Ліпополісахариди Rahnella aquatilis: структурно-функціональні дослідження

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ліпополісахариди Rahnella aquatilis: структурно-функціональні дослідження

За останні роки внаслідок удосконалення традиційних та розвитку нових методів систематики було описано ряд нових родів та видів Enterobacteriaceae. Однак, зі 100 видів мікроорганізмів, які до 1995 року були ідентифіковані як представники роду Enterobacteriaceae, лише деякі привернули увагу дослідників, інші, включаючи Rahnella aquatilis, практично не вивчались.

Вперше представники цього виду були виділені у Франції та США із відкритих водойм. Пізніше в Канаді, Великобританії, країнах Європи, Саудівської Аравії R. aquatilis були ізольовані також із грунтів (ризосфера рослин, в основному злакових), клінічного матеріалу. На території України R. aquatilis виділені із води відкритих водойм, продуктів харчування, клінічно здорових та хворих людей [Похил 1998]. Тобто, вони досить широко розповсюджені в природі.

Раніше ці бактерії відносили до Enterobacter agglomerans біогрупи G1. Застосовуючи методи нумеричної таксономії [Gavini, 1976] та генетичного аналізу [Izard, 1979] дослідники показали, що ці бактерії відрізняються від інших представників Enterobacteriaceae, і тому повинні бути виділені у новий вид - Rahnella aquatilis.

Хоча представники цього виду проявляють подібність за ознаками, на основі яких він був сформований, R. aquatilis є доволі гетерогенним видом. З огляду на це, ряд питань щодо систематики цих мікроорганізмів потребують свого вирішення. Для цього необхідний всебічний аналіз культур мікроорганізмів із застосуванням морфологічних, фізіолого-біохімічних та генетичних даних. Відомо, що одним із визнаних хемотаксономічних критеріїв є склад і будова ліпополісахариду (ЛПС) - структурного та функціонального компонента зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій, котрий безпосередньо контактує з оточуючим середовищем і в значній мірі визначає характер взаємодії між мікро- та макроорганізмом. Однак аналіз доступної нам літератури не дав змоги виявити жодної роботи стосовно виділення та характеристики ЛПС R. aquatilis. Разом з тим, дані щодо складу і структури ЛПС та його компонентів - ліпіду А, олігосахариду кора та О-специфічного полісахариду (О-ПС), є хімічною основою внутрішньовидових класифікаційних схем бактерій, необхідних для епідеміологічних цілей, зокрема ідентифікації штамів, які викликають інфекцію.

Оскільки ЛПС характеризуються широким спектром біологічної дії, фундаментальні дослідження щодо взаємозв'язків між особливостями складу, структури ЛПС з їх біологічною активністю роблять можливим розуміння на молекулярному рівні біологічних процесів за їх участю.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота включає дослідження, виконані згідно науково-дослідних робіт інституту за темами: „Дослідження молекулярних основ функціональної та біологічної активності полімерів (ліпополісахаридів, ферментів) мікробної клітини” (2003-2007 рр., держ. реєстр. номер теми 0103V005876); „Дослідження антигенних та ендотоксичних властивостей бактеріальних глікополімерів” (2002-2007 рр. програма „Молекулярні основи функціонування геному” номер теми за планом інституту 07.71); „Вплив фізичних та хімічних факторів на структурні особливості і біологічну активність ліпополісахаридів (ендотоксинів)” номер проекту Держ. фонду фунд. досліджень 05.07/00012).

Мета та завдання досліджень. Метою роботи було виділити та охарактеризувати на структурно-функціональному рівні ЛПС шести штамів R. aquatilis, ізольованих з різних джерел. У відповідності з поставленою метою були сформульовані наступні завдання:

§ виділити, здійснити очистку та хімічну ідентифікацію ЛПС;

§ отримати та вивчити окремі структурні складові макромолекули ЛПС: ліпід А, олігосахарид кору, О-специфічний полісахарид;

§ отримати О-антисироватки до досліджуваних штамів та встановити серологічні взаємозв'язки між ними;

§ встановити структури О-специфічних полісахаридних ланцюгів ЛПС;

§ дослідити гетерогенність ЛПС;

§ вивчити токсичну та пірогенну дію ЛПС;

§ отримати модифіковані форми ЛПС: дефосфорильовану та N,O-деацильовану;

§ провести порівняльне вивчення токсичної та пірогенної дії нативної молекули ЛПС та її модифікованих форм.

Об'єкт дослідження - ліпополісахариди представників нового мало дослідженого умовно-патогенного виду ентеробактерій R. aquatilis, виділених з різних джерел.

