972] з використанням стандартних наборів для визначення цАМФ і цГМФ фірми “Amercham” (Великобританія) та виражали у пмоль•мг-1 білка. Вміст іонів кальцію визначали за методом [Tsukuda, 1987] з використанням флуоресцентного зонду індо-1 і виражали в нмоль • 10-6 клітин. Експериментальні дані оброблялись загальноприйнятими методами варіаційної статистики [Кучеренко та ін., 2001].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У ході досліджень було показано підвищення активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази у лімфоцитах опромінених щурів порівняно з інтактними тваринами (рис. 1). За опромінення в дозі 0,25 Гр у спленоцитах активність ферменту максимально зростала - в 3 рази, тоді як у тимоцитах - в 1,6 раза. При підвищенні дози до 0,5 та 0,75 Гр у лімфоцитах селезінки зростання активності було менш вираженим, а за дози 1,0 Гр показник був у 2 рази нижчим за контрольні значення, тоді як у клітинах тимусу спостерігалось збільшення олігоаденілат-синтетазної активності: за доз 0,5 Гр і 0,75 Гр - в 1,8 та 2,3 раза, за дози 1,0 Гр показник був вдвічі вищим за контроль.

Вплив випромінення в досліджуваних дозах на активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази виявився різним: максимальне зростання активності ферменту в лімфоцитах селезінки було викликане опроміненням у більш низьких дозах - 0,25 Гр, тоді як у клітинах тимусу ефект був протилежним - максимальне зростання показника було виявлене за дози 0,75 Гр. Опромінення в дозі 1,0 Гр приводило до зменшення активності ферменту в лімфоцитах обох органів, що можна пояснити виникненням у клітинах більш значних порушень у метаболічних реакціях. Той факт, що у спленоцитах за дози 1,0 Гр показник був нижчим за контроль, може бути пов'язаним із більшою чутливістю лімфоцитів селезінки до радіації, порівняно з тимоцитами. Відомо, що в клітинах існує базальний рівень активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази, підвищення якого пов'язують з посиленням експресії генів ферменту [Иткес, 1985]. Тому отримані дані дозволяють зробити припущення про радіаційно-індуковану активізацію сигнального шляху 2?,5?-олігоаденілату, що пояснює стимуляцію 2?,5?-олігоаденілат-синтетази в лімфоїдних клітинах опромінених щурів та може розглядатися як прояв компенсаторної реакції імунокомпетентних клітин на дію іонізуючої радіації.

Оскільки 2?,5?-олігоаденілат-синтетаза є одним з найважливіших інтерферон-індукованих ферментів [Wang, 1997; Rebouillat, 1999], збільшення її активності за дії променевого фактора може бути пов'язаним з індукцією самого інтерферону, що узгоджується з літературними даними про здатність радіації посилювати синтез ендогенного цитокіну [Бабунина, 1998; Маркевич, 1999], у зв'язку з чим доцільним було провести визначення його титру в лімфоцитах опромінених щурів. В ході досліджень було виявлене суттєве зростання титру інтерферону в лімфоїдних клітинах опромінених щурів (табл. 1).

інтерферон олігоаденілат лімфоїдний опромінення

Таблиця 1. Титр інтерферону в лімфоцитах тимусу і селезінки щурів, опромінених у різних дозах (МО • мл-1), M m, n = 5

Ї показник поза чутливістю методу, * p 0,05 по відношенню до контролю

Встановлено, що променевий фактор впливає на рівень ендогенного інтерферону по-різному, що узгоджується з літературними даними, які свідчать про підвищення рівня цитокіну за низьких доз радіації (0,075 Гр) та його зменшення за більших доз (2,0 Гр) [Li Z.-S., 2000]. Можна припустити, що збільшення титру інтерферону є пов'язаним із участю даного цитокіну у формуванні відповіді клітин на дію випромінення та є проявом включення післярадіаційних захисних механізмів. Опромінення у вищих дозах, очевидно, пригнічує його синтез. Різна динаміка змін рівня цитокіну та активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази за різних доз опромінення тварин може бути пов'язана з тим, що фермент зазнає складного регуляторного впливу з боку інших месенджерних систем. Зокрема, є дані про взаєморегуляцію систем 2?,5?-олігоаденілату та циклічних нуклеотидів [Itkes, 1994].

