Поліваріантність онтогенезу міцеліальних мікроміцетів

Так само як рН, температура, цАМФ іони кальцію змінювали презумптивно пелетний ріст на нитчастий, діючи на конідії у стадії набряку. Аніонна частина теж впливала на морфогенну дію кальцію. Встановлено, що серед солей кальцію (оцетовокислого-, вуглекислого-, азотнокислого) тільки сірчанокислий у концентрації 10 - 50 мМ діяв аналогічно хлористому кальцію.

Результати досліджень, що проведені за участю одно- та двохвалентних катіонів підтвердили особливу роль кальцію в морфогенезі T. terrestris. Показано, що хлористий натрій, калій, амоній, магній та стронцій в концентраціі до 100 мМ впливають на морфологію міцелію в межах морфологічних варіантів. Прямий зв'язок ендогенного цГМФ з формоутворенням T. terrestris не встановлено.

Показано, що деполярізація цитоплазматичної мембрани, під впливом роз'єднувачів (FCCP, 2,4-ДНФ), мембраноактивного антибіотика (ністатину) та високих концентрацій калію в лаг-фазі призводить до зміни програми розвитку з перзумптивно пелетної на нитчасту (табл. 1). Це може свідчити про участь цитоплазматичної мембрани завдяки зміні ступеня її енергізації у сприйнятті та передачі морфогенного сигналу в T. terrestris.

Дослідження дії актиноміцину Д, РНКази, етіоніну та пуроміцину на процеси формоутворення T. terrestris продемонстрували зв'язок між морфогенезом міцелію та генним апаратом клітини. У випадку презумптивно нитчастого росту додавання інгібіторів призводило до зміни форми розвитку міцелію. Таким чином, регуляція формоутворення міцелію T. terrestris може здійснюватися на генному рівні.

Таблиця 1. Вплив концентрації KCl на форму міцелію T. terrestris при різних значеннях рН середовища

Особливості функціонування різних форм міцелію на прикладі Thielavia terrestris

Порівняльний аналіз кінетики та стехіометрії росту T. terrestris на твердому та в рідкому середовищі дозволив оцінити ці умови за ступенем сприятливості для розвитку гриба. Найбільш оптимальні для росту слід вважати умови культивування на твердому середовищі. У цих умовах штам характеризується високою спорідненостю зі субстратом (К_s = 0,026 г/л) та різким інгибуванням при збільшенні концентрації глюкози (К_і = 0,929 г/л).

В той самий час проведені дослідження показали, що пелетний ріст за фізіологічними показниками відповідає поведінці організму в умовах неспецифічного стресу. Збільшуються витрати енергії на підтримку культури (0,047 0,007 г/г·год. проти 0,024 0,007 г/г·год. для нитчастого), економічний коефіцієнт меньше (30,5 1,9 % проти 43,6 2,5 %), а метаболічний - більше, ніж у нитчастого міцелію (0,41 0,08 г^-1 проти 0,16 0,01 г^-1). Підвищується пул АТФ.

У пелетному міцелії спостерігається зниження білку, нуклеїнових кислот та збільшення резервних речовин (ліпідів, вуглеводів) (табл. 2). Нитчаста форма відзначається більшим рівнем конструктивних процесів, але меншою стійкістю до несприятливих факторів зовнішнього середовища (К_s = 0,19 0,01 г/л проти 0,09 0,01 г/л; K_i = 112,7 6,4 г/л проти 30,0 5,0 г/л).

Таблиця 2. Макромолекулярний склад міцеліальних структур T. terrestris на різних стадіях розвитку

Винятковим можуть бути однакові значення питомої швидкості росту для пелетної та нитчастої форм (0,106 0,017 г^-1 та 0,116 0,012 г^-1). Однак, враховуючи особливості будови міцелію та його апікальний рост, слід зазначити, що пригнічення ростових процесів у пелет дійсно відбувається. Апікальна швидкість росту пелетної форми нижче, ніж у нитчастої (0,089 0,5 мкм/г проти 1,68 0,5 мкм/г).

