Дослідження впливу гіпоксії на внутрішньоклітинний обмін Са2+ у сенсорних нейронах щура

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

УДК 612.273.2 : 612.822

Дослідження впливу гіпоксії на внутрішньоклітинний

обмін Са²⁺ у сенсорних нейронах щура

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Станіка Руслан Ілліч

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Наукові керівники: Академік НАН України, доктор біологічних наук Костюк Платон Григорович директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України зав. відділом загальної фізіології нервової системи (ЗФНС) Кандидат біологічних наук Лук'янець Олена Олександрівна провідний науковий співробітник відділу ЗФНС Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: Чл.-кор. НАН України, доктор біологічних наук Костерін Сергій Олексійович зав. відділом біохімії м'язів Інституту біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України, м. Київ.

Доктор біологічних наук Лозова Наталя Олексіївна провідний науковий співробітник відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, м. Київ.

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології та радіології ім. Р.Е. Кавецького.

Захист відбудеться “_______”________________ 2005 р. о “_____” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

Автореферат розісланий “________”________________ 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

АНОТАЦІЇ

Станіка Р.І. Дослідження впливу гіпоксії на внутрішньоклітинний обмін Са²⁺ у сенсорних нейронах щура. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02-біофізика. Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2005.

Дисертацію присвячено дослідженню впливу гіпоксії (парціальний тиск кисню рО₂=20-40 мм рт.ст) на концентрацію вільного внутрішньоклітинного кальцію [Ca²⁺]_вн у сенсорних нейронах щурів. Показано, що заміна контрольного зовнішньоклітинного розчину на гіпоксичний викликає достовірне збільшення концентрації кальцію всередині клітини у 1.7-2.4 рази, що більше виражено у клітинах малого діаметру. Цей ефект практично зникає при еквімолярній заміні кальцію у зовнішньому розчині на магній, що дозволяє зробити висновок про істотну роль іонних каналів у гіпоксичному ефекті. Виявлено, що основним шляхом збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію у сенсорних нейронах є потенціал керовані Са²⁺ канали. Аплікація ніфедіпіну (специфічного блокатору потенціалкерованих Са²⁺ каналів) майже повністю попереджувала збільшення [Ca²⁺]_вн, викликане гіпоксією. Отримані результати також свідчать, що Ca²⁺-обмінна функція мітохондрій задіяна у виражені гіпоксичного ефекту. У досліджуваних клітинах в присутності мітохондріального протонофору СССР гіпоксія викликала збільшення [Ca²⁺]_вн, хоча достовірно менше, ніж у контролі. Внесок зворотної роботи Na⁺/Ca²⁺-обмінника у виявлений ефект є несуттєвим. При заміні Na⁺ на Li⁺ відзначається статистично вірогідне зменшення гіпоксичного ефекту. Він складав 60±10 % у центрі та 31±7 % на периферії клітин. Досліджено вплив гіпоксії на сенсорні нейрони хворих на діабет щурів. У порівнянні з контрольною групою тварин ефект був значно меншим при тих самих значеннях парціального тиску кисню. При подальшому зниженні рО₂ ефект зростав. гіпоксія ніфедіпін кальцій нейрон

Ключові слова: кальцій, гіпоксія, DGR нейрон, L-тип кальцієвих каналів, мітохондрії, натрій, діабет.

Станика Р.И. Исследование влияния гипоксии на внутриклеточный обмен Са²⁺ в сенсорних нейронах крысы. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02-биофизика.- Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению влияния гипоксии (парциальное давление кислорода рО₂=20-40 мм рт.ст) на концентрацию свободного внутриклеточного кальция [Ca²⁺]_вн в сенсорных нейронах крыс. Продемонстрировано, что спад кальциевого транзиента после кратковременной деполяризации нейрона гиперкалиевым раствором имеет двухфазную структуру. На протяжении первых 3-5 секунд уровень [Ca²⁺]_вн уменьшался почти вдвое в сравнении с амплитудой транзиента. Далее скорость спада уменьшалась и [Ca²⁺]_вн достигала базального уровня на протяжении 2-х минут. Такая кинетика может быть обусловлена различными механизмами выведения кальция из клетки. Показано, что замена контрольного внеклеточного раствора на гипоксический вызывает достоверное увеличение концентрации кальция внутри клетки в 1.7-2.4 раза. Во всех случаях повышение было более существенным в центре нейрона по сравнению с примембранным просторанством. Количественные характеристики повышения [Ca²⁺]_вн отличались и в клетках с разным диаметром сомы: в больших клетках (сенсорные нейроны группы А, которые проводят импульсацию от низкопороговых механорецепторов и проприоцепторов) оно было меньшим, чем в клетках малого диаметра (сенсорные нейроны группы А или С, которые проводят в основном ноцицептивную импульсацию). Гипоксический эффект был обратимым в случаях, когда время аппликации гипоксического раствора не превышало 4 минут. Вызванное гипоксией увеличение внутриклеточной концентрации кальция существенно уменьшалось при удалении из внеклеточного раствора ионов кальция и его эквимолярной замене на магний, что позволяет сделать вывод о важной роли ионных каналов в гипоксическом эффекте. Выявлено, что основным путем увеличения внутриклеточной концентрации кальция в сенсорных нейронах при гипоксии являются потенциал-управляемые Са²⁺ каналы. Аппликация нифедипина (специфического блокатора потенциал-управляемых Са²⁺ каналов) почти полностью предупреждала увеличение [Ca²⁺]_вн, вызванного гипоксией. Было выявлено, что при добавлении во внеклеточный раствор 30 мкМ Cd²⁺ (условия блокирования работы плазматичной Са²⁺-АТФази) происходит увеличение базального уровня кальция. При блокировании Са²⁺-АТФази переход в гипоксическое состояние вызвал увеличение [Ca²⁺]_вн, подобныое аналогичному в контрольном растворе. Полученные результаты также свидетельствуют, что Ca²⁺-обменная функция митохондрий задействована в выражении гипоксического эффекта. В 5 исследуемых клетках как отдельно СССР (протонофор митохондрий карбонил цианид m-хлорофенил-гидразон), так и гипоксия в присутствии СССР не вызвали значительного эффекта, тогда как в других 4 клетках гипоксия вызвала увеличение [Ca²⁺]_вн, хотя достоверно меньшее, чем в контроле. Вклад плазматического Na⁺/Ca²⁺-обменника в выявленный эффект является несущественным. При замене Na⁺ на Lі⁺ отмечалось статистически достоверное уменьшение гипоксического эффекта. Он составлял 60±10 % в центре и 31±7 % на периферии клеток. При исследовании влияния гипоксии на сенсорные нейроны крыс, больных диабетом, в крови животных наблюдалось значительное повышение уровня глюкозы до 30 мМ/л (6-7 мМ/л в крови здоровых крыс). В сравнении с контрольной группой эффект был значительно меньшим при тех же самых значениях парциального давления кислорода как в малых, так и в больших нейронах. При дальнейшем снижении рО₂ эффект возрастал.