Предмет дослідження - хімічний склад ЛПС та їх структурних компонентів, структура О-ПС, деякі види біологічної активності ЛПС R. aquatilis.

Матеріали та методи дослідження. При виконанні поставлених завдань використовувались мікробіологічні, біохімічні, фізико-хімічні та імунологічні методи досліджень, а також методи біологічного контролю пірогенності та токсичності досліджуваних ЛПС.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше вивчені ЛПС представників нового мало дослідженого виду ентеробактерій R. aquatilis. Встановлена гетерогенність штамів за компонентним складом ЛПС.

При порівняльному вивченні окремих структурних компонентів молекули ЛПС досліджуваних штамів виявлена дивергенція їх властивостей. Найбільші розходження спостерігались в моносахаридному складі олігосахариду кору (9 хемотипів), менше - О-специфічного полісахариду (4 хемотипи), в той час як жирнокислотний склад ліпідів А всіх шести вивчених штамів R. aquatilis є аналогічним і представлений одним хемотипом.

Вперше для виду R. aquatilis встановлена гетерогенність структур О-ПС, що представлені лінійними або розгалуженими моно-, три- та гекса- (або гепта-) сахаридними ланцюгами, що повторюються.

Показано, що О-ПС досліджених штамів, включаючи і типовий, характеризуються наявністю більш ніж одного типу олігосахаридних ланцюгів, які відрізняються за структурою.

Вперше показана імунохімічна гетерогенність виду R. aquatilis: на основі О-антигенності ЛПС досліджені штами віднесені до 3-х серогруп.

Вперше для R. aquatilis встановлена пірогенна та токсична дія і показана роль ацильних та фосфорильних груп ліпіду А в її прояві.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в результаті проведених досліджень дані щодо хімічного складу та структурних особливостей ЛПС R. aquatilis можуть бути використані для з'ясування ряду не вирішених на сьогодні фундаментальних завдань сучасної мікробіології, а саме, питань систематики та класифікації цієї групи мікроорганізмів, для вивчення функціональної ролі ЛПС в клітині, для створення серологічної класифікаційної схеми представників виду R. aquatilis, для з'ясування особливостей функціонування клітинної оболонки грамнегативних бактерій.

Дані щодо складу ліпіду А, олігосахариду кору та О-специфічного ланцюга представляють собою особливу цінність для з'ясування питань філогенетичних взаємозв'язків бактерій, а також можуть слугувати основою для подальшого практичного використання, наприклад, при створенні вакцин, діагностичних та лікувальних препаратів.

Особистий внесок здобувача. Основні експериментальні дані були одержані здобувачем особисто: напрацьована бактеріальна маса шести досліджуваних штамів R. aquatilis, виділені ЛПС та отримані їх структурні компоненти. Вивчений хімічний склад ЛПС та їх структурних частин: встановлений вміст вуглеводів, нуклеїнових кислот, білку, КДО, гептоз. Здобувачем особисто із застосуванням газового хроматографа “Chrom-5”, хромато-мас-спектрометричної системи Agilent 6890N/5973 inert, амінокислотного аналізатора Biotronic LC-5001 проведені аналізи щодо визначення моносахаридного, жирнокислотного, амінокислотного складу препаратів ЛПС та їх структурних компонентів.

Спільно з к.б.н. Вінарською Н.В. (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ) отримані поліклональні О-антисироватки до шести досліджуваних штамів R. aquatilis. Проведені серологічні дослідження ЛПС штамів R. aquatilis із застосуванням методів кільцепреципітації, аглютинації, імуноелектрофорезу, ракетного імуноелектрофорезу, подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні. Проведено вивчення пірогенної та токсичної активності ЛПС.

Одержання модифікованих ліпідів А досліджуваних ЛПС здійснено спільно з к.б.н. Васильєвим В.М. (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ).

Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків проведено спільно з науковим керівником. Друковані роботи підготовлено при безпосередній участі автора спільно з науковим керівником.

Автор висловлює щиру подяку к.х.н. Є. Л. Здоровенко та інженеру Г. В. Затонському (Інститут органічної хімії ім. Н.Д. Зелинського РАН, Москва) за зняття та інтерпретацію ЯМР спектрів О-ПС.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації доповідались та обговорювались на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2003); на конкурсі експериментальних робіт дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2004); на Десятому з'їзді товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); 3rd German-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates (Poland, Wroclaw, 2004); на Першій міжнародній конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ в біології” (Львів, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових робіт в провідних наукових вітчизняних та закордоних виданнях, з них 5 статей у фахових виданнях, 4 тези доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 166 сторінках машинописного тексту і складається з розділів: „Вступ”, „Огляд літератури”, „Матеріали та методи досліджень”, „Результати досліджень”, „Обговорення результатів”, „Висновки”, „Список використаних джерел”, який містить 180 посилань, з яких 150 іноземних авторів. Робота містить 14 таблиць та 39 рисунків.