Особливості пулу амінокислот у пелетного та нитчастого міцелію відмічені у кількостному складі, хоча енергетичні витрати на синтез амінокислот у них рівні. У нитчастого міцелія вміст незамінних амінокислот більше, ніж у пелетного (особливо лізіну, треоніну та валіну). Пелетний міцелій характеризується більшою кількістю тірозину та метіоніну. До особливостей пелетної форми можна віднести наявність двох піків у накопиченні амінокислот в гідролізаті. Імовірно, що перший максимум пов'язаний з легкодоступними амінокислотами частково деструктурованих білків центральної частини пелет, а другий відображає наявність амінокислот після повного руйнування клітинної стінки.

Встановлено, що клітинна стінка пелетного міцелію містить більше структурних полісахаридів (глюкану 28 %, хітину 22 %), ніж нитчастого (10 % та 1-2 % відповідно). Разом з даними протопластування нитчастого та пелетного міцелію це свідчить про більшу міцність клітинної стінки пелет. Інтенсивність виходу протопластів та їх чисельність при обробці пелетного міцелію меньша.

Енергетична ефективність росту пелетного та нитчастого міцелію на різних субстратах є різною. Для нитчастої форми зі збільшенням ступеня інгибування вуглецьвміщуючих субстратів ефективність використання ксилози збільшується, для пелетної знижується. Використання ацетату для нитчастої форми є меньш ефективним, ніж для пелетної. Непродуктивні витрати на цьому субстраті є значно вищими (табл. 3). Все це може свідчити не тільки про кількісні, але й про якісні особливості у метаболізмі форм міцелію, що вивчаються.

Показано, що в умовах стресу, пов'язаного з голодуванням та механічним пошкодженням, пелетний та нитчастий міцелій демонструють різну реакцію за рівнем ендогенного дихання (рис. 18 і 19).

У пелетної форми спостерігається збільшення інтенсивності дихання через добу впливу, у нитчастої через дві доби.

Різниця між "голодуючим" інтактним та гомогенізованим міцелієм у пелетної форми швидко зникала в порівнянні з нитчастою. Більший ступінь інгібування дихання у пелет на першу добу дії може свідчити про міжклітинні контакти між ділянками гіф, що входять до складу цієї структури.

Внесення глюкози не впливає на інтенсивність дихання пелетної форми T. terrestris у процесі голодування. У той самий час активність дихання нитчастого міцелію в присутності глюкози збільшувалася. Це може свідчити про більшу залежність нитчастої форми від екзосубстратів.

Таблиця 3. Енергетична ефективність росту міцеліальних структур T. terrestris на різних субстратах

Встановлено, що ціанід по-різному блокує дихання пелетної та нитчастої форм. У пелетного міцелію в процесі голодування частка ціанрезистентного дихання збільшується, а у нитчастого - зменьшується. На четверту добу для обох форм характерна перевага альтернативних шляхів окислення субстрату.

Молекулярна модель сприйняття морфогенного сигналу конідіями грибів на прикладі Thielavia terrestris

На основі одержаних даних та літературних відомостей ми пропонуємо схему сприйняття та передачі морфогенного сигналу для Thielavia terrestris.

Аналіз схеми показує, що вона схожа зі схемою сигнальної системи, запропонованої для диморфізму Mucorales [Steward, Rogers, 1983]. Таким чином, можна припустити наявність загальних закономірностей цих процесів. Експериментальні дані вказують на те, що сигнальна система T. terrestris на першому етапі реагування на морфогенний фактор включає:

цитоплазматичну мембрану (завдяки зміні ступеня її енергізації), активізацію аденілатциклази, що призводить до утворення цАМФ. Далі, виходячи з літературних даних, можна прогнозувати цілу низку ферментативних реакцій (активізацію протеінкінази С, фосфорювання ядерних білків, експресію відповідних генів тощо), що призводить до розвитку міцелію певної форми. Головне припущення цієї моделі полягає у тому, що різні способи функціонування цієї сигнальної системи обумовлюють, як мінімум, дві форми росту міцелію (пелетну та нитчасту). Як показали наші дослідження, рівень цАМФ у даному випадку є одним з головних параметрів, що контролює розвиток пелетного чи нитчастого міцелію. Високий рівень цАМФ у лаг-фазі призводить до розвитку нитчастої, а низький пелетної форми. Запропонована схема дозволила здійснити спрямовану регуляцію форми росту T. terrestris, а тому може розглядатися як первинна модель, що описує початкові стадії формоутворення міцелію мікроміцетів за участю внутрішньоклітинних медіаторів.

Таким чином, згідно з одержаними даними механізм сприйняття та передачі у клітину морфогенного сигналу для пелетної та нитчастої форм є однаковим. Вибір програми розвитку (в межах вивченої схеми) залежить від концентрації ендогенного цАМФ у лаг-фазі, що визначає розвиток нитчастого чи пелетного міцелію.

Висновки

В роботі вирішено актуальну наукову проблему щодо природи формоутворення міцелію ряду мікроскопічних грибів в умовах глибинного культивування. Доведено, що розвиток форми вегетативного міцелію є адаптивним процесом та залежить від умов існування для кожного конкретного виду грибів. Встановлені взаємозв'язки між поліморфним розвитком міцелію та формоутворюючими факторами є основою для з'ясування молекулярних механізмів регуляції їх морфогенезом. Це дозволяє використовувати процес формоутворення міцелію як експериментальну модель для вивчення еволюційних шляхів становлення регуляторних механізмів морфогенезу. Розроблено наукові підходи до керування формою міцелію з відповідними особливостями метаболізму. Одержані результати можуть бути запропоновані для біотехнологічних процесів отримання біологічно активних речовин шляхом спрямованого культивування грибів.

Теоретично обґрунтовано та експериментально підтверджено адаптивний характер диморфізму мікроміцетів у вигляді нитчастого чи пелетного міцелію, про що свідчать особливості формоутворення Thielavia terrestris, Chaetomium globosum та меланінсинтезуючих гіфальних грибів, які відзначаються підвищеною резистентністю до несприятливих умов існування. Серед факторів зовнішнього середовища морфогенними є ті, що суттєво впливають на процеси розвитку мікроміцетів у період лаг-фази. Запропоновано розглядати пелетну форму росту поряд з нитчастою, як прояв поліваріантності онтогенезу мікроміцетів, що розвиваються в умовах глибинного культивування.

Доведено відсутність початкової запрограмованості розвитку конідій у нитчасту чи пелетну форми, тобто їх тотипотентність. Підтверджено роль передісторії інокулюму. Форма міцелію, що використовується як посівний матеріал, впливає на морфологію наступного покоління. Критичне значення умов культивування, у яких відбувається зміна форми міцелію, визначається попередньою формою росту гриба та відповідає явищу гістерезісу, що підтверджує самоорганізуючу природу формоутворення міцелію.

Встановлено, що програма формоутворюючих процесів сприймається клітиною у стадії набряку конідій, що відповідає лаг-фазі на кривій росту. Аналогічні особливості характерні для періоду компетентності в ембріогенезі вищих організмів.

Показано відповідність пелетної форми T. terrestris поведінці одноклітинних мікроорганізмів в умовах неспецифічного стресу, про що свідчать зміни у макромолекулярному складі біомаси, кінетичних та стехіометричних показниках, зростання пулу АТФ, збільшення ціанрезистентного дихання. Це підтверджує положення про функціональну схожість макроморфологічних структур модульних організмів з системами популяційного рівня.