Ключевые слова: кальций, гипоксия, DGR нейрон, L-тип кальциевых каналов, митохондрии, натрий, диабет.

Stanika R.I. Effect of hypoxia on intracellular exchange of Ca²⁺ in rat sensory neurons.

Thesis for a candidate degree by specialty 03.00.02. - biophysics. - Bogomoletz Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

Elevation of cytosolic level of Ca²⁺ was measured by spatial screening of freshly isolated dorsal root ganglion neurons loaded with Fura-2AMafter subjecting them to a moderate hypoxic solution (pO₂ = 10-40 mm Hg). Short exposure of neurons to hypoxia resulted in a reversible elevation of intracellular Ca²⁺ to about 120% in the cell center and to 80% in the cell periphery. Such elevation could be almost completely eliminated by removal of Ca²⁺ or Na⁺ from external medium or application of nifedipine, an L-type calcium channel blocker. Remarkable antihypoxic efficiency (58%) was achieved by preapplication of mitochondrial protonophore CCCP. A conclusion is made that in sensory neurons the hypoxia-induced elevation of cytosolic Ca²⁺ is induced by combined changes of the function on three cell substructures: voltage-operated L-type Ca²⁺ and Na⁺ channels and Ca²⁺ accumulation by mitochondria. Mitochondria are important for spatial difference in the hypoxia-induced Ca²⁺ elevation due to their specific location in these neurons. In diabetic animals the hypoxic effect decreased to 15±3 % (n=11) in small neurons and 8±2 % (n=9) in large one.

Keywords: calcium; hypoxia; DRG neurons; L-type calcium channels; mitochondria; sodium; diabetes.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Внутрішньоклітинний кальцій є одним з найбільш значимих та універсальних регуляторів клітинних функцій. Зміна цитозольної концентрації вільного кальцію забезпечує передачу сигналів від спеціалізованих структур плазматичної мембрани до внутрішньоклітинних систем, запускаючи ряд найважливіших цитоплазматичних процесів, що лежать в основі клітинної збудливості, метаболізму, пластичності, секреції та регуляції генетичного апарату. Підтримання внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію ([Ca²⁺]_вн) на дуже низькому рівні (10^-8 -10^-7 М/л) у стані спокою та зміна її під час клітинної активності забезпечується завдяки взаємодії різних структур, що розміщені як у цитоплазмі, так і у мембрані клітин. Порушення кальцієвого гомеостазу в нервових клітинах може бути основною причиною змін, пов'язаних з передачею сенсорної інформації. Рівень вільного цитозольного кальцію може контролювати процеси потенціації та депресії міжнейронної синаптичної передачі. Останнім часом багато дослідників схильні зараховувати саме зміни кальцієвої регуляції до основних причин виникнення патологій при гіпоксії.

Актуальність проблеми. Зменшення надходження кисню до організму може призводити до незворотного клітинного пошкодження. Нервові клітини особливо чутливі до зміни парціальної напруги кисню (pO₂) навколишнього середовища у порівнянні з іншими тканинами та клітинами ссавців. У людини гострий гіпоксичний стан може закінчуватися пошкодженням нейронів мозку та мозковим паралічем, стимулюючи олігофренію та епілепсію. Досліджені в даній роботі нейрони задньокорінцевих гангліїв (DRG нейрони) належать до первинних сенсорних нейронів та відіграють важливу роль при передачі сенсорної інформації безпосередньо від рецепторів до вторинних нейронів. В популяції DRG нейронів виділяють два типи клітин: малі нейрони (С тип) та великі нейрони (А тип). До перших належать нейрони, що проводять ноцицептивну (больову) інформацію, до других - нейрони, що проводять тактильну, температурну, пропріоцептивну та інші типи сенсорної інформації.

DRG нейрони є дуже цікавим об'єктом при дослідженні такого патологічного стану як цукровий діабет (ЦД), що супроводжується порушеннями у нервовій системі - діабетичними нейропатіями (ДН). Однією з патологій при ЦД є алодінія - стан, при якому небольовий стимул викликає больові відчуття. Таке порушення може бути також пов'язане із зміною у функціонуванні задньокорінцевих гангліїв (нейронів С типу) та порушенням у них кальцієвого гомеостазу.

Першою ознакою захворювання на діабет є гіперглікемія - збільшений вміст глюкози у крові (до 30 мМ/л; 6-7 мМ/л у нормі). Таке збільшення може призводити до змін у метаболізмі клітин, що у свою чергу може впливати на кальцієву сигналізацію при різних впливах на клітину, зокрема при зміні нормоксичного оточуючого середовища на гіпоксиче.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової програми відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: „Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій різних мозкових структур”.

Мета та завдання дослідження. Мета даної роботи полягала у дослідженні змін кальцієвого гомеостазу у первинних сенсорних нейронах (DRG нейрони) щурів при зменшенні напруги кисню у зовнішньоклітинному розчині. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

1. Використовуючи метод флуоресцентної кальціометрії та полярографічний метод вимірювання напруги кисню у зовнішньоклітинному середовищі, дослідити зміни внутрішньоклітинної концентрації вільного кальцію у первинних сенсорних нейронах щурів при гіпоксії.

2. Порівняти зміни кальцієвого гомеостазу при гіпоксії у DRG нейронах різних типів: малих (С тип) та великих (А тип).

3. Визначити роль кальцієвих каналів, Na⁺-Ca²⁺-обмінника та внутрішньоклітинних механізмів акумуляції кальцію у зміні кальцієвого гомеостазу за гіпоксичного впливу.