Огляд літератури представлений двома розділами, в одному з яких наведені відомості щодо нового, мало вивченого умовно-патогенного виду ентеробактерій R. aquatilis, який на сьогодні виділений з широкого кола джерел та є збудником захворювань людини. У другому розділі обговорюються питання щодо структури, функціі та біологічної активності ліпополісахаридів грамнегативних бактерій.

Об'єктами дослідження були ліпополісахариди шести штамів представників нового мало дослідженого умовно-патогенного виду ентеробактерій R. aquatilis, виділених з різних джерел (табл. 1). Штами R. aquatilis люб'язно надані нам завідуючим відділом нових та мало вивчених інфекцій Інституту мікробіології та імунології АМН України, к.м.н. С. І. Похилом, за що висловлюємо йому щиру вдячність. Культивування бактерій проводили в мікробіологічних матрацах на м'ясопептонному агарі при 280 С впродовж 24 год.

макромолекула ліпополісахарид токсичний

Таблиця 1. Походження досліджуваних штамів R. aquatilis

Виділення та очищення ЛПС проводили за водно-фенольним методом Вестфаля та Яна. Деградацію ЛПС здійснювали м'яким кислотним гідролізом в 1-3 % оцтовій кислоті, впродовж 2-6 год, в залежності від штаму, при 1000 С. Ультрацентрифугуванням (25000 об/хв, 40 хв) відділяли гідрофільні (вуглеводні) та гідрофобні (ліпід А) частини деградованого ЛПС. Окремі вуглеводні компоненти ЛПС одержували за допомогою гель-фільтрації на колонці з сефадексом G-50 (70 Ч 3 см) з використанням 0,025 М піридин-ацетатного буфера, рН 4,5. Визначення кількості вуглеводів здійснювали за [Dubois,1956], нуклеїнових кислот - за [Спіріним 1958], білку - за [Lowry, 1951]. Гептози визначали реакцією з цистеїном та сірчаною кислотою [Davies, 1957], 2-кето-3-дезокси-D-манооктонову кислоту (КДО) - реакцією з тіобарбітуровою кислотою [Droge, 1970]. Амінокислотний аналіз та визначення вмісту гексозамінів проводили на амінокислотному аналізаторі Biotronic LC-5001 (Німеччина). Нейтральні моносахариди визначали методом газо-рідинної хроматографії у вигляді ацетатів поліолів на хроматографі „Chrom-5” (Чехія). Жирнокислотний склад ліпідів А у вигляді метилових ефірів жирних кислот визначали на хромато-мас-спектрометричній сиситемі Agilent 6890N/5973 inert (США). 1Н- та 13С-ЯМР-спектри знімали на спектрометрі Bruker DRX-500 в D2O при 270 С. Хімічні зсуви оцінювали за внутрішнім натрій 3-метилсилілпропаноатом-д4 (дн 0,00) та ацетоном (дс 31,45). Час 200 та 150 мс був використаний в повній кореляційній спектроскопії (TOCSY) та ядерному ефекті Оверхаузера (NOESY), відповідно. Антисироватки до грітих впродовж 2,5 год при 1000 С культур R. aquatilis отримували шляхом трьох внутрішньовенних ін'єкцій кролям зростаючими дозами суспензії мікробних тіл (від 2 Ч 106 до 50 Ч 106 кл/мл) з інтервалом між ін'єкціями 3-7 діб. Кров у тварин відбирали на сьомий день після останньої імунізації. Подвійну імунодифузію в агарі проводили методом Оухтерлоні. Імуноелектрофорез здійснювали в двох модифікаціях: мікроімуноелектрофорезу та ракетного імуноелектрофорезу. Електрофорез проводили в системі ДСН-ПААГ за [Laemmli, 1970] із застосуванням 5 % концентруючого та 12 % розділяючого акриламідних гелів при постійній силі струму 30 mA. Гелі фарбували за допомогою азотнокислого срібла [Tsai, 1982].

Пірогенність вивчали на кролях шляхом внутрішньовенного введення мінімільної пірогенної дози, встановленої в серії розведень ЛПС (0,01-0,005 мкг/мл), з подальшою термометрією тварин впродовж 3 год. Кожну серію розчинів ЛПС перевіряли на кролях, близьких за вагою (різниця не більше 0,5 кг). ЛПС вважали не пірогенним, якщо сума підвищення температур у трьох кролів була меншою або дорівнювала 1,40 С; якщо ця сума перевищувала 2,20 С - ЛПС вважали пірогенним.