Встановлено відмінності у складі клітинних стінок нитчастого та пелетного міцелію, які закладаються у лаг-фазі. Кількість структурних полісахаридів (28 % глюкану і 22 % хітину у пелетного міцелію проти 10 % та 1 % відповідно у нитчастого), результати протопластування, гомогенізації та ультразвукової обробки міцелію свідчать про більшу міцність клітинних стінок пелетної форми.

Механізм взаємодії конідій T. terrestris на ранніх стадіях формоутворення обумовлений синтезом біополі мерів. При пелетоутворенні передбачається взаємодія за містковим типом, при розвитку нитчастого варіанту - стерична стабілізація за рахунок більш високих концентрацій біополімеру. У випадку C. cladosporioides причиною підвищеної агрегації конідій є утворення на їх поверхні меланінового шару. Пелетоутворення у alb-мутанту свідчить про значні молекулярні зміни, що вірогідно обумовлені К-стратегією розвитку цих темнозабарвлених грибів.

Показано інформативність атомно-силової мікроскопії, хемілюмінесценції та механоемісії для дослідження механізмів клітинних взаємодій і регуляторних процесів у лаг-фазі, що дозволяє вперше рекомендувати ці методи для вивчення періоду компетенції. За їх допомогою дано структурні та молекулярні характеристики конідій з різною спрямованістю формоутворюючих процесів. У випадку пелетної стратегії росту фібрилярні структури на поверхні конідій з'являються значно раніше і в більшій кількості, ніж у нитчастої. Хаотичність у характері випромінювання конідій з пелетною стратегією росту відповідає поведінці біологічних об'єктів у несприятливих умовах існування.

Показано участь внутрішньоклітинних регуляторів (цАМФ та іонів кальцію) та генетичного апарату (за результатами інгібіторного аналізу) у процесах формоутворення T. terrestris та відсутність ефекту дії цГМФ. Шлях рецепції морфогенного сигналу та його перетворення на внутрішньоклітинний не залежить від форміи росту T. terrestris. Розвиток нитчастого або пелетного міцелію визначає концентрація цАМФ: у лаг-фазі в нитчастої форми вона вища, ніж у пелетної (5-8 нмоль/гАСВ та 1 нмоль/гАСВ, відповідно).

Розроблено молекулярну модель поліморфізму T. terrestris на етапі передачі зовнішнього сигналу на внутрішньоклітинний регулятор, яка відповідає аналогічній схемі для дрожжево-гіфального диморфізму, та дозволяє регулювати процес формоутворення міцелію в глибинних умовах культивування шляхом дії у лаг-фазі певних морфогенних факторів.

Основні роботи, надруковані за темою дисертації

1. Шемшур Т.В., Подгорский В.С., Громозова Е.Н. Кинетика роста Thielavia terrestris на плотной питательной среде // Микология и фитопатология. - 1989. - Т. 23, № 2. - С. 156-159.

2. Громозова Е.Н., Шемшур Т.В., Фомина М.А. Формирование мицелиальных структур под действием условий культивирования на разных стадиях развития микромицетов // Микология и фитопатология. 1989. Т. 23, № 3. С. 202-205.

3. Громозова Е.Н., Блажчук И.С. Влияние некоторых факторов на характер роста Thielavia sp. в погружённой культуре // Микробиол. журн. 1989. Т. 51, № 4. С. 30-31.

4. Шемшур Т.В., Громозова Е.Н., Подгорский В.С. Влияние некоторых условий культивирования на характер роста аскомицетов в погружённой культуре // Микробиол. журн. 1989. Т. 51, № 3. С. 30-33.

5. Фомина М.А., Громозова Е.Н., Билай Т.И. Биосинтетическая активность Thielavia sp. на среде со свекловичным жомом в зависимости от морфофизиологической формы посевного материала // Микробиол. журн. 1989. Т. 51, № 3. С. 53-55.

6. Громозова Е.Н., Фомина М.А., Блажчук И.С., Подгорский В.С. Физиологические особенности роста различных мицелиальных структур Thielavia sp. на среде с глюкозой // Микробиол. журн. 1989. Т. 51, № 1. С. 43-46.