4. Дослідити зміни внутрішньоклітинної концентрації вільного кальцію у первинних сенсорних нейронах діабетичних щурів при гіпоксії та порівняти їх із змінами кальцієвого гомеостазу при гіпоксії у нормальних щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі досліджено зміни концентрації вільного кальцію у сенсорних нейронах щура при зниженні парціального тиску кисню у позаклітинному середовищі без глюкози в нормі та при діабеті. Вперше було показано, що гіпоксія викликає відносно більший ефект у нейронах С типу (ноцицептивні), ніж у нейронах типу А (пропріоцептивні), причому збільшення концентрації кальцію виявляється більш помітним у центрі клітини порівняно з периферією в обох типах клітин. Проведені експерименти показали, що гіпоксичний ефект у досліджуваних нейронах проявляється як у присутності кальцію у позаклітинному середовищі, так і при його відсутності. Показано, що основним шляхом входу кальцію всередину клітини із позаклітинного середовища є потенціалкеровані Ca² канали L типу, який є домінуючим в популяції Ca² каналів сенсорних нейронів. Виявлено участь у гіпоксичному ефекті зворотної дії Na⁺-Ca²⁺-обмінника та внутрішньоклітинних депо кальцію (мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму). Вперше було показано, що збільшення Ca²_вн при гіпоксії за різними окремими механізмами не є адитивним при загальному ефекті, що свідчить не лише про пряму дії гіпоксії на клітинні органели, але й про її складний ефект, при якому іони Ca² виступають як вторинні посередники. Зроблено порівняння ефекту гіпоксії на DRG нейрони щурів в нормі та при діабеті. Показано, що у ізольованих нейронах щурів, хворих на ЦД, ефект гіпоксії значно менший (15%) у порівнянні з контролем (130%), що може бути пов'язане з характерним для діабету послабленням Са²⁺-акумулюючої функції мітохондрій та ЕР.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів. Отримані в даній роботі результати мають як теоретичне, так і практичне значення. Ці дані дають підстави говорити про відміни в участі різних функціональних типів DRG нейронів у гіпоксичному ефекті. Представлені результати розкривають можливі аспекти збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію, викликані дією гіпоксії.

Результати роботи, отримані при використанні блокаторів L типу Ca² каналів, Na⁺/Ca²⁺ ? обмінника а також функцій певних внутрішньоклітинних органел, дають нам нові знання для розуміння функціонування сенсорних нейронів при гіпоксії. Визначення впливу різних видів блокаторів на зменшення гіпоксичного ефекту може допомогти знайти нові фармакологічні інструменти, які будуть ефективними в лікуванні хвороб, викликаних дефіцитом O₂ - таких як гіпоксія або ішемія.

Той факт, що у клітинах хворих на діабет щурів гіпоксія викликає менші зміни у концентрації внутрішньоклітинного кальцію, ніж у здорових тварин, спонукає проводити подальші дослідження по виявленню морфологічних та функціональних змін у нейронах при патології та пошук альтернативних шляхів лікування розладів, що виникають при гіпоксії.

Особистий внесок здобувача. Робота по вивченню змін внутрішньоклітинної концентрацію кальцію в DRG нейронах щурів в нормі та при діабеті, дослідження внеску L типу Ca²⁺ каналів, Na⁺/Ca²⁺-обмінника, Са²⁺-АТФази, а також функцій мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму при гіпоксичному ефекті, приготування ізольованих первинних сенсорних нейронів, обробка експериментального матеріалу та статистичний аналіз результатів дослідження проводилися автором особисто. В розробці напрямків роботи та обговоренні результатів приймали активну участь співавтори публікацій.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи докладались на конференції "Bogomoletz-Nencki Meeting" (Сулейов, Польща, 7-8 травня 2001 р.), міжнародній конференції ASTROECO-2002 (Терскол, Росія, 12-16 серпня 2002 р.), 29-ій конференції з нейробіології та 5-ій зустрічі фізіологічного товариства Германії (Геттінген, Германія, 2003 р.), конференції молодих вчених інституту фізіології „Перспективні напрями досліджень сучасної фізіології” (Київ, 17-18 листопада 2003 р.) та літній школі-семінарі IBRO (Москва, Росія, 18-31 серпня 2004 р.).

Публікації. По результатам роботи опубліковано чотири статті та тези двох доповідей у наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 262 найменування. Робота викладена на 144 сторінках та ілюстрована 29 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність дослідження впливу гіпоксії на внутрішньоклітинний кальцієвий гомеостаз у сенсорних нейронах щура в нормі та при захворюванні на цукровий діабет, сформульована мета та задачі дослідження, наведені відомості про наукову новизну, практичну та теоретичну цінність роботи, а також апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ 1. „Огляд літературних даних” присвячений висвітленню відомих аспектів ролі кальцію та кальцієвого гомеостазу у нейронах. Розглянуто властивості потенціал-керованих та рецептор-керованих кальцієвих каналів мембрани клітини, а також їх кисневу чутливість. Охарактеризовані різні внутрішньоклітинні кальцієві депо, шляхи збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію, а також механізми виведення іонів кальцію з клітини. Проведено аналіз відомих на сьогодні даних та існуючих протиріч стосовно впливу гіпоксії на нервові клітини в цілому та окремі їх структури. Надано класифікацію діабету та проаналізовано функціональні зміни у сенсорних нейронах, що виникають при цьому захворюванні, зокрема порушення кальцієвого гомеостазу.

Для досягнення поставленої мети у розділі 2 „Матеріали та методи дослідження” описано використання наступних методичних підходів:

· ферментативне виділення гостроізольованих DRG нейронів;

· флуоресцентний метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації іонів Са²⁺ у клітинах;

· моделювання стану гіпоксії;

· визначення напруги кисню за допомогою полярографічного методу;

· отримання експериментального стрептозотоцин-індукованого діабету;

· статистична обробка отриманих результатів з використання стандартних методів аналізу.

