Для двовимірного розташування міченої N-CAM були характерними щільність 88,9 міток/мкм² та простір, вільний від міток, діаметром 480 нм. Для нейронів, що вирощувалися за присутністю гепарансульфату 10 мкг/мл, середнє значення модельної відстані між мітками складало 179,96,6 нм, щільність - 86,7 міток/мкм², простір вільний від N-CAM - 480 нм у діаметрі. У разі культивування нейронів гіпокампа на субстраті з додатком гепарану 40 мкг/мл модельна відстань між міченими N-CAM у середньому складала 337,817,0 нм, щільність - 39,8 міток/мкм², простір, що вільний від N-CAM - 900 нм у діаметрі. Застосована математична модель дозволила створити двовимірне зображення розташування молекул клітинної адгезії на поверхні плазматичної мембрани соми нейронів гіпокампа, що наближене до реальної ситуації за рахунок компіляції паралельних зрізів. Отримані нами результати вказують на те, що гепарансульфат приймає участь у регуляції топографії молекул клітинної адгезії на плазматичній мембрані нейронів гіпокампу. Зв'язок N-CAM із гепарансульфатом може індукувати зміни конформації глікопротеїну, що призводить до зміни його адгезивної афіннoсті. З іншого боку, загальна концентрація гепарану в міжклітинному просторі може бути сигналом для механізмів адгезії, що ще не розкриті.

Очищення й фізико-хімічна характеристика гіалуронат- та гепарансульфат-зв'язуючих білків із мозку. На сьогодні в мозку виявлені наступні білки, що зв'язують гіалуронат: протеоглікани міжклітинного матрикса (сполучний білок (link protein) (Asher and Bignami, 1991), версікан (Marret et al., 1994), нейрокан (Rauch et al., 1992), бамакан (Couchman, 1996), цитозольні, водорозчинні - гіалуронектин (Marret et al., 1994), гліальний гіалуронат-зв'язувальний білок (GHAP) (Toole, 1990) і тільки два мембранних рецептори гіалуроната - CD44 і RНАММ (Turley, 1994). Отримані нами попередні результати показали, що найбільша кількість гіалуронат-зв'язуючих компонентів локалізовані в мембранній (чи навколо мембранній) частині клітин. Взаємодія гіалуроната зі специфічними білками клітинної поверхні може бути одним із можливих засобів впливу глікозаміноглікана на поведінку клітин нервової системи. Ця взаємодія стає найбільш актуальною під час критичних етапів розвитку нервової системи, тому метою наступного дослідження було виділення й очищення мембранного гіалуронат-зв'язуючого білка.

Попереду було визначено ступінь екстракції гіалуронат-зв'язуючих білків із мозку дорослих щурів та з ембріонального мозку людини із застосуванням різних детергентів. Найбільший вихід досягається при екстракції даних білків за допомогою тритона Х-100 з ембріонального мозку. Були досліджені різні методу синтезу афінного носія для хроматографії. Зв'язування гіалуронової кислоти (ГК) із сефарозою відбувалося за різними методами активації (рис. 16) .

Подалі афінна хроматографія проводилася на носії, синтезованому за 4 методом.

У результаті послідовних хроматографій були очищені гіалуронат-зв'язуючі мембранні білки , що у не денатурованих умовах мають масу 250 та 20 кДа.

На рис. 17. приведена електрофореграма розподілення білка 250 кДа на поліпептиди за денатуруючих умов, де основний поліпептид - 85 кДа та два мінорні - 68 і 36 кДа. Жодна з раніше ідентифікованих макромолекул як у нервовій, так й інших тканинах не має схожих параметрів. За результатами імуноблотингу очищений білок не має перехресної імунореактивності проти антитіл до відомих гіалуронат-зв'язуючих білків.

Таблиця 1. Ступінь очистки мембранного гіалуронат-зв'язуючого білка з ембріонального мозку людини

Виділення й вивчення фізико-хімічних властивостей гепарансульфат-зв'язуючих білків із різних фракцій мозку має велике значення для розуміння процесів, що відбуваються під час розвитку та функціювання мозку. На теперішній час найбільш докладно вивчені водорозчинні гепаран-зв'язуючі білки, до яких відносяться багато факторів росту та адгезивних білків (Baird, 1994, 2000). Головною проблемою при виділенні гепарансульфат-зв'язуючих білків із мозку є їх мала кількість. Приведені вище результати досліджень загальної гепаран-зв'язуючої активності у відділах мозку нормальних щурів різного віку вказують на найбільший вміст гепаран-зв'язуючих білків в екстра целюлярній/цитоскелетній та мембраноасоційованій фракціях мозку новонароджених щурів.

Для виділення гепарансульфат-зв'язуючих мембраноасоційованих та екстрацелюлярних білків мозку новонароджених щурів ми використовували афінну хроматографію на гепарин-сефарозі. Елюцію специфічних білків проводили в градієнті концентрації NaCl (0,1-1,5 М), оскільки саме іонні сили впливають на конформацію залишків ідуронової кислоти в складі гепарину. Конформація цих залишків є вирішальний чинник у специфічному зв'язуванні білків із гепарином. Пік елюції спостерігався при концентрації NaCl 0,5 М і збігався з піком гепарин-зв'язуючої активності білків у фракціях. У результаті афінної хроматографії були очищені у 526,5. раза білки, що специфічні до зв'язування гепарансульфату.

По результатам електрофорезу в ПААГ із ДСН були ідентифіковані два поліпептиди з молекулярними масами 19 і 28 кДа, котрі були присутні як в елюаті білків із мембраноасоційованої, так і екстрацелюлярної/цитоскелетної фракцій. У пробі, що містить гепаран-зв'язуючі білки із сечовинної фракції, була виявлена ще додаткова зона високомолекулярних білків, що не входили в 5% гель. Молекулярна маса цих білків перевищувала 150 кДа (рис. 18) .