Токсичну дію ЛПС (ЛД50) вивчали на безпорідних білих мишах, сенсибілізованих галактозамінгідрохлоридом, при внутрішньовенному введенні серії розведень ЛПС (10-33 мкг/мл). Кожну серію розведень ЛПС випробовували на 10 мишах; у контрольної групи мишей (10 мишей) розчини ЛПС були замінені 0,9 % розчином NaCl.

Модифіковані ЛПС отримували шляхом N,O-деацилювання (гідроліз в безводному гідразині при 1000 С впродовж 40 год) та дефосфорилювання (гідроліз в 40 % плавіковій кислоті при кімнатній температурі протягом 24 год). Дослідження прояву біологічної (токсичної та пірогенної) активності модифікованих ЛПС визначали вище описаними методами.

Всі отримані дані статистично обробляли з використанням комп'ютерних програм Microsoft Excel та Origin 6.1.

Виділення ЛПС та вивчення їх компонентного складу

З сухої бактеріальної маси водно-фенольним методом були виділені та очищені ЛПС шести штамів R. aquatilis. Встановлено, що досліджувані рахнели характеризуються різним відносним вмістом ЛПС, який коливався від 5,2 до 19,8 %. Необхідно відзначити, що за цим показником представники виду R. aquatilis відрізняються від багатьох інших грамнегативних бактерій, для яких вміст цих сполук становить не більше 5 %, за виключенням деяких видів Pseudomonas, вихід ЛПС у яких складає до 32,0 % [Касянчук, 1980]. ЛПС усіх досліджуваних штамів були вільними від домішок білку, вміст якого визначався на рівні від слідових кількостей до 0,8 %. Однак, усі ЛПС характеризувались достатньо високим вмістом нуклеїнових кислот (до 30 %), від яких позбавлялись застосуванням декількох циклів ультрацентрифугувань, а також осадженням насиченим розчином трихлороцтової кислоти, яка утворює з нуклеїновими кислотами нерозчинні комплекси. Цей метод очистки більш ефективний, однак при його застосуванні втрати ЛПС були значно більшими, ніж при ультрацентрифугуванні, тому що деяка його частина випадала в осад разом з нуклеїновими кислотами. В очищеному ЛПС частка нейтральних вуглеводів складала від 45,7 до 67,2 %, в залежності від штаму.

Аналіз моносахаридного складу показав (табл. 2), що домінуючими моносахаридами ЛПС типового штаму R. aquatilis 33071 є рамноза (57,2 %) та маноза (16,7 %); глюкоза, галактоза, рибоза та неідентифікований моносахарид Х3 були присутні в менших кількостях (7,9; 7,3; 6,7 та 4,2 %, відповідно). ЛПС чотирьох штамів R. aquatilis 1-95, 2-95, 2-87 та 3-88 відрізнялись від типового штаму наявністю галактози (78,7; 34,7; 31,1 та 36,0 %, відповідно) як домінуючого моносахариду і фукози (10,0; 10,0; 21,3 та 8,8 %, відповідно). Становить інтерес моносахаридний склад ЛПС R. aquatilis 3-95, який містив 86,6 % манози, а також значно меншу кількість галактози, глюкози та рибози (9,0; 4,2 та 4,2 %, відповідно). Із гексозамінів виявлений тільки глюкозамін, вміст якого складав від 0,4 до 1,0 %, в залежності від штаму. Вміст гептоз коливався у дослідних штамів від слідових кількостей (штами 1-95, 3-95) до 9,6 % (штам 2-87). Всі ЛПС, незалежно від їх бактеріального походження, містять, щонайменше, один залишок КДО, або її похідне. Відомо, що бактерії з дефектом в процесі біосинтезу КДО є нежиттєздатними. Вміст КДО в ЛПС досліджуваних штамів був незначним та коливався від 0,1 до 0,3 %, в залежності від штаму.

Амінокислоти в ЛПС R. aquatilis є мінорними складовими - їх кількість коливалась від слідових до 0,65 %.

Для виділення окремих структурних компонентів молекули ЛПС був використаний м'який кислотний гідроліз, внаслідок якого розщеплюється зв'язок між залишком КДО, що є мономером корового олігосахариду та залишком глюкозаміну (GlcNII), який входить до складу ліпіду А. Ліпід А відділяли при центрифугуванні гідролізату. Водорозчинні продукти гідролізу ЛПС були розділені гель-хроматографією та було показано, що нативні препарати ЛПС представляють суміш S- та R-типів молекул, про що свідчить присутність високомолекулярної фракції О-специфічного полісахариду (О-ПС, фракції 1) та низькомолекулярних фракцій корового олігосахариду (фракції 2 та 3) (рис. 1). Особливістю більшості досліджених штамів R. aquatilis (33071, 3-88, 3-95 та 2-87) була наявність не однієї, а двох високомолекулярних фракцій О-ПС (1 та 1*).