Ферментативне виділення гостроізольованих DRG нейронів. В експериментах використовувались щури лінії Вістар віком 1.5-2 місяці. Процедура декапітації щура проводились у відповідності з вимогами НАН України по використанню експериментальних тварин. Виділені спинномозкові ганглії переносилися у розчин Tyrode, що містив ферменти колагеназу (тип ІА, Sigma, США) в концентрації 0.5 мг/мл та протеазу (тип XIV, Sigma, США) в концентрації 1 мг/мл, в якому витримувалися на протязі 25-30 хвилин при температурі 37 С. Для усунення залишків ферменту та запобігання їх подальшої дії ганглії інкубувались в насиченому розчині білка альбуміну в DPBS 1 мг/мл (Sigma, США) на протязі 10 хвилин при 37 С, після чого відмивалися чистим розчином DPBS 5-6 разів на протязі 10 хвилин при цій же температурі. Для отримання суспензії клітин ганглії піпетувалися за допомогою Пастеровських піпеток різного діаметру у 0.5 мл розчину Tyrode. Отриману суспензію витримували у чашках Перті на протязі 20-30 хвилин для закріплення клітин до дна чашки. В експерименті клітини використовували на протязі 4-6 годин після виділення.

Вимірювання змін концентрації іонів Са²⁺ за допомогою флуоресцентного методу. Для дослідження змін [Са²⁺]_вн в сенсорних нейронах гангліїв дорсального корінця щура в якості кальцієвого індикатору використовувався барвник Fura-2. Гостроізольовані сенсорні нейрони інкубувалися протягом 30 хв. при температурі 37°С в зовнішньоклітинному розчині з барвником. Після цього клітини відмивались чистим розчином і залишалися на 30-40 хвилин для завершальної деестерифікації Fura-2 АМ. Завантаження барвником та подальша деестерифікація проводилися у відсутності світла. Збудження флуоресцентного зонду здійснювалось на довжинах хвилі 360 (F1) та 380 (F2) нм за допомогою ксенонової лампи та використання відповідних фільтрів. Реєстрація емісії зонду проводилась в діапазоні 480-570 нм з піком 510 нм за допомогою дисектору, який являє собою магнітооптичну лінзу. Кількісне визначення [Ca²⁺]_вн проводилося за формулою:

,

де R=F1/F2, К_д _ константа дисоціації Fura-2, R_мін=R при [Ca²⁺]_вн=0 М (відсутність кальцію), R_макс=R при [Ca²⁺]_вн=1 мкМ/л (насичуюча концентрація кальцію). Константа В визначається оптичними характеристиками установки та дорівнює В=F2_мін/F2_макс, де F2_мін та F2_макс ? інтенсивність флуоресценції барвника при відсутності та насичуючій концентрації кальцію відповідно. Всі величини концентрації представлені як середнє значення±стандартна помилка (SEM). Статистичні відмінності були оцінені за допомогою стандартних методів із рівнем достовірності р.

Моделювання гіпоксії. Для моделювання гіпоксичного стану клітини використовувалась аплікація зовнішньоклітинного розчину із зниженим вмістом кисню. Для отримання низьких значень рО₂ зовнішньоклітиний розчин на протязі 10 хвилин піддавався обробці азотом. Бульбашки азоту пропускалися через рідину, а також азот був присутній над поверхнею розчину. Рівень рО₂, що використовувався в даних експериментах, становив 10-40 мм рт.ст. і може бути віднесений до середньої гіпоксії по відношенню до нормоксичного стану (рО₂=156 мм рт.ст.).

Кількісне визначення рівня гіпоксії. Полярографічний метод вимірювання рО₂ ґрунтується на явищі електрохімічного відновлення фізично розчиненого у рідині кисню. Даний метод аналізу має велику чутливість, що дозволяє визначити дуже малі концентрації досліджуваної речовини при малих об'ємах розчину (до 10 мкл). Суть методу полягає у тому, що при подачі на робочий електрод від'ємної напруги від зовнішнього джерела струму, у приелектродному просторі відбувається організація іонів електроліту, в результаті чого електрод поляризується. Подвійний дипольний шар іонів електролітів, що присутні у досліджуваному розчині або живій тканині, створює високий омічний опір (0.1-10 ГОм), тому струм у колі електродів майже відсутній. При попаданні у розчин молекул кисню, що здатні приймати електрони на зовнішню орбіту, виникає “пробій” подвійного дипольного шару та у колі електродів з'являється струм. Сила струму пропорційна кількості продифундованих до робочого електроду молекул кисню та дозволяє судити про концентрацію та напругу кисню.

Модель стрептозотоцин-індукованого діабету. У моделі експериментального діабету ми використали щурів лінії Вістар у віці 24 дня. Штучний діабет викликався одноразовою внутрішньочеревинною ін'єкцією стрептозотоцину, розчиненого у фізіологічному розчині (ізотонічний 0,9% розчин NaCl для ін'єкцій), у кількості із розрахунку 80 мг/кг ваги тварини. Щури із STZ-індукованим діабетом та контрольні тварини такого самого віку утримувалися в однакових умовах з однаковим раціоном протягом усього періоду розвитку захворювання. Експерименти проводилися на тваринах через 3?4 тижні після ін'єкції стрептозотоцина. Концентрація глюкози в плазмі крові, взятої із хвостової вени, вимірялася за допомогою оптичного сенсора глюкози Глюкотренд (Roche Diagnostics Gmb., Mannheim, Німеччина). Із групи щурів зі STZ-індукованим діабетом у дослід бралися тварини з рівнем глюкози в плазмі крові більше 20 мМ/мл (6-7 мМ/мл у нормі).

У третьому розділі “Результати досліджень” представлено експериментально визначені зміни концентрації кальцію у сенсорних нейронах щурів за умов гіпоксії. Визначено внесок окремих клітинних структур у збільшення концентрації кальцію при зниженні парціального тиску кисню.

Ефект гіпоксії на рівень внутрішньоклітинного кальцію. DRG нейрони є гетерогенними по відношенню до їх функцій та морфології: ноціцептивні (клітини малого діаметру) та проприоцептивні (клітини великого діаметру). Тому в даних експериментах ми проводили аналіз окремо для обох типів нейронів. Оскільки використовувався зовнішньоклітинний розчин без глюкози як у контролі, так і при гіпоксичних умовах, ми виключали роль гліколізу при спостереженні ефекту гіпоксії. Оскільки використаний в даній роботі дисектор дозволяв робити просторово розділення флуоресцентного сигналу, реєстрація проводилась з двох точок клітини: з середини нейрону та поблизу його плазматичної мембрани. Проведені виміри показали, що зміна нормоксичного зовнішнього середовища клітини на гіпоксичне в усіх досліджуваних нейронах призводила до істотного підвищення вмісту іонів Ca²⁺ в їхньому цитозолі.

