Використовуючи метод флуоресцентної кальційметрії, встановити внесок мітохондрій у зміни амплітуди та кінетичних характеристик кальцієвих транзієнтів, викликаних:

деполяризацією плазматичної мембрани,

вивільненням Са2+ з депо ЕР,

активацією капсаіцинчутливих рецепторів плазматичної мембрани,

активацією депокерованих кальцієвих каналів плазматичної мембрани.

Порівняти ефективність захоплення та вивільнення Са2+ мітохондріями при надходженні іонів з позаклітинного середовища та вивільненні їх з депо ЕР.

Визначити участь ЕР у формуванні досліджуваних кальцієвих транзієнтів та встановити зв'язок між вивільненням Са2+ з депо та входом іонів з позаклітинного середовища.

Провести порівняльний аналіз депоактивованих кальцієвих транзієнтів, які викликаються вивільненням Са2+ при активації ріанодинових та інозитолтрифосфатчутливих рецепторів ЕР, а також при пасивному спустошенні ЕР за умов блокування роботи його АТФаз.

На базі одержаних даних дійти висновків щодо взаємного впливу різних кальційрегулюючих механізмів у процесі формування внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів у досліджуваних нейронах.

Наукова новизна одержаних результатів. У даній роботі вперше визначено кінетичні характеристики функціонування мітохондрій і ЕР в процесі активності здогадно ноціцептивних соматосенсорних нейронів щура, викликаної деполяризацією плазматичної мембрани. Показано, що характеристики функціонування згаданих органел є важливими для нормальної роботи клітини і саме вони зазнають змін при розвитку експериментально-індукованого діабету. Виявлено, що обмін Са2+ у мітохондріях залежить від джерела підвищення концентрації іонів в цитозолі. Крім того, уперше досліджені характеристики входу Са2+, активованого спустошенням депо ЕР, висунуті припущення щодо можливої природи різниці кінетичних характеристик активації таких сигналів та ролі мітохондрій у їх формуванні. У роботі досліджено чутливість внутрішньоклітинних кальцієвих депо до капсаіцину, визначено значні відмінності в чутливості ванілоїдних рецепторів плазматичної мембрани і ЕР, а також досліджено участь мітохондрій у формуванні капсаіциніндукованих кальцієвих сигналів. Показано складний взаємозв'язок різних кальційрегуляторних механізмів у формувані внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на: конференції фізіологічного товариства Угорщини “Оксидативний стрес і клітинна сигналізація”, Будапешт, Угорщина, 2003; IV Національному конгресі патофізіологів України, Чернівці, 2004; літній школі IBRO “Сенсорна і інтегративна нейронаука: від рецепторів до поведінки”, Москва, Росія, 2004; літній школі IBRO “Рецептори. Канали. Посередники.”, Ялта, Україна, 2004, III Конференції Українського Товариства Нейронаук, травень 2005 р., Донецьк; літній школі IBRO “Дослідницькі стратегії щодо вивчення комплексних нервових сітей.”, Дебрецен, Угорщина, 2005, а також на семінарах сектору молекулярної фізіології інституту фізіології ім. О.О. Богомольця.

Публікації. За результатами роботи опубліковано п'ять статей у наукових журналах та тези трьох доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів та результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 220 найменувань. Робота викладена на 150 сторінках та ілюстрована 31 рисунками.

Основний зміст роботи

У вступі обгрунтовано актуальність дослідження взаємодії входу Са2+ з позаклітинного середовища до цитозоля клітини через потенціалкеровані, рецепторкеровані та депоактивовані кальцієві канали плазматичної мембрани з функціонуванням мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму у процесі формування внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів, сформульовані мета і завдання дослідження, наведені відомості про наукову новизну, практичну цінність та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ 1 “Огляд літературних даних” присвячений висвітленню відомих аспектів функціонування мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму як активних внутрішньоклітинних кальцієвих депо, а також висвітлено процес взаємодії цих органел при формуванні кальцієвих транзієнтів в різних типах клітин. Висвітлено аспекти, пов'язані зі змінами в кальцієвій сигналізації досліджуваних нейронів при діабеті. Надано основні характеристики ванілоїдних рецепторів, які є полімодальними детекторами больових стимулів, що експресуються у плазматичній мембрані сенсорних нейронів малого та середнього діаметру. Наведено відомості про депоактивований вхід Са2+ у клітини та його фізіологічну роль, а також можливу участь ванілоїдних рецепторів у формуванні таких сигналів.

Для досягнення поставленої мети у розділі 2 “Матеріали та методи дослідження” описано використання наступних методичних підходів:

ферментативне виділення ізольованих нейронів спінальних гангліїв (СГ);

флуоресцентний метод вимірювання концентрації іонів Са2+;

метод експериментального моделювання діабету (стрептозотоциніндукований діабет);

метод локальної аплікації фармакологічних речовин на клітини СГ;

обробка отриманих результатів з використанням стандартних методів варіаційної статистики.

Ферментативне виділення ізольованих нейронів DRG.

В експериментах використовували щурів лінії Вістар віком 1-1,5 місяці. Процедура декапітації щура проводилась у відповідності з вимогами НАН України по використанню експериментальних тварин. Виділялись грудні і поперекові спинномозкові ганглії. Нейрони СГ ізолювались шляхом піпетування гангліїв після їх ферментативної обробки у базовому зовнішньоклітинному розчині Tyrode (склад розчинів наведений нижче) з додаванням 1 мг/мл протеїнази (тип XXIII, Sigma, США) і 0,5 мг/мл колагенази (тип IA, Sigma, США) протягом 35 хвилин (370 С). Клітини використовувалися в експерименті протягом 6-8 годин після виділення. Контрольні експерименти показали, що ізольовані таким методом нейрони зберігають свої основні характеристики протягом 24 годин.