Подальше накопичення очищених білків й одержання антитіл до них надасть можливість вивчити детальніше їх фізико-хімічні властивості, клітинний і тканинний розподіл, ступінь гомології з відомими рецепторами ГАГ, зрозуміти функцію й місце у молекулярному каскаді регуляціїї розвитку й функціонування мозку.

Зміна загальної глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків у мозку in vivo під впливом різних чинників. Вагомий вклад у регуляцію співвідношення ГАГ та їх специфічних білків вносять фактори середовища. Глікозаміноглікани є поліаніони, що дуже чутливі до зміни іонного складу середовища (особливо до зміни одно- та двовалентних іонів). Водно-електролітний статус середовища визначає загальний заряд ГАГ та їх фізико-хімічні властивості. Цей аспект викликає інтерес із практичної точки зору. Більшість патологій органів та тканин (а також системних захворювань) супроводжуються зміною рН середовища та електролітного складу. На сьогодні майже немає інформації стосовно зміни метаболізму ГАГ та їх специфічних рецепторів у наслідок багатьох патологій. У клініці розглядаються лише добре характеризовані лізосомні хвороби - мукополісахаридози, що є наслідком успадкованого дефекту лізосомних ферментів. Нажаль, питання стосовно метаболізму ГАГ та їх специфічних рецепторів у мозку ссавців у наслідок впливу патогенних чинників, що призводять до порушення водно-електролітного й кислотно-лужного балансу на сьогодні не вивчені. Особливо це торкається успадкованих та придбаних хвороб, що супроводжуються ацидозом й порушенням розумових здібностей (наприклад, фенілкетонурія).

Вплив гіперфенілаланінемії. Для дослідження була обрана експериментальна модель гіперфенілаланінемії, що описана Matsuo та Hommes (1988). Отримані результати свідчать про те, що висока концентрація фенілаланіну спричиняє збільшення глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків майже у 2 рази тільки на етапах активної проліферації й міграції клітин, та росту аксонів й дендритів. Відомо, що фенілаланін значно гальмує дію АТФ-сульфурилази, й це встановлено тільки для даного ферменту, виділеного з мозку (Matsuo, 1987). Печінковий ізофермент не має високої чутливості до фенілаланіну. Можливо, гальмування синтезу ФАСФ та зниження сульфатації глікозаміногліканів у мозку дійсно призводить до зміни загальної глікозаміноглікан-зв'зуючої активності білків під час активної міграції клітин та росту аксонів. Такі зміни зазвичай приводить до дефекту формування специфічних шарів та ядер, й синаптичних контактів між клітинами. Це може бути однією з причин зниження синаптичної та нейрональної пластичності мозку на більш пізніх етапах постнатального розвитку тварин в умовах гіперфенілаланінемії, що підтвердилось значним зниженням усіх показників поведінкових реакцій (особливо емоційної та дослідницької сфери).

Вплив материнського гіпотиреозу, спричиненого інкорпорованим ¹³¹І. Досліджено активність зв'язування гепарансульфату та гіалуронату специфічними білками й проліферативна активність клітин у мозку новонароджених щурів, розвиток яких проходив під впливом малої дози ¹³¹I (одноразове введення самицям до вагітності, або в переддень критичних стадій ембріогенезу). Обрана доза ¹³¹I (150 мкКі) відповідає поглиненій дозі радіації в 0,5 Гр. Зміни рівня гепарансульфат- й гіалуронат-зв'язуючою активності білків у мозку новонароджених щурів, внутрішньоутробний розвиток яких відбувався в умовах слабкого материнського гіпотиреозу, спричиненого інкорпорованим радіоактивним ізотопом йоду, співвідносяться зі зміною проліферації нервових клітин. При цьому вказані зміни торкались в більшості мембранних компонентів (рис. 19). У мозку самиць таких змін не було встановлено.

Можливо, зміна активності зв'язування гепарансульфату (як й гіалуронату), яка була викликана зміною локалізації і/або концентрацією вільних глікозаміногліканів, була компенсаторною і спрямованою на підвищення рівня проліферації нервових клітин в умовах материнського гіпотиреозу.

Дослідження впливу тотального одноразового та фракціонованого рентгенівського опромінення в дозі 0,25 Гр на загальну гепарансульфат-зв'язуючу активність сечовинорозчинних білків із мозку статевозрілих щурів показало, що дана характеристика має різноспрямовані зміни протягом 168 год після опромінення й характер цих змін залежить від відділу мозку й статі.

Максимальні коливання ГАГ-зв'язуючої активності білків після однократного радіаційного впливу були виявлені в корі великих півкуль самиць та лімбічній системі самців і самиць. Початок зміни ГАГ-зв'язуючої активності білків у гіпокампі й у корі великих півкуль мозку самиць приходиться на 24 год. після опромінення. На 120 год. після опромінення цей показник у корі великих півкуль самиць і гіпокампі як самців, так й самиць, перевищував контрольний рівень у середньому в 2,2 раза, але не перевищував 40 нг зв'яз. ГАГ/ мг ЗБ. На 7 добу після опромінення в більшості досліджуваних відділах мозку самиць цей показник наближався до норми. У самців дані зміни були більш виражені й на 7 добу ще не поверталися до норми. Ці дані співвідносяться з динамікою поведінкової активності тварин у пострадіаційний термін (визначалося найбільше пригнічення емоційного стану й дослідницьких можливостей у перші дні після опромінення).