7. Громозова Е.Н., Болдарева А.И., Блажчук И.С., Подгорский В.С., Ковальчук В.А., Синёв О.П. Перспективы использования Thielavia sp. в обработке и утилизации последрожжевой бражки // Химия и технология воды. 1990. Т. 12, № 8. С. 756-760.

8. Фомина М.А., Громозова Е.Н., Подгорский В.С. Материальный баланс роста двух мицелиальных структур Thielavia sp. на среде с глюкозой // Микробиол. журн. 1990. Т. 52, № 5. С. 42-48.

9. Зелтиня М.О., Швинка Ю.Э., Блажчук И.С., Громозова Е.Н. Энергетическая эффективность утилизации ряда углеродсодержащих субстратов различными мицелиальными структурами Thielavia terrestris // Микробиол. журн. 1990. Т. 52, № 6. С. 65-69.

10. Громозова Е.Н., Блажчук И.С., Галынина Н.И. Уровень АТФ в процессе развития различных мицелиальных структур Thielavia terrestris // Микробиол. журн. 1990. Т. 52, № 5. С. 48-51.

11. Блажчук И.С., Громозова Е.Н., Степанюк В.В. Особенности получения и характеристика протопластов из различных участков мицелиальных структур Thielavia terrestris // Микробиол. журн. 1991. Т. 53, № 6. С. 21-27.

12. Громозова Е.Н., Садовский М.Г. Эволюционные механизмы адаптационных перестроек в морфологии некоторых грибов // Эволюционное моделирование и кинетика. Новосибирск: Наука, 1992. С. 161-176.

13. Громозова Е.Н., Блажчук И.С., Тесленко В.В. Особенности роста и образования меланина Cladosporium cladosporioides в глубинных условиях культивирования при различных значениях рН среды // Микробиол. журн. 1993. Т. 55, № 2. С. 41-45.

14. Фомина М.А., Громозова Е.Н., Блажчук И.С. Особенности роста Cladosporium cladosporioides (Fresen) de Vries и синтеза меланина в процессе периодического культивирования // Микробиол. журн. 1995. Т. 57, № 2. С. 15-20.

15. Громозова О.М., Блажчук І.С., Підгорський В.С. Пул аденозин-3'-5'-монофосфата у процесі формування міцеліальних структур Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain в умовах глибинної культури // Укр. Ботан. Журн. 1995. Т. 52, № 5. С. 615-620.

16. Громозова Е.Н., Фомина М.А., Блажчук И.С. Особенности развития мицелиальных структур Thielavia terrestris в условиях периодического культивирования // Биополимеры и клетка 1995. Т. 11, № 3-4. С. 73-81.

17. Громозова Е.Н., Блажчук И.С. Участие ионов кальция в процессах мицелиального диморфизма Thielavia terrestris // Биополимеры и клетка. 1996. Т. 12, № 3. С. 91-96.

18. Фомина М.А., Громозова Е.Н., Подгорский В.С. Влияние света на меланиногенез Cladosporium cladosporioides (Fresen.) de Vries // Биополимеры и клетка. 1996. Т. 12, № 1. С. 58-63.

19. Подгорский В.С., Громозова Е.Н., Стрельчина Т.В. Исследование действия аналогов мембранотропных ауторегуляторов на процесс диморфизма Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain // Микробиол. журн. 1996. Т. 58, № 4. С. 29-34.

20. Громозова Е.Н. Мицелиальный диморфизм грибов в условиях глубинного культивирования // Онтогенез. 1999. Т. 30, № 5. С. 366-371.

21. Громозова Е.Н. Роль лаг-фазы в процессах развития различных форм мицелия некоторых грибов в условиях глубинного культивирования // Онтогенез. 1998. Т. 29, № 5. С. 362-365.

22. Громозова Е.Н., Орёл В.Э., Дзятковская Н.Н. Спонтанная хемилюминесценция и механоэмиссия конидий Thielavia terrestris на ранних стадиях формообразующих процессов // Доповіді НАНУ 2000. № 9. С. 176-179.