Флуоресцентний метод вимірювання концентрації іонів Са2+. Для реєстрації змін концентрації вільного внутрішньоклітинного кальцію використовувалась методика двохвильової флуоресцентної кальційметрії з використанням мембранопроникної естерифікованої форми флуоресцентного барвника indo1. Ізольовані нейрони СГ інкубували протягом 30 хв при температурі 370 С в розчині, що містив 10 мкМ indo1/am. Після цього клітини відмивали чистим зовнішньоклітинним розчином і залишали в темряві при кімнатній температурі на 30 хв для деестерифікації барвника. Збудження флуоресцентного зонду здійснювалось при довжині хвилі 360 нм за допомогою ртутної лампи та відповідних фільтрів. Реєстрація емісії проводилась у двох діапазонах: 395-410 нм (F400) і 490-510 нм (F500) за допомогою двох фотопомножувачів. Сигнали з фотопомножувачів подавали на вхід аналогового ділителя (DIV100, Burr Broun, США), який у реальному часі обчислював співвідношення флуоресцентних сигналів на двох довжинах хвиль: R = F400/F500 . Це співвідношення пропорційне концентрації внутрішньоклітинного кальцію ([Ca2+]i) і не залежить від концентрації барвника у клітині. Для точного обчислення [Ca2+]i нами використовувалася наступна формула:

[Ca2+]i = Kd · B · (R - Rmin) / (Rmax - R),

де Kd - константа дисоціації індикатору з кальцієм; B - коефіцієнт, обумовлений оптичними характеристиками установки, дорівнює співвідношенню F5000/F500s (F5000 - інтенсивність флуоресценції indo-1 у відсутності кальцію, F500s - інтенсивність флуоресценції indo-1 при насичуючій концентрації Са2+ ); Rmin - співвідношення F400/F500 у відсутності кальцію; Rmax - співвідношення F400/F500 при насичуючій концентрації іонів. Всі значення концентрацій представлені у вигляді середніх значення середньоквадратичне відхилення (SEM); n є кількістю досліджених клітин. Достовірність статистичних відмінностей при міжвибірковому порівнянні визначалась за допомогою критерія Ст'юдента (Т-тесту). Відмінності вважали достовірними при Р0,05. Апроксимацію кривих наростання кальцієвих транзієнтів виконували за формулою:

[Ca2+]i =[Ca2+]i o +A*(1 - exp(-)),

де [Ca2+]i - концентрація Са2+ в цитозолі клітини в даний момент часу, [Ca2+]i o - базальний рівень кальцію, t0 - початковий момент часу ?1 - стала часу наростання транзієнта, А - амплітудний коефіцієнт.

Модель стрептозотоциніндукованого діабету. У моделі експериментального діабету використовувались щури віком 21 день. Стан діабету викликався внутрішньочеревинною ін'єкцією стрептозотоцину (СТЗ), розчиненому у фізіологічному розчині (ізотонічний розчин 0,9% NaCl для ін'єкцій), із розрахунку 80 мг/кг. Щури з СТЗ-індукованим діабетом та контрольні тварини того самого віку утримувались в однакових умовах з однаковим раціоном протягом усього періоду розвитку захворювання. Експерименти проводилися на тваринах через 3-4 тижні після ін'єкції стрептозотоцину. Концентрацію глюкози в плазмі крові, взятої із хвостової вени, виміряли за допомогою оптичного сенсора глюкози Глюкотренд (Roche Diagnostics Gmb., Mannheim, Німеччина). Із групи щурів з діабетом бралися тварини з рівнем глюкози в плазмі крові, більшим, ніж 18 мМ.

У третьому розділі “Результати досліджень” експериментально визначені особливості кальцієвої сигналізації у нейронах СГ малого та середнього діаметру, кінетичні кальційобмінні властивості внутрішньоклітинних кальцієвих депо в залежності від джерела надходження Са2+ до цитозолю.

Вклад мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму в кальцієвий транзієнт, викликаний деполяризацією плазматичної мембрани. Внутрішньоклітинна концентрація іонів кальцію [Ca2+]i в нейронах СГ місячних щурів за відсутності зовнішніх впливів підтримувалася на постійному (базовому) рівні. Середнє значення останнього складало 1189 нМ (n = 40). Аплікація гіперкалієвого розчину (50 мМ KCl) тривалістю 3 с викликала короткочасне підвищення [Ca2+]i, котре надалі буде називатися “кальцієвим транзієнтом”. Викликаний деполяризацією кальцієвий транзієнт мав фазу швидкого наростання тривалістю 3 с і фазу спаду, що характеризувалася складною кінетикою. Протягом перших 8 с відбувалося швидке зниження концентрації іонів кальцію до певного значення, що потім зберігалося протягом 3-4 хв, утворюючи другу фазу спаду кальцієвого транзієнта, так звану фазу плато. Пікові значення кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією плазматичної мембрани, складали в середньому 377±21 нМ. Повторна аплікація гіперкалієвого розчину після відновлення внутрішньо-клітинного рівня Ca2+ до базової концентрації викликала кальцієвий транзієнт, що достовірно не відрізнявся за характеристиками від попереднього. Для оцінки участі ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) у формуванні транзієнтних змін концентрації Са2+ у цитозолі деполяризація плазматичної мембрани здійснювалася після преаплікації 1 мкМ тапсигаргіну - блокатора кальцієвої АТФ-ази ЕР.

Амплітуда кальцієвого транзієнта в цьому випадку знижувалася до 246±17 нМ (n=8, Р<0,001); тобто відносне зниження амплітуди склало 35% у порівнянні з контрольними умовами.