Така реакція розвивалася на протязі хвилини. В усіх випадках підвищення було більш істотним у центрі клітини, ніж в навколомембранному просторі. Кількісні характеристики підвищення [Ca²⁺]_вн відрізнялися і в клітинах з різним діаметром соми: у більших клітинах (сенсорні нейрони групи А, що проводять імпульсацію від низькопорогових механорецепторів та пропріоцепторів) воно було меншим, ніж у клітинах малого діаметру (сенсорні нейрони групи А або С, що проводять в основному ноціцептивну імпульсацію).

Рівень кальцію за гіпоксії складав 300±27 нМ та 270±40 нМ (n=8) в центрі та на периферії великих клітин і 400±60 нМ та 310±50 нМ (n=15) в центрі та на периферії малих нейронів відповідно. Гіпоксичний ефект вираховувався відношенням [Ca²⁺]_вн через 3 хвилини після початку гіпоксії до базального рівня кальцію окремо для кожної клітини. Потім результати усереднювалися. У більшості випадків описані зміни були зворотними, і після переходу клітини в нормоксичне середовище вміст Ca²⁺ у цитозолі через декілька хвилин повертався до базального рівня. Однак у деяких випадках ефект був незворотним (якщо клітина знаходилася у гіпоксичному стані на протязі 4 або більше хвилин) ? незважаючи на вихід із гіпоксії, цитозольний вміст Ca²⁺ продовжував підвищуватися, і незабаром наставала загибель клітини.

Отримані результати підтверджують припущення про те, що первинною прямою реакцією нервової клітини на гіпоксію є саме порушення її Ca²⁺ гомеостазу.

Роль зовнішньоклітинного кальцію. Найпершим методичним підходом для з'ясування первинного джерела іонів Ca²⁺, що наповнюють клітину за гіпоксичних умов, було проведення експериментів при відсутності у зовнішньоклітинному просторі іонів кальцію. Іони Ca²⁺ еквімолярно замінювався на іони Mg²⁺. При деполяризації клітини не виникало кальцієвих транзієнтів, що свідчило про неможливість збільшення [Ca²⁺]_вн за допомогою іонів із позаклітинного розчину. За умови безкальцієвого позаклітинного розчину гіпоксичне підвищення [Ca²⁺]_вн різко знижується у порівнянні з контролем і становить лише 260±30 нМ в центрі та 250±40 нМ (n=7) на периферії великих нейронів і 225±30 нМ та 215±20 нМ (n=17) в малих нейронах. У цьому випадку гіпоксичний ефект склав 25±6 % та 19±4 % (n=17) в малих клітинах та 17±10 % та 11±8 % (n=7) у великих. Таким чином, надходження іонів з позаклітинного середовища дійсно є домінуючим у виявленому гіпоксичному ефекті, хоч деяку його частину можуть складати і внутрішньоклітинні джерела іонів Ca²⁺.

Ефект Cd²⁺ на гіпоксичний ефект. Для дослідження можливої участі активного транспорту Ca²⁺ через мембрану у ефекті, що спостерігається при гіпоксії, було проведено експерименти в умовах блокування роботі Са²⁺-АТФази додаванням 30 М Cd²⁺ у зовнішньоклітинний розчин. Така концентрація Cd²⁺ недостатня для блокування Са²⁺ каналів, але достатня для блокування активності Са²⁺-АТФази. Присутність кальцієвих транзієнтів у відповідь на короткочасну аплікацію гіперкалієвого розчину вказує на збереження активності Са²⁺ каналів і селективність дії Cd²⁺ на Са²⁺-АТФазу в умовах даного експерименту.

В цих експериментах у всіх досліджуваних нейронів спостерігалося збільшення базального рівня Са²⁺. Він становив 230±20 нМ в центрі та 200±25 нМ (n=6) на периферії великих нейронів та 220±40 нМ і 195±40 нМ (n=5) відповідно у малих нейронах. Збільшення базального рівня Са²⁺ було достовірним у центрі великих нейронів (р<0.05). Зміни у [Ca²⁺]_вн в стані спокою при додаванні 30 М Cd²⁺ безперечно вказують на роль активного викачування іонів Са²⁺ активним транспортним механізмом у підтриманні низького базального рівня кальцію. За умов блокування Са²⁺-АТФази перехід до гіпоксичного стану викликав збільшення [Ca²⁺]_вн, подібне до аналогічного у контрольному розчині. Рівень іонів Са²⁺ збільшувався до 430±50 нМ в центрі та 330±40 нМ (n=6) біля мембрани великих нейронів та 400±90 нМ і 360±80 нМ (n=5) в центрі і на периферії, відповідно, малих нейронів. Ефект гіпоксії залишався високо достовірним.

Плазмалемальний Na⁺/Ca²⁺-обмінник. За фізіологічних умов іонообмінний механізм виводить іони Са²⁺ з клітини в обмін на надходження всередину клітини іонів Na⁺, трансмембранний градієнт яких є рушійною силою для такого обміну. Однак за певних умов можливе реверсування цього обмінного механізму, при якому він стає переносником іонів Са²⁺ з зовнішнього середовища всередину клітини. Такою умовою може бути істотне підвищення внутрішньоклітинного вмісту іонів Na⁺, при якому градієнт цих іонів уже не може бути рушійною силою для виведення кальцію з клітини.

Для визначення такої можливості за умов гіпоксії можна замінити іони Na⁺ в позаклітинному середовищі на інші одновалентні іоні ? Li⁺ або холіну. Іони Li⁺ здатні проникати через Na⁺ канали, однак вони не можуть замістити іони Na⁺ в іонному обміннику і не дозволяють працювати обміннику в зворотному режимі; іони холіну взагалі не проникають через ці канали. При заміні Na⁺ на Li⁺ відзначається невелике, але статистично вірогідне зменшення гіпоксичного ефекту. Він складав 60±10 % у центрі та 31±7 % на периферії клітин. При цьому концентрація іонів Са²⁺ складала відповідно 309±60 нМ та 219±35 нМ (n=8). У випадку заміщення Na⁺ на іони холіну [Ca²⁺]_вн при гіпоксії складала 200±40 нМ та 225±60 нМ (n=5). Значення гіпоксичного ефекту приведено на рис.3. Отже, певну роль у гіпоксичнуму підвищенні рівня Са²⁺ може відігравати і реверсія іонотранспортної функції плазмалемального обмінника.

