Створення букального препарату з інсуліном та оцінка його ефективності при корекції стоматологічних порушень у хворих на діабет 1-го типу

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

УДК 616.032:611.31

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

СТВОРЕННЯ БУКАЛЬНОГО ПРЕПАРАТУ З ІНСУЛІНОМ ТА ОЦІНКА ЙОГО ЕФЕКТИВНОСТІ ПРИ КОРЕКЦІЇ СТОМАТОЛОГІЧНИХ ПОРУШЕНЬ У ХВОРИХ НА ДІАБЕТ 1-ГО ТИПУ

03.00.20 - біотехнологія

СТАРОКАДОМСЬКИЙ Петро Львович

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, член-кореспондент НАН України, академік АМН України Кордюм Віталій Арнольдович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу регуляторних механізмів клітини.

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, професор Соломко Олександр Петрович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу біохімічної генетики; доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, професор кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії.

Провідна установа -Інститут біології клітини НАН України, м. Львів.

Захист дисертації відбудеться „27” грудня 2005 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м.Київ, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м.Київ, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано „26” листопада 2005 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Існують різні способи введення лікарських препаратів в організм. Найбільш універсальним є інґєкційний метод. Але ін'єкції в більшості випадків призводять до миттєвого локального збільшення концентрації введеного препарату, що при регулярному застосуванні може призводити до розвитку різноманітних токсичних та аутоімунних реакцій. Крім того ін'єкції дискомфортні, потребують амбулаторних умов чи кваліфікації при самообслуговуванні. Тому розробка неін'єкційних шляхів введення лікарських препаратів, таких як оральний, ректальний, інгаляційний, трансдермальний та інші методи, була і залишається актуальним завданням. І у першу чергу це актуально для білкових препаратів, для яких ін'єкції до сьогодні лишаються єдиним надійним способом введення. Тому особливий інтерес викликають праці, у яких досліджується можливість неін'єкційного введення білкових препаратів, таких як інсулін, інтерферони, інтерлейкіни. Однак поки що для більшості неін'єкційних методів притаманні суттєві недоліки. Основні з них - це низька ефективність та важко прогнозована дія.

Принципово нові можливості введення препаратів в організм людини відкриває спосіб, який використовує перепускний потенціал слизової оболонки порожнини рота (СОПР) - так званий букальний шлях введення (від лат. bucca - щока). Ротову порожнину для введення низькомолекулярних препаратів, таких як валідол, нітрогліцерин та інші, використовують вже тривалий час. Але букальне введення макромолекул, зокрема білків, у кровоносну систему поки що не може конкурувати з ін'єкційним способом. Це пояснюється низькою ефективністю, ненадійністю та дороговизною білкових букальних препаратів, запропонованих у сучасних роботах. В той же час для локального введення білків у тканини слизової оболонки рота букальний спосіб є надзвичайно перспективним. Наприклад, за допомогою букального введення інсуліну теоретично можливо проводити лікування та профілактику цілого ряду стоматологічних ускладнень, спричинених розвитком діабету 1-го типу. Однак у літературі даних про можливість використання букальних препаратів інсуліну для корекції стоматологічного статусу хворих на діабет відсутні. Тому актуальною є розробка ефективного букального препарату з інсуліном для лікування та профілактики стоматологічних ускладнень у діабетиків.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконана робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетною темою 2.2.4.3. „Вивчення на модельних об'єктах очікуваних терапевтичних ефектів, обумовлених введенням рекомбінантних молекул” (№ державної реєстрації 0103U000075, 2003-2007 pp.).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було створення букального препарату з інсуліном для лікування та профілактики стоматологічних ускладнень у хворих на діабет 1-го типу.

Відповідно до мети були поставлені такі завдання:

1. Теоретично визначити особливості транспорту білків через слизову оболонку порожнини рота.

2. Розробити ефективний та практичний стимулятор проникності (СП) для посилення букальної проникності інсуліну.

3. Визначити ефективність букальної композиції з інсуліном при лікуванні стоматологічних ускладнень у діабетичних щурів.

4. Розробити лікарську форму букального препарату з інсуліном.

5. Створити лабораторний методику розробки букального препарату з інсуліном та провести оцінку його ефективності.

Обєкт дослідження - проникність слизової оболонки порожнини рота для білків. Предмет дослідження - розробка науково обґрунтованого складу і лабораторної методики виготовлення букального препарату з інсуліном, вивчення стоматологічної лікувальної ефективності букального препарату з інсуліном. Для досягнення поставленої мети використовували такі методи дослідження: хімічний гідроліз овальбуміну, ліофілізація, дослідження проникності слизової оболонки рота для білків на ізольованих защічних мішках хомяка, диск-електрофорез у поліакриламідному гелі, гель-фільтрація, колориметричний аналіз, люмінесцентна мікроскопія. Доклінічні дослідження букального препарату з інсуліном були проведені на щурах відповідно до методик Державного Фармакологічного центру МОЗ України.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше запропоновано використовувати лізальбінат як ефективний стимулятор проникності для букальних білкових лікарських засобів.