Для того, щоб виключити дію тапсигаргіну на потенціалкеровані кальцієві канали плазмалеми, аналогічні експерименти були проведені в умовах преаплікації 200 нМ іономіцину, що спустошує ЕР за рецепторнезалежним механізмом. Спустошення депо ЕР іономіцином не внесло достовірних змін у результати, отримані при спустошенні того ж депо тапсигаргіном. Для оцінки участі уніпортера мітохондрій у формуванні кальцієвого сигналу деполяризація плазматичної мембрани здійснювалася на тлі преаплікації 10 мкМ СССР (мітохондріального протонофору, що роз'єднує протонний градієнт на внутрішній мембрані мітохондрій). Амплітуда деполяризаційних транзієнтів, викликаних таким чином, досягала 525±14 нМ (n=11, P<0,001), збільшившись у порівнянні з контрольними умовами на 39%. Істотно змінилася і кінетика транзієнтів. Тривалість фази наростання істотно зросла в порівнянні з контрольними умовами (у чотири рази), її середня тривалість склала 16 с, а фаза спаду втратила чітко виражене плато.

Отримані дані дозволяють зробити висновок, що в досліджуваних нейронах ЕР значно підсилює кальцієві сигнали, що надходять від потенціалкерованих каналів плазматичної мембрани. У той же час мітохондрії обмежують амплітуду деполяризаційного транзієнта й обумовлюють складну кінетику його спаду, активно захоплюючи кальцій, що надходить з зовнішньоклітинного середовища. Для детальнішого аналізу участі внутрішньоклітинних органел у підтриманні кальцієвого гомеостазу була проведена математична обробка отриманих даних і виділені криві, що характеризують зміни, внесені в амплітуду і кінетику кальцієвих транзієнтів уніпортером мітохондрій і ендоплазматичним ретикулумом (Рис.5). Криві отримані шляхом віднімання кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією плазматичної мембрани нейронів в контрольних умов та після блокування кальційобмінної функції або ЕР (шляхом преаплікації тапсигаргіну) або мітохондрій (шляхом преаплікації мітохондріального протонофору СССР).

Отримані результати свідчать, що кальційіндуковане вивільнення Са2+ з депо ЕР починалося на 1й - 3й секунді і досягало максимуму через 3,8 - 4,6 с після початку деполяризації. Потім протягом 6 - 7 с спостерігалося захоплення іонів кальцію з цитозоля АТФазами ЕР. Захоплення іонів кальцію мітохондріями починалося з 4ї - 8ї с і досягало максимуму через 14 - 18 с від початку деполяризації. Процеси вивільнення [Ca2+]i з мітохондрій через механізм Na+-Ca2+ обмінника починали переважати над процесами захоплення уніпортером через 38 - 43 с від початку деполяризації. Співставлення кінетики роботи мітохондрій і ретикулуму дозволяє припустити наявність функціонального зв'язку між цими структурами.

Взаємний вплив кальційрегулюючих органел у процесі формування кальцієвих сигналів. Вивільнення Ca2+ з ЕР в цитозоль викликалося шляхом активації ріанодинових рецепторів. Для цього використовувалася позаклітинна аплікація 30 мМ кофеїну. Для оцінки можливої участі мітохондрій у формуванні кофеїніндукованих кальцієвих транзієнтів порівнювались транзієнти в контрольних умовах та після преаплікації 10 мкМ мітохондріального протонофору СССР.

Блокування уніпортеру мітохондрій приводило до достовірних змін у кінетиці спаду кофеїн-індукованого кальцієвого сигналу; повернення концентрації Са2+ до базового рівню суттєво уповільнювалося. Такі зміни кінетики кофеїн-індукованого кальцієвого транзієнта, ймовірно, пов'язані з тим, що в контрольних умовах мітохондрії активно захоплюють Са2+, виведений з ЕР. Аплікація СССР на спаді кофеїніндукованого кальцієвого транзієнта викликала додаткове підвищення концентрації Са2+ в цитозолі, що також підтверджує участь уніпортеру мітохондрій у захопленні Са2+, що вивільняються з ЕР. Отримані дані свідчать про те, що в досліджуваних нейронах мітохондрії захоплюють не лише Са2+, що надходять з позаклітинного середовища, але і Са2+, що вивільняються з депо ендоплазматичного ретикулуму. При кофеїніндукованому кальцієвому транзієнті захоплення Са2+ мітохондріями починалося через 3 - 6 с від початку аплікації кофеїну, максимально ефективним мітохондріальне захоплення було на 12й -16й секундах спаду транзієнта, процес виведення починав переважати на 36й - 40й секундах спаду. На рис. 7 представлено криві кальцієвого обміну мітохондріями при різних джерелах надходження кальцію в цитозоль.

Зміна кінетичних характеристик взаємного функціонування мітохондрій та ЕР при цукровому діабеті. У контрольних умовах деполяризація плазматичної мембрани нейронів, узятих у тварин зі стрептозотоцин(СТЗ)-індукованим діабетом, викликала підвищення концентрації Са2+ від базального рівня 127±5 нМ до 430±22 нМ (n=11). Для визначення внеску мітохондрій у кальцієвий транзієнт деполяризація плазматичної мембрани відбувалась на тлі преаплікації мітохондріального протонофору СССР.