Потенціал-керовані Ca²⁺ канали. Найбільш ефективним шляхом надходження іонів Са²⁺ із позаклітинного середовища всередину нейрону можуть бути Ca²⁺ канали плазматичної мембрани. Тому було проведено порівняння описаних вище гіпоксичних ефектів до і після додавання специфічних блокаторів таких каналів. Оскільки в сенсорних нейронах домінуючим типом є канали L типу, як блокатор використовувався ніфедипін у концентрації 10 мкМ/л. Аплікація ніфедипіну майже повністю попереджувала збільшення [Ca²⁺]_вн, викликане гіпоксією. Воно становило 113±12 нМ в центрі та 112±12 нМ (n=7) біля мембрани великих нейронів і 96±8 нМ та 101±7 нМ (n=10) відповідно у малих нейронах.

Відносне значення гіпоксичного ефекту при дії ніфедипіну становило для усіх клітин 13.3±3 % у центрі та 10±3 % (n=17) на периферії клітин.

Участь мітохондрій у гіпоксичному ефекті. Дослідження останніх років продемонстрували активну роль мітохондрій у поглинанні іонів Ca²⁺, які входять усередину клітини із позаклітинного середовища, а також наступне їх вивільнення назад у цитозоль. Висока ефективність захоплення іонів Ca²⁺ мітохондріями можлива завдяки наявності на їхній внутрішній мембрані високої трансмембранної різниці потенціалів і механізму уніпортерного переносу кальцію всередину органел під впливом значного електрохімічного градієнту на цій мембрані. Було досліджено зміни гіпоксичного ефекту у разі виключення цієї функції мітохондрій сполукою, що проникає в клітину, протонофора СССР (карбоніл ціанід m-хлорофеніл-гідразону). У більшості клітин аплікація 10 мкМ/л СССР викликало збільшення базального рівня кальцію. Спостерігалось 2 типи відповіді DRG нейронів на гіпоксію в присутності СССР у зовнішньоклітинному розчині. У 5 досліджуваних клітинах як окремо СССР, так і гіпоксія в присутності СССР не викликали значного ефекту, тоді як в інших 4 клітинах гіпоксія викликала збільшення [Ca²⁺]_вн, хоча достовірно менше, ніж у контролі. Відносне значення гіпоксичного ефекту складало 45±5 % у центрі та 17±6 % (n=17) поблизу мембрани клітини. На рис.4. показаний ефект гіпоксії при додаванні у зовнішній розчин СССР та інших умовах експерименту.

Отримані результати свідчать, що Ca²⁺-обмінна функція мітохондрій задіяна у гіпоксичному ефекті. Можна припустити, що мітохондрії ефективно поглинають ці іони після їхнього надходження в клітину через поверхневу мембрану і потім з часовою затримкою вертають їх назад у цитозоль за допомогою іонного обміну, подовжуючи завдяки цьому часове проходження викликаних деполяризацією транзієнтів. За умов гіпоксії така абсорбція, очевидно, ускладнюється у зв'язку з характерним для цих умов зниженням різниці потенціалів на внутрішній мітохондріальній мембрані і відповідним ослабленням уніпортерного захоплення іонів мітохондріями.

Можлива участь ЕР у гіпоксичному ефекті. Перед аплікацією гіпоксичного розчину у позаклітинне середовище, у якому іони Ca²⁺ були еквімолярно заміщені іонами Mg²⁺, додавався протонофор мітохондрій СССР у концентрації 10 мкМ/л. При деполяризації клітини у безкальцієвому розчині не виникає Ca²⁺ транзієнту, що свідчить про неможливість входу кальцію із позаклітинного середовища. При аплікації СССР виникає підвищення [Ca²⁺]_вн, тобто кальцій знаходиться в мітохондріях і при відсутності його у позаклітинному середовищі. За гіпоксичних умов збільшення [Ca²⁺]_вн складало 7,7±3 % у центрі та 2,8±2 % (n=8) у примембранному просторі клітини.

Ефект гіпоксії на рівень внутрішньоклітинного кальцію у щурів, хворих на ЦД. При зменшенні парціального тиску кисню до значень 25-30 мм рт.ст. у нейронах діабетичних щурів гіпоксичний ефект склав 15±3 % (n=11) у малих клітинах та 8±2 % (n=9) у великих, що значно менше у порівняння із контролем. При подальшому зниженні вмісту кисню у позаклітинному середовищі до рО₂=1015 мм рт.ст, ефект виявлявся достовірно більшим і складав 41±5 % (n=6) і 53±11 % (n=8) у малих та великих клітинах відповідно.

Отримані дані свідчать, що діабетичні тварини виявляються більш стійкими до середніх рівнів гіпоксії. Подальше зменшення рівня рО₂ викликає подальше збільшення ефекту.

Обговорення результатів. З'ясування механізмів ушкодження нервових клітин при відсутності або нестачі кисню є однією із ключових завдань сучасної нейрофізіології та біофізики. Відомо, що при гіпоксії в нервових клітинах ЦНС відбувається збільшення концентрації внутрішньоклітинного кальцію. Однак, усе ще неясно, через що відбувається накопичення кальцію в клітині при прямій дії гіпоксії і який внесок у збільшенні внутрішньоклітинної концентрації кальцію належить окремим клітинним структурам.

Відомо, що при ранній гіпоксії відбувається зміна калієвої провідності, що призводить до гіперполяризації нейрону та зникнення постсинаптичних потенціалів і припинення електричної активності. Дані процеси можна розглядати як захисні механізми, оскільки вони запобігають клітинному ушкодженню, внаслідок невідповідності між потребами й запасами енергії. За умов нестачі кисню відбувається підвищення концентрації цитоплазматичного вільного кальцію, зниження концентрації ATФ, і позаклітинне накопичення аденозину. При реоксигенації реакція пригнічення нейронної активності зворотна, доки при гіпоксії нервові клітки мають адекватну поставку глюкози. Недостатній вміст ATФ і зменшення гліколізу приводить до зменшення активності Na⁺-K⁺ помпи й синтезу різних білкових молекул. Коли ж існує дефіцит кисню й глюкози, клітинні захисні механізми не можуть запобігти ушкоджуючим впливам надмірного входу Ca²⁺ у клітину. При цьому також можуть виникати відхилення від норми у роботі мітохондрій.