Таблиця 2

Своєрідність жирнокислотного складу ліпіду А, найбільш консервативної частини молекули ЛПС, може бути використана як додатковий таксономічний критерій при диференціації видів. Встановлено (табл. 3), що склад діагностичних для ліпідів А жирних кислот - 3-оксикислот, був однаковим для всіх досліджених штамів і представлений 3-окситетрадекановою жирною кислотою (48,5 - 63,4 % в залежності від штаму). Поряд з цим, виявлені тетрадеканова (24,4 - 30,6 %), додеканова (4,7 - 19,2 %) та гексадеканова (3,3 - 9,1 %) жирні кислоти. Лише в ліпіді А типового штаму 33071 була присутня гексадеценова жирна кислота (3,7 %). Відомо, що для ентеробактерій характерна присутність в ліпіді А тільки однієї оксикислоти - 3-окситетрадеканової, яка ацилює як аміно-, так і гідроксильні групи залишків глюкозаміну.

Таблиця 3. Жирнокислотний склад ЛПС R. aquatilis (у % до загальної суми площ піків)

Отже, отримані нами дані є додатковим показником, який підтверджує правильність віднесення досліджуваних штамів до представників ентеробактерій.

Хоча відомо, що олігосахарид кору є досить консервативною частиною молекули ЛПС, для досліджуваних штамів R. aquatilis були виявлені варіації щодо вмісту окремих його компонентів. Більшу частину корів всіх досліджуваних штамів складали галактоза і глюкоза. Поряд з цими моносахаридами слід зазначити про присутність в окремих випадках рамнози, фукози та арабінози (табл. 2). Визначення рибози в олігосахаридах корів пояснює її ідентифікацію при аналізі ЛПС. Був виявлений ряд неідентифікованих моносахаридів. Аналіз складу олігосахаридів кору дав змогу виявити 9 хемотипів, оскільки в кожному із штамів R. aquatilis були виявлені по дві фракції, які відрізнялись між собою комбінацією моносахаридів, тобто була виявлена гетерогенність кору. На основі даних щодо складу кору можна припустити, що в процесі еволюції відбувається дивергенція властивостей молекул ЛПС (9 хемотипів олігосахариду кору, в порівнянні з одним хемотипом ліпіду А).

Найбільш варіабільною частиною макромолекули ЛПС грамнегативних бактерій є О-специфічні полісахаридні ланцюги, тонкі варіації в структурі яких допомагають бактеріям обійти захисні механізми імунної системи організму-хазяїна. Так, для штамів R. aquatilis 33071, 2-87, 3-88 та 3-95 характерна присутність не однієї, а двох фракцій О-ПС (1 та 1*).

Домінуючими моносахаридами О-ПС двох досліджуваних штамів R. aquatilis (1-95, 2-95) є галактоза та фукоза, штаму 2-87 - фукоза, галактоза, маноза та глюкоза, штаму 3-88 - галактоза, маноза та глюкоза (табл. 2). О-ПС типового штаму 33071 як основні моносахариди містив рамнозу, манозу, галактозу та глюкозу. О-ПС штаму 3-95 був представлений, головним чином, біохімічних методів як розпад за Смітом, метилювання та інш. було встановлено типи заміщення, положення і конфігурацію глікозидних зв'язків окремих моносахаридних залишків. За допомогою комп'ютерного аналізу та всіх вищезазначених методів було встановлено 5 типів структур О-ПС R. aquatilis, які описані нами вперше (табл 4). Всі структури є унікальними. О-ПС типового штаму R. aquatilis 33071 характеризується наявністю двох типів структур, представлених три- та гекса- (або гепта-) сахаридними ланцюгами. Перша структура містить два залишки рамнози та один залишок манози. Друга представлена розгалуженим гекса- (або гепта-) сахаридом, який включає один або два залишки глюкози, два залишки галактози, два залишки манози і один залишок глюкуронової кислоти. О-ПС штаму 2-87 аналогічно типовому штаму містить два типи структур О-ПС, одна, як і у типового штаму представлена гекса- (або гепта-) сахаридом, а інша - трисахаридом, який включає один залишок галактози в фуранозній формі, один залишок галактози в піранозній формі та один залишок фукопіранози. Такий тип структури характерний також для двох інших досліджуваних штамів 1-95 та