Амплітуда викликаного в такий спосіб кальцієвого транзієнта досягала 386±28 нМ (n=14). Отримані результати дозволяють говорити про те, що і в умовах діабету функціонування мітохондрій в досліджених нейронах обмежує амплітуду кальцієвих сигналів. Після накладання кальцієвих транзієнтів, котрі спостерігалися у контрольних умовах і при заблокованому уніпортері мітохондрій, були виділені криві, що характеризують кінетику кальцієвого обміну мітохондріями в нейронах щурів, хворих на діабет. Порівняння кривих обміну Са2+ мітохондріями у нейронах контрольних тварин та тварин з діабетом, виявило значні розбіжності. Знизилися амплітуди мітохондріального захоплення і виведення Са2+. Відбулися зміни часових характеристик наростання і спаду концентрації Са2+ у мітохондріях. Так, у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом максимальна амплітуда захоплення і виведення Са2+ склала 218±18 і 60±4 нМ відповідно. У контрольних умовах величини відповідного мітохондриального захоплення і виведення склали 265±23 і 163±24 нМ відповідно. У нейронах діабетичних тварин спостерігалося значне уповільнення захоплення і виведення Са2+ мітохондріями. Так, постійна часу наростання концентрації Са2+ у мітохондріях склала 6,75±0,4 с для тварин з експериментальноіндукованим діабетом і 3,27±0,6 с для контрольних тварин. Параметром, що характеризує швидкість виведення Са2+ з мітохондрій, був обраний час, за який амплітуда [Са2+]м досягала 50% від свого максимального значення. Так, час напівспаду [Са2+]м при діабеті досягав значення 21±4 с, а в контрольних умовах - 12,6±2,4 с.

Аплікація 30 мМ кофеїну викликала в нейронах тварин, хворих на цукровий діабет, кальцієві транзієнти з середньою амплітудою 197±35 нМ (n=14), що на 33% нижче, ніж у аналогічних кальцієвих транзієнтів, викликаних кофеїном у нейронах контрольних тварин (амплітуда яких досягала 295±8 нМ). Аплікація 10 мкМ СССР на спаді кофеініндукованого кальцієвого транзієнта призводила до додаткового підвищення концентрації кальцію на 140±16 нМ у порівнянні з 223±42 нМ у нейронах контрольних тварин (Р<0,05).

Вхід Са2+ з позаклітинного середовища в цитозоль, активований спустошенням депо ЕР. Для дослідження можливої участі депокерованого входу Са2+ в цитозоль дослід-жуваних нейронів, було проведено експерименти по вивченню змін внутрішньоклітинної концентрації Са2+, які відбуваються при спусто-шенні ЕР у безкальцієвому та ка-льційвмісному зовнішньоклітин-них розчинах. Щоб стандартизу-вати початкові умови, всі дослід-жені нейрони піддавалися поперед-ній деполяризації, що призводила до перезаповнення депо. Після деполяризації над клітиною не проводилось ніяких маніпуляцій до повернення [Ca2+]i до базового рівня. Для вивчення можливого входу Са2+, викликаного спустошенням ЕР, порівнювали кінетичні характеристики кофеїніндукованих кальцієвих транзієнтів, викликаних аплікацією 10 мМ кофеїну у нормальному розчині Тіроде і у безкальцієвому позаклітинному розчині. Аплікація 10 мМ кофеїну в нормальному розчині, що містив 2 мМ Са2+, викликала в цитозолі транзієнтне підвищення [Ca2+]i, амплітуда якого досягала 13627 нМ (n=11), а постійна часу спаду склала 36,50,2 с. Амплітуда кальцієвого транзієнта, викликаного аплікацією кофеїну в безкальцієвому розчині достовірно не відрізнялася від такої в нормальному фізіологічному розчині і складала 12819 нМ (n=9). Однак при цьому відбувалися достовірні зміни кінетичних характеристик транзієнта. Відновлення концентрації Са2+ до базального рівня прискорювалося (постійна часу спаду транзієнта склала 15,80,1 с).

Спустошення ЕР у кальційвмісному розчині призводило до появи додаткового кальцієвого сигналу, який повністю зникав при додаванні у зовнішньоклітинний розчин 100 нМ лантану.Для більш докладного вивчення кальцієвих транзієнтів, зв'язаних з депозалежним входом Са2+ у досліджувані нейрони, застосовувалось спустошення ЕР у безкальцієвому розчині шляхом активації ріанодинових (RYR) та інозитолтрифосфатчутливих (Ins3R) рецепторів ЕР, а також при блокуванні АТФаз (SERCA) цієї органели. Для цього застосовувалися аплікації 100 нМ ріанодину, 200 мкМ АТФ і 1 мкМ тапсигаргіну відповідно. Потім безкальцієвий позаклітинний розчин замінювався на розчин Тіроде, що містив 2 мМ Са2+. Аплікація ріанодину в безкальцієвому розчині призводила до виникнення кальцієвого транзієнта з середньою амплітудою 15634 нМ (n=14), який практично відновлювався до вихідного базового рівня протягом наступних 30 - 40 с. Заміна безкальцієвого розчину на кальційвмісний розчин призводила до виникнення кальцієвого транзієнта, що мав фазу швидкого наростання і фазу монотонного повільного спаду.

Аплікація 200 мкМ АТФ у безкальцієвому розчині викликала Аплікація 200 мкМ АТФ у безкальцієвому розчині викликала активацію метаботропних пуринорецепторів плазматичної мембрани, підвищення концентрації інозитолтрифосфату в цитозолі нейронів і вивільнення кальцію з інозитолтрифосфатчутливого депо ЕР. Амплітуда такого транзієнта досягала 4621 нМ (n=9). При заміні безкальцієвого розчину на кальційвмісний виникав кальцієвий транзієнт з амплітудою 6420 нМ (n=9). Після досягнення максимального значення транзієнт виходив на стійке плато, що зберігалося протягом тривалого часу (300 с і більше).

Аплікація 1 мкМ тапсигаргіну викликала в безкальцієвому розчині підвищення [Ca2+]і, пов'язане з блокуванням кальцієвих АТФаз ЕР і виведенням Са2+ через канали витоку. Амплітуда такого тапсигаргініндукованого транзієнта складала 39±16 нМ (n=11); заміна безкальцієвого розчину кальційвмісним призво-дила до виникнення кальцієвих транзієнтів з амплітудою 59±12 нМ.