Дослідження змін у функціонуванні механізмів, що відповідальні за підтримання високого градієнту концентрації вільного кальцію між клітиною та позаклітинним простором при патологіях має велике практичне й теоретичне значення. Воно дозволяє значно розширити наші знання про фізіологічні зміни, що відбуваються в нервових клітинах при тих чи інших порушеннях в організмі людини.

У даній роботі ми проводили дослідження змін внутрішньоклітинної концентрації кальцію в первинних сенсорних нейронах (DRG нейронах) 1.5-2 місячних щурів в нормі та при діабеті. В експериментах проводився окремий статистичний аналіз для нейронів великого та малого діаметру. Це пов'язано із відмінностями у їх функціональному призначенні.

Для дослідження змін [Ca²⁺]_вн нами була обрана така модель гіпоксії: зменшення напруги кисню до 25ч35 мм рт.ст. у позаклітинному розчині, що не містив глюкози. Відсутність глюкози в позаклітинному розчині необхідно для запобігання захисним механізмам, які можуть бути використані клітиною при ранній гіпоксії, що може бути виражене у зміні відповіді нейрону на гіпоксію. При дослідженні змін вмісту кальцію у нейронах діабетичних щурів використовувались значення рО₂ до 15 мм рт.ст.

На першому етапі проведення експериментів досліджувався вплив гіпоксії середнього рівня на [Ca²⁺]_вн нормальних щурів у стандартному розчині Tyrode. Отримані дані свідчать про те, що гостроізольовані DRG нейрони, які ніяк не можуть бути активовані шляхом Ca²⁺-проникних рецептор-керованих каналів, все ще відповідають значним підвищенням [Ca²⁺]_вн на прикладення гіпоксії. Джерелом такого перевантаження кальцієм можуть бути іони із позаклітинного середовища, які входять усередину клітини декількома можливими шляхами.

Несподіваним виявився той факт, що доволі ефективним попередженням гіпоксичного ефекту є блокування L-типу потенціал-керованих Ca²⁺ каналів їх специфічним блокатором ніфедипіном. Подібні дані були отримані і на інших типах нейронів, які співпадають з нашими дослідженнями ролі L-типу каналів у гіпоксичному ефекті. Взагалі припускають, що кальцієві канали не є основним сенсором зменшення рО₂ у зовнішньоклітинному розчині, хоча в деяких типах нейронів вони фактично є доволі чутливими до таких умов. Описаний гіпоксичний ефект може бути зумовлений активацією цих каналів внаслідок деполяризації мембрани, викликаної іншими причинами, найбільш певною з яких є пригнічення калієвих каналів, значний рівень активності яких підтримує високі значення потенціалу мембрани. Такий механізм детально досліджений у рецепторних зонах стінки судинного русла ? дуги аорти і каротидних синусів.

Однак у деяких недавніх роботах показана можливість прямого збільшення ймовірності відкритого стану кальцієвих каналів L-типу за гіпоксичний умов ? наприклад у нейронах дихального центру довгастого мозку, що може забезпечити його швидку реакцію на нестачу кисню в крові. Однак у попередніх дослідженнях на сенсорних нейронах гангліїв дорзальних корінців не відзначено підсилення активності високопорогових кальцієвих каналів при зниженні оксигенації позаклітинного розчину; більш того, в деякому відсотку клітин відбувалося навіть зниження їхньої активності.

Важливо відзначити існуючу залежність розвитку гіпоксичного підсилення активності кальцієвих каналів від базового внутрішньоклітинного вмісту іонів Са²⁺. На нейронах гіпокампу було відмічено істотну потенціацію гіпоксичного впливу на кальцієві канали за умов, коли цей вміст штучного підвищувався. Внутрішньоклітинне додавання хелатору кальцію ЕГТА усувало гіпоксичний ефект на Ca²⁺ канали. Ці результати можуть свідчити про те, що збільшення концентрації цитозольного кальцію видаляє деякий постійний пригнічуючий внутрішньоклітинний ефект в цих каналах, активізуючи декілька механізмів. Одним з механізмів, що пояснює викликану гіпоксією активацію кальцієвих каналів, може полягати у їх збільшеному фосфорилюванні. Активація кальцій-залежних протеїнкіназ може викликати фосфорилювання кальцієвих каналів і, таким чином, збільшувати приток іонів Ca²⁺ із позаклітинного середовища всередину клітини. Серед відомих кальцій-залежних протеїнкіназ протеїнкіназа С та кальмодулін-залежна протеїнкіназа розглядаються як можливі регулятори Ca²⁺ каналів в нейронах. Участь протеїнкінази С у викликаному гіпоксією збільшенні провідності L-типу кальцієвих каналів була продемонстровано на клітинах сонної артерії. Однак зниження концентрації АТФ під час гіпоксії робить сумнівним участь АТФ-залежного фосфорилювання у гіпоксичному ефекті.

Гіпоксичний ефект на клітинах сонної артерії спостерігався у зовнішньоклітинному розчині, що містив HCO₃^? та СО₂. В даних експериментах на DRG нейронах ефект спостерігався у середовищі, в якому в якості буферу використовувався Hepes. Відмінність у ефектах може бути пов'язана із спеціалізацією клітин сонної артерії у чутливості до кисню. Слід зазначити, що іонні канали можуть збільшувати свою одиночну провідність під час гіпоксії.

Інші більш складні механізми також можуть бути задіяні у розвитку гіпоксичного ефекту. Наприклад, внутрішньоклітинний кальцій є необхідним для викликаної гіпоксією експресії генів, що може бути залучено у складні метаболічні шляхи, що впливають на клітинні відповіді на гіпоксію. Однак ці процеси можуть розвиватися на протязі більш тривалих відрізків часу, аніж ті, що використовувались в наших експериментах.