Дані про роль цАМФ та цГМФ у метаболічних процесах в імуноцитах суперечливі: зміни внутрішньоклітинного рівня циклічних нуклеотидів можуть приводити як до пригнічення, так і до активізації метаболізму клітин, залежно від фази клітинного циклу, тривалості та кінетики змін концентрацій цАМФ і цГМФ. Важливим показником, що відображає координування регуляторних механізмів клітини, вважають співвідношення цАМФ / цГМФ [Остапченко, 1999; Соболев, 1987]. Сьогодні ряд робіт присвячений взаємозв'язкам між системами циклічних нуклеотидів та інтерферону, проте дані про їх взаємодію є неоднозначними [Bick, 1999; Karpov, 1999; Sales, 1999; Kolachala; 2005]. Інтерферон здебільшого викликає збільшення вмісту циклічних нуклеотидів, які у свою чергу сприяють синтезу цитокінів. Крім того, існують дані, що 2?,5?-олігоаденілати також здатні збільшувати рівень цАМФ і цГМФ [Yin, 1989]. Вважається, що взаєморегуляція систем 2?,5?-олігоаденілату та циклічних нуклеотидів відбувається за механізмом негативного зворотного зв'язку: збільшення рівня цАМФ приводить до індукції 2?,5?-олігоаденілат-синтетази та підвищення вмісту олігоаденілату, який в свою чергу, активізуючи фосфодіестеразу цАМФ, викликає зменшення концентрації циклічного нуклеотиду [Itkes, 1994], що дає підстави розглядати їх як компоненти єдиної регуляторної системи клітини. Враховуючи універсальний характер відповіді системи циклічних нуклеотидів на вплив різних стресових факторів, у тому числі іонізуючого випромінення, а також взаємозв'язки між системами циклічних нуклеотидів, інтерферону та каскадом 2?,5?-олігоаденілату, доцільним було дослідити зміни вмісту цАМФ і цГМФ у лімфоцитах селезінки та тимусу щурів, опромінених у вищезазначених дозах, та порівняти їх з динамікою змін активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази та титру інтерферону.

Було показано, що в лімфоцитах тимусу опромінення спричиняло однаково спрямовані зміни концентрації обох циклічних нуклеотидів (рис. 2 А). За дози 0,25 Гр вміст цАМФ та цГМФ досягав максимального рівня, перебільшуючи контроль у 4,2 та 3,4 раза відповідно. За вищих доз зростання показників було менш вираженим. Слід зазначити, що максимальне співвідношення цАМФ / цГМФ в лімфоцитах тимусу відповідало дозі 0,5 Гр.

У лімфоцитах селезінки спостерігали різноспрямовані зміни вмісту цАМФ і цГМФ за дії радіації у різних дозах: підвищенню рівня одного з них відповідало зниження іншого (рис. 2 Б). За дози 0,25 Гр концентрація цАМФ збільшувалась у 2,9 раза, тоді як цГМФ, навпаки, зменшувалась. За дози 0,5 Гр вміст цАМФ наближався до контрольного рівня, в той час як цГМФ зростав у 1,9 раза, досягаючи максимального приросту. За дози 0,75 Гр концентрація цАМФ збільшувалась у 2,4 раза, тоді як рівень цГМФ перевищував контрольні значення лише в 1,2 раза. Максимальне співвідношення цАМФ / цГМФ відповідало дозі 0,25 Гр. За опромінення тварин у дозі 1,0 Гр у спленоцитах вміст обох циклічних нуклеотидів був меншим, порівняно з контролем.