Вперше показано ефективність букального препарату з інсуліном при лікуванні травматичного стоматиту та профілактиці пародонтозу у щурів з стрептозотоциновим діабетом.

Запатентовано жувальну форму букального препарату з інсуліном для профілактики та лікування стоматологічних ускладнень у хворих на діабет 1-го типу.

Створено методику розробки букального препарату з інсуліном.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано безпечний та ефективний стимулятор проникності для використання у букальних системах введення білкових препаратів.

Створено букальний препарат з інсуліном, який після проведення клінічних іспитів можливо застосовувати для профілактики та лікування стоматологічних ускладнень у хворих на діабет 1-го типу.

Узагальнено теоретичні уявлення про механізм проникності СОПР для інсуліну та створено лабораторну методику розробки БПІ, що закладає теоретичне підґрунтя для розробки нових препаратів для букального введення низки білків.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені у дисертації, отримані та проаналізовані особисто автором або за його безпосередньої участі. Здобувачем теоретично розраховано та виготовлено низку букальних препаратів з інсуліном, визначено оптимальну композицію стимуляторів проникності. Особисто здобувачем проведено всі необхідні дослідження проникності слизової оболонки рота для білків та вплив на цей процес різноманітних стимуляторів проникності.

Дослідження локальної ефективності букальних композицій з інсуліном були проведені на базі Інституту стоматології АМН України спільно із спеціалістами-стоматологами. Автор висловлює подяку спеціалістам відділу гігієни Інституту стоматології АМН України, зокрема д.мед.н., ст.н.с. Терешиній Т.Г., к.мед.н., ст.н.с. Мозговій Н.В., к.б.н., ст.н.с. Скибі О.І., Близнюк А.А. за допомогу у проведенні дослідів.

Лізальбінат було виготовлено спільно із к.х.н. Дубеєм І.Я., дослідження поверхнево-активних властивостей лізальбінату були проведені на кафедрі колоїдної хімії Київського національного університету імені Т.Г. Шевченка к.х.н. Григорьєвою Г.С.

Автор висловлює подяку співробітникам відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України та всім колегам, які сприяли виконанню роботи, за допомогу, корисні поради, обговорення результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були апробовані на конференції молодих вчених, присвяченій 30-річчю Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (Київ, 2003), Установчому зґїзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), Конференції робіт молодих вчених, присвяченій 100-річчю з дня народження Чаговця Р.В. (Київ, 2004), Міжнародній конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 2 експериментальних статті у провідних фахових виданнях, 1 деклараційний патент України, 2 огляди, тези 4 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, 4 розділів, у яких викладено отримані результати та їх обговорення, аналізу та узагальнення результатів, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 129 сторінках машинописного тексту. Вона містить 28 рисунків та 12 таблиць. Список використаної літератури охоплює 136 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. Для одержання стимулятору проникності лізальбінату (ЛК) застосовували удосконалену методику на основі методу, описаного в роботі (Paal, 1902). Визначення молекулярної маси ЛК проводили за допомогою гель-фільтрації та диск-електрофорезу у поліакриламідному гелі. Визначення поверхневого натягу розчину від концентрації ЛК та критичної концентрації міцелоутворення проводили за стандартними методами (Григоров, 1964).

Букальну проникність білків досліджували на моделі ізольованих защічних мішків хомяка (ЗМХ). Хом'яка забивали під ефірним наркозом. У вивернутий слизовою оболонкою назовні ізольований ЗМХ наливали чистий розчин Рінгера (1 мл) і занурювали його в розчин Рінгера (5 мл) з досліджуваним білком і з/без стимулятором проникності. Проникність білків аналізували за допомогою колориметричної реакції, електрофорезу у ПААГ або за допомогою флуоресцентної мікроскопії.