23. Gromozova E.N., Fomina M.A., Podgorsky V.S., Leite V.S., Zeltina M., Shvinka Y.E. Growth efficiency of Thielavia terrestris mycelial structures // Acta Biotechnologica. 1991. V. 11, № 4. P. 325-329.

24. Grube M., Zagreba E., Gromozova E., Fomina M. Comparative investigation of the macromolecular composition of mycelia forms Thielavia terrestris by infrared spectroscopy // Vibrational spectroscopy. 1999. № 19. P. 301-306.

25. Gromozova E.N., Lytvyn P.M., Podgorsky V.S. Peculiarities of Th. terrestris spores surface ultrastructure investigated by AFM // Frontiers of Multifunctional Nanjsystems, eds. E. Buzaneva, P. Scharff.: Kluwer Acad. Publ., Netherlands. 2002. P. 341-346.

26. Громозова Е.Н. Адсорбционно-структурные механизмы формообразования мицелия грибов в условиях глубинного культивирования // Доповіді НАНУ. 2003. № 12. С. 141-145.

27. Громозова Е.Н., Садовский М.Г. Эволюционные механизмы адаптационных перестроек в морфологии некоторых грибов. Красноярск, 1988. 32 с. (Препр. / Сиб. отд. АН. Ин-т биофизики; №79Б).

28. Фомина М.А., Громозова Е.Н., Подгорский В.С. Хемостатные культуры двух морфофизиологических форм роста Thielavia sp. // Ред. Микробиол. журн. Киев, 1989. 10 с. Деп. В ВИНИТИ 14.11.89 г., № 6844-В89.

29. Громозова О.М., Блажчук І.С. Пелетоутворення у Cladosporium cladosporioides та Thielavia terrestris // Тезиси 9 з'їзду Українського ботанічного товариства. Київ: "Наук.думка", 1992. С. 428-429.

30. Блажчук И.С., Громозова Е.Н. Влияние различных солей кальция на формообразование Thielavia terrestris // Тезисы I (YIII) Установочного съезда УМО. Одесса. Микробиол. журн. 1994. Т. 56, № 1. С. 36.

31. Grube M.K., Zagreba E.D., Fomina M.A., Gromozova E.N. Biomass macromolecular composition of mycelial forms of Thielavia terrestris studies by IR-spectoscopy // 8^th European congress of biotechnology, Bugapest. - 1997. - P. 195.

32. Громозова Е.Н., Войчук С.И. Влияние агентов, деполяризующих мембрану на формообразование мицелия Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain // Тезисы докладов 1 съезда микологов России "Современная микология в России". Москва: Из-во "Нац. акад. микол.". 2002. С. 145.

33. Громозова Е.Н., Фомина М.А., Подгорский В.С. Аминокислотный состав биомассы мицелиальных форм Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain // Материалы Международной конференции "Микробиология и биотехнология ХХI ст." Минск: Ин-т микробиологии АН Белоруссии. 2002. С. 27-29.

34. Регуляция процессов формообразования у ряда микромицетов в условиях глубинного культивирования / Громозова Е.Н.: Ин-т микробиологии и вирусологии НАН Украины. - Киев, 2005. - 209 с. -Рус. - Деп в ГНТБ Украины 12.12.2005, № 91-Ук2005 // Анот. в ж. ДНР, №1-2, 2006, № 40.

35. Громозова Е.Н. Форма мицелия в глубинных условиях культивирования как результат адаптационного выбора самоорганизующейся системы // Тезисы: IV Всероссийский конгресс по медицинской микологии. - Москва 29-31 марта 2006. - С. 164-165.

36. Громозова Е.Н., Садовский М.Г. Роль предыстории посевного материала в морфологии Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain // ДАН. - 2006. - Т. 406, № 1. - С. 139-141.

Размещено на Allbest.ru