Наслідки фракціонованого опромінення у кінцевій дозі 0,25 Гр мали більш спрямований характер, не мали залежності від статі й починали виявлятися пізніше, ніж при одноразовому опроміненні.

Отримані дані свідчать про активну участь ГАГ-зв'язуючих білків у нейропластичності в перші години після опромінення у малій дозі.

Вплив соматогеного болю на першу добу після операції у щурів призводить до збільшення гепарансульфат-зв'язуючої активності білків у частині мозку, що містить ретикулярну формацію, таламус та задню центральну борозну, в 1,67 раза. На 7 добу данний показник повертається до норми. У мозочку вірогідних змін не встановлено. Стимул болю одночасно приводить до зниження дегрануляції тканинних базофілів, що сполучено зі зменшенням секреції вільного гепарину в кров. Дефіцит гепарину, у свою чергу, може бути наслідком збільшення вільних місць зв'язування для гепарансульфату серед білків мозку. На сьогодні не можна точно сказати чи використовують нервові клітини гепарин, що синтезований у тканинних базофілах, чи вони синтезують власні гепариноїди. Знеболювання за допомогою кетаміна або морфіна (0,5 мг/кг за 5 хв. до операції) та їх коктейлю запобігає змінам гепарансульфат-зв'язуючої активності білків у мозку в післяопераційний термін.

ВИСНОВКИ

Величина рівня загальної здібності гепарансульфат- й гіалуронат-зв'язуючих білків щодо зв'язування відповідних глікозаміногліканів у мозку є одним із регуляторних механізмів контролю проліферації, міграції та диференціації клітин під час морфогенезу та нейрональної пластичності у дорослому мозку, залежна від віку, статі, та функцій відділів мозку за нормальних умов, є швидким корегуючим фактором при дії патогенних чинників.

Розроблена система визначення кількісної характеристики загальної здатності компонентів мозку щодо зв'язування гепарансульфата та гіалуроната та їх клітинної й субклітинної локалізації за допомогою синтезованих кон'югатів (гепарансульфат-ПХ та гіалуронат-ПХ).

Оптимальними умовами для кількісного аналізу глікозаміноглікан-зв'язуючої здатності білків мозку in vitro є:

- сорбція білків до полістеролу в умовах низької іонної сили та рН 5,8;

- блокування вільних місць зв'язування на полістеролі білками, що не зв'язують відповідні глікозаміноглікани;

- запобігання наявності в реакційній суміші детергентів, особливо на момент сорбції;

- зв'язування кон'югату з дослідними компонентами в умовах низької іонної сили (концентрація як Са²⁺, так й Mg²⁺ не повинна перевищувати 4 мМ, оптимальна концентрація Na⁺ чи К⁺ 60 мМ й рН 3 чи рН 6,8 становлять для гепарансульфата, та 20 мМ й рН 5-5,5 - для гіалуроната).

Аналогічні умови найсприятливіші й для проведення вуглеводгістохімічного аналізу за допомогою визначених кон'югатів.

Під час ембріогенезу щурів найвищій рівень гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності білків характерний в області вентрикулярного та субвентрикулярного шарів нервової трубки, що формується, особливо для компонентів плазматичної мембрани та ядра.

Характер та динаміка субклітинного розподілу гепарансульфат- й гіалуронат-зв'язуючих білків у мозку людини схожа з таковою у щурів.

Присутність як гепарансульфата, так й гіалуроната в субстраті моношарової культури нейронів гіпокампу щурів змінює адгезивність нейронів та термін морфогенезних подій. Використання субстрату, що містить більш ніж 20 мкг/мл указаних глікозаміногліканів, призводить до зменшення сорбції нейронів до субстрату, зменшення кількості нейрональних молекул клітинної адгезії та змін її топографії на плазматичній мембрані, затримці диференціації нейронів.

У мозку новонароджених щурів високий рівень гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності білків залишається тільки у відділах мозку, де ще відбуваються процеси активної проліферації та міграції нервових клітин. Найвищім є рівень у фракції цитоскелетних/ екстрацелюлярних білків мозочку (45080 нг зв'яз. ГП/мг ЗБ та 4000120 нг зв'яз. ГК/мг ЗБ). Під час ранніх етапів морфогенезу мозку характерне співвідношення гепарансульфат-зв'язуючої та гіалуронат-зв'язуючої активності 1:10. Найбільший внесок у загальний рівень глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків вносять компоненти ядерного скелета проліферуючих та мігруючих клітин, в меншій кількості складові міжклітинного матриксу та плазматичної мембрани.

У мозку дорослих щурів за нормальних умов рівень гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності білків значно менший (1-50 нг зв'яз. ГАГ/мг ЗБ), є постійною величиною для кожного відділу мозку й залежить від статі. У самців ця активність у середньому на 22% вище ніж у самиць в усіх дослідних відділах мозку, за виключенням гіпокампу.

Очищені нові мембраноасоційовані гепарансульфат-зв'язуючі білки з мозку новонароджених щурів, що мають молекулярну масу 19 та 28 кДа; та мембранні гіалуронат-зв'язуючі білки з ембріонального мозку людини молекулярною масою 20 й 250 кДа, останній представлений основним поліпептидом у 85 кДа та двома мінорними - 68 і 36 кДа.

В умовах експериментальної гіперфенілаланінемії у щурів збільшення гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності білків (майже у два рази) має місце тільки на ранніх етапах морфогенезу. Це може спричинити зміни розвитку мозку та подальші ментальні порушення.