Отримані результати узгоджуються з літературними даними, згідно з якими за дії радіації у низьких та сублетальних дозах внутрішньоклітинний вміст цАМФ збільшується, проте вплив випромінення на рівень цГМФ є неоднозначним, оскільки його концентрація може як зростати, так і знижуватись [Слатвинская, 1990; Зудина, 1993]. Беручи до уваги дані про пригнічення проліферації клітин при зростанні вмісту цАМФ [Соболев, 1987; Остапченко, 1999], можна припустити, що післяпроменеві зміни концентрації циклічних нуклеотидів, зокрема виявлене нами збільшення співвідношення цАМФ / цГМФ, спрямовані на інгібування поділу клітин, збільшення часу для усунення радіаційно-індукованих пошкоджень та відновлення нормального їх функціонування. Динаміка змін співвідношення цАМФ / цГМФ в лімфоцитах тимусу має характер, подібний до післярадіаційних змін титру інтерферону та активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази. Показник співвідношення був максимальним за дози 0,5 Гр, що відповідає і найвищому значенню титру інтерферону, проте залишався значно більшим за контроль і за дози 0,75 Гр, за якої було виявлено максимальне зростання активності досліджуваного ферменту. У клітинах селезінки також показана подібність між змінами співвідношення циклічних нуклеотидів та активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази із максимальним зростанням обох показників за дози 0,25 Гр. Співвідношення цАМФ / цГМФ та значення титру інтерферону в спленоцитах змінюються під дією радіації по-різному. За дози 0,25 Гр обидва показники істотно зростали, за дози 0,5 Гр ефекти були протилежними - титр цитокіну досягав максимуму, тоді як співвідношення цАМФ / цГМФ істотно зменшувалося. За вищих доз 0,75 та 1,0 Гр і рівень інтерферону, і співвідношення циклічних нуклеотидів, подібно до активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази, наближались до контрольного рівня.

Зазначена в імунокомпетентних клітинах відповідність змін активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази та концентрації цАМФ узгоджується з літературними даними, згідно яких даний фермент може індукуватися циклічним АМФ [Itkes, 1994]. Протилежний ефект впливу радіації на активність ферменту та вміст цГМФ можна пояснити, спираючись на дані про різноспрямований вплив іонізуючого випромінення на системи цАМФ та цГМФ [Слатвинская, 1990; Зудина, 1993]. З іншого боку, оскільки є відомості про індукуючий вплив цАМФ на 2?,5?-олігоаденілат-синтетазу [Itkes, 1994], а тісний взаємозв'язок систем цАМФ та цГМФ не викликає сумнівів, не можна виключати прямої взаєморегуляції 2?,5?-олігоаденілат-синтетази та цГМФ поряд із цАМФ. Відсутність у спленоцитах подібності змін співвідношення циклічних нуклеотидів та рівня інтерферону за різних доз опромінення можна пов'язати з більшою радіочутливістю клітин селезінки [Остапченко, 1999]. Очевидно, в цих клітинах уже за незначних доз відбувається дезінтеграція зв'язків між різними сигнальними системами, які в нормі функціонують узгоджено.

Важливим регуляторним фактором у клітині, залученим у розвиток відповіді клітини на дію іонізуючої радіації, поряд із циклічними нуклеотидами є іони кальцію [Остапченко, 1999]. Зокрема показано, що рентгенівське опромінення щурів у дозах 1,0 Гр та 10 Гр викликає значне підвищення вмісту вільного кальцію у спленоцитах [Габай, 1990]. Крім того, сьогодні активно досліджують питання взаємозв'язків між рівнем продукції інтерферонів та змінами цитозольної концентрації іонів Са2+: є дані, що обробка клітин даним цитокіном спричиняла збільшення вмісту внутрішньоклітинного кальцію [Ahn, 2003; Menon, 2004], який часто залучений у реалізації відповіді інтерферону [Ignjatovic, 2004; Xu, 2005]. Проте роль іонів Са2+ у функціонуванні інтерферон-індукованого каскаду 2?,5?-олігоаденілату не є остаточно з'ясованою. У зв'язку з вищезазначеним цікаво було дослідити вміст іонів кальцію в лімфоїдних клітинах опромінених щурів.

Були встановлені суттєві зміни концентрації кальцію в лімфоцитах тимусу та селезінки щурів за дії іонізуючої радіації, які мали різну спрямованість у досліджуваних клітинах (рис. 3). У клітинах тимусу за опромінення у дозах 0,25; 0,5 та 0,75 Гр рівень Са2+ зменшувався, порівняно з таким у тимоцитах неопромінених тварин, а за дози 1,0 Гр показник наближався до контрольного значення. У спленоцитах опромінених тварин показано значне зростання вмісту вільного кальцію, однак за дози 1,0 Гр досліджуваний показник, як і в лімфоцитах тимусу, наближався до контрольного рівня. Подібності у динаміці післяпроменевих змін концентрації іонів Са2+ та показників інтерферон-залежного каскаду 2?,5?-олігоаденілату встановлено не було, що може біти наслідком роз'єднання функціональних зв'язків між даними регуляторними системами через порушення певних їх ланок у результаті дії променевого фактора.