Доклінічні дослідження низки букальних композицій з інсуліном проводили на щурах із стрептозотоциновою моделлю діабету. Подразнюючу, сенсибілізуючу, ранозагоюючу та пародонтопротекторну дії створених препаратів на слизову оболонку порожнини рота щурів досліджували за методиками, рекомендованими Фармакологічним центром МОЗ України для вивчення препаратів, які призначені для профілактики і лікування захворювань слизової оболонки порожнини рота. Математичну обробку результатів проводили за стандартними методиками (Деркач, 1977). Методику виготовлення лікарської форми букального препарату з інсуліном наведено у деклараційному патенті України на розроблений препарат „Жувальний носій з інсуліном” (Деклараційний патент України № 60703 А). Результати дослідження та їхнє обговорення. Робота здійснювалась у кілька етапів. Першим кроком була розробка науково обґрунтованого складу букального препарату з інсуліном. На цьому етапі було поставлено та вирішено кілька питань: було проведено теоретичне вивчення основних особливостей механізму букального транспорту білків, винайдено ефективний стимулятор проникності (СП) для інсуліну та створено два варіанти букальних композицій з інсуліном. Другий етап роботи полягав у дослідженні локальної фізіологічної дії створених композицій та оцінки їх ефективності при лікуванні ряду стоматологічних ускладнень у діабетичних щурів. Кінцевий етап роботи полягав у виготовленні лікарської форми букального препарату з інсуліном (БПІ) та створенні лабораторної методики розробки БПІ.

Теоретичні засади та технологічні принципи забезпечення букального транспорту інсуліну. Букальне введення інсуліну ґрунтується на принциповій можливості проникності слизової оболонки рота для білків. Для того, щоб мати змогу цілеспрямовано змінювати проникність СОПР, необхідно теоретично зясувати механізми, за якими відбувається проникність білків з ротової порожнини до клітинних рецепторів у тканинах. На початку роботи було проаналізовано сучасні літературні дані із структури букального бар'єру та визначення способів посилення його проникності для білків.

СОПР є комплексною багатокомпонентною барєрною системою, складна будова якої дозволяє їй ефективно регулювати проникність екзогенних макромолекул. Зрозуміло, що для букального введення інсуліну важливо створити умови, які дозволять їм подолати зовнішній слизовий шар. Після подолання зовнішніх барєрів рух препарату буде забезпечуватися енергією транспортних систем організму.

Отже для ефективного введення білків через СОПР нам необхідно зосередитися на полегшенні подолання білками зовнішніх барєрів. Як відомо, поверхня слизового епітелію вкрита шаром слизу, який можна вважати першим зовнішнім бар'єром. Основною функцією слизу вважається механічний та хімічний захист слизового епітелію. Однак вже є достатньо даних і про барґєрні властивості слини, яка забеспечується зокрема агрегаційною активністю муцинів, домінуючих білків слини. Показано, що муцини здатні спричиняти агрегацію макромолекул та деяких вірусів (Mandel, 1987; Bergey, 1994). Взаємодія муцинів з інсуліном буде значно підвищувати вірогідність його агрегації та втрати біологічної активності. Тому логічно вважати, що для запобігання агрегації білків та підсилення проникності слизу для макромолекул до складу букального препарату необхідно додавати поверхнево-активні речовини (ПАР). Наступним бар'єром на шляху інсуліну є зовнішній шар клітин епітелію. У поверхневому шарі міжклітинної речовини СОПР накопичуються секрет так званих мембрано-вкритих гранул (МВГ) (Raknerud, 1976). МВГ - це гідрофобні сферичні гранули ліпідної природи діаметром біля 0,2 мкм, які утворюються в цитоплазмі клітин поверхневого шару слизового епітелію. Після дозрівання вони мігрують до плазматичної мембрани і зливаються з нею, а їх вміст - суміш ліпідної природи - секретується у міжклітинний простір, внаслідок чого формуються ліпідні гідрофобні „барикади”. Показано, що від концентрації МВГ у цитоплазмі значно залежить проникність ряду молекул (Squier, 1978). Оскільки ПАР можуть екранувати гідрофобні ділянки білків та емульгувати МВГ, то очевидно, що ПАР і в цьому випадку повинні полегшувати проникність інсуліну. Після того, як білок потрапляє всередину слизового епітелію, він попадає у систему каналів міжклітинної речовини (МР), яка пристосована саме для транспорту білкових молекул.

Логічно припустити, що інсулін буде рухатися вглиб тканини переважно каналами міжклітинної речовини внаслідок своєї гідрофільності. Це припущення було підтверджено практично. Використання флуоресцентної мікроскопії дозволило нам візуалізувати шлях, за яким інсулін, мічений ізотіоцианатом флуоресцеїну (ФІТЦ-інсулін) долає слизову оболонку защічного мішка хом'яка. Видно, що максимум флуоресценції спостерігається у міжклітинному просторі. Це свідчить, що інсулін рухається переважно міжклітинним простором. Виходячи із запропонованої моделі транспорту, логічно припустити, що рухаючись міжклітинним простором інсулін має можливість взаємодіяти з інсуліновими рецепторами клітин слизової оболонки та підслизових тканин. Це дозволяє зробити висновок, що букальне введення інсуліну можливо використовувати для локальної корекції метаболічних процесів, порушених внаслідок дефіциту ендогенного гормону. Наприклад, це актуально для усунення стоматологічних ускладнень у хворих на діабет 1-го типу. Базуючись на запропонованій вище моделі, можна запропонувати основні етапи розробки букальних препаратів з інсуліном.