Уведення ¹³¹I в дозі 150 мкКі щурам самицям на різних стадіях вагітності призводить до посилення гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності білків у мозку новонароджених (із максимумом змін при введенні ¹³¹I на 16 добу ембріогенезу), що є, можливо, компенсаційною реакцією на зниження кількості проліферуючих клітин в умовах ¹³¹I-індукованого материнського гіпотиреозу.

Мембранні та сечовинорозчинні глікозаміноглікан-зв'язуючі макромолекули приймають активну участь у регуляції нейрональної пластичності у пострадіаційний термін. Вплив тотального рентгенівського опромінення в дозі 0,25 Гр викликає хвилеподібні зміни загальної глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків у мозку дорослих щурів. Одноразове опромінення призводить до швидкої зміни даного показника впродовж 24 год. у стовбурних структурах та поступовому підвищенню його впродовж 120 год. у корі, із поверненням до норми на 168 год. після опромінення; максимальні зміни характерні для гіпокампа та стріатума й супроводжуються пригніченням емоційного стану та дослідницьких здібностей тварин, ступінь даних змін залежить від статі. Фракціоноване опромінення призводить до поступового підвищення загальної глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків у стовбурних структурах мозку, та зниження у корі, із максимальним відхиленням від контролю на 168 год. після опромінення; ці зміни у мозку самців та самиць мають вірогідно однаковий характер.

У першу добу після оперативного втручання гіпералгезія спричиняє незначне підвищення (у 1,3-1,5 раза) гепарансульфат-зв'язуючої активності сечовиннорозчинних білків із задньої частини півкуль мозку щура з поступовим поверненням до норми на 6 добу після операції, що вказує на участь гепарансульфат-зв'язуючих білків у регуляції центральних механізмів ноцицепції. Застосування знеболюючих препаратів (морфіну та кетаміну) за 5 хв. до операції запобігає таким змінам.

Запропонована шкала залежності морфогенезних подій у мозку щурів від загального рівня гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності сечовиннорозчинних білків та протеогліканів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статі

Одноособові

Ушакова Г.А. Регуляторная роль гиалуроната // Сборник научных трудов “Регуляция в живых системах”, Днепропетровск, ДГУ. 1998. С. 136-141.

Ушакова Г.А. Экспрессия глиального фибриллярного кислого белка в период неоплазии. Вестник ДГУ. Биология, Экология. 1998. Вып.4. С. 41-46.

Ushakova G. Postnatal dynamics of the heparin-binding activity of rat cerebellar cells // Нейрофизиология/Neurophysiology. 1999. Vol. 31, № 2. P. 140-141.

Ушакова Г.А. Участие кальпаина II в деградации промежуточных филаментов астроглии в условиях нейрогенного стресса // Нейрохимия. 1999. Т.16, № 3. С. 230-234.

Ушакова Г.О. Зміна гіалуронат-зв'язуючої активності білків мозку щурів за дією малих доз радіації // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. 2000. Вип. 8, том 1. С. 100-105.

Ушакова Г.А. Сравнительная характеристика гиалуронат-связывающей активности в различных органах и отделах головного мозга крысы и человека // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. 2002. Вип. 10, том 1. С. 94-99.

Ушакова Г.О. Чинники, що впливають на афінність білків мозку ссавців до гіалуронату в умовах in vitro // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. 2003. Вип. 11, том 2. С. 170-175.

У співавторстві

Ushakova G., Skibo G., Berezin V. Neural cell adhesion molecule (N-CAM) distribution may predict the effect of neurotoxins on the brain // Toxicon. 1995. Vol. 33, № 4. P. 577-581. (Дисертантом досліджено розподілення N-CAM на плазматичній мембрані нейронів гіпокампу під впливом фармпрепаратів).

Долженко М.И., Качур В.А., Колкова Е.А., Ткач В.Л., Ушакова Г.А., Лепехин Е.А. Гликозаминогликан-связывающие белки в развивающейся нервной системе млекопитающих // Вестник Днепропетровского университета. Биология. Экология. 1996. Вып. 2. - С. 40-47. (Дисертантом проведено виділення та характеристика гіалуронат-зв'язуючих білків з ембріонального мозку).

Ткач В.Л., Ушакова Г.А., Лепехин Е.А.. Гиалуронат-связываюшая активность головного мозга крысы в период постнатального развития // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія-Екологія. 1997. Вып. 3. С. 56-61. (Дисертантом визначена гіалуронат-зв'язуюча активність білків мозку щурів).

Ushakova G., Gubkina H., Kachur V., Lepekhin E. Effect of experimental hyperphenylalaninemia on the postnatal rat brain // Int. J. Devl. Neuroscience. 1997. Vol. 15, № 1. P. 29-36. (Дисертантом створена модель гіперфенілаланінемії на щурах, досліджена глікозаміноглікан-зв'язуюча властивість білків мозку).

Ushakova G, Nikonenko I., Skibo G., Witt M., Lepekhin E. The role of hyaluronate in morphogenesis of the neurons // Нейрофизиология/ Neurophysiology. 1997. Vol. 29, № 1. P. 21-27. (Дисертантом визначено вплив вільного гіалуроната у субстраті на морфофункціональні характеристики нейронів гіпокампу в культурі).

Usenko V., Kornilovska I., Lizogubov V., Apostolov E., Gubkina H., Ushakova G., Lepekhin E. Some morphological changes in the thyroid glad during exerimental hyperphenilalaninemia // Anatomical Rec. 1997. Vol. 248. P. 251-258. (Дисертантом створена модель гіперфенілаланінемії, прийнята участь в обговоренні результатів).