На основі отриманих даних можна припустити, що інтерферон-, циклонуклеотид- та кальцій-залежна сигнальні системи, які в нормі функціонують у тісному взаємозв'язку, є залученими до реалізації компенсаторної відповіді імунокомпетентних клітин на дію радіації. Особливістю післярадіаційних реакцій клітини можна вважати дезінтеграцію взаємозв'язків між цими каскадами та порушення цілісності функціонування загальної регуляторної системи. Вищезазначені процеси розвиваються у більш радіочутливих лімфоцитах селезінки за умов дії радіації у менших дозах (0,5 Гр), а у відносно стійких тимоцитах - за умов опромінення в більших дозах (1,0 Гр).

З метою з'ясування можливих шляхів корекції післяпроменевих змін функціонування інтерферон-залежної системи 2?,5?-олігоаденілату дослідження впливу радіації на вищезазначену систему здійснювали на фоні застосування різних індукторів інтерферону в моделі in vitrо (ізольовані лімфоцити преінкубували з циклофероном, полі(І)полі(С), тилорон-тригідрохлоридом 223 та тилорон-дигідрохлоридом 334) та in vivo (тваринам вводили циклоферон шляхом внутрішньочеревинних ін'єкцій та біологічно активну речовину сквален - перорально в розчині рослинної олії).

Було показано, що преінкубація лімфоїдних клітин з індукторами інтерферону in vitro спричиняла збільшення активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази, порівняно з її значеннями в клітинах, які не підлягали обробці вищевказаними речовинами. У результаті оцінки приросту активності досліджуваного ферменту під впливом використовуваних за опромінення індукторів по відношенню до змін даного показника, викликаних дією радіації без обробки клітин препаратами, було виявлено таку закономірність. Тилорон-дигідрохлорид 334, полі(І)·полі(Ц) та циклоферон за умов впливу променевого фактора викликали найбільші зміни активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази в клітинах обох імунних органів за дози 0,75 Гр. В той же час тилорон-тригідрохлорид 223 спричиняв найбільший приріст активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази за дози 0,25 та 0,5 Гр у лімфоцитах тимусу й селезінки відповідно. Можливо, виявлені відмінності пов'язані з особливостями фізіології цих органів імунної системи, їх різною чутливістю до дії променевого фактора, а також з різними механізмами дії та органоспецифічністю використаних індукторів інтерферону тощо.

Також нами було показано збільшення титру інтерферону в лімфоцитах щурів при дії різних індукторів in vitro за умов опромінення (табл. 2). У клітинах тимусу тилорон-тригідрохлорид 223 та тилорон-дигідрохлорид 334 стимулювали значне зростання титру інтерферону, особливо за максимальної дози 1,0 Гр, за якої без обробки клітин індукторами інтерферон визначити не вдалось. Полі(І)·полі(Ц) та циклоферон у тимоцитах виявились більш ефективними за дози 0,5 Гр - титр інтерферону збільшився в 1,4 раза в обох випадках. У лімфоцитах селезінки тилорон-тригідрохлорид 223 викликав найбільший приріст титру інтерферону (в 4 рази) за дози 0,25 Гр, тоді як тилорон-дигідрохлорид 334, полі(І)·полі(Ц) та циклоферон стимулювали надзвичайно високі титри інтерферону за дози 1,0 Гр (див. табл. 2).