1. Вибір та характеристика стимулятора проникності (СП). Як СП рекомендується використовувати поверхнево-активні речовини.

2. Створення експериментальної композиції для попередніх досліджень. Принциповий склад композиції, що рекомендується - інсулін + стимулятор проникності + допоміжні речовини, агрегатний стан композиції - суспензія.

3. Дослідження букальної проникності інсуліну (у складі запропонованої у п.2 композиції) in vitro, на моделі слизової оболонки порожнини рота.

4. Дослідження ефективності композиції, запропонованої у п.2, in vivo:

· дослідження на тваринах безпечності препарату;

· дослідження на тваринах букальної проникності інсуліну, нанесеного на СОПР у складі композицій.

5. Створення лікарської форми букального препарату:

· створення системи стимуляторів проникності на основі даних п.1-4; розробка інертного носія;

· розробка методики приготування букального препарату.

6. Смакове оформлення композиції та інше. Тестування на добровольцях смакових властивостей готового препарату або препарату без діючого компонента.

7. Доклінічні та клінічні дослідження ефективності створеного букального препарату на модельних тваринах.

Прикладом практичного використання такої технології є описаний нижче процес створення композиції з інсуліном.

Лізальбінат як стимулятор букальної проникності інсуліну. Теоретичний аналіз механізму букального транспорту і вказані принципи технології розробки БПІ вимагають спершу визначити оптимальний ПАР для використання його як стимулятора проникності (СП). На жаль більшість існуючих ПАР не відповідають основним вимогам, оскільки для можливості тривалого використання СП повинен бути ефективними, але не викликати подразнення та неприємних смакових відчуттів. У роботі показано, що цим вимогам відповідає лізальбінат (ЛК) - продукт лужного гідролізу яєчного альбуміну (Paal, 1902). Відсутність ЛК фірмового виробництва, а також суперечливість даних про його властивості у літературі, змусило нас самостійно виготовляти і визначати його основні показники. Проведені дослідження показали, що препарат є гетерогенною сумішшю пептидів із молекулярною масою від 600 до 11000 Да. Визначення двох основних характеристик поверхневої активності ЛК - залежності поверхневої активності розчину від концентрації ЛК і критичної концентрації міцелоутворення (ККМ) показало, що лізальбінат має поверхнево-активні властивості. Тому наступним кроком було визначення впливу лізальбінату на проникність низки модельних білків. Оскільки існуючі методи визначення букальної проникності дорогі, потребують значного часу та зусиль, було запропоновано просту приблизну модель СОПР для первинної оцінки ефективності лізальбінату як стимулятора букальної проникності.

Защічний мішок хом'яка як модель для дослідження букального транспорту. Для дослідження букальної проникності білків нами було обрано методику, яку описано у роботі (Генесина, 1971). Особливістю даної методики є використання ізольованих защічних мішків хом'яка (ЗМХ) як моделі слизової оболонки рота. Хоча у деяких сучасних роботах зазначається, що слизова оболонка хом'яків не може достовірно моделювати СОПР людини (Nicolazzo, 2005), ця методика дозволяє швидко проводити попередній етап досліджень та оцінювати принципову проникність СОПР для білків.

За допомогою описаної методики показано, що лізальбінат значно посилював букальну проникність для невеликих білків - б-інтерферону та інсуліну. Це підтверджує наш висновок, що для посилення проникності букального барєру інсулін потрібно вводити разом із ПАР.

Отримані на моделі ЗМХ результати свідчать, що лізальбінат є достатньо потужнім стимулятором проникності, який можна використовувати у букальних препаратах. Наступним кроком було порівняння стоматологічної лікувальної активності in vivo інсулінових композицій з лізальбінатом та іншими поширеними стимуляторами проникності, наприклад солями жовчних кислот.

Розробка базової композиції для букального введення інсуліну. Дослідження, проведені на ізольованих защічних мішках хом'яків, показали, що при контакті із слизовою оболонкою суміші інсуліну і лізальбінату відбувається букальне всмоктування інсуліну. Однак для достовірної оцінки ефективності букальних композицій з інсуліном необхідні досліди in vivo. Такі досліди повинні становити наступний технологічний етап при створенні нового букального препарату. Було важливим спланувати досліди так, щоб біологічна відповідь організму давала однозначну характеристику властивостям препарату.

Перш за все потрібно було провести попередню оцінку безпечності препарату. Як первинні показники безпечності ми обрали два параметри - ступінь подразнення СОПР при регулярній обробці слизової рота тварин досліджуваними композиціями та оцінка сенсибілізаційної активності препарату.