Ткач В.Л., Ушакова Г.А., Лепехин Е.А. Выделение и очистка мембранного гиалуронатсвязывающего белка из мозга эмбрионов человека // Укр. биохим. журн. 1998. Т. 70, № 5. С. 69-74. (Дисертантом очищені та характеризовані мембранні гіалуронат-зв'язуючі білки з ембріонального мозку людини).

V.Usenko, E. Lepekhin, V. Lyzogubov, I. Kornilovska, G. Ushakova and M. Witt. The influence of low doses 131-I-induced maternal hypothyroidism on the development of rat embryos // Exp. Toxic Pathol. 1999. Vol.51. P. 223-227. (Дисертантом визначені рівень гормонів у сироватці крові самиць та щурят й морфологічні показники мозку).

Білоусова Т.В., Ушакова Г.О. Визначення проліферативної активності клітин мозку новонароджених щурів // Вісник ДДУ. Біологія. Екологія. 1999. Вип. 6. С.36-42. (Дисертанту належать ідея дослідження проліферативного індексу нервових клітин у мозку новонароджених щурів та обговорення результатів).

Belousova T.V., Ushakova G.A. Changes in the proliferative activity in the brain of offspring rats induced by the influence of ¹³¹I on the maternal organism // Neurophysiology. 1999. Vol.31, № 4. P. 280-281. (Дисертантом створена експериментальна модель впливу інкорпорованого I-131, обговоренні результати).

Кобеляцкий Ю.Ю., Ушакова Г.А. Влияние морфина и кетамина на нейрональную и глиальную пластичность при послеоперацинной гипералгезии // Журн. АМН України. 1999. Т.5, № 4. С. 732-742. (Дисертантом визначена кількість нейроспецифічних білків у різних відділах мозку щурів та сироватці крові у післяопераційний термін).

Ушакова Г.А., Березин В.А., Неруш П.А. Изменение уровня NCAM в различных структурах головного мозга крыс, подвергавшихся стрессированию, и восстановление этого уровня под влиянием галоперидола // Нейрофизиология/Neurophysiology. 2000. Т. 32, № 5. С. 366-371. (Дисертантом визначений рівень NCAM у різних структурах мозку щурів).

Белоусова Т.В. , Ушакова Г.А. Гепаринсвязывающие белки в мозгу крысы // Нейрофизиология/Neurophysiology. 2001. T. 33, № 6. С. 387-392. (Дисертанту належать ідея дослідження гепарин-зв'язуючих білків у мозку щурів, проведена очистка білків).

Ушакова Г.А., Корниловская И.Н., Кобеляцкий Ю.Ю. Участие гепарина и гепаринсвязывающих белков мозга крыс в процессе гипералгезии // Біополімери і клітина. 2001. Т. 17, № 5. С. 428-433. (Дисертантом визначена гепарансульфат-зв'язуюча активність білків у мозку щурів у післяопераційний час).

Ushakova G.A., Nikonenko I.R., Nikonenko A.G., Skibo G.G. Extracellular matrix heparin induces alteration of the cell adhesion during brain development // Neurochemistry International. 2002. Vol. 40. P. 277-283. (Дисертантом визначений розподіл NCAM на плазматичній мембрані нейронів гіпокампу під впливом гепарансульфату).

Белоусова Т.В. , Ушакова Г.А. Изменение гепарин-связывающей активности белков мозга крыс после однократного воздействия ионизирующего излучения в дозе 0,25 Гр. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42, №3. С. 268-273. (Дисертанту належать ідея експерименту, опромінення щурів, обговорення результатів).

Ушакова Г.О., Білоусова Т.В. Вплив одно- та двовалентних іонів на загальну гепарин-зв'язуючу активність білків з мозку новонароджених щурів // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. 2002. Вип. 10, том 2. С. 45-50. (Дисертантом проведений синтез специфічного кон'югату, обговорення результатів).

Белоусова Т.В. , Ушакова Г.А. Динамика изменений гепаринсвязывающей активности белков мозга крыс после фракционированного воздействия ионизирующего излучения низкой интенсивности // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43, № 1. С. 44-48. (Дисертанту належать ідея експерименту, опромінення щурів, обговорення результатів).

Тези доповідей

Ushakova G.A., Lepekhin E.A., Gubkina E.A., Kachur V. Quantification of NCAM, GFAP and hyaluronate-binding activity in postnatal rat brain during experimental hyperphenylalaninemia // 15^th Meeting of the International Society for Neurochemistry, Kyoto, July 2-7, 1995. J. of Neurochemistry. 1995. Vol. 65,S. P. 182.

Ushakova G.A., Lepekhin E.A., Tkath V.L. Hyaluronate-binding activity in human and rat tissue // 23rd Meeting of FEBS, Basel, August 13-18. 1995. P.182.

Ushakova G.A., Gubkina E.A., Lepekhin E.A. The cell adhesion alteration during postnatal rat brain development under hyperphenylalaninemic conditions // Second Biennial Research Conference on “Molecular biology of cellular interactions”, Lenggries, Germany, October 9-15. 1995. P.23.

Ushakova G. The effect of stress conditions to cell adhesion // 8^th Sardinian Conference on Neuroscience, Cagliary, Italy, May 24-28, 1995. Behavioral Pharmacology J. 1995. Vol. 31, S. P. 108.

Tkach V., Ushakova G., Lepekhin E. Hyaluronate-binding activity in development of rat cerebellum and cerebral hemispheres // 24 Meeting of FEBS, Barselona. 1996. P. 132.

Ushakova G., Tkach V.,Lepekhin E. Glycosaminoglycan-binding activity during postnatal rat brain development // 11^th Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience, Tampere, Finland, 30 July - 3 August, 1996. Int.J. of Devl. Neuroscience. 1996. Vol. 14, S1. P. 89.