Таблиця 2. Титр інтерферону в лімфоцитах тимусу опромінених щурів за умов преінкубації з різними індукторами даного цитокіну (МО • мл-1), M m, n = 5

Ї показник поза чутливістю методу, * p 0,05 по відношенню до контролю

Отримані результати свідчать про те, що застосування індукторів інтерферону за умов впливу променевого фактора посилює післярадіаційну стимуляцію ендогенного синтезу цитокіну в лімфоїдних клітинах щурів. У зв'язку з цим можна припустити, що захисні механізми, які ініціюються радіаційним впливом і протікають за участю системи інтерферону, спрямовані на ліквідацію післяпроменевих пошкоджень у клітині, інтенсифікуються при застосуванні індукторів даного цитокіну. Встановлений для розглянутих індукторів ефект істотного підвищення титру інтерферону та активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази в лімфоїдних клітинах за опромінення у вищих дозах (0,75 Гр та 1,0 Гр), коли без додаткової обробки клітин синтез ендогенного цитокіну пригнічувався, а ефект активізації досліджуваного ферменту послаблювався під впливом радіації, має особливо важливе значення в контексті доцільності практичного застосування даних препаратів як протипроменевих засобів за умов дії вищих доз випромінення.

Оскільки було показано значне посилення стимуляції 2?,5?-олігоаденілат-синтетази у лімфоцитах опромінених щурів за умов обробки циклофероном in vitro, для порівняння було досліджено його вплив на фермент при застосуванні in vivo. Крім того, оскільки в наш час зростає зацікавленість до використання біологічно активних речовин, які посилюють стійкість організму до різних негативних факторів, у тому числі променевого, було розглянуто також вплив сквалену при введенні in vivo на активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази в клітинах опромінених тварин. Вибір даної речовини обумовлений тим, що вона є антиокислювальним та протипухлинним агентом [Kohno, 1995; Smith, 2000] та здатна підвищувати активність імунної системи [Kelly, 1999]. Також існують дані, що сквален має радіопротекторну дію, посилюючи ферментативний та неферментативний захист у тканинах, збільшуючи адаптивність організму [Konyk, 2002]. У ході досліджень було показано, що введення тваринам циклоферону та сквалену in vivo зумовлювало підвищення активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази в лімфоїдних клітинах відносно її значень в системах без препарату за дії іонізуючого випромінення.

У лімфоцитах тимусу дія сквалену виявилася більш вираженою за дози 0,25 Гр, коли активність ферменту зростала втричі, порівняно з клітинами тварин, що не отримували препарат (рис. 4 А). При збільшенні дози опромінення застосування сквалену викликало незначні зміни досліджуваного показника. Циклоферон, навпаки, мав слабко виражену дію за нижчих доз. За дози 0,25 Гр активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази збільшувалася в 1,2 раза, за дози 0,5 Гр досліджуваний показник зростав у 1,4 раза, і в подальшому приріст активності ферменту збільшувався: при 0,75 Гр - 1,6 раза, при 1,0 Гр - майже вдвічі.

У лімфоцитах селезінки за усіх досліджуваних доз опромінення краще виражений ефект виявив циклоферон, викликаючи збільшення активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази втричі у неопромінених тварин, в 1,5 раза за опромінення в дозі 0,25 Гр, в 4 рази - за дози 0,5 Гр, в 1,4 і 2,2 раза за 0,75 та 1,0 Гр відповідно (рис. 4 Б). Таким чином, найбільший приріст активності ферменту виявлений за дози 0,5 Гр, проте за максимальної дози зафіксований її дворазовий приріст, подібно до виявленого в клітинах тимусу. Введення сквалену спричиняло зростання активності досліджуваного ферменту в лімфоцитах селезінки за усіх доз опромінення, проте спостережувані зміни мали менш виражений характер, порівняно з дією циклоферону. Так, у неопромінених щурів, що отримували сквален, активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази збільшувалась вдвічі, за опромінення в дозі 0,25 Гр вона зростала в 1,3 раза, за дози 0,5 Гр - в 2 рази; 0,75 Гр - в 1,5 раза, а за дози 1,0 Гр виявлено максимальний приріст активності ферменту (майже в 2 рази), порівняно з групою тварин, які не отримували препарат.

Таким чином, вплив сквалену та циклоферону in vivo на активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази у лімфоїдних клітинах щурів за дії іонізуючого випромінення проявлявся у збільшенні її рівня. Оскільки сквален, який не є індуктором інтерферону, викликав збільшення рівня активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази, можна припустити існування інших шляхів активізації ферменту під дією даного препарату. У будь-якому разі отримані дані дають підстави стверджувати, що сквален має виражену імуномодулюючу та протипроменеву дію, що узгоджується з літературними джерелами [Kelly, 1999; Konyk, 2002].