Спочатку було проаналізовано безпечність для організму восьми створених букальних композицій. Кожна з композицій складалась з базової букальної композиції (ББК), містила один чи два стимулятори проникності та інсулін. Із них для подальшої роботи було відібрано дві композиції, які викликали найменше подразнення, умовно позначених Д_ІН та ЛК_ІН. Обидві композиції як стимулятори проникності містять ПАР (див. табл.).

Порівняння стоматологічної активності букальних композицій Д_ІН та ЛК_ІН. Далі потрібно було провести оцінку лікувальної ефективності кожної з композицій та порівняти їх. З літератури відомо, що при діабеті розвиваються різні стоматологічні захворювання, прямо чи опосередковано пов'язані з порушенням метаболізму внаслідок недостатньої секреції інсуліну. Виходячи з того, що при букальному введені інсулін рухається переважно міжклітинним простором, було висунуто припущення, що інсулін, введений букально, буде взаємодіяти з рецепторами клітин епітелію і локально нормалізувати стоматологічні показники у діабетичних тварин. Тому локальну ефективність композицій ми оцінювали, визначаючи їхній вплив на процеси загоєння ран СОПР (модель травматичного стоматиту) та на ступінь вікової атрофії альвеолярних відростків (надалі - ступінь пародонтозу) у щурів із стрептозотоциновою моделлю діабету 1-го типу (надалі - діабетичні щури).

діабетичний щур інсулін букальний

Таблиця Варіанти композицій з інсуліном, що досліджувались

Основний стимулятор проникності	Композиція	Скорочена назва
Дезоксихолат Na	ББК + дезоксихолат Na + інсулін людини	ДІН
Лізальбінат	ББК + лізальбінат + інсулін людини	ЛКІН

Показано, що композиції Д_ІН та ЛК_ІН значно прискорювали процеси загоєння травм слизової оболонки порожнини рота у діабетичних щурів. Динаміка загоєння у тварин, яких обробляли композиціями протікали аналогічно до здорових щурів та позитивно відрізнялась від динаміки загоєння, що спостерігалась у діабетичних тварин з контрольної групи.

Отримані результати є одним з підтверджень висновку про доцільність букального використання інсуліну для корекції стоматологічних порушень у хворих на діабет 1-го типу.

Далі було показано значний позитивний вплив композиції ЛК_ІН на стан тканин пародонту у діабетичних тварин. ЛК_ІН вірогідно знижував вікову атрофію альвеолярних відростків у діабетичних щурів (на 27%), нормалізуючи стан пародонту до рівня здорових тварин (рис.4). Букальне введення Д_ІН діабетичним щурам протягом 22 діб також вірогідно знижувало відносну величину індукованої діабетом атрофії альвеолярних відростків (надалі - атрофія) на 10 %, однак внаслідок гіркого смаку тривале використання препарату виявилось не можливим - вже за цей час значно зростала агресивність піддослідних тварин, постерігали відмову тварин від прийому препарату. В той же час нейтральний смак ЛК_ІН дозволив провести обробку діабетичних щурів протягом 70 діб.

Отже, проведені досліди показали, що при тривалому застосуванні смак композиції відіграє досить важливу роль. Препарат повинен мати нейтральний або слабо-специфічний смак. Дослідження пародонтопротекторної активності композицій ЛК_ІН проводили більш ніж 70 діб, і протягом цього часу не було зареєстровано значних відхилень у поводженні тварин, як це спостерігали під час дослідженнь композиції Д_ІН. Оскільки за ефективністю дезоксихолат натрію та лізальбінат були практично однаковими, нейтральний смак ЛК робить його придатнішим для використання як стимулятора проникності для букального введення інсуліну.

Отримані результати є одним із підтверджень висновку про можливість ефективного букального використання інсуліну для локальної терапії. Регулярне букальне введення інсуліну діабетичним тваринам зрівноважує метаболічні процеси у тканинах СОПР. Також отримані експериментальні дані доводять, що смак букальних композицій є досить важливим показником препарату. Тому при створені лікарської форми „Букального препарату з інсуліном” за основний стимулятор проникності було обрано лізальбінат.

Створення лікарської форми „Букальний препарат з інсуліном”. На основі описаних вище робіт було створено та запатентовано „Букальний препарат з інсуліном” (деклараційний патент України № 60703 А). Як лікарську форму препарату було обрано жувальний варіант препарату. На нашу думку, жувальна система є оптимальною для букального введення інсуліну. Вона дозволяє пролонгувати час знаходження препарату у ротовій порожнині, що надає такій формі перевагу над полосканнями та букальними спреями. Також вона є зручнішою, що надає їй перевагу порівняно з букальними аплікаціями. Крім того, процес пережовування додатково активізує процеси всмоктування за рахунок підвищення швидкості току крові у капілярах внаслідок роботи жувальних м'язів та тиску на зуби, що значно підсилює конвекційні процеси у міжклітинній речовині.