Додавання у кальцій-вмісний зовнішньоклітинний роз-чин 100 нМ лантану повністю бло-кувало підвищення [Ca2+]i у 100% дослід-жуваних нейронів. Наявність 100 нМ рутенія червоного призводила до зниження амплітуди депоза-лежного входу Са2+ на 18% тільки у випадку спустошення ЕР аплі-кацією ріанодину. Такий результат дозволяє припустити участь вані-лоїдних рецепторів у формуванні депозалежних кальцієвих сигналів, викликаних спустошенням ЕР ріанодином. Отримані дані дозволяють зробити висновок про те, що незалежно від того, за допомогою якого механізму відбувається виведення Са2+ з ЕР, спустошення депо ретикулуму викликає вхід Са2+ з позаклітинного середовища, і такий вхід відрізняється за своїми амплітудно-кінетичними характеристиками. Для більш детального аналізу кінетики наростання кальцієвих транзієнтів, викликаних депозалежним входом Са2+, були отримані усереднені (у кожному випадку суперпозиція 7 кривих) нормовані щодо максимального значення [Ca2+]i , викликані депозалежним входом кальцію, а також отримані відповідні значення сталих часу наростання транзієнтів у кожному випадку.

Отримані дані показали, що спустошення ЕР за допомогою АТФ і тапсигаргіну призводить до виникнення кальцієвих транзієнтів, що достовірно не відрізняються за кінетикою наростання. Постійні часу наростання для депозалежного входу Са2+, викликаного аплікацією АТФ і тапсигаргіну, склали 33,051,42 і 28,21,29 с відповідно. У той же час постійна часу наростання депозалежного входу Са2+, викликаного спустошенням депо ЕР ріанодином склала 8,770,86 с. Така різниця у характеристиках може бути пов'язана як з різними механізмами активації відповідних кальцієвих сигналів, так і компартменталізацією ЕР.

Для визначення можливої участі мітохондрій у формуванні депоактивованих кальцієвих транзієнтів аплікація індукторів вивільнення Са2+ з ЕР з подальшою заміною безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину кальційвмісним відбувалась на тлі преаплікації мітохондріального протонофору СССР. Блокування уніпортеру мітохондрій призводило до значних змін у кінетичних характеристиках кальцієвих сигналів, що активувались спустошенням ЕР. На рис.15 представлено нормовані щодо максимального значення кальцієві транзієнти, викликані спустошенням депо аплікацією ріанодину (А) та АТФ (Б) в контрольних умовах (темні символи) та при заблокованому уніпортері мітохондрій (світлі символи).

Отримані дані дозволяють зробити висновок про участь мітохондрій у формуванні кінетичних характеристик відповідних депоактивованих кальцієвих транзієнтів. У контрольних умовах мітохондрії сприяють подовженню такого депозалежного сигналу в часі; фаза спаду є повільнішою. Блокування уніпортеру мітохондрій призводить до швидкого відновлення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ до базального рівня. Подібні результати свідчать про те, що мітохондрії в досліджуваних нейронах захоплюють іони Са2+, які надходять в цитозоль через депокеровані канали плазматичної мембрани, перешкоджаючи таким чином їх кальційзалежній інактивації. При блокуванні уніпортеру мітохондрій відбувається швидка інактивація цього типу кальцієвих каналів і швидкий спад відповідних кальцієвих транзієнтів.

Капсаіциніндуковані кальцієві транзієнти. Здатність первинних сенсорних нейронів малого та середнього діаметру передавати інформацію про больові стимули пов'язана з тим, що в цих клітинах експресовані так звані ванілоїдні рецептори (TRPV1). Для дослідження чутливості ванілоїдних рецепторів нейронів СГ ми використовували аплікації капсаіцину в різних концентраціях у розчині, що містив 2 мМ Са2+, і в безкальцієвому позаклітинному розчині. У кальційвмісному розчині капсаіцин викликав кальцієві сигнали, що характеризувалися фазою швидкого наростання і дещо уповільненою фазою спаду. Спад капсаіциніндукованих кальцієвих транзієнтів залежав від концентрації капсаіцину у розчині. Константа IC50 у випадку наявності Са2+ у звнішньоклітинному розчині склала 19 нМ. Аплікація капсаіцину в безкальцієвому розчині викликала дозозалежне збільшення [Ca2+]i в 53% досліджених нейронів (19 з 36). IC50 в цьому випадку склала 172 нМ. Таким чином, концентрація капсаіцину, що викликає кальцієвий транзієнт з амплітудою у 50% від максимальної (IC50), відрізняється для рецепторів плазматичної мембрани і ЕР майже на порядок. В іншій групі досліджуваних нейронів (17 з 36) аплікація капсаіцину в безкальцієвому розчині викликала підвищення концентрації кальцію, що за амплітудою не перевищувало 50 нМ. Ймовірно, що ця група клітин відноситься до більших нейронів (з середнім діаметром соми). Ці клітини експресують у мембрані ЕР рецептори, подібні до ванілоїдних, але не чутливі до капсаіцину. При заміні безкальцієвого розчину, що містить капсаіцин, на нормальний розчин Тіроде, що містить 2 мМ Са2+, у 100% досліджуваних нейронів виникало підвищення [Ca2+]i, яке, досягнувши максимального значення, виходило на стійке плато і зберігалось у цитозолі протягом сотень секунд. У клітинах, у яких капсаіцин викликав дозозалежні кальцієві транзієнти в безкальцієвому розчині Тіроде, амплітуда кальцієвих сигналів, викликаних додаванням Са2+ у зовнішньоклітинне середовище, склала 126±18 нМ. У нейронах, що демонстрували слабку чутливість до капсаіцину в безкальцієвому розчині Тіроде, виникали транзієнти з середньою амплітудою 325±41 нМ.