Індуктор інтерферону циклоферон посилював післярадіаційну стимуляцію 2?,5?-олігоаденілат-синтетази у двох експериментальних моделях - in vivo та in vitro. Порівнюючи результати вивчення впливу циклоферону на активність ферменту в цих системах, можна зробити висновок, що досліджувані показники досягали вищого рівня за умов преінкубації клітин з індуктором in vitro. Такий ефект може бути наслідком безпосередньої взаємодії препарату з клітинними рецепторами, результатом чого є інтенсивніша стимуляція досліджуваного ферменту, що може бути зумовлено більш ефективною індукцією інтерферону. Варто підкреслити, що циклоферон як in vivo, так і in vitro проявив більш виражений стимулюючий вплив на 2?,5?-олігоаденілат-синтетазу за опромінення тварин у вищих дозах, за яких активність ферменту була пригнічена дією радіації. Тому можна стверджувати, що циклоферон інтенсифікує захисні механізми клітини за участю інтерферон-індукованої системи олігоаденілату, ініційовані дією радіації та спрямовані на ліквідацію порушень, спричинених впливом променевого фактора.

Введення тваринам in vivo циклоферону та сквалену викликало також додаткові зміни рівня циклічних нуклеотидів у лімфоїдних клітинах щурів (табл. 3).

Таблиця 3. Вміст циклічних нуклеотидів (пмоль · мг-1 білка) у лімфоцитах тимусу і селезінки щурів, опромінених у різних дозах, за умов введення сквалену та циклоферону in vivo, (М ± m), n = 5

* p 0,05 по відношенню до контролю

У клітинах тимусу сквален здійснював однаково спрямований вплив на рівень обох циклічних нуклеотидів, крім того спостережувані зміни мали практично однакову кратність. Цікавий ефект сквалену був виявлений за максимальної із застосованих доз (1,0 Гр), коли введення препарату приводило до зростання вмісту цАМФ та зменшення цГМФ, що отримало вираження в істотному збільшенні їх співвідношення. Примітним є те, що стимулюючий ефект сквалену на активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази в клітинах тимусу був найбільш вираженим за дози 0,25 Гр, тоді як за вищих доз випромінення введення препарату спричиняло незначні її зміни. Циклоферон за опромінення тварин у дозі 0,25 Гр викликав зниження концентрації обох циклічних нуклеотидів; за дози 0,5 Гр рівень цАМФ підвищувався у 1,6 раза, тоді як вміст цГМФ достовірно не змінювався; при 0,75 Гр розподіл концентрацій змінився: вміст цГМФ значно перевищував контроль, а кількість цАМФ зменшувалась. За дози 1,0 Гр рівень обох посередників після введення циклоферону був нижчим, порівняно з системами без застосування препарату. У той же час найбільш виражену дію на активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази циклоферон проявив за опромінення тварин у вищих дозах як in vivo, так і in vitro. Ймовірно, ключ до пояснення ефекту, який спостерігали, полягає в тому, що, крім індукуючої дії цАМФ на 2?,5?-олігоаденілат-синтетазу існує також зворотний регуляторний вплив 2?,5?-олігоаденілату на систему циклічних нуклеотидів, оскільки він виступає активатором фосфодіестерази цАМФ [Itkes, 1994]. У зв'язку з цим можна припустити, що за доз, коли ефект досліджуваних препаратів на активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази був найбільш вираженим, додаткова стимуляція ферменту на фоні їх введення спричиняла посилення негативного зворотного впливу на систему циклічних нуклеотидів, що проявлялось, зокрема, у зменшенні співвідношення цАМФ / цГМФ. Дане припущення пояснює, чому в клітинах тимусу опромінених щурів циклоферон та сквален проявляли стимулюючий вплив на 2?,5?-олігоаденілат-синтетазу та систему циклічних нуклеотидів у різних діапазонах застосованих доз.