При розробці системи стимуляторів проникності для букального препарату з інсуліном були враховані виявлені нами позитивні властивості композиції ЛК_ІН. Тому як основний стимулятор проникності ми обрали лізальбінат. Систему стимуляторів також було доповнено сумішшю ліпідів та фосфоліпідів, які при пережовуванні букального препарату здатні утворювати у гідрофільному середовищі ротової порожнини замкнені везикули, що може полегшувати доставку інсуліну всередину тканин (Долгинова, 1989). Крім стимулюючої функції, ліпідна суміш також позитивно впливає на стан плазматичних мембран клітин епітелію. Оскільки відомо, що більшість ПАР здатні пошкоджувати мембрани клітин, ліпіди були включені до складу препарату і для корекції можливої деструктивної дії лізальбінату.

Також до складу букального препарату було включено ряд допоміжних речовин - пластифікатор, емульгатор, антиоксидант, харчові смакові та ароматичні добавки. Готову лікарську форму покривали поверхневою захисною плівкою.

Методика розробки букальних препаратів з інсуліном. Отримані результати дозволяють розширити та конкретизувати методику розробки букальних препаратів

з інсуліном, основні пункти якого були запропоновані на початку роботи. У кінцевому вигляді методику можна зобразити у вигляді шести пунктів:

1. Визначення залежності проникності слизової оболонки защічного мішка хомяка для інсуліну від концентрації останнього, розчинника, стимуляторів проникності тощо;

2. Створення композиції для букального введення інсуліну:

· Підбір стимуляторів проникності на основі даних, отриманих у п.1;

· Розробка інертного носія;

· Розробка технології приготування букальних композицій. Рекомендована форма композиції - стабілізована емульсія.

3. Дослідження на тваринах безпечності букальних композицій;

· Визначення гострої подразнювальної дії

· Визначення сенсибілізувальної дії

4. Дослідження ефективності букальних композицій на модельних тваринах:

· Визначення хронічної подразнювальної дії

· Визначення ранозагоювальної активності на моделі травматичного стоматиту у щурів із стрептозотоциновою моделлю діабету;

· Визначення пародонтопротекторної активності у щурів із стрептозотоциновою моделлю діабету.

5. Створення букальної форми препарату.

6. Смакове оформлення готового букального препарату. Тестування смакових властивостей препарату без діючого компонента або готового препарату на добровольцях. Рекомендована форма букального препарату - жувальна таблетка.

ВИСНОВКИ

Створено букальний препарат з інсуліном і досліджено можливість його використання для лікування та профілактики стоматологічних ускладнень у хворих на діабет 1-го типу.

1. Вперше запропоновано використовувати лізальбінат як букальний стимулятор проникності інсуліну. Показано, що лізальбінат має переваги порівняно із традиційними стимуляторами проникності, наприклад дезоксихолатом натрію.

2. Створено та досліджено два варіанти букальних композицій з інсуліном. Показано безумовну ефективність букальних композицій з інсуліном ЛК_ІН та Д_ІН при лікуванні травматичного стоматиту та профілактиці вікової атрофії альвеолярних відростків у щурів із стрептозотоциновим діабетом.

3. Отримані дані дозволяють припустити, що при застосуванні букальних препаратів з інсуліном відбувається проникнення та накопичення інсуліну у тканинах порожнини рота у кількостях, достатніх для місцевої нормалізації процесів метаболізму, порушених внаслідок розвитку діабету 1-го типу.

4. На основі композиції ЛК_ІН створено та запатентовано лікарську форму букального препарату з інсуліном для корекції стоматологічних ускладнень у хворих на діабет 1-го типу.

5. Запропоновано лабораторну методику розробки букальних форм препаратів для введення інсуліну.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Старокадомський П.Л., Кордюм В.А. Дослідження стоматотропної дії нового інсулін-вмісного букального препарату // Ендокринологія. - 2004. - Т. 9, №2. - С. 155-161.

Особистий внесок здобувача - створення букальної композиції з інсуліном, дослідження її ранозагоювальної дії на здорових та діабетичних щурах.

2. Старокадомський П.Л., Кордюм В.А. Дослідження парадонтопротекторної активності нового інсулін-вмісного букального препарату // Ендокринологія. - 2005. - Т. 10, №1. - С. 28-35.

Особистий внесок здобувача - створення букальної композиції з інсуліном, дослідження її пародонтопротекторної активності дії на здорових та діабетичних щурах.

3. Деклараційний патент 60703 А Україна, МКИ А 61 К 9/68. Жувальний носій для лікарського засобу / В.А. Кордюм, П.Л. Старокадомський, А.Ф. Возіанов (Україна). - № 2003020995; Заявл. 04.02.2003; Опубл. 15.10.2003, Бюл. № 10. - 3 с.