Додавання до Са2+-вмісного розчину 100 нМ рутенія червоного (блокатору TRPV1), приводило до зниження амплітуд відповідних кальцієвих транзієнтів на 78%, основний вклад у формування таких транзієнтів вносять капсаїцинові рецептори плазматичної мембрани.

Для того, щоб перевірити можливу участь мітохондрій у кальцієвої сигналізації, пов'язаній з аплікацією капсаіцину, спустошення депо ЕР у безкальцієвому розчині відбувалось на тлі преаплікації мітохондріального протонофору СССР і блокування уніпортеру мітохондрій.

При цьому спостерігались значні зміни в амплітуді (спостерігалось підвищення амплітуди в обох групах клітин, більш вираженим - майже вдвічі зростання було для клітин з високою чутливістю ЕР до капсаіцину) та кінетиці відповідних кальцієвих сигна-лів. Так, у контрольних умовах спад транзієнтів був набагато повільнішим; протягом перших 100 - 120 с з моменту заміни безкальцієвого на кальційвмісний розчин зберігалося стабільне значення концентрації внутрішньо-клітинного Са2+. При заблокованому уніпортері мітохондрій вже в перші 40 - 50 с з моменту заміни безкальцієвого розчину на розчин з 2 мМ Са2+, амплітуда такого капсаіциніндукованого кальцієвого транзієнта знижувалася в середньому на 54% у порівнянні з максимальним значенням його амплітуди. Таким чином, можна зробити висновок про те, що мітохондрії беруть активну участь у модуляції кінетичних характеристик кальцієвих транзієнтів, пов'язаних із входом кальцію, котрий викликаний спустошенням ЕР капсаіцином.

Обговорення результатів. Наша робота присвячена вивченню взаємної участі кальцієвих каналів плазматичної мембрани різних типів і внутрішньоклітинних кальційрегулюючих органел у кальцієвій сигналізації нейронів СГ малого та середнього діаметру при наявності різних джерел надходження Са2+ до цитозолю. Основним фактором, що визначає характер взаємодії різних кальційрегулюючих механізмів, є просторове розташування внутрішньоклітинних органел, які беруть участь у кальцієвому гомеостазі, у цитоплазмі клітини відносно плазматичної мембрани. На культурі нейронів гіпокампу за допомогою вінбластіну - агента, що дестабілізує мікротрубочки цитоскелета, була показана зміна кальцієвої сигналізації в залежності від просторового розподілу мітохондрій у цитоплазмі (Wang et al., 2003). У нашій лабораторії раніше було показано, що існують значні відмінності в кальційрегулюючій функції мітохондрій у первинних та вторинних сенсорних нейронах (Shishkin et al., 2002). Це може бути обумовлене саме різним розподілом мітохондрій у цитоплазмі клітин. На основі даних електронної мікроскопії був зроблений висновок про те, що в нейронах СГ (первинні сенсорні нейрони) основна маса мітохондрій розташована в досить тонкому примембранному шарі; це обумовлює активну участь уніпортеру мітохондрій у захопленні Са2+, котрий надходить через кальцієві канали плазматичної мембрани. Отримані в роботі результати свідчать, що саме мітохондрії є найбільш потужним і універсальним кальційрегулюючим механізмом у даному типі клітин. При застосуванні блокаторів мітохондріального захоплення реєструвалися значні зміни у характеристиках кальцієвих сигналів, що викликались як активацією кальцієвих каналів плазматичної мембрани різних типів, так і вивільненням Са2+ з депо ЕР. Мітохондрії обмежують амплітуду і обумовлюють кінетику спаду внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів. Ендоплазматичний ретикулум в досліджуваних нейронах також функціонує як активне кальцієве депо, підсилюючи кальцієві сигнали, що надходять від каналів лпазматичної мембрани. Зіставлення кривих функціонування мітохондрій і ЕР, а також отримані в роботі кількісні характеристики активності кальційрегулюючих органел, дозволяють представити картину функціональної взаємодії даних структур у досліджених нейронах при формуванні кальцієвого сигналу, викликаного деполяризацією плазматичної мембрани:

1. Посилення кальцієвого сигналу, викликаного активацією потенціал-керованих каналів плазмалеми, за допомогою механізму CІCR починається з 1ї - 3ї секунди і досягає максимуму на 4й - 6й секунді після початку деполяризації.

2. Захоплення Са2+ мітохондріями починається на 4й - 8й секунді і досягає максимуму на 14й - 18й секунді після початку деполяризації.

3. Виведення Са2+ мітохондріями назад у цитозоль починається з 38ї - 43ї секунди.

Оскільки саме зміни кальцієвого гомеостазу у нейронах спінальних гангліїв малого та середнього діаметру пов'язують з виникненням больових синдромів, а найбільш часто розвиток таких змін відбувається при діабеті, ми проаналізували зміни у функціонуванні мітохондрій та ЕР при розвитку даної патології. Як було показано, важливою властивістю змін у сигнальних механізмах цих нейронів при діабеті є істотне подовження кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією плазматичної мембрани (Kostyuk et.al., 2001). Саме такі транзієнти відповідають за вивільнення нейротрансмітерів і передачу аферентних сигналів від первинних до вторинних сенсорних нейронів. Результати наших досліджень узгоджуються з даними літератури (Voitenko et al., 1999; Schmeichel et al., 2003). Діабетична гіперглікемія істотно знижує ефективність захоплення мітохондріями Са2+ (на 24% у порівнянні з контрольними умовами), значно знижуючи швидкість процесів захоплення і виведення Са2+ мітохондріями. Механізми описаних змін, що відбуваються в мітохондріях, на сьогоднішній день залишаються предметом дискусій. Гіперглікемія приводить до змін потенціалу на внутрішній мембрані мітохондрій, що у свою чергу відбивається на рушійній силі для захоплення Са2+ уніпортером мітохондрій. За даними літератури такі зміни потенціалу в мітохондріях відбуваються в першу чергу в нейронах периферичної нервової системи; нейрони ЦНС мають більш потужний антиоксидантний захист (Moreira et. al., 2004). Зміни у кінетичних характеристиках вивільнення Са2+ з мітохондрій пов'язані, очевидно, з погіршенням функціонування Na+-Ca2+ обмінника мітохондрій. Додавання блокатора так званих мітохондріальних пор з перехідною проникністю (PTP) не викликало змін у кальцієвих транзієнтах, які вивчалися, що виключає участь даного механізму у формуванні характеристик відповідних кальцієвих сигналів. Погіршення кальційаккумулюючої функції мітохондрій приводить до зниження продукції АТФ у клітинах (Heller et.al., 1994), що в свою чергу знижує ефективності роботи АТФаз плазматичної мембрани та мембрани ЕР. В роботі виявлено та проаналізовано пригнічення ефективності функціонування ЕР в умовах діабету. Порушення у роботі мітохондрій та ЕР є складовою частиною змін кальцієвого гомеостазу, які відбуваються при діабеті і ведуть до порушення проведення сенсорної інформації в нервовій системі.