2-95. При гель-фільтрації на сефадексі G-50 була встановлена наявність двох високомолекулярних фракцій О-ПС штама 3-88. Вивчення їх структури показало, що вони однакові і представлені гекса- (або гепта-) сахаридом, аналогічним типовому штаму. В цьому випадку дві фракції О-ПС відрізняються між собою лише молекулярною масою, тобто кількістю олігосахаридних одиниць в О-ПС. На відміну від цих п'яти штамів, О-ПС яких представлені гетеросахаридами, О-ПС штаму 3-95 включає ланцюги тільки з одного моносахариду, тобто вони є гомополісахаридами: манози (фракція 1) або глюкози (фракція 1*). Раніше манани, як О-ПС були знайдені в деяких видах грамнегативних бактерій, таких як Salmonella enterica, Yersinia, Serratia marcescens, Campylobactrer fetus, але структура їх ланцюгів була іншою.

Таким чином, вивчення структури О-ПС свідчить про її гетерогенність, тобто про наявність в одному штамі ЛПС більш ніж одного типу олігосахаридів, які відрізняються за структурою.

Гетерогенність ЛПС R. aquatilis також була підтверджена за допомогою ДСН-ПААГ електрофорезу, результати якого свідчать, що ЛПС утворюють велику кількість ліній з різним ступенем електрофоретичної рухливості. Лінії, які проходять більшу відстань в процесі електрофоретичного розподілу відповідають незаміщеному олігосахариду кору, а повільно рухливі - олігосахариду кору, який заміщений О-ПС. Гетерогенність повільно рухливих компонентів можна пояснити різною довжиною О-специфічного ланцюга (рухливість зменшуються з додаванням однієї повторюваної одиниці).

Таким чином, клітини R. aquatilis здатні синтезувати ЛПС, які відрізняються як структурою О-ПС, так і довжиною полісахаридних ланцюгів, тобто для них характерна наявність S- та R-типів ЛПС. Біологічне значення такої гетерогенності ЛПС ще не встановлено, але можна припустити, що вона обумовлює більш щільну упаковку молекул ЛПС на клітинній поверхні і сприяє виживанню мікроорганізмів в умовах постійного контакту з імунною системою макроорганізму.

Імунохімічні дослідження ЛПС

ЛПС являє собою основний термостабільний антиген мікробної клітини. Його серологічну специфічність, а також специфічність мікробної клітини в цілому визначає структура О-ПС. Для оцінки ступеня кореляції виявлених особливостей структури О-ПС з серологічними властивостями та з'ясування взаємозв'язків між досліджуваними культурами бактерій до них були отримані високоактивні сироватки, титри яких в реакціях кільцепреципітації та аглютинації складали 1:12800 та 1:25600, відповідно. Реакціями подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні, імуноелектрофорезу та ракетного імуноелектрофорезу встановлено, що в гомологічних системах ЛПС всіх досліджуваних штамів R. aquatilis проявляють антигенну активність (рис. 4).

Відомо, що перехресні серологічні реакції, які засновані на філогенетичній спорідненості, можуть бути використані як один з підходів в класифікації різних видів додатково з загальноприйнятими методами таксономії.

Результати перехресних реакцій з використанням подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні та ракетного імуноелектрофорезу повністю співпадають та свідчать про серологічну різноманітність ЛПС досліджуваних штамів R. aquatilis.

Таким чином, отриманні дані свідчать, що R. aquatilis є імунохімічно гетерогенним видом. На основі О-антигенності ЛПС досліджувані штами можна віднести до трьох серогруп: до першої - типовий штам 33071, ЛПС якого взаємодіяв лише з гомологічною О-антисироваткою; до другої - штами 1-95, 2-95, 3-95 та 2-87, ЛПС котрих містять загальні антигенні детермінанти та проявляли серологічну специфічність не лише в гомологічних системах, а й перехресно взаємодіяли з гетерологічними О-антисироватками; до третьої - штам 3-88, ЛПС якого взаємодіяв як з гомологічною, так і з гетерологічними О-антисироватками (до штамів 1-95, 2-95, 3-95 та 2-87). Однак, О-антисироватка до штаму 3-88 була активна лише до гомологічного ЛПС.