Особистий внесок здобувача - розробка букальної композиції з інсуліном, оформлення патенту.

4. Старокадомський П.Л. Неін'єкційні методи введення інсуліну: ефективність, недоліки, перспективи // Ендокринологія. - 2003. - Т.8, №2. - С. 244-255.

Особистий внесок здобувача - аналіз літературних даних по неін'єкційним методам введення інсуліну.

5. Старокадомский П.Л., Скиба О.И. Проницаемость слизистой оболочки полости рта для некоторых неорганических и органических молекул // Вісник стоматології. -2003. - №3. - С. 2-9.

Особистий внесок здобувача - аналіз проникності слизової порожнини рота для ряду сполук, зокрема білків. Аналіз та теоретичне виведення основних принципів букальної проникності слизової оболонки для високомолекулярних речовин.

6. Старокадомский П.Л. Проницаемость здоровой и воспаленной слизистой оболочки полости рта для б-интерферона // Фактори експериментальної еволюції організмів. - К.: КВІЦ, 2004. - С. 116-120.

Особистий внесок здобувача - дослідження проникності пероксидази та б-інтерферону через слизову оболонку ізольованих защічних мішків залежно від фізіологічного стану слизової оболонки.

7. Starokadomskyy P.L. New possibilities of chewing gum in local therapy // Conference for young scientists, PhD students and students of molecular biology and genetics, dedicated to the 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine (September 25-27, 2003). - Kyiv, 2003. - P. 263.

Особистий внесок здобувача - розробка букальної композиції з інсуліном, дослідження ранозагоювальної дії букальної композиції з інсуліном.

8. Starokadomskyy Peter. Study of protein permeability through the mouth cavity mucous // First Ukrainian Congress for Cell Biology (April 25-28, 2004). - Lviv, 2004. - P.235.

Особистий внесок здобувача - дослідження проникності пероксидази та б-інтерферону через слизову оболонку ізольованих защічних мішків хом'яка.

9. Старокадомський П.Л. Можливість використання жувальних носіїв для доставки білків у тканини // Конференція робіт молодих вчених, присвячена 100-річчю з Дня народження Чаговця Р.В. (2-3 червня 2004). - Київ, 2004. - С. 29.

Особистий внесок здобувача - дослідження можливості використання жувальних носіїв для доставки інсуліну у тканини, що оточують ротову порожнину.

АНОТАЦІЇ

Старокадомський П.Л. Створення букального препарату з інсуліном та оцінка його ефективності при корекції стоматологічних порушень у хворих на діабет 1-го типу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2005.

Дисертацію присвячено розробці букального препарату з інсуліном. Вперше запропоновано та обґрунтовано використання лізальбінату як стимулятора проникності для білкових букальних препаратів. Показано, що букальні композиції з лізальбінатом як стимулятором проникності є більш придатними для тривалого застосування порівняно з композиціями, що містять традиційні стимулятори всмоктування, наприклад дезоксихолатом натрію. Вперше показано ефективність букального препарату з інсуліном при лікуванні травматичного стоматиту та профілактики пародонтозу у щурів із стрептозотоциновим діабетом. Отримані дані дозволяють обґрунтувати думку, що при регулярному застосуванні букального препарату інсулін всмоктується і накопичується у тканинах порожнини рота у кількостях, достатніх для місцевої нормалізації процесів метаболізму, що були порушені внаслідок розвитку діабету. Вперше створено та запатентовано жувальну форму букального препарату з інсуліном. На основі дисертаційної роботи запропоновано лабораторну методику розробки букальних форм препаратів для введення інсуліну.

Ключові слова: букальний препарат з інсуліном, слизова оболонка порожнини рота, лізальбінат, діабет 1-го типу.

Старокадомский П.Л. Создание буккального препарата с инсулином и оценка его эффективности при коррекции стоматологических нарушений у больных диабетом 1-го типа. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена разработке буккального препарата с инсулином. В работе впервые предложено и обосновано применение буккального препарата с инсулином для лечения и профилактики стоматологических осложнений у диабетиков, таких как травматический стоматит и пародонтоз.