У лімфоцитах селезінки найбільш виражений вплив обох препаратів був виявлений за максимальної із застосованих доз (1,0 Гр) - при введенні сквалену та циклоферону вміст цАМФ зростав у 1,9 та 2,3 раза відповідно, а цГМФ зменшувався, що спричинило збільшення співвідношення циклічних нуклеотидів. Дія сквалену на активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази в клітинах селезінки була також найбільш вираженою за дози 1,0 Гр. Циклоферон викликав максимальний приріст активності ферменту за опромінення в дозі 0,5 Гр, проте за дози 1,0 Гр також було зафіксовано значне збільшення олігоаденілатсинтетазної активності, порівняно із спленоцитами опромінених тварин, яким не вводили індуктор.

Відмінності у взаєморегуляції систем 2?,5?-олігоаденілату та циклічних нуклеотидів у лімфоїдних клітинах тимусу і селезінки опромінених щурів при введенні циклоферону і сквалену можна пов'язати з фізіологічними відмінностями даних органів, їх різною чутливістю до дії радіації, а також особливостями механізмів дії застосованих препаратів. Біологічні ефекти сквалену полягають перш за все у його антиоксидантних властивостях, тоді як циклоферон виступає специфічним індуктором інтерферонів та характеризується потужною імунотропною дією. Отже, обидва препарати проявили протипроменеві ефекти, які полягають у стимуляції ключових ланок регуляторних сигнальних систем клітини, проте реалізуються за різними механізмами.

Таким чином, система 2?,5?-олігоаденілату бере участь у реалізації радіаційно-індукованої відповіді імунокомпетентних клітин тимусу і селезінки щурів на дію рентгенівського випромінення у малих дозах, що проявляється у післяпроменевій стимуляції ключового ферменту даної системи - 2?,5?-олігоаденілат-синтетази. Каскад олігоаденілату залучений як у відповіді системи інтерферону на променеве ураження, про що свідчить посилення синтезу самого цитокіну в експериментальних моделях та інтенсифікація досліджуваного ферменту під впливом його індукторів, так і поза дією інтерферону поряд з циклонуклеотид- та кальцій-залежним сигнальними шляхами як частина загальної багатофункціональної регуляторної системи клітини. Проте слід відмітити, що збільшення дози радіації, очевидно, викликає дезінтеграцію взаємозв'язків між різними сигнальними каскадами, які в нормі функціонують узгоджено. У зв'язку з цим подібність динаміки післяпроменевих змін досліджуваних показників не завжди прослідковувалась у більш радіочутливих лімфоцитах селезінки, в яких порушення зв'язків між даними регуляторними каскадами, очевидно, відбувалось за менших доз, порівняно з більш стійкими клітинами тимусу. Подальше детальне дослідження цих процесів є важливим для з'ясування загальних механізмів впливу іонізуючої радіації на метаболізм клітин імунної системи та організму в цілому, а також для розробки нових препаратів з радіомодифікуючими та імунокорегуючими властивостями на основі індукторів інтерферону.

ВИСНОВКИ

Досліджено активність 2?,5?-олігоаденілат-синтетази за умов впливу променевого фактора і показано, що даний фермент є радіочутливою ланкою інтерферон-залежної системи імунокомпетентних клітин щурів та бере участь у формуванні компенсаторної відповіді на дію іонізуючої радіації в дозах 0,25 - 1,0 Гр.

Встановлено, що при опроміненні щурів відбувається підвищення активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази в лімфоїдних клітинах, причому найбільша активність ферменту в тимоцитах виявлена після опромінення у дозах 0,5 - 1,0 Гр, у спленоцитах - 0,25 Гр.

Показано, що рівень інтерферону зростає у лімфоїдних клітинах тимусу і селезінки за умов дії іонізуючої радіації у дозах 0,25 і 0,5 Гр, після опромінення у дозах 0,75 і 1,0 Гр титр цитокіну знижується. Виявлено, що обробка лімфоцитів тимусу і селезінки щурів індукторами інтерферону (тилорон-дигідрохлоридом, полі(І)·полі(Ц) та циклофероном) in vitro викликала найбільш виражене підвищення активності 2?,5?-олігоаденілат-синтетази та рівня інтерферону за опромінення у дозах 0,75 і 1,0 Гр відповідно. Встановлено, що рівні циклічних нуклеотидів (цАМФ і цГМФ) в лімфоїдних клітинах тимусу і селезінки зазнають післяпроменевих змін; найбільші значення співвідношення цАМФ / цГМФ виявлені у тимоцитах за дії доз 0,5 - 1,0 Гр, у спленоцитах - 0,25 Гр. Показано додаткові зміни досліджуваних показників внаслідок введення щурам in vivo циклоферону та сквалену на фоні рентгенівського опромінення.