Як було показано раніше, ріанодинчутливе депо ЕР досліджуваних нейронів може спонтанно перезаповнюватися при потенціалі спокою, в умовах, коли потенціалкеровані кальцієві канали не беруть участі у проведенні Са2+ з позаклітинного середовища в цитозоль клітини (Garaschuk et.al., 1997). Значна частина Са2+, що вивільняється з депо ЕР, негайно виводиться з цитозоля клітини (Werth, 1996), тому в перезаповненні депо ЕР при потенціалі спокою, можливо, бере участь Са2+, що надходить з позаклітинного середовища за допомогою механізму, який не залежить від потенціалу на мембрані і керується лише ступенем заповненості депо. Наші результати показали наявність такого механізму в досліджуваних нейронах. Депозалежний вхід Са2+ у незбудливих клітинах є основним шляхом підвищення [Ca2+]i. Таке надходження Са2+ в цих клітинах пов'язують в основному зі спустошенням ІnsР3-чутливого депо ЕР (Parekh, 1997). Депоактивований вхід Са2+, пов'язаний зі спустошенням ріанодинчутливого депо ЕР був показаний на клітинах лінії РС12 (Bennett, 1998). Результати нашої роботи свідчать про наявність зв'язку між спустошенням як ріанодинчутливого, так і інозитолтрифосфатчутливого депо ЕР з активацією депозалежного входу Са2+ у нейронах СГ малого та середнього діаметру. Структурна і функціональна подібність ріанодинчутливих і інозитолтрифосфатчутливих ЕР була показана раніше (Pozzan, 1994). Активація депозалежного входу Са2+, викликана блокуванням АТФаз ЕР у нейронах СГ, свідчить про те, що утворення інозитолтрифосфату не є необхідною умовою активації депозалежного входу Са2+ у ці клітини. У досліджуваних здогадно ноціцептивних нейронах СГ кінетика розвитку депокерованих кальцієвих транзієнтів достовірно відрізнялась у випадку спустошення ЕР різними індукторами вивільнення Са2+ з ЕР. Це може бути пов'язано як з наявністю різних механізмів активації таких сигналів, так і з неоднорідним розподілом рецепторів на мембрані ЕР (Liu et. al., 2003). В усіх випадках розвитку кальцієвих транзієнтів, пов'язаних з вивільненням Са2+ з депо ЕР, блокування уніпортеру мітохондрій приводило до швидкого повернення концентрації Са2+ до базального рівня. Очевидно, це пов'язане з кальційзалежною інактивацією депоактивованих кальцієвих каналів плазматичної мембрани. Щодо природи іонних каналів, які опосередковують такий вхід Са2+ в цитозоль клітин і механізмів передачі сигналу від ЕР до плазматичної мембрани, на сьогоднішній день немає чіткої визначеності (Putney, 2004).

Найбільш імовірними кандидатами на роль іонних каналів плазматичної мембрани, які активуються спустошенням депо ЕР, на сьогоднішній день вважаються іонні канали сімейства TRP (Transient Receptor Potential). Ванілоїдний рецептор (VR1 або TRPV1) є функціональним маркером ноціцептивних нейронів, які здатні передавати інформацію про больові стимули. VR1 опосередковує кілька сенсорних функцій у досліджених нервових клітинах, включаючи передачу хімічних (ванілоїди і рН) і фізичних (температура) стимулів (Caterina, 2000). У досліджуваних нейронах СГ VR1 функціонує не тільки як канал плазматичної мембрани, але і як рецептор, що вивільняє Са2+ з депо ЕР (Liu et. al., 2003). Результати наших експериментів по аплікації капсаіцину у безкальцієвому розчині продемонстрували гетерогенність досліджуваних нейронів. Для першої групи клітин була характерна дозозалежність амплітуд кальцієвих транзієнтів, що виникають у безкальцієвому розчині у відповідь на аплікацію різних концентрацій капсаіцину. Константа ЕС50 для цих клітин склала 172 нМ. Друга група нейронів демонструвала слабку чутливість до капсаіцину. Такий поділ клітин за капсаіцинчутливістю, можливо, пов'язаний з наявністю на мембрані ЕР в клітинах різного діаметру соми різних підтипів ванілоїдних рецепторів (Tamura et.al., 2005). Нейрони середнього діаметра соми експресують у мембрані ЕР ванілоїдоподібні рецептори, нейчутливі до капсаіцину. Блокування уніпортеру мітохондрій впливало на параметри кальцієвих сигналів, пов'язаних з аплікацією капсаіцину. Очевидно, це пов'зано як з захопленням мітохондріями Са2+, що надходять до цитозолю через капсаіцинактивовані канали плазматичної мембрани, так і деполяризацію мітохондрій капсаіцином (Dedov, 2001).