Впервые предложено и обосновано использование лизальбината в качестве стимулятора проникновения для инсулина. Лизальбинат - продукт щелочного гидролиза яичного альбумина, является гетерогенной смесью пептидов с молекулярной массой от 600 до 11000 Да. Было показано, что препарат обладает выраженными поверхностно-активными свойствами. Используя изолированные защечные мешки хомяка как модель слизистой оболочки полости рта, установлено, что лизальбинат усиливает буккальную проницаемость ряда белков, таких как инсулина и б-интерферона. С помощью флуоресцентной микроскопии и меченого инсулина (ФИТЦ-инсулин) мы смогли визуализировать процесс проницаемости белков. Показано, что инсулин проникает через буккальный барьер, двигаясь в основном по межклеточному пространству. Это позволило выдвинуть гипотезу, что при буккальной введении инсулин имеет возможность взаимодействовать с инсулиновыми рецепторами клеток тканей, окружающих полость рта. Из этого следует, что с помощью буккального введения инсулина возможно проводить локальную коррекцию метаболических процессов, нарушенных вследствие дефицита эндогенного гормона. Это актуально, например, для устранения стоматологических осложнений у больных диабетом 1-го типа.

Для проверки этой гипотезы было создано восемь буккальных композиций, состоящих из инсулина, специфического стимулятора проницаемости и вспомогательных веществ. После определения раздражающего и сенсибилизирующего действия для дальнейшей работы были отобраны две композиции, в которых как стимуляторы проницаемости использовались лизальбинат и дезоксихолат натрия, условно обозначенные ЛК_ін и Д_ін соответственно. Было показано, что указанные композиции не обладают раздражающим и сенсибилизирующим действием при длительном применении. Это позволило перейти к изучению возможности использования композиций ЛК_ін и Д_ін для лечения ряда модельных стоматологических заболеваний у крыс со стрептозотоциновой моделью диабета.

Полученные данные позволяют утверждать, что с помощью композиции ЛК_ін и Д_ін возможно локально нормализировать процессы метаболизма в тканях ротовой полости, нарушенные вследствие развития диабета 1-го типа. Показано, что регулярное буккальное введение инсулина в составе указанных композиций достоверно нормализировало состояние тканей слизистой оболочки полости рта у диабетических животных. Так, введение композиций диабетическим крысам с травматическим стоматитом в 3 раза ускоряло заживление ран слизистой. При чем, если в контрольных группах заживление происходило только у половины диабетических животных, то применение буккальных композиций с инсулином обеспечивало 100-процентное заживление у всех обрабатываемых животных. Была показана прямая зависимость эффективности действия композиций от дозы и частоты применения. Также использование композиций ЛК_ін или Д_ін нормализировало процессы образования/рассасывания костной ткани у диабетических крыс. Обработка поверхности слизистой оболочки полости рта в течении 1-2 месяцев снижала уровень возрастной атрофии альвеолярных отростков у диабетических животных на 10-30 % до уровня здоровых крыс, тогда как в контрольной группе более чем у половины животных с диабетом развивались выраженные признаки пародонтоза.

Следует отметить то, что нами не было зарегистрировано позитивного влияния композиций ЛК_ін и Д_ін на аналогичные стоматологические показатели у животных без диабета. Это позволяет утверждать, что показанное нами локальное нормализирующее действие композиций у диабетических крыс обеспечивалось эффективным проникновением в ткани слизистой оболочки полости рта инсулина и локальной компенсацией негативных последствий его дефицита в результате развития диабета.

Полученные результаты обосновывают использование препаратов для буккального введения инсулина в терапии стоматологических осложнений диабета 1-го типа. Показано, что композиции с лизальбинатом ЛК_ін обладают рядом преимуществ по сравнению с композицией Д_ін с традиционным буккальным стимулятором проницаемости - дезоксихолатом натрия.

На основе ЛК_ін впервые создано и запатентовано лекарственную форму буккального препарата с инсулином. Создана лабораторная методика разработки буккальных форм препаратов для введения инсулина.

Ключевые слова: буккальный препарат с инсулином, слизистая оболочка полости рта, лизальбинат, диабет 1-го типа.

Starokadomskyy P.L. The development of buccal preparation with insulin and evaluation of its effectiveness in correction of stomatological disorders in patients with diabetes mellitus. - Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology by speciality 03.00.20 - biotechnology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2005.

The work is devoted to the development of buccal preparation with insulin. A lysalbinate has been proposed as a absorption enhancer for protein buccal administration for the first time. It has been shown that insulin buccal compositions with lysalbinate are more acceptable for the prolonged use in comparison with the compositions containing the traditional absorption enhancer, for example sodium deoxycholate.

For the first time the efficiency of buccal preparation with insulin for the treatment of traumatic stomatitis and prevention of periodontosis in diabetic rats has been demonstrated. The obtained data revealed that regular administration of buccal preparation with insulin resulted in insulin penetration and accumulation in the mouth cavity mucosa in quantities sufficient for local normalization of the metabolism that was disrupted as a result of the development of diabetes.

For the first time the chewing form of buccal preparation with insulin was created and patented. The laboratory protocol of the development of buccal forms of preparations for insulin administration was created.

Key words: buccal preparation with insulin, mouth cavity mucosa, lisalbynate, diabetes mellitus.

Размещено на Allbest.ru

...