Як показали наші дослідження, вхід кальцію із позаклітинного середовища до нейрону через L-тип кальцієвих каналів не є єдиним шляхом збільшення [Ca²⁺]_вн при гіпоксичному впливі. Існують інші паралельні механізми, що сприяють входу кальцію ззовні. Представлені дані вказують на те, що іони Na⁺ можуть відігравати суттєву роль в гіпоксичному ефекті, що закінчується мембранною деполяризацією та можливим переходом роботи Na⁺- Ca²⁺ обмінника у зворотний режим після суттєвого збільшення внутрішньоклітинного рівня іонів Na⁺. В наших експериментах була виключена роль метаботропних рецепторів, оскільки, подібно до коркових нейронів, в цих клітинах гіпоксія може викликати вхід Na⁺ у клітини через потенціал-керовані натрієві канали.

В даних експериментах було показано, що гіпоксичний ефект був достовірно меншим при використанні зовнішньоклітинного розчину, що не містив іони Na⁺. Заміна Na⁺ на Li⁺ у зовнішньому середовищі призвело до збільшення [Ca²⁺]_вн в 2 рази меншого, ніж при контрольному розчині.

А от пригнічення плазматичної Ca²⁺-АТФази суттєво не впливало на характеристики викликаного гіпоксією збільшення рівня кальцію, оскільки зниження рівня АТФ під час гіпоксії може інактивувати АТФази.

Накопичення іонів Na⁺ в цитозолі може також суттєво активізувати викид кальцію з мітохондрій через активацію Na⁺- Ca²⁺ обмінника на їх внутрішній мембрані. Такий ефект було продемонстровано під час гіпоксії в нейронах гіпокампу. Приймаючи до уваги, що Li⁺ може зайняти місце іонів Na⁺ у випадку мітохондріального Na⁺- Ca²⁺ обмінника, іони Li⁺, можливо, можуть частково брати участь у гіпоксичному ефекті шляхом вивільнення іонів Ca²⁺ через Li ⁺- Ca²⁺ обмінник. На відміну від іонів Li⁺, холін є непроникним для Na⁺ каналів.

При дослідженні впливу двох речовин на гіпоксичний ефект, Li⁺ та СССР, виявилось, що вони викликають просторово різний захисний ефект, що може бути пов'язано з змінами мітохондріальних функцій.

Ефект гіпоксії, який спостерігався при використанні протонофору мітохондрій СССР, був значно меншим за контрольний, причому протекторний ефект СССР більше спостерігався біля плазматичної мембрани клітини, ніж у центрі. Це явище можна пояснити тим, що мітохондрії переважно розташовані безпосередньо біля плазматичної мембрани, як це було знайдено при електронному дослідженні структури DRG нейронів.

Таким чином при звичайних умовах викликаний гіпоксією вхід кальцію в першу чергу відбувається через Ca²⁺ канали L-типу. Оскільки мітохондрії в DRG нейронах розташовані поблизу плазматичної мембрани, вони відразу ж поглинають іони Ca²⁺ з цитоплазми, акумулюючи їх у великій кількості. Збільшення рівня внутрішньомітохондріального кальцію може, в свою чергу, призводити до активації мітохондріальної пори перехідної проникності, через яку у внутрішньоклітинний простір викидаються іони Ca²⁺ та інші молекули з вагою до 1.5 кДа. Як результат, мітохондрії становляться недієздатними і може початися процес апоптозу. У випадку використання мітохондріального блокатору СССР мітохондрії не можуть акумулювати цитозольний кальцій і, отже, не можуть бути перевантажені кальцієм. Тому частина кальцію, що входить до нейрону під час гіпоксії через кальцієві канали, може бути виведена з клітини через Na⁺- Ca²⁺ обмінник і таким чином зменшувати гіпоксичний ефект.

Як зазначалося вище, при застосуванні протонофору мітохондрій СССР ефект викликаного гіпоксією підвищення [Ca²⁺]_вн був значно більшим у центрі клітини у порівнянні з її периферією. Близьке розташування мітохондрій до плазматичної мембрани сприяє швидкому накопиченню та вивільненню кальцію, що входить із зовнішнього середовища. В DRG нейронах ця структурна особливість може бути причиною описаних суттєвих змін в примембранній концентрації кальцію після запобігання акумуляції іонів Ca²⁺ мітохондріями.

Ця сама структурна особливість може бути причиною певних відмінностей у значенні гіпоксичного ефекту у малих та великих DRG нейронах, які функціонально відрізняються. При різних фармакологічних впливах на DRG нейрони відношення гіпоксичного ефекту центр/периферія змінювалося по-різному, що свідчить про залучення до збільшення [Ca²⁺]_вн різних внутрішньоклітинних процесів.

Хоча ендоплазматичний ретикулум також може відігравати роль у гіпоксичному збільшенні [Ca²⁺]_вн, його роль дуже обмежена. Треба взяти до уваги той факт, що під час гіпоксії концентрація АТФ значно зменшується через припинення її синтезу мітохондріями, і Ca²⁺-АТФази плазматичної мембрани та ендоплазматичного ретикулуму припиняють викачування Ca²⁺ з цитозолю. Тому в даних експериментах не спостерігалося значного ефекту блокування цих ферментів іонами Cd²⁺, оскільки вони пригнічуються власне шляхом зменшення рО₂ у зовнішньому розчині.

Іншим шляхом збільшення [Ca²⁺]_вн може бути Ca²⁺-опосередковане вивільнення Ca²⁺ із ретикулуму після його активації викликаним гіпоксією первинним збільшенням вмісту кальцію через мембранні канали. Однак він не може бути суттєвим, оскільки ретикулум не може достатньо заповнюватися кальцієм через інактивацію його Ca²⁺-АТФази. В даних експериментах був неможливим вихід кальцію із InsP₃-чутливого ЕР під час гіпоксії, оскільки ми виключили дію агоністов метаботропних рецепторів. В умовах in situ вивільнення іонів Ca²⁺ з цієї акумулюючої структури може бути викликане активацією певних мембранних рецепторів, сполучених з фосфоліпазою С.

При дослідженні ефекту гіпоксії на сенсорних нейронах діабетичних щурів виявилося, що клітини хворих тварин мають високу толерантність до зниження рО₂ у зовнішньому середовищі. Навіть при зменшенні вмісту кисню у навколоклітинному просторі до значень рО₂=10ч15 мм рт.ст. ефект гіпоксії був меншим, ніж у контрольних тварин.

Цукровий діабет спричиняє комплексні порушення центральної та периферичної нервової системи. Багато досліджень виявляють структурні зміни та функціональні порушення у DRG нейронах.