Внутрішньоклітинний рівень іонів кальцію збільшується у лімфоцитах селезінки та зменшується в тимоцитах щурів після опромінення в дозах 0,25 - 0,75 Гр і практично дорівнює значенням у контролі за дози 1,0 Гр в обох органах. Динаміка змін даного показника набуває протилежного характеру за умов введення щурам перед опроміненням препарату циклоферону in vivo.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Михайлик І.В., Прокопова К.В., Остапченко Л.І. Вивчення активності 2',5'-олігоаденілат-синтетази в культурі клітин Namalwa за умов рентгенівського опромінення // Вісник Київського Університету. Серія Біологія. - 2003. - № 40. - С. 65-66. (Особистий внесок здобувача - опрацювання літератури за темою досліджень, визначення активності 2',5'-олігоаденілат-синтетази, статистична обробка результатів).

2. Михайлик І.В., Прокопова К.В., Остапченко Л.І. Визначення рівню 2',5'-олігоаденілатів у лімфоїдних клітинах селезінки і тимусу щурів за умов рентгенівського опромінення в дозах 0,5 і 1 Гр // Вісник Київського Університету. Серія Біологія. - 2003. - № 41. - С. 104-105. (Особистий внесок здобувача - опромінення піддослідних тварин, виділення лімфоїдних клітин з селезінки і тимусу щурів, отримання фракції цитозолю).

3. Раєцька Я.Б., Білокінь Ю.М., Прокопова К.В., Лукашова К.В. Оцінка дії антиоксиданту (проантоціанідину) на злоякісний ріст при променевій терапії // Вісник Київського Університету. Серія Біологія. - 2003. - № 41. - С. 118-120. (Особистий внесок здобувача - введення препарату проантоціанідину піддослідним тваринам).

4. Михайлик І.В., Прокопова К.В., Остапченко Л.І., Кучеренко М.Є. Вивчення інтерфероніндукованої системи 2',5'-олігоаденілату в лімфоїдних клітинах щурів за дії іонізуючого випромінення // Український біохімічний журнал. - 2004. - т. 76, № 3. - С. 126-130. (Особистий внесок здобувача - опрацювання літератури за темою досліджень).

5. Прокопова К.В., Михайлик І.В., Остапченко Л.І. Вплив сквалену на рівень олігоаденілатсинтетазної активності в лімфоїдних клітинах щурів за умов розвитку різних патологічних станів // Доповіді НАН України. - 2004. - № 9. - С. 182-187. (Особистий внесок здобувача - визначення активності 2',5'-олігоаденілат-синтетази, аналіз отриманих результатів, підготування матеріалів до друку).

6. Михайлик І.В., Прокопова К.В., Остапченко Л.І. Вивчення системи інтерферону в лімфоїдних клітинах за дії радіації // Тезисы Всеукраинской конференции молодых ученых „Актуальные вопросы современного естествознания” (11-13 апреля 2003 г.). - Сімферополь, 2003. - С. 61-62.

7. Михайлик І.В., Прокопова К.В., Остапченко Л.І. Вплив рентгенівського випромінення на стан сигнальної системи інтерферону в лімфоїдних клітинах щурів // ІІІ з'ізд з радіаційних досліджень „Радіобіологія та радіоекологія” (21-25 травня 2003 р.). - Київ, 2003. - С. 54.

8. Прокопова К.В., Михайлик І.В., Остапченко Л.І. Вплив рентгенівського опромінення на активність 2',5'-олігоаденілат-синтетази в лімфоїдних клітинах щурів // IV Всеукраїнська конференція студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (квітень 2004 р.). - Київ, 2004. - С. 42-43.

9. Mihailik I.V., Prokopova K.V., Ostapchenko L.I. The molecular mechanisms of interferon signalling in lymphoid cells under the action of ionizing irradiation // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (April 25-28, 2004). - Lviv, 2004. - P. 36.