Ткач В.Л., Ушакова Г.А., Лепёхин Е.А. Влияние малых доз радиоактивного йода на гиалуронат-связывающую активность мозжечка крысы в период пренатального развития // Матеріали 4 Міжнародної Конференції “Франція и Україна, науково-практичний досвід у контексті діалогу національних культур”, Дніпропетровськ. 1997. С. 37.

Яснило Ю.А., Исмаилова Ю.А., Ушакова Г.А. Влияние материнского гипотиреоза на пролиферацию клеток мозжечка потомства // Матеріали 4 Міжнародної Конференції “Франція и Україна, науково-практичний досвід у контексті діалогу національних культур”, Дніпропетровськ. 1997. С. 149-150.

Tkach V.L., Ushakova G.A., Lepekhin E.A. Effect of maternal hypothyroidism on hyaluronate-binding activity during prenatal rat brain development // 16^th ISN/28^th ASN Meeting, Boston, USA, July 20-26, 1997. J. of Neurochem. 1997. Vol. 69, S. P. 165.

Ushakova G.A., Ismailova Y.A., Lepekhin E.A. Effect of maternal hypothyroidism to cell adhesion during early stage of rat brain development // 16^th ISN/28^th ASN Meeting, Boston, USA. July 20-26, 1997. J. of Neurochem. 1997. Vol. 69, S. P. 166.

Ушакова Г.О. Участь глікозаміногліканів у процесах морфогенезу мозку ссавців під час постнатального розвитку // Матеріали YII Українського Біохімічного З'їзду, Київ, 1997. С. 169-170.

Ткач В.Л., Імаїлова Ю.О., Ушакова Г.О., Лепехін Є.О. Мембранний гіалуронат-з'язуючий білок ембріонального мозку людини // Матеріали YII Українського Біохімічного З'їзду, Київ, 1997. С. 167-168.

Ткач В.Л., Ушакова Г.А., Лепёхин Е.А. Влияние радиоактивного йода на гиалуронатсвязывающую активность мозга крысы в период пренатального развития // Материалы 3-го Съезда по радиационным исcледованиям, Москва, Россия, 14-17 октября 1997. С. 263-264.

Ушакова Г.А. Влияние малых доз радиоактивного йода на развитие мозга млекопитающих // Материалы 3-го Съезда по радиационным иследованиям, Москва, Россия, 14-17 октября 1997. С. 266-267.

Белоусова Т.В., Ушакова Г.А. Влияние радиоактивного йода на развитие мозга млекопитающих // V Міжнародна конференція “Франція та Україна, науково-практичний досвіт у контексті діалогу національних культур”, Дніпропетровськ. 1998. - T. 2. С. 74-75.

Ушакова Г.А. Регуляція деградації цитоскелету нервових клітин іонізованим кальієм // 2 З'їзд Укр. біофізичного товариства, Харків, 29 червня - 3 липня 1998. С. 74.

Ushakova G.A. The possible role of NCAM in synaptic plasticity in connection with learning // Proceeding of the IV European Research Conference: Neural Mechanisms of Learning and Memory, Acquafredda di Maratea, Italy, May 9-4, 1998. P.27.

Ushakova G.A. Hyaluronate and neural development // Forum of European Neuroscience, Berlin, June 27 - July 1, 1998. Eur. J. Neuroscience. 1998. Vol. 10, S10. P.163.

Lepekhin E., Ushakova G., Usenko V., Lyzogubov V., Kornilovska I., Witt M. Low dose of I-131 disturbs rat brain development // Forum of European Neuroscience, Berlin, June 27 - July 1, 1998. Eur. J. Neuroscience 1998. Vol. 10, S10. P. 164.

Ushakova G. Carbohydrate-binding activity under hyperphenylalaninemia // Twelfth General Meeting of the European Society for Neurochemistry, St. Petersburg, Russia, July 19-24, 1998. J. Neurochem. 1998. Vol.71, S. P. 66.

Kobeliatsky Y, Ushakova G. Interaction among expression NCAM and excitatory mechanism of hyperalgesia on the experimental model of postoperative pain // 1998 Annual Meeting of the Canadian Pain Society, Saskatchewan, Canada, May 28-30, 1998. Pain Res. Management. 1998. Vol.3, N 1. P.61.

Kobeliatsky Y, Ushakova G. Experimental postincisional pain: hyperalgesia, behavioral responses and synaptic plasticity // 10^th European Congress of Anaesthesiology, Frankfurt/Main, Germany, June 30 - July 4, 1998. J. AINS. 1998. Vol.33, S3. P.546.

Belousova T., Ushakova G. Purification of heparin-binding proteins from rat brain // 4^th International Congress In The Decade of the Brain, Gdansk, Poland, 2-5 September 1999. P.45.

Ushakova G.A., Nikonenko I.R., Nikonenko A.G., Skibo G.G.. Free heparin in substrates takes part in the regulation of neurite outgrowth // 15 th National Meeting of British Neuroscience, London, 11-14 April 1999. P. 8.11.

Ushakova, T. Belousova, E. Lepekhin. Heparin-binding proteins take part in regulation of brain cells proliferation // Fifth IBRO World Congress of Neuroscience. Jerusalem, Israil, 11-15 July 1999. P. 125.

G. Ushakova, I. Nikonenko, A. Nikonenko, G. Skibo. Heparin induces alteration of N-CAM distribution on the neuron membrane // 17^th ISN/13^th ESN Meeting, Berlin, Germany, August 8-14, 1999. J. Neurochem. 1999. Vol. 73, S. P. 58.