Порівняльний аналіз структур О-ПС з серологічною активністю ЛПС свідчить про відсутність прямої кореляції між цими показниками, як це встановлено для інших видів бактерій. Незважаючи на те, що О-ПС типового штаму 33071 містить одну з структур, яка аналогічна О-ПС штамів 2-87 та 3-88, між ними не виявлено перехресних серологічних реакцій. В той же час ЛПС штаму 3-95, О-ПС якого представлений мананом та глюканом взаємодіє з антисироватками до культур R. aquatilis 1-95, 2-87 та 2-95, які відрізняються структурою О-ПС. Одержані результати можна пояснити рядом причин. По-перше, відомо, що внесок в серологічну активність молекули ЛПС, крім О-ПС, здійснюють олігосахарид кору та ліпід А, який був аналогічним у всіх досліджених штамів. По-друге, не слід виключати можливість того, що в структурах О-ПС присутні певні мінорні мономери, які обумовлюють серологічну специфічність ЛПС, але використані нами методи не здатні були їх виявити.

Біологічна активність ЛПС

Відомо, що грамнегативні бактерії здатні здійснювати потужний вплив на організми вищих тварин, людини та рослин. Вони викликають різного роду патофізіологічні зміни, порушення імунологічної реактивності організму. Одним із таких мікроорганізмів є R. aquatilis. Описані в літературі випадки виділення цього умовного патогену із широкого кола джерел (продукти харчування, вода, інфекційний матеріал) та відсутність відомостей щодо пірогенної та токсичної дії представників виду R. aquatilis спонукали нас до їх вивчення.

При дослідженні пірогенності ЛПС була емпірічно встановлена мінімальна пірогенна доза (7,5Ч10-3 мкг ЛПС/мл непірогенного ізотонічного розчину). Ця доза була використана при вивчені пірогенності ЛПС досліджуваних штамів R. aquatilis. Дослідження проводили в порівнянні з фармацевтичним препаратом „Пірогенал”, основу якого складає ЛПС Shigella typhi. Всі досліджувані штами виявились пірогенними і проявили активність на рівні з препаратом „Пірогенал”, на відміну від типового штаму 33071, який виявився значно активнішим в порівнянні з усіма іншими досліджуваними штамами (табл. 5).

Для оцінки токсичності ЛПС R. aquatilis визначали дозу, при введенні якої спостерігалась би загибель 50 % піддослідних тварин (ЛД50) (табл. 5). ЛД50 визначали в серії розведень ЛПС, що складали від 18 до 33 мкг/мл, на мишах, сенсибілізованих D-галактозамінгідрохлоридом. ЛПС досліжуваних штамів виявили близький рівень токсичності - показник ЛД50 коливався в межах від 3,6 до 5,0 мкг із розрахунку на мишу, в залежності від штаму.

ЛПС грамнегативних бактерій являють собою біополімери, з широким спектром біологічної активності. На сьогодні відомі та вивчаються радіопротекторна, пірогенна, імуномодулююча, протипухлинна та багато інших активностей ЛПС та розглядаються можливості впровадження їх в медичну практику. Одним із основних бар'єрів і ускладнень в цьому процесі є високий рівень їх токсичності. Це спонукає дослідників, поряд з постійним пошуком нових, менш токсичних полімерів, розробляти підходи до отримання хімічно модифікованих ЛПС з меншою токсичністю, але які б зберігали свої терапевтичні ефекти. З огляду на те, що ЛПС R. aquatilis виділені вперше і досі відсутні дані про участь окремих структурних компонентів ліпіду А (саме він відповідає за ендотоксичну активність ЛПС грамнегативних бактерій) в токсичності та пірогенності, нами була проведена хімічна модифікація ЛПС досліджуваних штамів (N,O-деацилюванням та дефосфорилюванням) та вивчений їх вплив на токсичність та пірогенність.

Отримані нами дані (табл. 5) повністю узгоджуються з даними інших дослідників про те, що за токсичність та пірогенність ЛПС грамнегативних бактерій відповідають як ацильні, так і фосфорильні групи ліпіду А: модифіковані форми ЛПС повністю втратили можливість проявляти вищезгадані види активності.

макромолекула ліпополісахарид токсичний

Таблиця 5

Таким чином, представлена робота є першим дослідженням щодо виділення, хімічної та біологічної характеристики ЛПС шести штамів нового виду Enterobacteriaceae - R. aquatilis. Дані щодо біохімічного аналізу цих макромолекул в поєднанні з іншими біохімічними, генетичними та морфолого-фізіологічними властивостями можуть привести до удосконалення класифікації представників цього виду бактерій.

Висновки

1. Вперше виділені та хімічно охарактеризовані ЛПС шести штамів R. aquatilis. Виявлена штамова гетерогенність за моносахаридним складом ЛПС.

2. ЛПС всіх досліджуваних штамів R. aquatilis за своєю структурою належать до S-форм і складаються з ліпіду А, олігосахариду кору та О-специфічного ланцюга.