Отже, результати нашої роботи можна представити у вигляді схеми, що представлена на рис. 20. Ліва частина схеми демонструє механізми підвищення [Ca2+]i: потенціал-керовані, рецепторкеровані та депокеровані кальцієві канали плазматичної мембрани, Na+-Ca2+ обмінник мітохондрій, RYR та InsP3- ріанодиновий та інозитолтрифосфатчутливий рецептори ЕР відповідно. На правій частині схе-ми зображено механізми зниження [Ca2+]i: PMCA - кальцієва АТФаза плазматичної мембрани, SERCA - АТФаза ЕР, та механізм захоплення Са2+ мітохондріями - уіпортер. [Ca2+]ER та [Ca2+]MIT - концентрації іонів Са2+ всередині ЕР та мітохондрій відповідно.

ВИСНОВКИ

У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань проведено дослідження функціонування кальційрегулюючих механізмів у ноціцептивних нейронах спінальних гангліїв (СГ) та встановлено внесок кожного з механізмів у формування внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів, що дозволяє значно розширити уявлення про роль різних Са2+-транспортних систем у кальцієвій сигналізації нейронів СГ малого та середнього діаметру.

З використанням флуоресцентної кальційметрії досліджено участь мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) у формуванні характеристик кальцієвих сигналів, викликаних надходженням Са2+ з позаклітинного середовища при деполяризації плазматичної мембрани, входом Са2+ з позаклітинного середовища в цитозоль нейронів при спустошенні ЕР шляхом активації його рецепторів або блокуванні АТФаз, а також активацією ванілоїдних рецепторів плазматичної мембрани в нейронах СГ малого та середнього діаметру, вірогідно залучених у процеси ноціцепції.

Порівняння впливу внутрішньоклітинних кальційрегулюючих органел на зміни амплітудно-кінетичних характеристик кальцієвих транзієнтів показало, що в досліджуваних нейронах найбільш потужним механізмом регуляції концентрації вільного Са2+ в цитозолі є мітохондрії. Вони модулюють кальцієві сигнали, які виникають в цитозолі клітини, незалежно від джерела підвищення [Ca2+]i.

Аналіз функціонування ЕР виявив його вплив на характеристики внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів не лише через вивільнення Са2+ шляхом активації відповідних рецепторів ЕР, а і шляхом забезпечення зворотнього зв'язку між вивільненням Са2+ з депо і активацією депозалежного входу Са2+ в досліджуваних нейронах.

Дослідження входу Са2+ з позаклітинного середовища в цитозоль нейронів СГ малого та середнього діаметру виявило значні розбіжності в кінетичних характеристиках фази наростання відповідних транзієнтів в залежності від механізму, за допомогою якого відбувалось вивільнення Са2+ з депо ЕР. Наявність входу Са2+ з позаклітинного середовища, викликаного блокуванням АТФаз ЕР, свідчить, що підвищення концентрації інозитолтрифосфату в цитозолі не є необхідною умовою виникнення депозалежого входу Са2+ в досліджувані нейрони.

Виявлено гетерогенність досліджуваних нейронів за чутливістю мембрани ЕР до капсаіцину, це може бути обумовлене наявністю різних підтипів ванілоїдних рецепторів на мембрані ЕР нейронів СГ малого та середнього діаметру соми. Виявлено участь мітохондрій у формуванні кальцієвих транзієнтів, викликаних активацією ванілоїдних рецепторів плазматичної мембрани.

Отримані результати демонструють важливу роль взаємодії механізмів, за допомогою яких іони Са2+ надходять з позаклітинного середовища при деполяризації плазматичної мембрани, активації її рецепторів, при спустошенні депо ЕР з внутрішньоклітинними кальційрегулюючими органелами у кальцієвій сигналізації нейронів СГ, залучених у процеси ноціцепції. Порушення такої взаємодії є однією з причин зміни передачі сенсорних сигналів при патологічних станах.

кальцієвий плазматичний нейрон мембрана

Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації

Статті:

П. Костюк, Е. Потапенко, И. Степанова. Щелочно-кислотное равновесие и функция нервной клетки. Весци нацианальной академии наук Беларуси 2003, Т.3, С.34-39.

Е.П. Костюк, И.В. Степанова, В.О. Пинченко. Роль изменений кальциевой сигнализации в процессе ноцицептивной передачи в условиях стрептозотоцин-индуцированного диабета. Клин. и эксперим.патол. 2004, Т.3, №2, С.121-124.

E.P. Kostyuk, P.G. Kostyuk, I.V. Stepanova. Intracellular mechanisms participating in the formation of neuronal calcium signals. Neurophysiology 2004, V36, №5/6, С.405 - 417.

І.В. Степанова, П.Г. Костюк, О.П. Костюк. Динамічна взаємодія структур плазматичної мембрани з внутрішньоклітинними кальцієвими депо в сенсорних нейронах щура. Фізіол. Журн. Т51, №2, С. 14-22.

И.В. Степанова. Депозависимый вход Са2+ в сенсорные нейроны крыс. Нейрофизиология 2005, Т.37, №3, С.277-283.

Тези доповідей:

E. Potapenko, P. Kostyuk, I. Stepanova, E. Kostyuk. Intracellular calcium homeostasis changes induced in rat spinal cord neurons by extracellular acidification. Physiological Society Spring Workshop “Receptors and Cell Signslling in Oxidative Stress”, Budapest 2003.

Stepanova I., Dynamic interaction between plasma membrane structures and intracellular calcium stores in nociceptive neurons of rats, IBRO advanced school of neuroscience, IASN 2004, Crimea.