Ushakova G., Kobeliatsky Y. N-CAM level alteration in the rat brain under an experimental model of post-operative pain // Forum of European Neuroscience 2000, Brighton, UK, 24-28 June, 2000. Eur. J. of Neuroscience. 2000. Vol. 12, S11. P.122.

Belousova T., Ushakova G. Changes of total heparin-binding activity of the rat brain proteins after low dose irradiation // Joint Meeting of the ISN/ASN, Buenos Aires, August 26-31, 2001. J. Neurochem. 2001. Vol. 78, Supl. 1. P. 83.

Belousova T., Ushakova G. Participation of heparinoids in the proliferation control of the nervous cells // International Symposium Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems, Kyiv, Ukraine, 9-14 September, 2001. P.50.

Белоусова Т.В., Ушакова Г.А. Фракционированное воздействие ионизирующего излучения низкой интенсивности изменяет гепарин-связывающую активность белков мозга // IV Съезд по радиационным исследованиям (радиобология, радиоэкология, радиационная безопасность). Москва, Россия. 20-24 ноября 2001. С. 326.

Ushakova G. Heparin-binding activity of proteins in the human and rat brain during embryonic and postnatal development // 14^th Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience, Sydney, Australia, January 31 - February 4, 2001. Int. J. Devl. Neuroscience. 2001. Vol. 19. P. 731.

Белоусова Т.В., Ушакова Г.А. Очистка мембранноассоциированных и экстрацеллюлярных гепаринсвязывающих белков мозга крыс // VIII Український біохімічний з'їзд, Чернівці, 1-3 жовтня 2002. Укр. біохім. журн. 2002. Т. 74, № 4б. С. 21-22.

Білоусова Т., Ушакова Г.О. Афіність зв'язування гепарину до мембраннеасоційованих білків мозку новонароджених щурів // Тези доповідей III З'їзду Українського біофізичного товариства, 8-11 жовтня 2002 року. С. 132.

Ушакова Г.О. Вплив іонізуючої радіації низької інтенсивності на загальну гіалуронат-зв'язуючу активність білків мозку щурів // III съезд по радиационным исследованиям, Киев 21-25 мая 2003. С.73.

Белоусова Т.В., Ушакова Г.О. Изменение гепаринсвязывающей активности белков в различных структурах мозга крыс при фракционированном действии рентгеновского излучения в малой дозе // III съезд по радиационным исследованиям, Киев 21-25 мая 2003. С.21.

АНОТАЦІЯ

Ушакова Г.О. Роль глікозаміноглікан-зв'язуючих білків у морфогенезі та пластичності мозку. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04-біохімія. - Харківській національній університет ім. В.Н.Каразіна, Харків, 2005 р.

Дисертація присвячена вивченню ролі макромолекул, що специфічно зв'язують гепарансульфат та гіалуронат, на різних етапах морфогенезу мозку щурів за нормальних умов й при моделюванні гіперфенілаланінемії, ¹³¹І-індукованого материнського гіпотиреозу, опромінення низької інтенсивності, соматогенного післяопераційного болю. Запропоновані нові методичні підходи до кількісного визначення загального рівня гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої властивості білків in vitro та in situ. Запропонована оригінальна концепція залежності морфогенезних подій у мозку від загального рівня гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої властивості водорозчинних, мембраноасоційованих, мембранних та екстрацелюлярних/ цитоскелетних компонентів. Показано характерне співвідношення гепарансульфат-зв'язуючої та гіалуронат-зв'язуючої активності 1:10 на ранніх етапах розвитку мозку. Установлено ступінь залежності адгезивності нейронів гіпокампу від кількості гепарансульфату та гіалуронату в субстраті культури. Установлена наявність гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючих компонентів у ядрах проліферуючих та мігруючих нервових клітин. Очищені мембраноасоційовані гепарансульфат-зв'язуючі білки з мозку новонароджених щурів (19 і 28 кДа) та мембранні гіалуронат-зв'язуючі білки з ембріонального мозку людини (250 і 20 кДа). Наведені докази збільшення загального рівня глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків на етапі активної проліферації й міграції клітин в умовах гіперфенілаланінемії. Представлені докази участі гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючих рецепторів в адаптаційних процесах в умовах впливу ¹³¹І-індукованого материнського гіпотиреозу та опромінення низької інтенсивності (одноразового та фракціонованого в дозі 0,25 Гр). Визначена участь гепарансульфат-зв'язуючих білків мозку щура в центральних механізмах соматогенного післяопераційного болю.

Ключові слова: ЦНС, гепарансульфат-, гіалуронат-зв'язуючі білки, мозок, морфогенез, нейрональна пластичність, гіперфенілланінемія, опромінення низької інтенсивності, біль.

АННОТАЦИЯ

Ушакова Г.А. Роль гликозаминогликансвязывающих белков в морфогенезе и пластичности мозга. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2005 г.

Диссертация посвящена изучению роли гепарансульфат- и гиалуронатсвязывающих макромолекул на разных этапах морфогенеза мозга крыс при нормальных условиях и при моделировании гиперфенилаланинемии, ¹³¹I-индуцированного материнского гипотиреоза, облучения низкой интенсивности, соматогенной послеоперационной боли.

Предложены новые методические подходы для количественному определения общего уровня гепарансульфат- и гиалуронат-связывающих белков (синтезированы специфические коньюгаты, предложены твердофазный углевод-ферментный микрометод и углевод-гистохимический метод с применением этих коньюгатов), определены оптимальные условия для их использования при исследованиях мозга in vitro и in situ.