3. Домінуючими жирними кислотами ліпідів А ЛПС R. aquatilis є

3-окситетрадеканова (від 48,5 до 63, 4 %) та тетрадеканова (від 24,4 до 30,5 %) (в залежності від штаму).

4. За якісним та кількісним моносахаридним складом олігосахариди корів досліджуваних штамів відрізняються між собою і можуть бути віднесені до 9-ти хемотипів.

5. Вперше для R. aquatilis встановлені структури О-ПС, які побудовані з ланцюгів, що представлені лінійними або розгалуженими моно-, три- та гекса- (або гепта-) сахаридами. Всі структури є унікальними і раніше не були встановлені в О-ПС інших грамнегативних бактерій.

6. Показана гетерогенність ЛПС за структурою О-ПС, тобто наявність в його складі більш ніж одного типу структур олігосахаридів.

7. Особливості структури О-ПС впливають на прояв серологічної активності ЛПС: встановлена імунохімічна гетерогенність виду R. aquatilis. Вперше, на основі О-антигенності ЛПС, досліджувані штами R. aquatilis, які характеризуються п'ятьма типами структур О-ПС, віднесені до трьох серогруп.

8. Вивчення структурних компонентів макромолекули ЛПС досліджуваних штамів R. aquatilis свідчить, що дивергенція її властивостей відбувається в наступному порядку: ліпід А - О-ПС - олігосахарид кору. В ліпіді А виявлений один хемотип жирних кислот, в той час як в О-ПС - чотири хемотипи, а в олігосахариді кору - дев'ять хемотипів.

9. Вперше, для ЛПС представників виду R. aquatilis показана пірогенна та токсична дія, в прояві якої приймають участь як ацильні, так і фосфорильні групи.

Список робіт

1. Варбанец Л.Д., Остапчук А.Н, Винарская Н.В. Выделение и характеристика липополисахаридов R. aquatilis // Мікробіол. журн. - 2004. - 66, № 2. - С. 25-34. (Здобувачем накопичена біомаса досліджуваних штамів, виділені ЛПС, проведені аналізи по вивченню їх хімічного складу).

2. Варбанец Л.Д., Остапчук А.Н, Похил С.И. Характеристика структурных компонентов липополисахаридов R. aquatilis // Мікробіол. журн. - 2004. - 66,

№ 4. - С. 13-22. (Здобувачем деградовані ЛПС та отримані їх структурні компоненти, проведена хімічна ідентифікація: вивчені склад О-ПС, кору, визначений жирнокислотний склад ліпідів А ).

3. Остапчук А.Н, Варбанец Л.Д. Биологическая активность нативных и модифицированных липополисахаридов R. aquatilis // Мікробіол. журн. - 2004. - 66, № 6. - С. 31-36. (Здобувачем отримані модифіковані препарати ЛПС та проведені досліди по вивченню токсичності та пірогенності нативних і модифікованих ЛПС).

4. Варбанец Л.Д., Здоровенко Э.Л., Остапчук А.Н, Здоровенко Г.М Характеристика липополисахарида R. aquatilis 1-95 // Микробиол. - 2005. - 74, № 4. - С. 466-474. (Здобувачем отримана бактеріальна маса досліджуваного штаму, віділено ЛПС та його структурні компоненти, проведені аналізи по вивченню їх хімічного складу та біологічної активності).

5. Zdorovenko E.L., Varbanets L.D., Zatonsky G.V., Ostapchuk A.N. Structure of the O-polysaccharide of the lypopolysaccharide of R. aquatilis 1-95 // Carbohydr. Res. - 2004.-339.-P. 1809-1812. (Здобувачем накопичена бактеріальна маса досліджуваного штаму, ізольовано ЛПС, проведена його очистка, деградація та гель-хроматографія, отримано О-специфічний полісахарид та вивчений його хімічний склад).

6. Остапчук А.М. Вивчення жирнокислотного складу ліпіду А ліпополісахаридів R. aquatilis // Тези доп. Х з'їзду товариства мікробіологів України. - Одеса. 2004. - С. 67.

7. Ostapchuk A.N. Fatty acid composition of R. aquatilis lipopolysaccharides // 3rd German-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates. - Wroclaw (Poland). - 2004. - P. 75.

8. Varbanets L.D., Ostapchuk A.N. Characterization of R. aquatilis lipopolysaccharides // 3rd German-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates. - Wroclaw (Poland). - 2004. - P. 74.

9. Остапчук А.М. Вивчення токсичності та пірогенності нативних та хімічно-модифікованих ліпополісахаридів R. aquatilis // Тези доп. Першої Міжнародної конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ в біології”. - Львів. 2005. - С.165.

10. Размещено на Allbest.ru