Предложена оригинальная концепция зависимости морфогенезных событий (пролиферации, миграции, дифференциации клеток) в мозге от общего уровня гепарансульфат- и гиалуронат-связывающей активности водорастворимых, мембранно-ассоциированных, мембранных и экстрацеллюлярных/цитоскелетных компонентов. Исследована динамика перераспределения гликозаминогликансвязывающей активности между мембранными и экстрацеллюлярными/цитоскелетными компонентами мозга в период эмбриогенеза и раннего постнатального развития. Показано характерное соотношение гепарансульфат- и гиалуронатсвязывающей активности 1:10 на ранних этапах развития мозга. Наивысший уровень гликозаминогликансвязывающей способности белков характерный для ядерного цитоскелета пролиферирующих клеток и мембранных компонентов во время миграции клеток (45080 нг связ. гепарансульфата/мг общего белка и 4000120 нг связ. гиалуроната/мг общего белка). В мозге взрослых крыс гепарансульфат- и гиалуронатсвязывающая активность белков наименьшая (1-50 нг связ. ГАГ/мг ОБ), характеризуется постоянным уровнем для каждой структуры, зависит от пола животного. У самцов гликозаминогликансвязывающая активность белков на 22% выше, чем у самок практически во всех отделах мозга, за исключением гиппокампа. Характер и динамика субклеточного распределения гепарансульфат- и гиалуронатсвязывающих белков в мозге человека похожи с таковыми в мозге крыс.

Показана степень зависимости адгезивных свойств нейронов гиппокампа в культуре от количества гепарансульфата и гиалуроната в субстрате. Увеличение количества свободных гликозаминогликанов в субстрате приводит к снижению адгезивных контактов и задержке дифференциации нейронов гиппокампа в культуре.

Выделены новые мембранно-ассоциированные гепарансульфатсвязывающие белки из мозга новорожденных крыс (19 и 28 кДа) и мембранные гиалуронатсвязывающие белки из эмбрионального мозга человека (250 и 20 кДа), которые не имеют иммуноперекрестной реакции с раннее описанными углеводсвязывающими белками и протеогликанами.

Получены экспериментальные доказательства активного участия гликозаминогликансвязывающих белков в регуляции морфогенеза мозга в условиях воздействия патогенных факторов. Показано увеличение более чем в два раза общего уровня гликозаминогликансвязывающей активности белков в период активной пролиферации нейронов в условиях гиперфенилаланинемии, что может индуцировать задержку синаптогенеза и в дальнейшем снижение умственных способностей.

Представлены доказательства участия гепарансульфат- и гиалуронатсвязывающих рецепторов в нейрональной пластичности в условиях влияния ¹³¹I-индуцированного материнского гипотиреоза и облучения низкой интенсивности (одноразового и фракционированного в дозе 0,25 Гр).

Определено участие гепарансульфатсвязывающих белков мозга крыс в центральных механизмах соматогенной послеоперационной боли. Обезболивание с применение кетамина и морфина (0,5 мг/кг за 5 мин до операции) предотвращает увеличение гепарансульфатсвязывающей активности белков в мозге крыс.

Предложена шкала изменения морфогенезных процессов в мозге (пролиферации, миграции, дифференциации клеток) в зависимости от уровня общей гепарансульфат и гиалуронатсвязывающей активности экстрацеллюлярных/цитоскелетных белков, с помощью которой можно прогнозировать степень нарушения нейрональной пластичности и наличие риска неоплазии в условиях действия патогенных факторов.

Ключевые слова: ЦНС, гепарансульфат-, гиалуронатсвязывающие белки, мозг, морфогенез, нейрональная пластичность, гиперфенилаланинемия, облучение низкой интенсивности, боль.

SUMMARY

Ushakova G.A. The role of glycosaminoglycan-binding proteins in morphogenesis and plasticity of the brain - Manuscript.

The thesis for the obtaining of doctor of biological science degree in speciality 03.00.04 - biochemistry. - V.N. Karazin Kharkov national university, Kharkov, 2005.

The dissertation is devoted to investigation of the role of macromolecule that specific bind the heparansulfate and hyaluronate during different stages of rat brain morphogenesis under normal conditions and effect of hyperphenylalanunemia, ¹³¹I-inducable maternal hypothyroidism, low dose irradiation, somatogenic postoperative pain. It was proposed the new ways to quantitative measure of total level of heparansulfate- and hyaluronate-binding activity of proteins. It was proposed the conception of morphogenic events depends of total level of heparansulfate- and hyaluronate-binding activity of soluble, membrane-associated, membrane and extracellular/cytoskeleton components during brain development. The correlation of heparansulfate-binding to hyaluronate-binding activity at the early stage brain development is 1:10. It was shown the degree of dependence of hippocampus neuron adhesion to free heparansulfate and hyaluronate content in the substrate of cultures. It was indicated the heparansulfate- and hyaluronate-binding components in the nucleus of proliferating and migrating nervous cells. The new membrane-associated heparansulfate-binding proteins from newborn rat brain (19 и 28 кДа) and membrane hyaluronate-binding proteins from embryonic human brain (250 и 20 кДа) were purified. The elevation of the total glycosaminoglycan-binding activity level was shown at the first stage of brain morphogenesis under hyperphenylalaninemia. It was presented the proofs that heparansulfate- and hyaluronate-binding receptors take part in the neural plasticity under ¹³¹I-inducable maternal hypothyroidism and low dose irradiation (single and fractionated in the 0,25 Gy dose) conditions. It was established that heparansulfate-binding proteins of rat brain take part in the central mechanism of somatogenic postoperative pain.

Key words: CNS, heparan-, hyaluronate-binding proteins, brain, morphogenesis, neural plasticity, hyperphenylalaninemia, low dose irradiation, pain.

Размещено на Allbest.ru